專利名稱：測定鈉-質(zhì)子-交換蛋白配體功效的方法
測定鈉-質(zhì)子-交換蛋白配體功效的方法本發(fā)明涉及測定離子通道配體的功效的方法。膜轉(zhuǎn)運蛋白的Na+/H+-交換蛋白或者鈉_質(zhì)子-交換蛋白(NHE)家族利用細胞外到細胞內(nèi)Na+梯度來驅(qū)使H+從細胞中流出。這組轉(zhuǎn)運蛋白(或者離子通道)實現(xiàn)的基本功能包括調(diào)節(jié)細胞體積和PH以及在細胞增殖中的許可作用和Na+的經(jīng)上皮轉(zhuǎn)運。哺乳動物 NHE是一種發(fā)揮將1個細胞內(nèi)質(zhì)子交換1個細胞外鈉離子作用的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。通過涉及離子流動，NHE可用于調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH和細胞體積，以及啟動細胞生長或者機能狀態(tài)的變化。 除了其生理學作用之外，NHE還在人病理學中起重要作用。在心肌梗塞期間和之后導致的人心肌膜損傷中，NHE引起的轉(zhuǎn)運起著關鍵作用，并且被認為代表在癌性細胞的致癌性轉(zhuǎn)化中的重要步驟。因此，NHE多年來已經(jīng)是心血管和腫瘤學研究中的靶標，并且已經(jīng)對成千上萬種化合物進行NHE抑制性和選擇性的篩選。測定NHE拮抗劑的效能的標準方法是ktiwark和其合作者(ktiwark et al., 1998,Pflugers Arch. ,336(5) :797-800)以及Wiemann和其合作者(ffiemann etal.，1999， PflugersArch. ,436(3) =255-262)描述的體外測定。在測定配體在所選的NHE上的IC5tl之后，可用相同的測定測量對其它NHE的選擇性。一般而言，選擇具有優(yōu)良選擇性的有效力配體用于進一步的藥代動力學研究、配體的體內(nèi)驗證研究。然而，一些非常有效力的化合物在體內(nèi)研究中僅僅顯示微小的效果。其原因可能是高的蛋白質(zhì)結(jié)合、低的生物利用度或者其它降低化合物在血漿中的有效濃度的作用。期望在藥物開發(fā)過程的非常早的時期排除這些化合物以節(jié)省時間和資源。由于幾種化合物的體外IC5tl與藥理學效能(功效)之間的偏差，因而需要發(fā)展測定或者模擬NHE配體或者其它離子通道配體在體內(nèi)的功效的方法。因此，本發(fā)明的第一個主題是提供測定離子通道配體功效的方法。優(yōu)選地，該測試應該是節(jié)約時間和成本的。在本申請的上下文中，術語離子通道理解為包括被動的離子通道以及主動的離子通道(離子轉(zhuǎn)運蛋白)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，離子通道配體的功效(尤其是NHE拮抗劑的功效)可通過使表達離子通道的細胞與動物血漿和離子通道配體接觸來測定。在該測試中，可測定離子通道配體對細胞的作用，其中該作用反映配體的體內(nèi)功效。因此，本發(fā)明的第一方面提供測定離子通道配體的功效的方法，其包括下面步驟a)使表達離子通道的細胞與下面物質(zhì)接觸iii)動物血漿，和iv)離子通道配體；以及b)測定離子通道配體對細胞的作用。簡而言之，該方法可如下進行將表達審議中的表達離子通道的適當細胞保持 (例如培養(yǎng))在適當?shù)臈l件下，并與動物血漿和所述離子通道配體進行接觸(溫育)。這兩成分可同時或者一起添加。在足以顧及對細胞的作用的時間之后，測定對細胞的作用。在所述接觸之后或者同時，觀察作用(信號)，其中對作用的檢測指示了離子通道配體對細胞的作用。在本發(fā)明的上下文中，術語“離子通道配體的功效”涉及離子通道配體的藥理學效能。與無血漿條件下的體外測定形成對比，在血漿的存在下進行的本發(fā)明方法慮及蛋白質(zhì)結(jié)合量，吸收的程度和速率，配體利用度的分布、代謝和排泄和/或其它降低化合物在血漿中的有效濃度的作用。當將配體給藥于動物并從動物取出血漿時，該方法也慮及吸收的程度和速率，配體的分布、代謝和排泄。這些作用可取決于下列因素，包括但不限于藥物的物理性質(zhì)(疏水性、pKa、溶解性)、藥物組成、在進食或者禁食狀態(tài)下給藥、生理節(jié)奏特性和/ 或與其它藥物、食物或者內(nèi)源物質(zhì)(例如酶)的相互作用。因此，術語“離子通道配體的功效”不但涉及配體與離子通道的結(jié)合和下游信號傳導的誘導，而且還慮及配體在血漿和/或活的動物中的上述作用。這允許更方便地確認適于例如體內(nèi)治療的候選藥物和/或排除具有低體內(nèi)功效的化合物。配體對細胞的作用可以是對細胞的任何作用，包括但不限于形態(tài)學、生存力或者細胞內(nèi)化合物的組成等的改變。該作用可以是處于任何水平的離子通道信號傳導，包括配體與離子通道的結(jié)合、離子的流出、各離子與靶標例如細胞內(nèi)靶標的結(jié)合、確定細胞化合物例如第二信使(如cAMP、CGMP、Ca2+、IP3、二乙酰基甘油等)的量、確定細胞內(nèi)蛋白(例如蛋白激酶A、蛋白激酶C或者MAP激酶)的激活態(tài)，確定mRNA或者蛋白質(zhì)的量、任何改變的細胞機能(例如誘導細胞凋亡或者細胞周期停滯)等。該方法可用來測定或者模擬體內(nèi)離子通道的配體功效。該方法的應用范圍的實例包括以下首先，可測量離子通道配體在源于用離子通道配體給藥的動物的血漿樣品中的有效濃度(例如參見實施例幻。若將配體給藥于動物，與配體的給藥量相比低的配體血漿濃度可解釋為差的生物利用度(例如由于低的血漿半衰期)。其次，可測定離子通道配體在血漿例如人血漿中的作用(例如參見實施例2)。