專利名稱：對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型特異的配體的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及鑒定對(duì)蛋白同工型具有結(jié)合特異性的配體的方法。
背景技術(shù)：
從正常的可溶性蛋白到構(gòu)象改變的、不可溶的聚集物的裝配和去裝配的過(guò)程，被認(rèn)為是很多種疾病的致病過(guò)程。一些不可溶的蛋白和它們的相關(guān)疾病的實(shí)例包括，但不限于，在阿耳茨海默(氏)病和大腦淀粉樣血管病中的β-肽；在帕金森病中向心性多層圓形小體(盧伊體)中的α-synuclein沉積物，額顳癡呆以及皮克病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau蛋白；肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化中的超(過(guò))氧化物歧化酶；以及亨延頓(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。人轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白(transthyretin)到淀粉樣原纖維中的異常自裝配導(dǎo)致兩種類型的人類疾病，即老年性全身淀粉樣變性病和家族性淀粉樣多神經(jīng)病。朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象變化似乎涉及可傳播性海綿狀腦病(TSEs)，如克雅(氏)病(或皮層-基底節(jié)-脊髓變性癥候群(CJD))的神經(jīng)退化過(guò)程。
通常，這些高度不可溶的蛋白形成聚集物，該聚集物由具有β折疊片層構(gòu)象特征的原纖維組成。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，淀粉狀蛋白可以存在于大腦和腦膜血管(腦血管沉積物)以及腦薄壁組織中(斑)。形成神經(jīng)炎斑的精確機(jī)制以及聚集物與疾病相關(guān)的神經(jīng)退化過(guò)程的關(guān)系在很大程度上是未知的。
天然或者細(xì)胞朊病毒蛋白“PrPc”廣泛分布于哺乳動(dòng)物中，并且具有特別的非常保守的氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)。認(rèn)為傳染性朊病毒蛋白是由正常細(xì)胞(PrPc)朊病毒蛋白的修飾形式構(gòu)成，并且稱作“PrPsc”(表示蛋白的瘙癢癥形式)；稱作“PrPcjd”(表示蛋白的CJD形式)；以及稱作“PrPres”(表示蛋白的蛋白酶K(PK)抗性形式)。朊病毒蛋白與其它傳染性病原體有一些共同的特性，但是看起來(lái)其中并不含有核酸。換句話說(shuō)，認(rèn)為翻譯后的構(gòu)象變化與非傳染性的PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)閭魅拘缘腜rPsc有關(guān)，其中發(fā)生了α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊。PrPc含有三個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)以及很少的β-折疊結(jié)構(gòu)；與之相反，PrPsc富含β-折疊。相信PrPc到PrPsc的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了可傳播性海綿狀腦病(TSEs)的發(fā)展，其中，PrPsc積累于中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且同時(shí)伴隨著神經(jīng)病理學(xué)的變化以及神經(jīng)學(xué)上的功能紊亂。傳染性形式的朊病毒蛋白被認(rèn)為對(duì)于在動(dòng)物和人中的可傳播的神經(jīng)退化疾病的傳播和致病機(jī)理是必要的，并且很可能是充分的。(參見Prusiner 1991Science 2521515-1522)。
傳染動(dòng)物的TSE疾病的實(shí)例包括，但不限于，侵襲綿羊的羊瘙癢癥，侵襲牛的牛海綿狀腦病(BSE)或“瘋牛病”，可傳播的水貂腦病(TME)，以及鹿和駝鹿的慢性消耗病(CWD)。人TSE疾病的范圍包括，但不限于，苦魯病、克雅(氏)病(或皮層-基底節(jié)-脊髓變性癥候群(CJD))，格-施-沙綜合征(Gerstmann-Straüssler-ScheinKer(GSS))，致命性家族失眠癥。最近，已經(jīng)有跡象，BSE對(duì)大量的其它動(dòng)物包括人具有傳染性。該疾病的人類形式被稱作變體CJD(vCJD)。
需要能便于區(qū)分或者能分辨蛋白的兩種或者更多種不同構(gòu)象形式，如PrPc和PrPsc的方法學(xué)，從而理解這種轉(zhuǎn)變的過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)形式發(fā)生特異地相互作用的結(jié)構(gòu)。區(qū)分或者分辨同工型的目前的方法學(xué)包括在存在如尿素的離液劑條件下，在聚丙烯酰胺凝膠上的差別遷移率，尤其是橫向尿素梯度(TUG)凝膠；對(duì)于蛋白酶處理如PK處理的差別敏感性，檢測(cè)被稱作PrPres的PrPsc之PK-抗性消化產(chǎn)物；通過(guò)磷鎢酸鈉的示差沉淀；差別溫度穩(wěn)定性；在非離子去垢劑中的相對(duì)溶解性；以及纖維性結(jié)構(gòu)結(jié)合某些化學(xué)物質(zhì)如剛果紅和異黃酮S的能力。然而，仍需要鑒定對(duì)構(gòu)象改變的蛋白，特別是與疾病相關(guān)的蛋白具有高親合性的配體或試劑。這樣的配體或試劑可用于多種用途，包括但不限于，開發(fā)可能的診斷試劑盒；分離和純化蛋白的不同形式；從治療試劑、生物制品、疫苗和食品中去除該疾病的傳染性形式以及用于治療。

發(fā)明內(nèi)容
此處提供了用于鑒定配體的方法，所述配體對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型是特異的，所述蛋白的結(jié)構(gòu)同工型也被稱作靶結(jié)構(gòu)同工型。這些配體被用于，例如用于分離、濃縮、或區(qū)分樣品、溶液或復(fù)合混合物中的蛋白的結(jié)構(gòu)同工型和其它靶物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白是朊病毒蛋白，結(jié)構(gòu)同工型是傳染性朊病毒蛋白同工型。
根據(jù)本發(fā)明的某些方面，依照該方法的一個(gè)實(shí)施方案，將一個(gè)或多個(gè)固定化的配體與含有靶蛋白同工型的樣品在足以、或允許引起配體-同工型復(fù)合體形成的條件下接觸。配體或配體-同工型復(fù)合體被固定化在第一支持物上邊或內(nèi)部。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在固定化到第一支持物上之前，測(cè)試配體文庫(kù)被固定化在固相，例如但不限于，聚合珠子上，產(chǎn)生大量帶有不同配體的珠子，有單一、獨(dú)特的測(cè)試配體的多個(gè)拷貝存在于珠子表面上。這些珠子隨后被固定化在第一支持物上面或內(nèi)部。用這種方式，配體被間接地固定化在第一支持物上。
另外，測(cè)試配體通過(guò)與第一支持物如膜或凝膠直接偶聯(lián)而被固定。例如，配體文庫(kù)被固定在第一支持物上，如二維陣列，其中每一種類的測(cè)試配體被置于陣列中的唯一位置上。從而，基于蛋白同工型與特異測(cè)試配體的相互作用，蛋白同工型在陣列中的唯一位置上被捕獲。
在復(fù)合體固定化在第一支持物上之后，檢測(cè)配體-同工型復(fù)合體。檢測(cè)是與配體-同工型復(fù)合體直接相關(guān)的，如珠上檢測(cè)(on-beaddetection)，或間接地相關(guān)，如化學(xué)發(fā)光信號(hào)在X射線膜上的捕獲。
然后同工型被轉(zhuǎn)移到第二支持物，并且固定化在其上，以便它們存在于與第一支持物上的固定化作用位置相對(duì)應(yīng)的位置上。優(yōu)選地，同工型被從配體分離下來(lái)，然后被固定化在第二支持物上，留下測(cè)試配體結(jié)合在第一支持物上。然后檢測(cè)固定化在第二支持物上的同工型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶同工型和對(duì)照組同工型都被固定化在第二支持物上，并且靶同工型在第二次檢測(cè)事件之前被修飾，其中所述對(duì)照組同工型在折疊模式或其它二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)上與靶同工型不同。靶同工型可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)修飾，但優(yōu)選地通過(guò)變性或酶促切割來(lái)修飾，以形成與同樣蛋白的靶同工型不相同的同工型。在一個(gè)實(shí)施方案中，被修飾的靶同工型和對(duì)照組同工型都使用檢測(cè)標(biāo)記物在第二支持物上被檢測(cè)。
