Il-17在提高間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及IL-17在提高間充質(zhì)干細(xì)胞免 疫抑制功能中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于 發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化 潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。如 間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、 神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可 作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
[0003] 無論在體內(nèi)實驗還是在體外實驗中，MSC對于T細(xì)胞的免疫抑制機制已經(jīng)得到了 廣泛的研究，目前普遍認(rèn)為MSC對于T細(xì)胞的抑制不是通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，而是使得T細(xì) 胞的細(xì)胞周期停留在G0/G1期。也有研究表明MSC可以促進(jìn)激活的T細(xì)胞的凋亡，但可以 促進(jìn)靜息狀態(tài)下的T細(xì)胞的存活，這也說明MSC發(fā)揮免疫抑制依賴于T細(xì)胞活化時所釋放 的炎癥細(xì)胞因子的刺激。
[0004] 白介素-17A (interleukin 17A，IL-17A，白細(xì)胞介素17,簡稱為IL-17)是目前已 發(fā)現(xiàn)的30余種白細(xì)胞介素之一，按序號排在第17位。IL-17由⑶4+T細(xì)胞分泌，能夠誘導(dǎo) 上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2,促進(jìn)ICAM-I的表達(dá)。 近年來發(fā)現(xiàn)IL-17是一種主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子，可以促進(jìn)T細(xì)胞的激 活和刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞刺激因子（GM-CSF)和化學(xué)增活素及細(xì)胞黏附分子I (cellular adhesion molecule 1，CAM-1)，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可以通 過促進(jìn)釋放前炎性細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)。IL-17與受體結(jié)合后，可通過MP激酶途徑和 核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclearfactor kB，NF-kB)途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。Thl7細(xì)胞能夠分泌產(chǎn) 生11^-17厶、11^-17?、11^-6以及腫瘤壞死因子<1(1：111]1〇1'116(31'〇818€&(31:〇抑，1即-(1)等，這些 細(xì)胞因子可以集體動員、募集及活化中性粒細(xì)胞。Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17能有效地介導(dǎo)中 性粒細(xì)胞動員的興奮過程，從而有效地介導(dǎo)了組織的炎癥反應(yīng)。
[0005] IL-17作為一種促炎癥細(xì)胞因子，能夠作用于多種細(xì)胞類型，進(jìn)而促進(jìn)其他一些細(xì) 胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶的表達(dá)，包括TNFa、IL-IP、IL-6、GM-CSF、G-CSF、CXCL1、 MMP-3等。同時，IL-17還可以和其他一些細(xì)胞因子如TNFa協(xié)同促進(jìn)多種靶基因的表達(dá)。 體內(nèi)的實驗研究揭示了 IL-17家族細(xì)胞因子在機體抗微生物感染中所發(fā)揮的重要作用。盡 管IL-17在機體細(xì)菌和真菌感染中起到保護(hù)作用，但是IL-17信號通路的過度激活則會導(dǎo) 致自身免疫病的發(fā)生。在人自身免疫病中，IL-17是明顯上升的，許多研究表明IL-17參與 了諸多自身免疫病的發(fā)病進(jìn)程，包括MS (多發(fā)性硬化）、RA (類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）和IBD (炎癥 性腸?。?。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供白介素-17、白介素-17的衍生物或其激動劑的用途。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供白介素-17拮抗劑的用途。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種經(jīng)IL-17處理的提高了免疫抑制能力的間充質(zhì)干 細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種白介素-17、白介素-17的衍生物或其激動劑的用 途，用于制備制劑或試劑盒，所述制劑或試劑盒用于：
[0010] (1)提高間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能；和/或
[0011] ⑵上調(diào)MSC中免疫抑制因子的表達(dá)；和/或
[0012] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩(wěn)定性；和/或
[0013] (4)降低RNA結(jié)合蛋白AUFl的表達(dá)水平；和/或
[0014] (5)抑制T細(xì)胞的增殖；和/或