與不含血漿的測定(這是本領域已知的)中測量的IC5tl相比，可以對配體的血漿結(jié)合和體內(nèi)利用度得出結(jié)論。IC5tl與血漿中功效之間差異非常高的化合物可以較早地棄去，因此在藥物開發(fā)中能潛在地節(jié)約成本。目前，這些化合物只能在體內(nèi)實驗之后才棄去。離子通道是一種通常為成孔的蛋白質(zhì)，其有助于建立和控制離子通過質(zhì)膜的流動。離子通道是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，或者更典型地是幾種蛋白質(zhì)的組裝。這樣的多亞單元組裝通常涉及環(huán)繞貫穿質(zhì)膜的孔緊密堆積的相同或者同源蛋白質(zhì)的環(huán)狀排列，所述孔填充有水。 盡管一些通道僅僅基于電荷而允許離子通過，但是原型通道孔在其最窄處僅僅1或2個原子寬。其傳導特異的離子例如鈉離子或鉀離子，并將它們運輸通過膜。在一些離子通道中， 通過孔的通路由“門，，控制，該“門，，通過化學或電信號、溫度或者機械力開啟或者關閉，這取決于離子通道的種類。通常，根據(jù)門控、通過這些門的離子種類和孔數(shù)，對離子通道進行詳細說明。如果通道按門控分類，則通道分成兩類電壓門控離子通道(激活/失活取決于跨膜的電壓梯度)和配體門控離子通道(激活/失活取決于配體與通道的結(jié)合)。電壓門控通道的實例包括電壓門控鈉通道、電壓門控鈣通道、電壓門控鉀通道、一些瞬時型感受器電位通道、超極化-激活環(huán)核苷酸門控通道和電壓門控質(zhì)子通道。配體門控通道的實例包括鉀通道例如內(nèi)向整流鉀通道(inward-rectifier potassium channel)、 鈣激活鉀通道和雙孔結(jié)構(gòu)域鉀通道、光門控通道如通道視紫紅和環(huán)核苷酸門控通道。當按通過通道的離子分類時，離子通道一般分為下面幾種氯離子通道、鉀通道(例如電壓門控鉀通道、鈣離子鈣激活鉀通道、內(nèi)向整流鉀通道和雙孔結(jié)構(gòu)域鉀通道)、鈉通道、鈣通道、質(zhì)子通道(例如電壓門控質(zhì)子通道)和相對非特異性離子的通用的離子通道(包括大多數(shù)瞬時型感受器電位通道)。一些離子通道影響細胞內(nèi)pH，如碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白和鈉離子質(zhì)子交換蛋白 (NHE)。離子通道的活性可受到與審議中的離子通道結(jié)合的天然或人工產(chǎn)生的配體的影響。 這些配體的眾所周知的實例包括阻斷鈉通道的河豚毒素、海藻毒素、利多卡因和奴佛卡因以及阻斷鉀通道的樹突毒素、非洲蝎毒素(iberiotoxin)和蜘蛛毒素(heteropodatoxin)。如上所述，離子通道配體是與離子通道特異性結(jié)合的任意化學物質(zhì)?！芭c離子通道特異性結(jié)合”根據(jù)本發(fā)明包括但不限于解離常數(shù)Kd不超過10_4mol/l優(yōu)選不超過10_5mol/ 1的結(jié)合。解離常數(shù)Kd可以在例如本領域技術人員所熟知的競爭性結(jié)合實驗中根據(jù)下式測定B [L] = [L] / {[L] +KDL (1+ [L*] /KDLJ，其中[L]和[Li分別代表審議中的離子通道配體的濃度和可檢測的(例如標記的)離子通道配體如離子通道的放射性配體的濃度。Km和Kdw分別是審議中的離子通道配體和可檢測的配體的解離常數(shù)，B[L] (0%至100% )是在具體濃度的離子通道配體時的結(jié)
口 O在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，待確定的配體是激動劑或者拮抗劑。激動劑與離子通道結(jié)合并激活離子通道(例如通過引起構(gòu)象變化來激活)。拮抗劑或者阻斷劑也與離子通道結(jié)合并使其失活。如果配體改變了離子通道的狀態(tài)(活性狀態(tài)或無活性狀態(tài))，則激活和失活可引起可檢測的信號。優(yōu)選，配體是使審議中的離子通道失活的拮抗劑。通過本發(fā)明方法表征的配體可以用作有用于治療和預防與離子通道相關的障礙或疾病的潛在藥物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，離子通道是鈉-質(zhì)子-交換蛋白(NHE)或者鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白。由于在細胞中起作用的蛋白質(zhì)例如酶的結(jié)構(gòu)極大地受到PH 的影響，存在蛋白質(zhì)作用的最佳PH?；谠撛颍３趾驼{(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH對于細胞保持細胞機能的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)是極其重要的。在細胞的PH調(diào)節(jié)中涉及NHE以及鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白。鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白由細胞膜內(nèi)外的Na+濃度梯度驅(qū)動，并將1個Na+以及1個或多個HCO3-離子一起運入細胞內(nèi)。由于鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白存在于細胞膜中并且通過鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白運入細胞內(nèi)的HC03_中和了細胞質(zhì)中的H+，鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)PH中起著重要的作用。