然后對(duì)齊并且比較第一個(gè)和第二支持物上的檢測(cè)圖案。首先，確定靶同工型在第二支持物上的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，該位置由第二支持物上存在檢測(cè)信號(hào)，以及在第一支持物上不存在對(duì)應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)來(lái)表明，或者相反。因此，第一次檢測(cè)鑒定出同工型的子集或者所有同工型，第二次檢測(cè)鑒定出在第一個(gè)步驟中沒(méi)有檢測(cè)出的同工型的子集，或者相反。正如此處所用，關(guān)于蛋白同工型，術(shù)語(yǔ)“子集”指蛋白的一組同工型。該子集包括從零到所有的蛋白同工型。通過(guò)對(duì)齊第一個(gè)和第二支持物，并且分析或比較，檢測(cè)結(jié)果，可以檢測(cè)、鑒定以及分離與同工型的多種多樣的不同子集最初結(jié)合的配體。也就是，一旦鑒定了第二支持物上的蛋白的唯一位置，就可以確定其在第一支持物上的先前位置(在該位置上蛋白被配體捕獲)，從而導(dǎo)致鑒定和分離負(fù)責(zé)其原始捕獲的配體。
相對(duì)于當(dāng)前可利用的用于鑒定應(yīng)用于分離蛋白結(jié)構(gòu)同工型的配體的方法，此處描述的方法提供了多種多樣的優(yōu)勢(shì)。首先，蛋白及其關(guān)聯(lián)配體可以在解離之后被鑒定。不需要事先修正如下所述方法中的任一種方法，蛋白及其配體就可以被鑒定；例如，但不限于，通過(guò)用熒光分子、放射性氨基酸或分子來(lái)標(biāo)記、生物素化作用以及抗體衍生作用。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)移后進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以完全地避免檢測(cè)系統(tǒng)的組分與配體、支持物或系統(tǒng)的其它元件之間的相互作用。其次，由于檢測(cè)方法可以在時(shí)間上和空間上被分開進(jìn)行，所以它們彼此之間不會(huì)干擾，并且可以被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同工型的不同群體。第三，要求變性或失活的方法可以被應(yīng)用在同一程序中；同樣地，也可以在同一程序中使用能維持生物活性的方法，可以維持與其最初結(jié)合的配體的蛋白鑒定配體的能力。最后，區(qū)別蛋白的多種形式的配體可以被鑒定，并且被用于針對(duì)蛋白的不同結(jié)構(gòu)形式或同工型的存在進(jìn)行分離、純化、濃縮或診斷、或其任意組合。這些優(yōu)勢(shì)中沒(méi)有一種優(yōu)勢(shì)可通過(guò)當(dāng)前可獲得的可比技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。


圖1是示意圖，顯示將靶異構(gòu)體和對(duì)照組異構(gòu)體從包埋在瓊脂糖凝膠中的珠子(第一支持物)上轉(zhuǎn)移到膜(第二支持物)上。
圖2是示意圖，顯示針對(duì)PrPsc特異性配體的一種篩選方法，其中未變性的PrPc異構(gòu)體在第一支持物上被檢測(cè)，變性的PrPsc和PrPc同工型在第二支持物上被檢測(cè)；并且其中，將第二支持物檢測(cè)結(jié)果與含有堅(jiān)牢紅染色珠子的第一支持物瓊脂糖凝膠進(jìn)行比較。
圖3是流程圖，示意性代表根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案鑒定PrPsc配體的一種方法。
具體實(shí)施例方式
此處描述了用于鑒定配體(ligand)的方法，所述配體對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型(structural isoform)是特異的，或者具有結(jié)合特異性。這些方法總的來(lái)說(shuō)包括將靶結(jié)構(gòu)同工型與測(cè)試配體結(jié)合，形成同工型-配體復(fù)合體，其中配體或復(fù)合體被固定化在第一支持物上；檢測(cè)第一支持物上的被結(jié)合的同工型；通過(guò)直接的定位轉(zhuǎn)移將同工型轉(zhuǎn)移到第二支持物上；以及檢測(cè)第二支持物上的同工型，從而允許使用扣除鑒定技術(shù)，以便鑒定對(duì)靶結(jié)構(gòu)同工型特異的配體。圖1和2表明了用于在一個(gè)或多個(gè)支持物之間轉(zhuǎn)移同工型的方法、以及扣除鑒定技術(shù)的代表性的非限定性實(shí)例。
配體或復(fù)合體以本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的多種方式被固定化在第一支持物上。例如，配體被直接地或間接地固定化在第一支持物內(nèi)部或其上。術(shù)語(yǔ)“其上”，當(dāng)指代配體附著到支持物上時(shí)，包括配體結(jié)合到支持物的外部或表面，以及將配體包埋在支持物內(nèi)部。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一支持物是固體或半固體物質(zhì)，如凝膠，該物質(zhì)一旦聚合就固化或凝固。在該實(shí)施方案中，第一支持物含有分散在其中的固相，配體結(jié)合在該固相上。例如，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是顆粒，如聚合珠子，該顆粒用結(jié)合配體包被。用這種方式，可以在支持物上的特定位置上維持高濃度的配體。另外，通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的偶聯(lián)方式，配體被直接結(jié)合在支持物上，如在一維或二維陣列或矩陣中。
用含有相關(guān)靶同工型的樣品接觸配體，從而產(chǎn)生同工型-配體復(fù)合體；或者在配體被固定化在第一支持物之前，或者之后進(jìn)行。任選地，對(duì)照組同工型也被固定化在第一支持物上。正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)照組同工型”指與靶同工型具有相同氨基酸序列的蛋白，但在其折疊模式或其它二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)上有所不同。靶同工型，對(duì)照組同工型，或者靶同工型及對(duì)照組同工型，可以在第一支持物上被檢測(cè)。
隨后，靶同工型和，任選地，對(duì)照組同工型，被轉(zhuǎn)移到第二支持物上，所述第二支持物例如但不限于膜，以實(shí)現(xiàn)同工型從第一支持物到第二支持物的直接定位轉(zhuǎn)移。靶同工型、對(duì)照組同工型中的任一種，或者兩者，都在第二支持物上被檢測(cè)，通過(guò)允許第一支持物和第二支持物的對(duì)齊，并且使用扣除鑒定技術(shù)確定結(jié)合到第一支持物上的靶同工型的配體的位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第二個(gè)檢測(cè)步驟之前，靶同工型被修飾。
此處描述的靶結(jié)構(gòu)同工型和對(duì)照組結(jié)構(gòu)同工型蛋白包括具有多于一個(gè)結(jié)構(gòu)同工型的任何蛋白的同工型，所述結(jié)構(gòu)同工型包括但不限于，朊病毒蛋白同工型；正如阿耳茨海默(氏)病和大腦淀粉樣血管病中涉及的β-肽同工型；α-synnuclein同工型；額顳癡呆以及皮克病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau蛋白同工型；肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化中的超(過(guò))氧化物歧化酶；亨廷頓(huntingtin)同工型；以及人轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白的同工型蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)同工型蛋白是傳染性或?qū)е录膊〉耐ば?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)同工型蛋白是朊病毒蛋白，例如但不限于，PrPc、PrPsc或PrPres。
定義正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“這個(gè)(the)”的定義指“一個(gè)或更多個(gè)”，并且除非在上下文中認(rèn)為不適當(dāng)?shù)那闆r下，還包括復(fù)數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“肽”“多肽”和“寡肽”被交替使用，此處被定義為氨基酸鏈，其中碳通過(guò)一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基之間的縮合反應(yīng)形成的肽鍵連接。
術(shù)語(yǔ)“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然和廣泛地表達(dá)于哺乳動(dòng)物的體內(nèi)。其結(jié)構(gòu)高度保守并且與疾病狀態(tài)不相關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“PrPsc”是指PrPc分子的構(gòu)象改變形式，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)為該分子與疾病相關(guān)，例如，但不限于，TSE/朊病毒疾病，包括vCJD、CJD、庫(kù)魯病、致命性失眠癥、GSS、搔癢癥、BSE、CWD以及被捕獲動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的其它TSE。PrPsc具有與正常的細(xì)胞PrPc相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋變成了β折疊，其與疾病狀態(tài)相關(guān)。因此，術(shù)語(yǔ)“PrPsc”包括被稱作“PrPtse”和“PrPcjd”形式的朊病毒蛋白形式。