[0015] (6)治療肝炎或肝損傷。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17是哺乳動物的白介素-17。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17是人白介素-17。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17的衍生物包括經(jīng)修飾的白介素-17分子、氨基酸 序列與天然白介素-17同源且具有天然白介素-17活性的蛋白分子、白介素-17的二聚體 或多聚體、含有白介素-17氨基酸序列的融合蛋白。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)修飾的白介素-17分子是PEG化的白介素-17。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述"氨基酸序列與天然白介素-17同源且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子"是指其氨基酸序列與SEQ ID NO. :1相比具有彡85%的同源性，較佳地 彡90%的同源性，更佳地多95%的同源性，最佳地多98%同源性；并且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述"間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能"是指間充質(zhì)干細(xì)胞對T細(xì) 胞的免疫抑制功能。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或試劑盒中還包含IFN Y和/或TNF a。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述激動劑是指能夠在體內(nèi)或體外提高白介素-17或其衍生物 的活性和/或含量的物質(zhì)。所述物質(zhì)可以為人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導(dǎo)性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0028] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種白介素-17拮抗劑的的用途，用于制備制劑或試 劑盒，所述制劑或試劑盒用于：
[0029] (1)降低間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能；和/或
[0030] (2)下調(diào)MSC中免疫抑制因子的表達(dá)；和/或
[0031] (3)降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩(wěn)定性；和/或
[0032] (4)增強RNA結(jié)合蛋白AUFl的表達(dá)水平；和/或
[0033] (5)促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17的拮抗劑是指能夠降低體內(nèi)或體外白介素-17 活性的物質(zhì)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17的拮抗劑可以為小miRNA、抗白介素-17抗體或 iNOS抑制劑、Actl蛋白抑制劑、AUFl蛋白激動劑、白介素-17受體的抑制劑、NF K B抑制劑、 TRAF6抑制劑。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑包括藥物組合物、保健品組合物、食品組合物、或?qū)?驗試劑。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0039] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，所述組合物包括白介素-17或其衍生物、 IFN Y 和 TNF a 0
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述白介素-17或其衍生物、IFNy和TNFa的摩爾比為：1-1〇 : 10 ：10〇
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括固態(tài)制劑、液態(tài)制劑，較佳地為干粉或溶液形 式。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物。
[0043] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的MSC細(xì)胞群，所述MSC細(xì)胞群由MSC細(xì)胞構(gòu) 成或基本上由MSC細(xì)胞構(gòu)成，并且所述的MSC細(xì)胞具有增強的抑制T細(xì)胞增殖的能力，
[0044] 并且，所述的MSC細(xì)胞選自下組：
[0045] (1)體外經(jīng)預(yù)處理的MSC細(xì)胞群，其中所述預(yù)處理指用⑴白介素-17或其衍生 物、（ii)IFNy和（iii)TNFa同時、依次或先后進(jìn)行處理；
[0046] (2)Actl蛋白過表達(dá)和/或AUFl蛋白缺失或活性降低的細(xì)胞群；和
[0047] (3)體外經(jīng)預(yù)處理的MSC細(xì)胞群，其中所述預(yù)處理指用IFN Y和TNF a進(jìn)行處理；
[0048](4)組（1)、組⑵和組⑶的組合。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)處理中，條件如下：0? 5-1000ng/ml (較佳地l-200ng/ml， 更佳地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)的 IFN y、0? 5-1000ng/ml (較佳地 l_200ng/ml，更佳 地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)的 TNF a，和 〇? 2-1000ng/ml (較佳地 0? 5-200ng/ml，更佳 地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)白介素-17。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)處理中，使用l_2ng/ml IFNy、l-2ng/ml TNFa和 0.5_2ng/ml 白介素-17;或使用 10ng/ml IFNy、10ng/ml TNFa 和 l〇ng/ml 白介素-17。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的增強的抑制T細(xì)胞增殖的能力指11/10彡1. 5 (較佳地 彡2,更佳地彡4)，其中，Il為所述MSC細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的百分比抑制率；而IO為對照 組的同物種的野生型的MSC細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的百分比抑制率。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的"基本上由…構(gòu)成"指MSC細(xì)胞占所述細(xì)胞群中細(xì)胞總數(shù) 的至少90 %，較佳地至少95 %，更佳地至少99 %。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞群具有以下特征：將所述MSC細(xì)胞群施用于動物 后，可導(dǎo)致所述動物體內(nèi)發(fā)生選自下組的變化：
[0054] (a)血清ALT的水平下降；
[0055] (b)肝臟中單個核細(xì)胞下降；
[0056] (c) CD4+T細(xì)胞數(shù)下降；和/或
[0057] (d)CD8+T細(xì)胞數(shù)下降。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，