同樣，NHE也在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH中起著重要的作用。迄今，已經(jīng)在哺乳動物NHE家族中確定了 9種異形體(NHE1至NHE9)。異形體共有約25 70%的序列同一性，其計算相對分子量的范圍為約74000 93000。交換蛋白的結(jié)構(gòu)分析表明它們具有相似的膜拓撲，其中氨基端膜結(jié)構(gòu)域由12個跨膜段組成，而羧端細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域差異較大。很早就已知NHE對于腫瘤生長是重要的，因為當將缺少Na+/H+交換活性的腫瘤細胞移植入喪失免疫的小鼠時，它要么不能生長腫瘤要么顯示嚴重的遲緩生長。現(xiàn)在明顯的是，NHEl引起多種變異和/或惡性細胞內(nèi)PH梯度的逆轉(zhuǎn)從而細胞內(nèi)環(huán)境是堿性而細胞外環(huán)境是酸性。該‘惡性酸中毒’被認為代表致癌性轉(zhuǎn)化中的關鍵步驟且是發(fā)展和維持變異表型所必需的。此外，NHE尤其是NHEl牽涉幾種疾病的生理學，其中大部分研究集中在NHEl在心臟病和癌癥中的作用。正常情況下，在心肌膜中NHEl移去過量的細胞內(nèi)酸以交換細胞外鈉離子。增多的細胞內(nèi)鈉離子被調(diào)控膜蛋白移去，所述調(diào)控膜蛋白包括Na+/K+ATP酶和Na+/ Ca2+交換蛋白。隨著在心肌梗塞期間和之后發(fā)生在人類心肌膜中的質(zhì)子產(chǎn)生的增加，心肌膜出現(xiàn)問題。NHEl異形體是交換蛋白的‘管家’異形體，且在基本上所有組織的質(zhì)膜中普遍地表達。NHEl異形體是在心肌膜的質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)的主要的NHE異形體。NHE2至NHE5異形體也位于質(zhì)膜中，但是具有更有限的組織分布。NHE2和NHE3主要位于上皮的頂膜中且高度表達在腎和腸中。與它們成對比的是，NHE4主要富集于胃中，但是也表達在腸、腎、腦、子宮和骨骼肌中，而NHE5主要表達在腦中(但是也可能低水平地存在于其它非上皮組織(包括脾、睪丸和骨骼肌)中)。異形體NHE6至NHE9普遍地表達和存在于細胞內(nèi)室中。這些細胞器膜 NHE被假定為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)室的腔內(nèi)pH和陽離子濃度。NHE6在心、腦和骨骼肌中表達最高， 并位于早期循環(huán)核內(nèi)體。NHE7異形體主要位于轉(zhuǎn)運高爾基氏體網(wǎng)絡，并因其介導Na+或者 K+流入以交換H+而不同于其它NHE異形體。最高的NHE8表達見于骨骼肌和腎，并且該異形體主要位于中間-至轉(zhuǎn)運-高爾基氏體室。最近鑒定出的NHE9異形體發(fā)現(xiàn)位于晚期循環(huán)核內(nèi)體。NHE是利尿化合物阿米洛利(amiloride)及其類似物和苯甲酰胍衍生物抑制的靶標。對比不同的NHE異形體顯示對于這些抑制劑它們具有不同的親和性，在相似的實驗條件下具有下面的敏感順序NHE1 ^ NHE2 > NHE5 > NHE3 > NHE4。由于NHEl是對抑制最敏感的異形體且似乎是存在于心肌膜的質(zhì)膜中的最重要的異形體，因此可以治療上利用這些抑制劑的選擇性質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述離子通道是NHE，例如NHE1、NHE2、NH3、NHE4、 NHE5、NHE6、NHE7、NHE8 或者 NHE9，優(yōu)選 NHE1、NHE2、NHE3 或者 NHE5，尤其是 NHEl 或者 NHE3， 特別是NHEl。NHEl異形體是NHE家族的最佳表征的異形體。NHEl為815氨基酸長，其中殘基1 至500代表膜結(jié)構(gòu)域，殘基501至815代表胞質(zhì)尾區(qū)。對于離子轉(zhuǎn)運，NHEl的膜結(jié)構(gòu)域不但是必要的而且是充分的，而細胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域涉及調(diào)節(jié)交換蛋白的活性。經(jīng)由交換蛋白的離子流動受到跨膜Na+梯度的驅(qū)使，并且看來不需要直接的代謝能量輸入。如上所詳述，離子通道配體優(yōu)選為激動劑或者拮抗劑。但是，由于NHE的臨床重要性，配體優(yōu)選為NHE激動劑，更優(yōu)選為NHE拮抗劑。如果審議中的離子通道在缺少配體時是失活的，那么在激動劑的存在下監(jiān)控拮抗劑的作用可能是必須的。在此情形下，拮抗劑的作用是使激動劑激活的離子通道失活。根據(jù)本發(fā)明，將細胞與配體和血漿一起溫育。所述細胞可以是表達審議中的離子通道的任何適當細胞。表達審議中的離子通道配體的細胞可以是天然表達離子通道的細胞。作為選擇，也可以將細胞進行基因修飾以表達離子通道。如本領域技術人員所知的那樣，可以對細胞進行分離(任選地，基因修飾的)，保持和培養(yǎng)。除了溫度和氣體混合物之外，在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中最常見的變量是生長培養(yǎng)基。 生長培養(yǎng)基的處方可在PH、葡萄糖濃度、生長因子和其它營養(yǎng)成分的存在等等方面上變化。 