術(shù)語(yǔ)“PrPres”是指PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍生物，27-30kDa，其在用PK進(jìn)行PrPsc的部分消化后保留下來(lái)。
術(shù)語(yǔ)“PrPr”是指通過(guò)重組技術(shù)表達(dá)的朊病毒蛋白。
術(shù)語(yǔ)“PrP”是指朊病毒蛋白的總稱。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)...特異的”或“對(duì)...具有結(jié)合特異性”，可以與術(shù)語(yǔ)“關(guān)連的(cognate)”交替使用，當(dāng)指代配體時(shí)，是指以充分親和性和親和力結(jié)合到靶蛋白上、導(dǎo)致產(chǎn)生配體-靶蛋白復(fù)合體的配體。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)同工型”指僅僅在它們的折疊模式或其它二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)上有所不同，但具有相同的一級(jí)氨基酸序列的蛋白的形式。
術(shù)語(yǔ)“3F4抗體”是指對(duì)于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或者PrPres，具有特異性的單克隆抗體。該抗體對(duì)于倉(cāng)鼠和人PrPc、PrPsc和PrPres的變性形式有特異性。
配體術(shù)語(yǔ)“配體”指蛋白能與其結(jié)合的分子，包括但不限于，小分子、肽、蛋白、多糖或核酸。優(yōu)選的測(cè)試配體是肽，尤其是由1到大約15個(gè)氨基酸殘基組成的肽。肽配體可以通過(guò)用于產(chǎn)生組合文庫(kù)的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生，如“剪接、偶聯(lián)、重組”方法，以及通過(guò)文獻(xiàn)中描述的其它方法。例如參見，F(xiàn)urka等人，Int.J.Peptide Protein Res.，37，487-493(1991)；K.S.Lam等人，Nature，354，82-84(1991)；PCT Publication WO92/00091；U.S.Patent No.5,133,866；U.S.Patent No.5,010,175；U.S.Patent No.5,498,538。肽文庫(kù)的表達(dá)由Devlin等人在Science，249，404-406(1990)中描述。使用本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，配體的大量文庫(kù)可以通過(guò)一系列的偶聯(lián)反應(yīng)直接合成到珠子上，隨后該珠子被固定化在第一個(gè)固體支持物上；或者在珠子上合成，切割，然后附加到第一個(gè)固體支持物上；或者直接合成到第一個(gè)固體支持物上。典型地，配體被合成到珠子上，這樣就可以在每一個(gè)珠子上合成單一配體的多個(gè)拷貝。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也將意識(shí)到，配體可以通過(guò)共價(jià)附著、直接地或通過(guò)連接分子結(jié)合到珠子或第一個(gè)固體支持物上。
支持物正如上面所說(shuō)明的，此處描述的方法包括靶同工型在兩個(gè)或多個(gè)支持物之間的直接定位轉(zhuǎn)移，以允許差別檢測(cè)在每一個(gè)支持物上的同工型，以及隨后使用扣除鑒定技術(shù)鑒定對(duì)一種同工型具有結(jié)合特異性的配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了第一支持物和第二支持物。術(shù)語(yǔ)“支持物”指能將配體或同工型固定化在其中或其上的任何材料。同工型可以被附著到固定化在支持物上的配體上，或者同工型本身可以被固定化在支持物上。例如，優(yōu)選地，配體被固定化在第一支持物上，同工型被結(jié)合到該固定化配體上，但是，只有同工型(不是配體)被轉(zhuǎn)移到并且固定化在第二支持物上。術(shù)語(yǔ)“被固定化”指分子臨時(shí)且半永久保留在支持物上的特定位置上。同工型被臨時(shí)地固定化在支持物上，直到它們轉(zhuǎn)移到另一個(gè)支持物上，并且配體優(yōu)選地半永久地固定化在支持物上，以便同工型的轉(zhuǎn)移也不影響配體的轉(zhuǎn)移。
盡管優(yōu)選的第一支持物是含有固相物質(zhì)如聚合珠子的凝膠，如瓊脂糖凝膠，但第一支持物也可以包括配體被直接偶聯(lián)到其上以形成陣列的任何材料。正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“陣列”指空間陣列，如分子在固體支持物上的排列，并且包括一維排列，二維排列，三維排列，環(huán)狀排列或其任何修飾或改變。大量的多孔基質(zhì)可用作第一支持物材料，包括但不限于，合成的聚合物，如聚丙烯酰胺、明膠、脂多糖和硅酸鹽。第一支持物也由玻璃、硝化纖維、硅、或聚乙烯基二氟化物尼龍組成。
當(dāng)珠子或顆粒被用作第一支持物的組分時(shí)，配體以上面提供的任何方式附加到珠子上。珠子可以是能形成顆粒的任何材料，包括但不限于，丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、葡萄糖、瓊脂糖、纖維素、多糖、親水烯類聚合物、C鹽、瓊脂糖凝膠、其聚合衍生物及其組合。特別優(yōu)選的珠子材料是聚羥基化甲基丙烯酸酯聚合物，更優(yōu)選的是ToyopearlTM650-M氨基樹脂(Tosoh BioScience，Montgomeryville，PA)。多種其它的甲基丙烯酸酯聚合物樹脂可商購(gòu)獲得，通常以珠子形式應(yīng)用。應(yīng)該理解到，在用含有同工型蛋白的樣品接觸之前、過(guò)程中或之后，負(fù)載有配體的珠子可以被固定化在第一支持物上或其中。應(yīng)該進(jìn)一步理解到，配體可以直接附著在支持物上，直接在支持物上合成，和/或直接包埋在支持物中，而不是首先附著在珠子上。
根據(jù)此處描述的方法，將同工型從第一支持物轉(zhuǎn)移到第二支持物。靶同工型，以及任選地對(duì)照組同工型，使用本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法在支持物之間被轉(zhuǎn)移，所述方法包括但不限于毛細(xì)管作用。用于將同工型轉(zhuǎn)移到第二支持物上的代表性試劑包括，但不限于，水、鹽溶液、含有變性試劑的溶液，如鹽酸胍、有機(jī)溶劑、與至少一種同工型與配體之間的結(jié)合作用特異性地競(jìng)爭(zhēng)的化合物，以及在足以從配體去除至少一種同工型的條件下，用于從親和配體上去除蛋白的其它標(biāo)準(zhǔn)試劑。轉(zhuǎn)移的一個(gè)非限定性實(shí)例如圖1中所示例性描述。術(shù)語(yǔ)“第二支持物”指在從第一支持物去除或洗脫之后，能固定化同工型蛋白的任何材料。第二支持物材料包括，例如，硝化纖維、聚二氟乙烯、尼龍和纖維素膜、玻璃和硅。在固定化到第二支持物上之后，檢測(cè)靶同工型和對(duì)照組同工型中的一種或兩者。
這樣的轉(zhuǎn)移的非限定性例子如圖1中示意性描述。術(shù)語(yǔ)“第二支持物”指在從第一支持物去除或洗脫之后，能固定化同工型蛋白的任何材料。第二支持物材料包括，例如，硝化纖維、聚二氟乙烯、尼龍和纖維素膜、玻璃和硅。在固定化到第二支持物上之后，靶同工型和對(duì)照組同工型中的一種或兩者都被檢測(cè)。
修飾在優(yōu)選的實(shí)施方案中，同工型在第一個(gè)檢測(cè)步驟和第二個(gè)檢測(cè)步驟之間被修飾，以便改變檢測(cè)特征。這樣的修飾可以在同工型從第一支持物轉(zhuǎn)移到第二支持物之前、過(guò)程中、或之后發(fā)生。優(yōu)選地，同工型的修飾允許在第一個(gè)和第二個(gè)檢測(cè)步驟過(guò)程中使用一種單一檢測(cè)試劑，盡管仍然產(chǎn)生可以按照扣除鑒定技術(shù)操作的不同的第一個(gè)檢測(cè)集合和第二個(gè)檢測(cè)集合。