[0059] (a)血清ALT的水平下降50 %~80 %;
[0060] (b)肝臟中單個核細(xì)胞下降50 %~80 %;
[0061] (c)CD4+T細(xì)胞數(shù)下降50 %~80%;和/或
[0062] (d) CD8+T 細(xì)胞數(shù)下降 50 % ~75 %。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述預(yù)處理過程包括步驟：
[0064] 胰酶消化MSC細(xì)胞后，先培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后加入上述濃度的細(xì)胞因子，繼續(xù)培 養(yǎng)6-24小時后，再消化收集細(xì)胞群。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞等。
[0066] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種遺傳改造的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株是經(jīng)基因工程改 造從而導(dǎo)致內(nèi)源的Actl蛋白過表達(dá)和/或AUFl蛋白缺失或活性降低。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞株為哺乳動物MSC細(xì)胞株。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞株用于增強間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能。
[0069] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種分離的蛋白復(fù)合物，所述蛋白復(fù)合物為Actl蛋白 和AUFl蛋白結(jié)合的蛋白復(fù)合物。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述蛋白復(fù)合物分子量在80KD~130KD。
[0071] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第六方面所述蛋白復(fù)合物的應(yīng)用，所述用途為 用于篩選藥物或化合物，所述藥物或化合物促進(jìn)或抑制Actl蛋白和AUFl蛋白形成所述的 復(fù)合物。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物用于：
[0073] (1)提高間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能；和/或
[0074] (2)上調(diào)MSC中免疫抑制因子的表達(dá)；和/或
[0075] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩(wěn)定性；和/或
[0076] (4)降低RNA結(jié)合蛋白AUFl的表達(dá)水平；和/或
[0077] (5)抑制T細(xì)胞的增殖；和/或
[0078] (6)治療肝炎或肝損傷。
[0079] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)應(yīng)用所述蛋白復(fù)合物篩選藥物時，所述應(yīng)用包括步驟：
[0080] (a)將目標(biāo)物質(zhì)與MSC細(xì)胞共培養(yǎng)；
[0081] (b)檢測培養(yǎng)的細(xì)胞中所述蛋白復(fù)合物的含量。當(dāng)細(xì)胞中所述蛋白復(fù)合物含量較 空白對照升高時，則該物質(zhì)為陽性候選物質(zhì)。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的篩選中還包括陽性對照組，較佳地所述的陽性對照組中 添加IL17。（實驗表明，IL17能增強兩個蛋白的結(jié)合形成復(fù)合物的能力。）
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導(dǎo)性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0086] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中含有以下組分：
[0087] (a)白介素-17或其衍生物；
[0088] (b)IFNy;和
[0089] (c) TNF a;
[0090]以及使用說明書，
[0091]其中，所述的組分（a)、（b)和（C)分別位于一個或多個不同的容器或位于同一容 器中。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述的說明書中描述：所述試劑盒用于
[0093] (1)提高間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能；和/或
[0094] (2)上調(diào)MSC中免疫抑制因子的表達(dá)；和/或
[0095] (3)增強MSC中免疫抑制因子的mRNA的穩(wěn)定性；和/或
[0096] (4)降低RNA結(jié)合蛋白AUFl的表達(dá)水平；和/或
[0097] (5)抑制T細(xì)胞的增殖。
[0098] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞。
[0099] 在另一優(yōu)選例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導(dǎo)性肝損傷、肝纖維化、肝硬化。
[0100] 在另一優(yōu)選例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_雙加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0101] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種藥盒，所述藥盒中包括如權(quán)利要求3所述的藥物 組合物和說明書，所述說明書中記載該藥物組合物用于：
[0102] (1)提高間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能；和/或
[0103] (2)上調(diào)MSC中免疫抑制因子的表達(dá)；和/或
[0104] (3)增強免疫抑制因子的mRNA的穩(wěn)定性；和/或
[0105] (4)降低RNA結(jié)合蛋白AUFl的表達(dá)水平；和/或
[0106] (5)抑制T細(xì)胞的增殖；和/或
[0107] (6)治療肝炎或肝損傷。
[0108] 在另一優(yōu)選例中，所述MSC細(xì)胞為骨髓來源的MSC細(xì)胞、臍帶來源MSC細(xì)胞、脂肪 來源MSC細(xì)胞、胎盤來源MSC細(xì)胞、和/或牙髓來源MSC細(xì)胞。
[0109]在另一優(yōu)選例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝損傷包括酒 精性肝損傷、藥物誘導(dǎo)性肝損