用于補充培養(yǎng)基的生長因子常常源于動物血液例如小牛血清。如本領域技術人員所知的那樣，基因修飾的細胞可以通過插入離子通道的全長編碼序列來獲得。本領域技術人員知道使用分子生物學的標準技術如何去得到離子通道蛋白的核酸序列編碼以及如何分離或產(chǎn)生這樣的核酸序列。這可通過例如利用限制性酶來使用和組合現(xiàn)有的序列完成。核酸可以與其它要素例如啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止信號、以及翻譯起始和終止信號進行組合，以提供離子通道序列的表達。所形成的核酸序列可以例如利用病毒作為載體或者通過轉(zhuǎn)染(包括例如通過電穿孔、熱激、磁力轉(zhuǎn)染(magnetofection)、細胞核轉(zhuǎn)染(nucleofection)和使用轉(zhuǎn)染劑)引入細胞中。任選地，細胞可以是組織的一部分；但是本發(fā)明方法是離體法。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，細胞來自細胞系(其中多數(shù)是充分表征的，并提供恒定的條件且便于操作)，具體是哺乳動物細胞系，更具體是人或小鼠細胞系，尤其是小鼠LTK-細胞系 LAPl (Franchi et al. , 1986, Proc NatlAcad Sci U SA. 83 (24) :9388-9392)。適當?shù)募毎档膶嵗ǖ幌抻?HEK 293、745-A、A-431、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-l、CC531、CFPAC、 CHO、CHO KU COS-U C0S-7、CV-U EAHY, EAHY 926、F98、GH3、H-295R、H-4-II-E、HACAT, HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、H印 G2、High Five,Hs 766T、HT29、HUV_EC R24、HUV_EC_C、IEC 17、IEC 18, Jurkat, K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、 MT4、N64、NCTC 2544,NDCK II,Neuro 2A、NIH 3T3、NT2/D1、P19、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、 SWU-20S、U-373、U-937和Yl。其它適當?shù)募毎潜绢I域技術人員已知的那些。優(yōu)選的細胞系是HEK 293細胞(原代人胚胎腎細胞)、3T3細胞(鼠胚胎成纖維細胞)、CH0細胞(中國倉鼠卵細胞)、C0S-7細胞(非洲綠猴細胞系)、HeLa細胞(人上皮樣子宮頸癌細胞)、JURKAT細胞(人T-細胞白血病細胞)、BHK 21細胞(倉鼠正常腎，成纖維細胞)和MCF-7細胞(人乳腺癌細胞)，尤其是小鼠LTK-細胞系LAPl。在本發(fā)明方法中，將細胞(如上所指出的)與動物的血漿一起溫育。所述動物可以是脊椎動物，具體是哺乳動物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者貓，它們提供在實驗室中方便和安全的操作。為了提供最有意義的人醫(yī)學結(jié)果，血漿也可以源于人類。因此，靜脈血可以由人供體的靜脈穿刺獲得，其中對于本發(fā)明方法(參見實施例)通常僅僅少量樣品例如5ml至 25ml血液樣品就足夠了。血液通常從前臂前區(qū)(肘的中隆內(nèi)的一側(cè))上的肘正中靜脈獲得。該靜脈靠近皮膚的表面，此處沒有大的神經(jīng)分布。在發(fā)達國家中的大多數(shù)血液采集借助由塑料針座、皮下注射針和真空管組成的抽真空管系統(tǒng)完成。根據(jù)本發(fā)明方法，測定離子通道配體的功效。功效通過測定在血漿的存在下離子通道配體對細胞的作用來確定。如上所詳述，可在信號傳導的各水平時評價配體對細胞的作用，包括配體與離子通道的結(jié)合，各離子與靶標的結(jié)合，確定細胞化合物例如第二信使的量，確定mRNA或者蛋白質(zhì)的量，任何改變的細胞機能(例如誘導細胞凋亡或者細胞周期停滯)等。測定配體與靶標的結(jié)合的方法是本領域技術人員熟知的，包括本文指出的那些。確定mRNA或者蛋白質(zhì)的量的方法也是本領域技術人員熟知的。觀察細胞機能的改變的方法很大程度取決于細胞機能的類型，并且也是技術人員熟知的。
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測定離子通道配體對細胞的作用的方法可能包括異相或者單相測定。本文中使用的異相測定是包括一個或多個洗滌步驟的測定，而在單相測定中，這樣的洗滌步驟不是必須的。試劑和化合物僅僅進行混合和測量。本發(fā)明方法也可包括離子通道下游信號特異性的抗體。所述測定可以是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、DELFIA(解離放大鑭系熒光免疫測定)、SPA(閃爍親近測定)、flaShplate測定、FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定、TR-FRET (時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定、FP (熒光極化)測定、ALPHA (放大熒光親近單相測定)、 EFC(酶片段互補)測定、二雜環(huán)測定或者共免疫沉淀測定。