檢測(cè)特征可以通過(guò)如下方式來(lái)修飾，即通過(guò)變性或切割同工型，通過(guò)用標(biāo)記物或連接物衍生同工型，通過(guò)修飾或失活同工型的酶促活性，或通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何其它方式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶同工型是PrPsc，其使用變性試劑來(lái)變性。代表性的變性試劑包括鹽酸胍；尿素；β-巰基乙醇；去污劑；硫醇試劑，包括硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇(DTT)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tween和十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)。PrPsc的變性允許通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物如可商購(gòu)的3F4單克隆抗體在第二支持物上檢測(cè)同工型。該特定抗體特異性地與天然PrPc和變性形式的PrPc結(jié)合，以及與PrPsc的變性形式結(jié)合，但不與天然、非變性PrPsc結(jié)合。固定化在第一支持物上的同工型-配體復(fù)合體不被3F4單克隆抗體檢測(cè)到，然而，修飾的同工型當(dāng)固定化在第二支持物上時(shí)將被該抗體檢測(cè)到。在第二支持物上觀察到的檢測(cè)信號(hào)，但不存在于第一支持物上，將表明PrPsc同工型存在于第一支持物上的相應(yīng)位置上。應(yīng)該可以推斷出，在第一支持物上的相應(yīng)位置上固定化的配體將特異性地與PrPsc同工型結(jié)合。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型特異的配體的鑒定通過(guò)實(shí)踐如下步驟實(shí)現(xiàn)用測(cè)試配體在足以導(dǎo)致形成配體-同工型復(fù)合體的條件下接觸含有靶同工型的樣品；將配體-同工型復(fù)合體固定化，并且任選地，將對(duì)照組同工型固定化在第一支持物上；檢測(cè)第一支持物上的同工型；轉(zhuǎn)移同工型至第二支持物上，并且在其上固定化同工型；檢測(cè)第二支持物上的同工型，其中該同工型的可檢測(cè)性在檢測(cè)之前被改變；對(duì)齊第一支持物和第二支持物，并且確定第二支持物上靶同工型的位置，其中該位置由第二支持物上存在檢測(cè)信號(hào)的以及第一支持物上不存在相應(yīng)的檢測(cè)信號(hào)來(lái)表明；確定第一支持物上的靶同工型的位置；并且鑒定該位置上的配體。
在可選擇的實(shí)施方案中，第一支持物和第二支持物之間的差別檢測(cè)通過(guò)使用針對(duì)每一支持物上存在的多個(gè)同工型的不同檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)。在絲氨酸蛋白酶抑制劑如α-1蛋白酶抑制劑(API)的情況下，活性同工型和潛伏同工型均存在。當(dāng)API“翻轉(zhuǎn)”其結(jié)構(gòu)時(shí)，就失去了其活性。對(duì)這些同工型中的一種同工型特異的配體可以通過(guò)用含有API的起始材料溫育它們來(lái)鑒定。然后配體被固定化在凝膠中，用酶溫育，API對(duì)該酶具有活性，如豬彈性蛋白酶。與活性API同工型復(fù)合的配體通過(guò)比色測(cè)定法鑒定。蛋白同工型隨后在非變性條件下從配體轉(zhuǎn)移到第二個(gè)固體支持物如膜上。然后用檢測(cè)標(biāo)記物如檢測(cè)所有形式API的抗體溫育膜。一些配體可能結(jié)合活性和潛伏形式的API，這是有可能的；然而，用該方法，鑒定了僅僅結(jié)合活性形式蛋白的配體。其它實(shí)施方案，包括對(duì)僅僅結(jié)合某些形式的淀粉樣蛋白的配體的鑒定，也應(yīng)該預(yù)期包括在該方法的范圍內(nèi)。
仍然在其它實(shí)施方案中，當(dāng)在第一支持物上檢測(cè)了對(duì)照組同工型和靶同工型之后，靶同工型或?qū)φ战M同工型中僅僅一種被轉(zhuǎn)移到第二支持物上并且在其上被檢測(cè)到時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)第一個(gè)和第二支持物之間的差別檢測(cè)。例如，PK可被用于消化對(duì)照組朊病毒蛋白同工型(PrPc)，并且在第一支持物上將PrPsc靶同工型切割為PK抗性片段，已知為PrPres。這樣的處理導(dǎo)致僅僅PrPres轉(zhuǎn)移到第二支持物上。檢測(cè)標(biāo)記物，如可商購(gòu)的3F4抗體(可以從Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA獲得)，然后可以被用于在第二支持物上檢測(cè)PrPres。第一個(gè)和第二支持物的對(duì)齊顯示了對(duì)PrPsc同工型特異的一種或多種測(cè)試配體的位置。
檢測(cè)在上面描述的幾種檢測(cè)方法中，可檢測(cè)的配體或標(biāo)志物被用于確定蛋白同工型的存在。術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)的標(biāo)志物”或“檢測(cè)方法”指可以用來(lái)確定蛋白的存在的實(shí)體或方法。當(dāng)使用可檢測(cè)標(biāo)志物時(shí)，用于檢測(cè)同工型的特定標(biāo)記物或可檢測(cè)基團(tuán)不是關(guān)鍵的，只要與測(cè)定方法的要求事項(xiàng)是相容性的?？蓹z測(cè)標(biāo)記物可以是具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)特性的任何材料。這樣的可檢測(cè)標(biāo)記物已經(jīng)得到了很好的發(fā)展，并且一般而言，在這樣的方法中使用的任何標(biāo)記物可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法。因此，標(biāo)記物是可以通過(guò)分光鏡的、光化學(xué)的、生化的、免疫化學(xué)的、電子的、光學(xué)的或者化學(xué)的方法檢測(cè)的任何組分。有用的標(biāo)記物包括熒光染料(如，異硫氰酸熒光素，德克薩斯紅，若丹明和類似物)，放射性標(biāo)記物(如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(如LacZ，CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，以及一般在酶免疫測(cè)定(EIA)或者酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)中用作可檢測(cè)酶的其它酶，和比色標(biāo)記物如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯，聚丙烯，膠乳，等等)珠子。標(biāo)記物可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法直接或間接偶聯(lián)到分析所需要材料上。如以上所示，許多標(biāo)記物都可以使用，標(biāo)記物的選擇取決于所需要的靈敏度，化合物偶合的容易性，穩(wěn)定性要求，可以獲得的設(shè)備，對(duì)該測(cè)定法的適宜性和垃圾處理規(guī)定。
非放射性標(biāo)記物通常用間接的方法加上。一般地，第二配體分子(如生物素)共價(jià)結(jié)合于第一配體上。然后第二配體結(jié)合于第三配體(如鏈霉抗生物素)分子，該第三配體分子是固有地可檢測(cè)的，或者共價(jià)結(jié)合于信號(hào)系統(tǒng)，如可檢測(cè)的酶、熒光化合物、或者化學(xué)發(fā)光化合物?？梢允褂枚喾N第二和第三配體。當(dāng)?shù)诙潴w具有天然的第三配體時(shí)，例如，生物素、甲狀腺素或皮質(zhì)醇，第二配體可以用于與標(biāo)記的、天然發(fā)生的第三配體結(jié)合起來(lái)。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可以與抗體組合起來(lái)被予以使用。
第二配體也可以直接偶合到信號(hào)產(chǎn)生化合物上，如，通過(guò)與酶或熒光團(tuán)相連。感興趣的作為標(biāo)記物的酶首選是水解酶，特別是磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化還原酶，特別是過(guò)氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，傘形花內(nèi)酯，等等。化學(xué)發(fā)光化合物包括螢光素和2，3-二氫-2，3-二氮雜萘二酮，如魯米諾。
本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知檢測(cè)標(biāo)記物的手段。所以，例如，在標(biāo)記物是放射性標(biāo)記物的情況下，檢測(cè)方法包括用閃爍計(jì)數(shù)器或在放射自顯影中的照相膠片作。當(dāng)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物時(shí)，可以通過(guò)用合適波長(zhǎng)的光激發(fā)熒光染料，并且檢測(cè)所產(chǎn)生的熒光來(lái)檢測(cè)，如通過(guò)顯微鏡，目測(cè)，通過(guò)照相膠片，通過(guò)使用電子探測(cè)器如電荷耦合器件(CCDs)或光電倍增管，以及類似方法。類似地，酶標(biāo)記物可以通過(guò)提供酶的合適底物，并且檢測(cè)形成的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。最后，簡(jiǎn)單比色標(biāo)記物可以簡(jiǎn)單地通過(guò)觀察與該標(biāo)記物相關(guān)的顏色進(jìn)行檢測(cè)。
應(yīng)該理解到，不同的可檢測(cè)標(biāo)志物的聯(lián)合可以在該方法中使用，以實(shí)現(xiàn)同工型的區(qū)分。本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)志物可以是任何分子或生物學(xué)實(shí)體，其可以以不同方式與多種多樣的同工型相互作用。例如，標(biāo)志物可以是與一種或數(shù)種同工型特異性地互相作用的酶或抗體，通過(guò)雜交與一種或數(shù)種同工型結(jié)合的核酸序列，或在存在一種或數(shù)種同工型的情況下進(jìn)行可檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)的分子實(shí)體。類似地，標(biāo)志物對(duì)蛋白可以是特異的，所述蛋白是與其它生物實(shí)體如輔因子或酶進(jìn)行復(fù)合的蛋白?？梢赃x擇地，蛋白本身可以通過(guò)光譜信號(hào)包括熒光，或通過(guò)分子量或蛋白序列，通過(guò)質(zhì)譜法或其它方式來(lái)直接檢測(cè)。