在本發(fā)明的另一種實施方案中，檢測功效的方法可以包括測量一種或多種第二信使例如cAMP或者磷脂，優(yōu)選磷脂酰肌醇磷酸酯。該測量可包括測定一種或多種第二信使的濃度。測定一種或多種第二信使的濃度的手段和方法是本領域技術人員熟知的，包括涉及例如標記的前體優(yōu)選標記的第二信使前體(例如[32P]ATP或者[3H]肌醇)的那些，其中包括通過例如柱色譜或者質(zhì)譜純化。磷脂的改變通常在鈣通道處尤其相關。如果審議中的離子通道例如NHE或者鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白影響pH值，則通過本發(fā)明方法測定的作用是PH值的改變，優(yōu)選細胞內(nèi)pH值的改變。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，離子通道配體對審議中的離子通道例如NHE或者鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的作用通過熒光測定。熒光是一種光學現(xiàn)象，其中光子的分子吸收引發(fā)以更長的波長發(fā)射另一光子。吸收光子與發(fā)射光子之間的能量差以分子振動或者熱形式耗散。通常，吸收光子在紫外光區(qū)而發(fā)射光在可見光區(qū)，但是這取決于具體熒光團的吸收曲線和斯托克位移。熒光應用在生物醫(yī)學和相關科學中越來越廣泛。在些領域中的分析方法也越來越多，盡管是日益增多的以縮寫形式的令人遺憾的命名FLIM、FLI、FLIP、CALI, FLIE、FRET、FRAP、FCS, PFRAP、 smFRET、FIONA、FRIPS、SHREK、SHRIMP、TIRF。這些技術的大多數(shù)依賴于熒光顯微鏡。這些顯微鏡使用高強度的光源(通常汞或者氙的燈、LED或者激光)來在待觀測的樣品中激發(fā)熒光。然后濾光片將激發(fā)光與發(fā)出的熒光分開，用眼睛或者(CCD)相機或其它光檢測器(光電倍增管、攝譜儀等)檢測。為了檢測審議中的信號(此處為離子通道配體的作用)，通常使用熒光染料或者標志或標記。熒光染料包含熒光團。類似于生色團，熒光團是引起分子發(fā)熒光的分子成分。 它是分子中將吸收特定波長能量再發(fā)出不同(但也是特定的)波長的能量的官能團。發(fā)出的能量的數(shù)量和波長取決于熒光團和該熒光團所處的化學環(huán)境。異硫代氰酸酯熒光素(熒光素的反應衍生物)已經(jīng)成為一種最常見的與其它非熒光性分子進行化學連接以產(chǎn)生用于各種應用的新的熒光性分子的熒光團。其它歷史上常用的熒光團是若丹明、香豆素和花青的衍生物。熒光染料的實例包括但不限于7-氨基-放射菌素D、吖啶橙、吖啶黃、Alexa Fluor、AnaSpec、金胺0、金胺-若丹明染色劑、苯并蒽酮、9，10-二(苯基乙炔基)蒽、5， 12-二(苯基乙炔基)丁省、CFDA-SE、CFSE、鈣黃綠素、羧基熒光素、l-氯-9，10-二(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9，10-二 (苯基乙炔基)蒽、香豆素、花青、DAPI、Dioc6、DyLight Fluor、溴化乙錠、熒光素、Fura-2、Fura_2-乙酰氧基甲基酯、綠色熒光蛋白、Hilyte Fluor、Hoechst 染色劑、Vidian黃、Indo-Ι、熒蟲素、二萘嵌苯、藻膽色素、藻紅蛋白、藻紅素、碘化丙錠、熒光黃(pyranine)、若丹明、RiboGreeru紅熒烯、三(4，7-二苯基-1，10-菲繞啉酯)釕(II) (ruthenium(II) tris (bathophenanthroline disulfonate))、STOR 綠、均二苯乙烯、磺酰羅丹明101、TSQ、Texas紅、傘形酮、黃色熒光蛋白或者BCECF。根據(jù)一種優(yōu)選的實施方案，使用BCECF。BCECF為2'，7'-雙(羧乙基)_5 (6)-羧基熒光素，C27H2tlO11),M = 520，45g/mol，CAS 號:85138-49_4，存儲；2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基熒光素的類似物，由于其在細胞內(nèi)增強的保留因而能更好地用于在淋巴細胞中PH測定。為了充分攝入完整細胞中，BCECF可以以乙酰氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在細胞內(nèi)剪切成更不能滲透的BCECF。70nM的BCECF溶液的最大激發(fā)位于500nm。BCECF的熒光強度可以受到幾種試劑的影響，所述試劑例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。 BCECF的適當濃度為5 μ M(最終濃度)。在本發(fā)明的上下文中，熒光染料對于離子通道配體對離子通道的作用是敏感的。 該作用可以是對通道本身的直接作用(例如構(gòu)象變化、結(jié)合特性的變化等)或者審議中的離子通道的下游的信號途徑變化，具體是通過審議中的離子通道轉(zhuǎn)運的離子的細胞內(nèi)濃度變化。所述離子可以是例如H+、HC0” K+、Na+、Cl—或者Ca2+。適當?shù)膒H依賴性熒光標志 (針對H+和HCO3-)包括但不限于H+選擇性熒光生色團ETH 5294, S NAFL, SNARF, HPTS、熒光素、羧基熒光素、BCECFO' ,7' -二(2-羧乙基)5(和6)羧基熒光素)和BCPCFO'， 7' -二(2-羧丙基)-5(和6)羧基熒光素)。鈣離子可通過使用下面物質(zhì)檢測水母素 (待分離的第一發(fā)光蛋白)、用Alexa-488或者photina標記的鈣調(diào)蛋白(Axxam SpA，意大利米蘭)、Fluo4 (甘氨酸，N-[4-[6-[(乙?；趸?甲氧基]_2，7- 二氟-3-氧代-3H-夾氧雜蒽-9-基]-2-[2-[2-[ 二 [2-[(乙?；趸?甲氧基]-2-氧代乙基]氨基]-5-甲基苯氧基]乙氧基]苯基]-N-[2-[(乙?；趸?甲氧基]-2-氧代乙基]-，(乙?；趸?甲基酯，C51H50F2N2O23)，M = 1096. 95g/mol, CAS 號:273221-67-3,存儲2 至 8 °C，避光)或者Fura-2(5-噁唑羧酸，2-(6-( 二乙酰基氧基)甲氧基)_2_氧代乙基)氨基)-5-0-(2-( 二(2-((乙?；趸?甲氧基)-2-氧代乙基)氨基)-5-甲基苯氧基)乙氧基)-2-苯并呋喃基)_(乙酰基氧基)甲基酯，C44H47N3O24)，M = 1001. 86g/mol, CAS號 108964-32-5，存儲-20°C，避光)。為了檢測鈉離子和鉀離子，可使用離子載體X和離子載體BME-44。上述方法可如下進行，其中下面僅供示例說明用。本領域技術人員會理解可以以不同方式進行一個或多個步驟(例如如本發(fā)明的說明書所述)細胞可以通過從組織中分離來獲得，用于離體培養(yǎng)。例如可將組織的片段置于生長培養(yǎng)基中，長出的細胞可用于培養(yǎng)。該方法被稱為移植培養(yǎng)。作為選擇，可使用細胞系 (例如確立或者永生化細胞系)。存在許多種代表具體細胞類型的確立細胞系(也參見前述)O細胞可培養(yǎng)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基(例如可商購的包含血清和抗生素的培養(yǎng)基)。細胞通常培養(yǎng)在適當?shù)姆諊?例如5% CO2)、相對濕度(例如90% )和溫度(例如在37°C )中。 為了高通量篩選和/或常規(guī)操作，細胞可培養(yǎng)在多孔板例如96孔板、M孔板等。如上所詳述，可使用熒光標志測定細胞內(nèi)pH變化。適當?shù)臉酥景⊿NARF-I、 BCECF和CMFDA。激發(fā)和發(fā)射是激發(fā)485，發(fā)射590nm(對于羧基SNARF-1)；激發(fā)500，發(fā)射538nm(對于BCECF)；以及激發(fā)485，發(fā)射538nm(對于CMFDA)。激發(fā)和發(fā)射帶寬可以分別是20nm和25nm。測量細胞內(nèi)pH的適當裝置例如是FLUOstar 97熒光計多孔板讀數(shù)器 (BMGLabTechnologies, Inc, Durham, NC)或者實施例中所述的裝置。
根據(jù)一種實施方案，使用熒光染料BCECF，即2'，7' -二(羧乙基)_5 (6)-羧基熒光素，C27H2tlO11)，M= 520，45g/mol，CAS 號:85138-49_4，存儲2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基熒光素的類似物，由于其在細胞內(nèi)增強的保留因而能更好地用于在淋巴細胞中PH測定。為了充分攝入完整細胞中，BCECF可以以乙酰氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在細胞內(nèi)剪切成更不能滲透的BCECF。70nM的BCECF溶液的激發(fā)最大位于500nm。BCECF的熒光強度可以受到幾種試劑的影響，所述試劑例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。BCECF 的適當濃度為5 μ M(最終濃度)。下面是制備用于細胞內(nèi)PH測定的細胞的一個示例性方法細胞可以生長至例如 90%鋪滿，用例如胰蛋白酶收獲，并立即用含有例如10%胎牛血清的培養(yǎng)基淬滅，造粒，然后淋洗1次。將細胞粒再混懸于新鮮的培養(yǎng)基中，使其復原(例如在5%C02，37°C條件下1 小時)，用例如不含碳酸氫鹽的緩沖液(例如130mM NaCl,4. 7mM KCl、1. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES，pH 7.4)淋洗例如兩次，然后加載上面的標記物(染料)。根據(jù)另一實施方案，在加載染料之前，細胞未用胰蛋白酶處理。染料加載例如可以如下進行在室溫將細胞用5 μ M的5-(和-6)-羧基SNARF-I/ AM (Molecular Probes, Eugene, OR)溫育在不含碳酸氫鹽但含有 (wt/vol) Pluronic F-127 (Sigma Chemicals, St Louis,MO)的Krebs-H印es 緩沖液(pH 7.4)中 30 分鐘。細胞可以在室溫在緩沖液中用例如ΙμΜ的2，7-二(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素(BCECF/ AM) (Molecular Probes)加載45分鐘。細胞可以在37°C在緩沖液中用5 μ M CellTracker 綠色CMFDA(5-氯甲基熒光素二乙酸酯)(Molecular Probes)加載45分鐘。用一種或多種其它上述染料加載可以根據(jù)合適且熟知的規(guī)程類似地進行。在加載之后，細胞可以例如用緩沖液淋洗一次或多次(例如2次)，并再混懸于新鮮的培養(yǎng)基中，使其在5% CO2于371復原1小時或更長時間(例如過夜)。在染料加載和復原時間之后，可將細胞用合適的緩沖液例如不含碳酸氫鹽的Krebs-ifepes緩沖液(pH 7. 4或者6. 0)淋洗一次或多次(例如3次)，再混懸成最終濃度2. 5x IO6個細胞/毫升并保持在4°C。