同工型的鑒定也可以通過(guò)對(duì)同工型本身的生物學(xué)、生物化學(xué)或化學(xué)活性的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是，蛋白可以被轉(zhuǎn)移到另一種支持物上，使用的是蛋白可以保持其生物學(xué)活性的條件。例如，一種同工型可以保持或獲得在不同的同工型中不存在的活性，該活性用于在同工型之間予以區(qū)別的配體之間的區(qū)分。
樣品用于此處描述的方法中的蛋白同工型，可以包括在多個(gè)不同類型的樣品中，包括環(huán)境樣品和生物樣品。同工型可以在樣品中，在純化、半純化中，或在復(fù)合環(huán)境中共存。環(huán)境樣品包括但不限于，來(lái)自如下來(lái)源的水，所述來(lái)源如湖泊、海洋、溪流、河流、含水土層、水井、水處理設(shè)備或改造水。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，樣品含有合成的靶同工型，包括合成的同工型肽，重組的同工型蛋白，合成的核酸同工型種類，組合同工型文庫(kù)，有機(jī)溶劑，來(lái)自土壤、食品、空氣和水供給的提取物，環(huán)境表面的拭樣，及其類似物。
可能含有蛋白同工型的生物樣品的實(shí)例包括但不限于，全血、血液來(lái)源的組合物或組分、血清、腦脊液、尿液、唾液、奶、導(dǎo)管液、眼淚、精液，或者可以是有機(jī)來(lái)源的，包括腦或脾，來(lái)自人或動(dòng)物的組合物、組織勻漿、細(xì)胞勻漿、條件培養(yǎng)基、發(fā)酵液、抗體制劑、植物勻漿和提取物、以及食品，包括營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。其它生物樣品包括含有膠原提取物或腺體提取物的那些生物樣品。正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“血液來(lái)源的成分”和“血液成分”被交替使用，并且意味著包括全血、紅細(xì)胞濃縮物、血漿、富含血小板的部分或血小板含量很少的部分、血漿沉淀物、血漿上清、靜脈免疫球蛋白制劑，包括IgA、IgE、IgG和IgM；純化的凝固因子濃縮物；絲氨酸蛋白酶抑制劑，包括a-1蛋白酶抑制劑、抗-凝血酶III、a2抗纖溶酶；血纖蛋白原濃縮物、和白蛋白；或其它來(lái)源于人或動(dòng)物的多種其它成分。該術(shù)語(yǔ)也包括純化的血液來(lái)源蛋白，是通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)普通的多種方法中的任一種方法，包括離子交換層析、親和層析、凝膠滲透層析、和/或疏水層析，或通過(guò)示差沉淀制備。
含有本發(fā)明的同工型的生物樣品進(jìn)一步包括用于動(dòng)物或者用于人類消費(fèi)的食品或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。例如，生物樣品可以含有來(lái)源于任何動(dòng)物的材料，所述動(dòng)物包括但不限于牛、綿羊、豬、馬、鼠，如小鼠和倉(cāng)鼠；和Cervidae，如鹿和駝鹿動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物來(lái)源材料”指上面描述的材料，以及含有動(dòng)物部分如肌肉、結(jié)締組織和/或組織器官的材料。動(dòng)物來(lái)源的材料進(jìn)一步包括但不限于，骨粉、牛肉、牛肉副產(chǎn)品、綿羊、綿羊副產(chǎn)品、駝鹿、駝鹿副產(chǎn)品、豬肉、豬肉副產(chǎn)品、香腸、火腿、嬰幼兒食品、明膠、果凍、牛奶和兒童配方食品。PrPsc特異性配體的鑒定參考圖3，此處描述了鑒定對(duì)朊病毒蛋白同工型PrPsc特異的，而不是對(duì)PrPc特異的配體的優(yōu)選方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用組合產(chǎn)生的配體文庫(kù)溫育含有PrPc和PrPsc的復(fù)合樣品，其中所述組合產(chǎn)生的配體文庫(kù)是在層析樹脂珠子上合成的，以便每一珠子含有單一的、獨(dú)一無(wú)二的配體的數(shù)百萬(wàn)個(gè)拷貝，并且每一珠子載有一個(gè)不同的配體。優(yōu)選地，樣品是來(lái)自已經(jīng)感染了搔癢癥的倉(cāng)鼠的腦勻漿。該腦勻漿同時(shí)含有朊病毒蛋白的正常細(xì)胞形式PrPc，以及傳染形式PrPsc。可以選擇地，該樣品是感染了克雅(氏)病(CJD)的人的腦勻漿，或感染了變體CJD(vCJD)的人的腦勻漿。
用在珠子上的文庫(kù)和該樣品溫育一段時(shí)間，溫育的時(shí)間要足以使蛋白同工型與多個(gè)配體通過(guò)高度特異的親和相互作用結(jié)合。未結(jié)合的和結(jié)合較弱的蛋白通過(guò)洗滌去除。結(jié)合的蛋白通過(guò)第一次檢測(cè)方法鑒定，使用對(duì)PrPc特異的檢測(cè)標(biāo)志物。優(yōu)選的檢測(cè)標(biāo)志物是被稱作3F4的單克隆抗體(Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)。該抗體可以在其天然和變性形式下檢測(cè)PrPc；然而，當(dāng)該抗體被變性時(shí)，僅僅能檢測(cè)PrPsc。用檢測(cè)標(biāo)志物溫育載有配體的珠子，其中在這些珠子上蛋白被分組分離。結(jié)合的檢測(cè)標(biāo)志物使用第二個(gè)檢測(cè)標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)，如與第一個(gè)檢測(cè)標(biāo)志物結(jié)合的可檢測(cè)抗體。優(yōu)選地，第二個(gè)檢測(cè)標(biāo)志物是偶聯(lián)結(jié)合到堿性磷酸酶(AP)上的抗體，其形成不可溶的、有色沉淀物，該沉淀物一旦與AP底物反應(yīng)，就將那些具有二抗的珠子染為紅色。因此，紅色珠子表示存在已經(jīng)結(jié)合PrPc或檢測(cè)標(biāo)志物或二抗的配體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，接著，用PK溫育已經(jīng)用起始材料溫育過(guò)的完整文庫(kù)，PK優(yōu)選地消化PrPc。這可以從珠子上去除了PrPc，僅僅留下PrPres用于轉(zhuǎn)移和檢測(cè)。在這個(gè)和其它的實(shí)施方案中，然后處理過(guò)的文庫(kù)被固定化在第一支持物上，如凝膠，優(yōu)選地如瓊脂糖凝膠。該第一支持物將珠子固定化在一個(gè)薄的單層中。在一個(gè)實(shí)施方案中，用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如化學(xué)發(fā)光堿性磷酸酶底物溫育該第一支持物和珠子，隨后暴露于射線照相膠片，以便帶有斑點(diǎn)的薄膜(膜1)，斑點(diǎn)在結(jié)合PrPc檢測(cè)標(biāo)志物-第二標(biāo)志物的珠子的位置上。在這個(gè)和其它實(shí)施方案中，與珠子結(jié)合的蛋白然后從珠子中被轉(zhuǎn)移走，如以毛細(xì)管方式，通過(guò)在一個(gè)方向擴(kuò)散轉(zhuǎn)移緩沖液，通過(guò)凝膠，通過(guò)珠子，以及通過(guò)第二支持物，如蛋白-結(jié)合膜，在該膜上已經(jīng)被從珠子上剝?nèi)サ牡鞍妆徊东@。它們?cè)诘诙С治锷媳徊东@，是在與固定化在第一支持物中相同的相對(duì)位置上被捕獲的。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移緩沖液是改性劑，優(yōu)選地是變性劑，如6M鹽酸胍(GuHCl)，該試劑去除并且變性蛋白，將蛋白從珠子上解離，并且在轉(zhuǎn)移過(guò)程中將它們保持在變性狀態(tài)。
蛋白與其結(jié)合的第二支持物，從第一支持物上被去除并且被處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，在膜上結(jié)合的、變性的PrPc和PrPsc(如果文庫(kù)已經(jīng)被PK處理，那么是PrPres)使用檢測(cè)標(biāo)志物如3F4抗體來(lái)檢測(cè)。在前述條件下，3F4抗體允許在膜上檢測(cè)PrPc和PrPsc，這是由于它們兩者都是變性的。結(jié)合的3F4抗體通過(guò)二抗被檢測(cè)，如與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)結(jié)合的抗體。該酶然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光HRP底物被檢測(cè)，并且暴露于射線照相膠片。該溫育導(dǎo)致具有斑點(diǎn)的膜，這表明存在PrPc、PrPsc/PrPres和3F4抗體(膜2)。膜1和膜2的重合表明已經(jīng)僅僅與3F4抗體(抗體結(jié)合物)、PrPc或3F4抗體、PrPc和PrPsc/PrPres(在膜1和膜2上存在的重合斑點(diǎn))結(jié)合的珠子，以及僅僅與PrPsc/PrPres(僅僅在膜2上存在的斑點(diǎn))結(jié)合的珠子。對(duì)齊帶有含珠子的第一支持物的膜，能使得回收具有期望特性的特異性珠子成為可能。