細胞可稀釋和平均地分布(約35000個細胞/孔)至不透明的白色96孔板(或者任何其它適當?shù)陌澹缇哂型该鞯椎暮谏?。血漿和僅僅的緩沖液或者含有配體的緩沖液可先后注入各孔中，并以合適的間隔(例如20秒)記錄熒光強度。在各注入之前，以合適的間隔(例如20秒間隔)記下幾個(例如5個)基線讀數(shù)。在各實驗結(jié)束時，用已知的離子通道配體(例如針對H+/K+交換蛋白，尼日利亞菌素)進行原位校準的方法可用于使熒光強度與PH值相關。這例如可以如此完成通過使細胞在去極化高 K+緩沖液(140mM KClU. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES, pH 6. 0至8. 0，在20 μ M尼日利亞菌素存在下)中暴露于不同的pH緩沖液，將K+/H+交換蛋白離子載體設置[K+]o= [K+] i和pHo = pHi。為了校正校準與實驗之間的小的細胞密度偏差和照明強度不穩(wěn)定，通過在各實驗結(jié)束時用0. 1% Triton X-100 透化處理細胞并用KOH調(diào)節(jié)pH至11來測量CMFDA濃度。此外，可通過分離出來自漏出的和細胞內(nèi)染料的貢獻來跟蹤染料漏出。為此，可將細胞以不同時間間隔離心例如30秒。然后，可測量各上清液和再懸浮細胞裂解物溶液的熒光強度。上清液的熒光強度反映染料從細胞中漏出，上清液和細胞裂解物的合并熒光強度
10可用于定義染料的總量。對照(沒有染料)的熒光強度可從各部分中減去，漏出可報道為熒光強度(上清液/總量)之比對時間的關系。進一步示例性方法描述在下面的實施例中。作為選擇，離子敏感性微電極(包括離子選擇性離子載體例如鈉離子載體二 (12-冠醚-4)，鉀離子選擇性離子載體二(苯并-15-冠醚-5)，鈣離子選擇性離子載體HDOPP-Ca)或者離子敏感性酶(例如鉀依賴性脲酰胺分解酶、丙酮酸激酶(美國專利 5，501，958和5，334，507)或者甘油脫氫酶(美國專利5，719，036))可以用于檢測穿過細胞膜的離子流出。其它PH敏感性方法包括弱酸或堿的分布、31P-NMR光譜和pH敏感性綠色熒光蛋白[GFP]。優(yōu)選地，采用高通量篩選的方法。在該方法中，針對審議中的離子通道，在全細胞測定中對大量化合物進行篩選。通常，這些篩選利用基于自動機器工作臺的技術或者以較高密度陣列(“芯片")格式在96孔板中進行。在本發(fā)明方法的一種實施方案中，將離子通道配體例如NHE配體給藥于細胞以及血漿。這可通過將配體給藥于非人類動物來實現(xiàn)。配體可以以任何適當?shù)耐緩浇o藥，包括腸胃外(例如靜脈、動脈內(nèi)、肌肉、心內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi))，腸內(nèi)(例如口腔或者直腸)，表面(例如上表皮、吸入、鼻內(nèi)或者陰道)等給藥。優(yōu)選喂食給藥。在足以使配體存在于血漿中的時間量之后，對動物采集血漿。為了實施本發(fā)明方法，將包含配體的血漿加入細胞中，測定配體對細胞的作用。該作用的測定可包括測定血漿中配體濃度(同樣參見實施例幻。如果將給藥于動物的配體的量與血漿中存在的配體量進行比較，則可從該比較中得出關于例如吸收的程度和速率以及配體的分布、代謝和排泄的結(jié)論。根據(jù)本發(fā)明，測定離子通道配體作用的方法可用于測定配體的血漿濃度。這可通過將具有未知配體濃度的血漿的作用與標準例如標準曲線進行比較來完成(參見例如實施例2)。本發(fā)明方法可用于篩選預防和/或治療涉及離子通道機能障礙的疾病尤其是預防和/或治療心血管疾病或者癌癥的藥物。如果用于篩選目的，測試的配體可以是已知的離子通道配體或者功能仍然未知的或者還未與離子通道相關的物質(zhì)。因此，本發(fā)明方法可以用于確認新的離子通道配體。作為選擇，可利用本發(fā)明方法對已知的離子通道配體測試其功效。可將該功效與在不含血漿的系統(tǒng)中的配體作用(例如結(jié)合親合力)進行比較，從而評價血漿對配體活性的影響和估計配體的體內(nèi)活性。配體可以以化合物庫的形式提供?；衔飵彀ù罅炕衔铮⑶覅R編自多種來源中的任一種(包括化學合成的分子和天然產(chǎn)物)，或者通過組合化學技術產(chǎn)生。它們尤其適于高通量篩選。它們可以由具有特定結(jié)構(gòu)的化合物或者特定生物例如植物的化合物構(gòu)成。在本發(fā)明的上下文中，所述化合物庫優(yōu)選包含小分子的化合物庫。下面通過附圖
和實施例來說明本發(fā)明，這不意在限制本發(fā)明的范圍。附1顯示在大鼠血漿中的計算功效的卡立泊來德校準曲線(EC5tl = 115nM)。圖2顯示在大鼠血漿中的計算功效的新型化合物X校準曲線(EC5tl = 662nM)。圖3顯示利用NHEl體外測定估計的卡立泊來德和化合物X血漿濃度。實施例實施例1 建立一種測定來確定在動物血漿樣品中NHE拮抗劑有效濃度血漿樣品得自新西蘭雄兔(2. 5-3. 5kg)，該標準兔子食用0. 3 %卡立泊來德(NHE 抑制劑)。在一周之后從耳動脈采取血樣，用于測定卡立泊來德的血漿濃度。測定卡立泊來德的血漿濃度如下所述進行將NHE-基因(SLC9A1，F(xiàn)ranchi A. etal. ,Proc Natl Acad Sci USA.，1986Dec ； 83(24) =9388-92.)克隆至pMamneo-載體然后引入到LAPl (小鼠LTK-細胞系)細胞中。穩(wěn)定的細胞系由轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生。將穩(wěn)定表達人NHEl (hNHEl)的LAPl (小鼠LTK-細胞系)細胞以密度25，000個細胞/孔/100 μ 1培養(yǎng)基(Iscove-培養(yǎng)基，10%FCS，2mM L-谷氨酰胺，100u/ml青霉素/鏈霉素，50 μ g/ml慶大霉素，400 μ g/ml G418)在透明底的96孔黑色微量板(Costar , Corning Inc.，Corning, NY)上接種。將細胞在37°C>5% CO2和90%濕度的條件下溫育過夜。在測量之前棄去培養(yǎng)基，并加入100 μ 1/孔的染料緩沖液OOmM HEPES,用KOH調(diào)節(jié)至ρΗ 7. 4， 20mMNH4Cl，115mM 氯化膽堿，ImM MgCl2, ImM CaCl2, 5mM KC1，5mM 葡萄糖，5 μ M BCECF)。在 37°C溫育20分鐘之后，用不含Na+的洗滌緩沖液(5mM HEPES，用KOH調(diào)節(jié)至ρΗ 7.4,133. 8mM 氯化膽堿，4. 7mM KCl，1. 25mM CaCl2,1. 25mM MgCl2,0. 97mM K2HPO4,0. 23mM KH2PO4, 5mM葡萄糖)洗滌細胞3次，使每孔剩余90μ 1洗滌緩沖液。用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices, Sunnyvale, CA ；激光功率 0. 3W，孔徑 4，測量間隔 k，測量時間 120s)測量ρΗ恢復。在測量期間，向各孔加入90 μ 1血漿溶液(90%的來自未喂食拮抗劑的動物的動物血漿，10%的Na+-緩沖液IOmM HEPES，用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.4,133. 8mM NaCl, 4. 7mM KCl，1. 25mM MgCl2,1. 25mM CaCl2,0. 97mM Na2HPO4,0. 23mM NaH2PO4, 5mM 葡萄糖)。由于緩沖液中的Na+，NHEl開始從細胞中轉(zhuǎn)運出H+，導致細胞內(nèi)ρΗ升高和產(chǎn)生熒光。高對照 血漿溶液，無拮抗劑。低對照血漿溶液，具有20 μ M卡立泊來德(10 μ M最終濃度)。在制備后將卡立泊來德加入血漿中。加入10 μ M卡立泊來德導致完全阻斷NHEl活性。為了校準，在制備后將不同量的卡立泊來德和測試拮抗劑加入血漿中以確定在動物血漿中的功效。為了計算NHEl活性，計算第12秒和第32秒之間的熒光增大。高對照設為100% 的NHEl活性，而低對照確定為0%的NHEl活性。樣品通過與對照進行比較來計算樣品的％ 活性。表1 用源自兔子的血漿進行的血漿測定實施例
權(quán)利要求
1.測定離子通道配體的功效的方法，其包括下面步驟a)使表達離子通道的細胞與下面物質(zhì)接觸i)動物血漿，和ii)離子通道配體；以及b)測定離子通道配體對細胞的作用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述離子通道是鈉-質(zhì)子-交換蛋白(NHE)或者鈉-碳酸氫根-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述NHE是NHEl、NHE2、NHE3或者NHE5，尤其是NHEl 或者NHE3，特別是NHE1。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述離子通道配體尤其NHE配體，是激動劑或者拮抗劑，尤其是NHE拮抗劑。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞是細胞系，具體是哺乳動物細胞系， 特別是人或小鼠細胞系，尤其是小鼠LTK-細胞系LAP1。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述動物是脊椎動物，具體是哺乳動物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者貓。
7.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述動物是人。
8.權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其中所述作用是改變pH值。
9.權(quán)利要求1至8中任一項的方法，其中所述作用是改變細胞內(nèi)pH值。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的方法，其中所述作用通過熒光得到測定。
11.權(quán)利要求1至6和8至10中任一項的方法，其中NHE配體已被給藥于所述動物，該動物是非人類動物。
12.權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其中所述方法用于測定配體的血漿濃度。
13.權(quán)利要求1至12中任一項的方法，其中所述方法用于篩選用來預防和/或治療涉及離子通道機能障礙的疾病的藥物。
14.權(quán)利要求1至13中任一項的方法，其中所述方法用于篩選用來預防和/或治療心血管病或者癌癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定離子通道配體的功效的方法，包括(a)使表達離子通道的細胞與(i)動物血漿和(ii)離子通道配體接觸，以及(b)測定離子通道配體對細胞的作用。
文檔編號G01N33/58GK102227640SQ200980147360
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者厄休拉·欣德勒, 托馬斯·利徹, 斯蒂芬·謝弗, 漢斯-威利·詹森 申請人:賽諾菲-安萬特