使用配體檢測(cè)及去除結(jié)構(gòu)同工型使用此處描述的方法鑒定的配體是抗體制劑、蛋白、肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂質(zhì)、有機(jī)分子、聚合物和/或推定治療試劑，以及類似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體是肽配體。對(duì)使用上面描述的方法鑒定的結(jié)構(gòu)同工型或結(jié)構(gòu)同工型的片段特異的配體，可用于多種分析、制備和診斷應(yīng)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用此處提供的方法所鑒定的配體，被用于檢測(cè)生物液體中結(jié)構(gòu)同工型的存在。生物液體，如測(cè)試樣品，在足以導(dǎo)致結(jié)構(gòu)同工型和一個(gè)或多個(gè)配體之間復(fù)合體形成的條件下，根據(jù)此處描述的方法，與一種或多種配體接觸。然后檢測(cè)復(fù)合體，從而鑒定生物液體中結(jié)構(gòu)同工型的存在。通過(guò)此處描述的方法所鑒定的配體，也可以被用于檢測(cè)從固體材料提取到溶液中的同工型靶物質(zhì)。例如，固體樣品可以用含水或有機(jī)溶劑或臨界液體提取，得到的上清液可以與配體接觸。固體樣品的實(shí)例包括植物產(chǎn)品，尤其是那些已經(jīng)暴露于試劑的樣品，所述試劑傳播朊病毒，如來(lái)源于牛的骨粉；動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)物，尤其是那些已經(jīng)暴露于試劑的動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)物，所述試劑傳播朊病毒，如來(lái)源于牛的骨粉。其它固體樣品包括腦組織、角膜組織、排泄物、骨粉、牛肉副產(chǎn)品、綿羊、綿羊副產(chǎn)品、鹿和駝鹿、鹿和駝鹿副產(chǎn)品、以及其它動(dòng)物和動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中的配體，可以被用于檢測(cè)土壤中結(jié)構(gòu)同工型的存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)同工型的配體被固定化在支持物上，如珠子或膜，并且被用于結(jié)合和去除來(lái)自樣品的結(jié)構(gòu)同工型。用于去除污染物的珠子(bead)和膜(membrane)在本技術(shù)領(lǐng)域是熟知的，并且已經(jīng)被描述，例如在Baumbach和Hammond(1992)，Buettner(美國(guó)專利號(hào)5,834,318)中。在該實(shí)施方案中，在足以導(dǎo)致形成結(jié)構(gòu)同工型-配體復(fù)合物或復(fù)合體的條件下，根據(jù)本發(fā)明，將生物樣品與結(jié)構(gòu)同工型-結(jié)合配體接觸。該復(fù)合體然后從生物樣品中被去除，從而從生物樣品中去除了結(jié)構(gòu)同工型。正如上面所表明的，生物樣品的實(shí)例包括，如血液、血液來(lái)源組分、血漿或血清。其它生物液體包括腦脊液、尿液、唾液、奶、導(dǎo)管液、眼淚或精液。其它生物液體可能包括膠原、腦和腺體提取物。
由于使用此處描述的方法所鑒定的配體對(duì)特定同工型是特異的，所以這些配體可以用于選擇性濃縮，或者，相對(duì)于一個(gè)同工型，去除復(fù)數(shù)個(gè)同工型中的一個(gè)同工型。在一些實(shí)施方案中，配體區(qū)分傳染性同工型和非傳染性同工型，并且這些配體可以被用于在涉及傳染性或?qū)е录膊〉耐ば偷娜祟惢騽?dòng)物中疾病的診斷和預(yù)后。被認(rèn)為由蛋白的單一同工型引起的疾病的實(shí)例是朊病毒相關(guān)疾病，包括但不限于，TSEs如搔癢癥，該疾病侵襲綿羊和山羊；BSE，該疾病侵襲牛；可傳播的水貂腦病、貓海綿狀腦病以及長(zhǎng)耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和駝鹿的CWD；苦魯病、CJD、GSS、致命性失眠癥和(vCJD)，這些疾病影響人類。
本發(fā)明將通過(guò)特別的實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明，目的既不在于以任何方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行限制也不在于以任何方式對(duì)發(fā)明進(jìn)行定義。
實(shí)施例1鑒定結(jié)合來(lái)自感染搔癢癥的倉(cāng)鼠腦勻漿的PrPc和PrPsc的肽此處描述的方法的一個(gè)用途是鑒定與朊病毒蛋白PrPc和PrPsc的正常形式對(duì)傳染形式的優(yōu)先結(jié)合的配體，從而允許檢測(cè)和分離正常和傳染形式的朊病毒蛋白PrPc和PrPsc。PrPc和PrPsc的不同生物化學(xué)特性以及抗體的結(jié)合作用，即3F4單克隆抗體(Signet Laboratories，Inc.，Dehdam，MA)，被予以探究，用來(lái)發(fā)現(xiàn)與PrPsc選擇性地結(jié)合的配體。單克隆抗體3F4與變性PrPsc和PrPc結(jié)合；與未變性PrPsc相比，具有高得多的親和性。
A.肽文庫(kù)單聚體肽文庫(kù)、二聚體肽文庫(kù)、和三聚體肽文庫(kù)，由PeptidesInternational(Lexington，Inky)直接在ToyopearlTM650-M氨基樹脂(Tosoh BioScience，Montgomeryville，PA)上，使用基于由Buettner等人于1996年所描述方法的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)來(lái)合成。四聚體肽文庫(kù)、五聚體肽文庫(kù)和六聚體肽文庫(kù)包括位于氨基和文庫(kù)產(chǎn)生之間的ε氨基己酸間隔物。用上述設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的肽密度通常在0.1-0.5mmole/克樹脂干重量的范圍內(nèi)。
B.制備倉(cāng)鼠腦勻漿的方案(含有PrP的材料)在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中制備未感染的和感染了搔癢癥的倉(cāng)鼠腦的10％(v/v)勻漿，于-80℃冷凍(由Robert Rohwer博士，VA Medical Center，Baltimore提供)。在使用之前，將勻漿于濕冰上解凍，并且用0.5％十二烷基肌氨酸鈉，將1.2ml(未感染的)和0.5ml(感染的)勻漿于室溫輕輕攪拌30分鐘溶解。樣品以14,000rpm離心5分鐘，收集含有兩種形式即PrPc(未感染的和感染的)和PrPsc(僅感染的)的上清。
通過(guò)將1ml正常倉(cāng)鼠腦材料與0.33ml感染了搔癢癥的腦材料和3.67ml的pH 7.2的Tris-緩沖鹽水(TBS)緩沖液混合，制備5毫升腦材料，其中所述Tris-緩沖鹽水(TBS)緩沖液含有1％酪蛋白封閉劑(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)和1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。正常腦勻漿與感染了搔癢癥的腦勻漿的最終比率為3比1，這導(dǎo)致大約相等數(shù)量的PrPc和PrPsc。
C.肽文庫(kù)結(jié)合篩選的方案將來(lái)自肽文庫(kù)的5毫克干珠子放置到Bio-SpinTM可支配的色譜柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中，并且用20柱體積(CV)的溶于水中的20％甲醇洗滌，以便去除肽合成中可能的雜質(zhì)和使用的有機(jī)溶劑。然后將珠子洗滌，并且使用20CV的1×TBS，pH 7.6平衡(1×TBS是通過(guò)對(duì)10×TBS進(jìn)行10倍稀釋而制備(BioSource International，Camarillo，CA)。終止流動(dòng)，珠子被懸浮在1ml的新鮮的1×TBS中，并且允許再次溶脹15分鐘。排干TBS，再次填充柱子。為了防止非特異性結(jié)合，將1ml溶解在添加了0.5％BSA(Sigma-Aldrich)的TBS中的BlockerTMCasein(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)溶液施加到珠子上。在覆蓋了柱的兩個(gè)端之后，于4℃過(guò)夜封閉(blocking)，同時(shí)溫和地?cái)嚢?。排干封閉溶液，并且將上述制備的1ml倉(cāng)鼠腦勻漿施加于樹脂。將柱的兩端緊緊密閉，放置于水平位置，室溫下輕輕地?fù)u動(dòng)1到3小時(shí)。排干腦勻漿，用10ml含有0.05％Tween 20的TBS(T-TBS)洗滌，隨后用10ml的TBS洗滌。
D.檢測(cè)結(jié)合的PrPc的方案使用在含有1％酪蛋白的TBS中以1∶8,000稀釋的小鼠單克隆抗體3F4(Signet，Dedham，MA)，進(jìn)行正常PrPc的比色檢測(cè)。單克隆抗體結(jié)合天然haPrPc，但對(duì)天然haPrPsc具有很少的親和力或沒(méi)有親和力；然而，單克隆抗體確實(shí)結(jié)合變性的haPrPsc和haPrPc。將1ml經(jīng)過(guò)稀釋的3F4抗體，加入到先前暴露的珠子中。室溫下輕輕地?fù)u動(dòng)該柱1小時(shí)。排干含有抗體的溶液，用10ml的TBS和10ml的T-TBS洗滌珠子。然后在1ml堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(KPL，Gaithersburg，MD)中溫育珠子，所述二抗用溶解在TBS中的0.5％酪蛋白/0.5％BSA以1∶2,000稀釋。溫育于室溫下，在同時(shí)輕輕地?fù)u動(dòng)下，進(jìn)行1小時(shí)。排干二抗溶液，并且用10ml的TBS和10ml的T-TBS洗滌珠子。根據(jù)制造商的描述制備用于堿性磷酸酶的1毫升ImmunoPure Fast RedTM底物，并且施加到珠子上。溫育在室溫下進(jìn)行大約15分鐘，或直到珠子開始變?yōu)闇\粉紅，并且出現(xiàn)了少量深紅色珠子。排干底物溶液，用10ml的TBS洗滌珠子。密閉珠子的兩端，于4℃保存過(guò)夜。
E.檢測(cè)包埋在瓊脂糖中的PrP-結(jié)合珠子的方案簡(jiǎn)單的說(shuō)，將上面描述的用倉(cāng)鼠腦勻漿溫育過(guò)的珠子包埋在瓊脂糖中。首先，通過(guò)用9ml的溶解在水中的1％瓊脂糖(Invitrogen，Carlsbad，CA)覆蓋49cm2盤子(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)的表面，制備瓊脂糖基層，所述瓊脂糖被預(yù)先熔化并且冷卻至大約40℃。使瓊脂糖正好凝固。將90微升漿狀珠子溶液，以1.923mg/ml加入到800μl的0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖中(參見Plaque GTG AgaroseTM，F(xiàn)MCBioProducts(現(xiàn)在已知為Cambrex Bioscience，Inc，Baltimore，MD)，其中所述瓊脂糖溶解在水中、熔化、并且冷卻到大約40℃。將混合物輕輕地渦旋振蕩，并且散布到所述基層的整個(gè)表面。將一滴含有PrP的材料直接放置到凝膠中，在其角落處，用作下一個(gè)程序的陽(yáng)性對(duì)照組。在PrP-結(jié)合珠子的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)被進(jìn)行之前，使凝膠在4℃凝固。
F.包埋在瓊脂糖中的PrP-結(jié)合珠子的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方案在將珠子包埋在凝膠中之后，加入足量體積的化學(xué)發(fā)光堿性磷酸酶底物CDP-Star(Tropix Inc.(Applied Biosystems)，Bedford，MA，)，覆蓋凝膠的表面，并且根據(jù)制造商的建議于室溫溫育5分鐘。排干凝膠中的過(guò)剩底物，將凝膠放置在干凈的塑料透明膜上，密封在塑料袋子中，并且暴露于放射自顯影膠片30分鐘。該膜(膜1)僅僅鑒定天然PrPc，結(jié)合3F4和二抗的珠子，隨后被用于對(duì)齊將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜之后所獲得的膜。
G.蛋白從包埋的珠子轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜的方案該方法學(xué)從珠子上洗脫蛋白，并且通過(guò)毛細(xì)管作用將它們轉(zhuǎn)移到硝化纖維素或PVDF膜上。一張3MM過(guò)濾紙(Schleicher and Schuell，Keene，NH)通過(guò)“燈芯”效應(yīng)作用于從容器來(lái)的轉(zhuǎn)移緩沖液(該緩沖液可以是適合于實(shí)驗(yàn)的特定需求的任何緩沖液)，使轉(zhuǎn)移緩沖液通過(guò)有珠子固定化于其中的凝膠。因此，3MM紙芯被轉(zhuǎn)移溶液預(yù)先弄濕，放置在一個(gè)表面上，該紙的邊緣浸入緩沖液容器中。用6摩爾(6M)鹽酸胍(GuHCl)作為轉(zhuǎn)移溶液，并且在轉(zhuǎn)移過(guò)程中足以從珠子解離和變性被結(jié)合的蛋白。將凝膠被放置在濕的3MM紙上，珠子面朝上，從而確保紙和凝膠之間沒(méi)有氣泡。將一張切成凝膠尺寸(ECL-standardnitrocellulose HybondTM(Amersham Biosciences Corp.Piscataway，NJ)的膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中弄濕，并且放置在凝膠的上面。將吸液管在膜上滾動(dòng)以消除氣泡。將兩張預(yù)濕的3MM紙放置在膜上，用吸液管滾過(guò)以去除氣泡。將一堆干紙巾或其它吸附紙放置在上面，稱重為300g。轉(zhuǎn)移在室溫下進(jìn)行16小時(shí)，導(dǎo)致結(jié)合到珠子上的蛋白轉(zhuǎn)移并且固定化在捕獲膜上。
H.ECL(化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)的方案將蛋白轉(zhuǎn)移到其上的膜放置在塑料容器中，該容器有懸浮在T-TBS中的10ml的5％(w/v)干燥的、脫脂牛奶(3F4不能識(shí)別牛奶中存在的牛PrPc)。于4℃，將該膜輕輕地?fù)u動(dòng)溫育16小時(shí)，以防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。在封閉后，用10ml的1∶4,000倍稀釋的第一抗體3F4(Signet)溫育該膜，室溫下輕輕地?cái)嚢?.5小時(shí)，其中3F4(Signet)是在5％牛奶中、在TBS中。丟掉一抗溶液，用T-TBS將膜沖洗兩次，在T-TBS中洗滌15分鐘，然后在新鮮的T-TBS中洗滌5分鐘，洗滌兩次。所有洗滌都在輕輕地?fù)u動(dòng)下進(jìn)行。然后在室溫下，在輕輕搖動(dòng)下，將膜溫育1.5小時(shí)，其中使用10ml的1∶10,000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗(KPL)進(jìn)行溫育，二抗在5％牛奶中、在T-TBS中。丟棄二抗溶液，如上沖洗和洗滌膜。
通過(guò)根據(jù)制造商的說(shuō)明書制備HRP化學(xué)發(fā)光底物ECL-Plus(Pierce)，實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將10ml混合物加入到每一膜中，蛋白面朝上。用手輕輕地旋動(dòng)底物1分鐘，取出底物飽和膜，放置在3MM過(guò)濾紙上，以快速吸干；然后包裹在保護(hù)紙(Boise Cascade OfficeProducts，Boise，IL)中。用放射自顯影膠片多次接觸膜的蛋白側(cè)，使膜顯色(膜2)。
I.對(duì)來(lái)自搔癢癥倉(cāng)鼠腦的PrPsc特異的三聚體-結(jié)合物的檢測(cè)上述方案導(dǎo)致產(chǎn)生了有一定百分比的珠子被染為紅色的凝膠，這表明它們結(jié)合了天然PrPc或二抗，具有來(lái)自那些珠子的信號(hào)的第一個(gè)膜，和具有來(lái)自結(jié)合珠子的信號(hào)的第二個(gè)膜，其中珠子結(jié)合了天然PrPc和/或二抗(在凝膠上被染為紅色)，以及變性的PrPc和PrPsc，和/或二抗。一旦對(duì)齊了帶有先前被染色珠子的膜1和膜2上的斑點(diǎn)，四個(gè)群體的珠子是可能的1)那些結(jié)合3F4的珠子將被染為紅色，并且將在膜1和膜2上產(chǎn)生信號(hào)；2)那些對(duì)PrPc和PrPsc均結(jié)合的珠子將被染為紅色，并且將在膜1和膜2上產(chǎn)生信號(hào)；3)那些單獨(dú)結(jié)合PrPc的珠子將被染為紅色，并且將在膜1和膜2上產(chǎn)生信號(hào)；和4)那些僅僅或優(yōu)先結(jié)合PrPsc的珠子將在膜2上產(chǎn)生信號(hào)，但不被染為紅色，它們也不在膜1上產(chǎn)生信號(hào)。對(duì)齊過(guò)程和選擇過(guò)程用示意圖表示在圖2中。選擇珠子中的第四群體作為PrPsc特異性珠子。對(duì)來(lái)自三聚體文庫(kù)的代表性珠子測(cè)序，所述珠子不在第一次化學(xué)發(fā)光檢測(cè)上產(chǎn)生信號(hào)(膜1，在變性步驟之前)，但在第二次化學(xué)發(fā)光檢測(cè)上產(chǎn)生信號(hào)(膜2，在變性步驟之后)。在這些和其它實(shí)驗(yàn)(包括其中使用了PK的實(shí)驗(yàn))中，鑒定出的幾種配體氨基酸序列羅列在下面的表1中。合成了數(shù)克DVR樹脂。
表1結(jié)合來(lái)自感染了搔癢癥的倉(cāng)鼠腦勻漿的PrPc和PrPsc的肽(na代表2-萘基-丙氨酸)

在室溫下，用1％spCJD腦勻漿溫育5毫克(5mg)DVR(SEQ IDNO3)和氨基650-M(作為對(duì)照組)1小時(shí)，其中用0.1％十二烷基肌氨酸鈉進(jìn)行增溶。如前所述，用堅(jiān)牢紅檢測(cè)結(jié)合了PrPc的珠子的存在。然后將珠子固定化在瓊脂糖凝膠中，在第一支持物上檢測(cè)，用GuHCl轉(zhuǎn)移，并且在第二支持物上檢測(cè)。在顯微鏡下DVR珠子為白色，隨后是珠上檢測(cè)，第一支持物上的信號(hào)微弱，這表明結(jié)合了很少的PrPc。氨基珠子是粉紅色，第一支持物上的信號(hào)強(qiáng)，這表明氨基樹脂結(jié)合了PrPc。在變性和轉(zhuǎn)移后，第二支持物上的來(lái)自DVR(SEQ ID NO 3)珠子的信號(hào)是強(qiáng)烈的。來(lái)自氨基珠子的信號(hào)也是強(qiáng)烈的，這表明它結(jié)合了PrPc，也可以結(jié)合PrPsc。這些結(jié)果表明DVR(SEQ ID NO3)優(yōu)先結(jié)合PrPsc，并且確認(rèn)了該方法可以鑒定優(yōu)先結(jié)合蛋白的不同同工型的配體。
實(shí)施例2在蛋白酶K處理后對(duì)來(lái)自散發(fā)性CJD腦的PrPres具有特異性的源自三聚體-文庫(kù)的結(jié)合劑的檢測(cè)在該實(shí)施例中，篩選三聚體文庫(kù)，從腦勻漿獲得PrPsc結(jié)合劑，所述腦勻漿是從患有人類散發(fā)性CJD的病人制備的；并且，在PrPsc特異性結(jié)合劑的免疫檢測(cè)之前，用蛋白酶K(PK)處理珠子。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)先前實(shí)施例中描述的程序進(jìn)行，其中有如下變化1)用1ml的1.0％腦勻漿溫育10mg樹脂/每柱，所述腦勻漿被稀釋到CPD緩沖液(檸檬酸鹽、磷酸鹽、右旋糖(Baxter Healthcare/Fenwal，Deerfield，IL)中，并且含有0.05％十二烷基肌氨酸鈉(Sigma-Aldrich)和0.2mM的苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma-Aldrich)；2)在用ImmunoPure Fast RedTM底物檢測(cè)之后，用1ml的PK(100μg/ml)于37℃溫育珠子1小時(shí)。PK處理的結(jié)果是在轉(zhuǎn)移之前消化PrPc，僅僅將PrPres留在珠子和隨后的膜上。這導(dǎo)致膜2僅僅具有由3F4識(shí)別PrPres所產(chǎn)生的信號(hào)。膜2與含有珠子的凝膠間的對(duì)齊，表明了對(duì)PrPsc特異的那些珠子。從該篩選獲得的序列是FPK(SEQ ID NO19)，HWK(SEQ ID NO20)，WEE(SEQ ID NO21)，和LLR(SEQ ID NO22)。
雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)中可以使用與在此描述的方法和材料相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧希且陨厦枋龅氖呛线m的方法和材料。所有的出版物、專利申請(qǐng)、專利和在此提及的其它引述的參考資料被完整地引用于此，作為參考。另外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是例證性的，其目的不在于限制。
上述的描述被提供出來(lái)，用于描述與本發(fā)明有關(guān)的幾個(gè)實(shí)施方案?？梢詫?duì)這些實(shí)施方案和/或結(jié)構(gòu)進(jìn)行多處修正、添加和刪除，而不會(huì)脫離本發(fā)明的范圍和精神。
序列表<110>美國(guó)紅十字會(huì)(American National Red Cross)<120>對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型特異的配體的鑒定方法<130>EP05-2857-XC20<150>US 60/462,658<151>2003-04-14<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa＝2-萘基-丙氨酸<400>10Xaa His Glu Phe Tyr Gly Ala1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝2-萘基-丙氨酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>Xaa＝2-萘基-丙氨酸<400>11His Glu Xaa Xaa Leu Val Ala1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>Xaa＝2-萘基-丙氨酸<400>12Ser Ser Xaa Lys Lys Asp Ala1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>Xaa＝2-萘基-丙氨酸<400>13Arg Xaa Agp Lys Glu Ala Ala1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>14Phe Gln Gly Thr Arg Glu Ala1 5<210>15<211>7
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>15Thr Gly Thr Asn Arg Tyr Ala1 5<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>16Lys Trp Ala Thr Arg Tyr Ala1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>17Asn Ser Thr Lys Phe Asp Ala1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>18Glu His Ala Thr Tyr Arg Ala
1 5<210>19<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>19Phe Pro Lys1<210>20<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>20His Trp Lys1<210>21<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>21Trp Glu Glu1<210>22<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>22Leu Leu Arg權(quán)利要求
1.一種用于鑒定對(duì)樣品中的蛋白同工型具有結(jié)合特異性的配體的方法，所述方法包括a.在允許所述一種或多種配體和所述一種或多種蛋白同工型之間形成一種或多種復(fù)合體的條件下，用含有至少兩種蛋白同工型的樣品接觸一種或多種配體；b.在允許產(chǎn)生第一可檢測(cè)信號(hào)并且檢測(cè)所述第一可檢測(cè)信號(hào)是否存在的條件下，用第一可檢測(cè)標(biāo)志物接觸所述一種或多種復(fù)合體；c.將所述一種或多種蛋白同工型從第一支持物轉(zhuǎn)移到第二支持物；d.在允許產(chǎn)生第二可檢測(cè)信號(hào)并且檢測(cè)所述第二可檢測(cè)信號(hào)是否存在的條件下，用第二可檢測(cè)標(biāo)志物接觸所述被轉(zhuǎn)移的同工型；e.將所述第一信號(hào)與所述第二信號(hào)比較，其中所述第一信號(hào)的存在與否以及所述第二信號(hào)的存在與否鑒定出對(duì)所述一種或多種蛋白同工型具有結(jié)合特異性的所述一種或多種配體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種蛋白同工型是朊病毒蛋白的同工型。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一可檢測(cè)標(biāo)志物和第二可檢測(cè)標(biāo)志物檢測(cè)相同蛋白的不同同工型。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述配體直接地或間接地固定化在所述固體支持物上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述配體結(jié)合在固相上，該固相固定化在所述固體支持物上。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在用含有至少兩種蛋白同工型的樣品接觸所述配體之前或之后，將所述一種或多種配體固定化在所述第一支持物上。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種蛋白同工型在轉(zhuǎn)移到第二支持物之前、過(guò)程中或之后被修飾，以形成不同的蛋白同工型，并且用第二可檢測(cè)標(biāo)志物接觸該不同的蛋白同工型。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述一種或多種蛋白同工型通過(guò)消化或變性來(lái)修飾。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被鑒定出對(duì)所述一種或多種蛋白同工型具有結(jié)合特異性的配體是肽，其具有選自SEQ ID NOS1-22的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被鑒定出對(duì)所述一種或多種蛋白同工型具有結(jié)合特異性的配體是具有氨基酸序列SEQ ID NO3的肽或其類似物。
全文摘要
一種鑒定對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)同工型具有特異性的配體的方法，通過(guò)將結(jié)構(gòu)同工型結(jié)合到位于支持物上的配體上，結(jié)構(gòu)同工型和對(duì)照組同工型在兩個(gè)或多個(gè)不同的固體或半固體支持物之間直接定位轉(zhuǎn)移，以及檢測(cè)每一支持物上的至少一種同工型，從而允許使用扣除鑒定技術(shù)，以便鑒定對(duì)結(jié)構(gòu)同工型特異的配體子集或配體。
文檔編號(hào)G01N33/537GK1806053SQ200480016648
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者J·T·拉特羅普, D·J·哈蒙德, L·切爾韋納科娃, L·喬治烏, O·雅科夫列娃 申請(qǐng)人:美國(guó)紅十字會(huì)