產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細胞之方法、依該方法所制備之細胞及其應(yīng)用
【專利說明】產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細胞之方法、依該方法所制備之細胞及其應(yīng) 用
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年9月10日提交的美國申請13/607976的優(yōu)先權(quán)。以磁盤提交 的序列表
[0003] 序列表是依照37C. F. R § 1. 823 (a)以紙件形式提交的說明書的一部分。
【背景技術(shù)】
[0004] 本發(fā)明關(guān)于一種制備具有特定功能之細胞之方法，特別系關(guān)于一種制備免疫調(diào)節(jié) 細胞（immunomodulatory cells)之方法。
[0005] 自體免疫疾病系由不正常的免疫反應(yīng)所致，此種免疫反應(yīng)會針對正常存在于人體 中之物質(zhì)或組織；換言之，免疫系統(tǒng)將身體某部分誤認為病原體并因而攻擊自身細胞。移植 物排斥則是不欲之免疫反應(yīng)所造成的另一個問題，所謂移植，系將細胞、組織或器官由一處 移往另一處之行為。雖然移植已成為一種例行的醫(yī)療手段，但免疫系統(tǒng)仍然是最難以克服 的障礙。
[0006] 免疫抑制藥物可降低免疫反應(yīng)，通?？捎糜谥委?預防自體免疫疾病及移植物排 斥。免疫抑制藥物會伴隨不同的副作用，包括抑制整體免疫系統(tǒng)、造成患者易受感染等。生 物制劑亦可用于該治療，包括例如抗細胞因子療法（anti-cytokine therapy)、T細胞清除 療法、B細胞清除療法、及耐受性誘發(fā)療法。近來，細胞療法（例如被動給予T細胞（adoptive T-cell)或干細胞）成為治療或預防自體免疫疾病及移植物排斥之新選擇，但此療法仍在 發(fā)展中。
[0007] 人類間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC)為一種多元性前體細 胞（multilineage progenitor cells)之細胞群，具有分化成多種間充質(zhì)細胞系之能 力。間充質(zhì)干細胞可由骨髓及其它幾種器官，例如脂肪組織、胎盤、羊水、及胎兒組織， 如胎兒的肺及血液，分離出。由于間充質(zhì)干細胞易于分離、且已報導可分化成中胚層 之外（extra-mesodermal)的細胞類型，因此使得此種出生后前體細胞（post-natal progenitors)成為多種疾病之細胞療法之熱門選擇。
[0008] 除了多元性分化能力以外，骨髓及胎兒之間充質(zhì)干細胞已被報導具有免疫調(diào)節(jié)效 果。此項功能牽涉到調(diào)控T細胞、B細胞、單核細胞衍生之樹突細胞（DC)、及天然殺傷淋巴 細胞（NK)之增殖能力及效應(yīng)功能。人類間充質(zhì)干細胞對免疫細胞的效用，主要經(jīng)由非細胞 接觸過程而進行調(diào)控，但確切機制仍為未知。
[0009] 日漸增多的研宄顯示了免疫調(diào)節(jié)性免疫細胞的重要性。直到最近才知道有許多 白細胞亞群可產(chǎn)生免疫抑制效果，包括調(diào)節(jié)性T淋巴細胞、II型巨噬細胞、及未成熟樹突細 胞。然而，幾乎沒有針對調(diào)節(jié)性單核細胞之資料。
[0010] 肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，以下有時簡稱HGF)已知為有絲分 裂促進劑，且為發(fā)展上重要的分子。亦已知為細胞擴散因子（scatter factor)，HGF不僅提 供強力生長訊號，亦可誘導細胞迀移，因此，HGF在癌細胞生長及擴散的角色已被充分研宄； 但關(guān)于HGF在非有絲分裂之功效上則所知不多。HGF由中葉細胞分泌，并主要作用于上皮細 胞及內(nèi)皮細胞，但亦可作用于造血性前體細胞。HGF已被顯示在胚胎器官發(fā)展、成人器官再 生、及傷口愈合上扮演重要角色。HGF及TGF-0已被報導可于混合淋巴細胞反應(yīng)中作為抑 制T細胞增殖之調(diào)控者，此可藉由給予針對HGF及TGF-0之中和性抗體后，T細胞增殖作用 會重新恢復而證明Nicola et al.，Blood 2002;99:3838-3843)。然而，也有報告顯示 了不同結(jié)論，該等因子系與間充質(zhì)干細胞對于T細胞受有絲分裂促進劑刺激之抑制作用無 關(guān)，因而提出與前述不同的刺激物依賴性機制（Le Blanc et al.，Scand J Immunol 2004; 60:307-315 ;Rasmusson I et al.，Exp Cell Res 2005;305:33-41)。綜上述，HGF 與免疫 系統(tǒng)間的功能及交互作用仍為未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明系提供一種產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細胞之方法，包括：以肝細胞生長因子（HGF)處 理外周單個核細胞（peripheral mononuclear cell)，以誘發(fā)該外周單個核細胞分化成免 疫調(diào)節(jié)性白細胞（immunomodulatory leukocyte)。
[0012] 本發(fā)明亦提供一種以前述方法所制備之免疫調(diào)節(jié)細胞。
[0013] 本發(fā)明另提供一種治療由異常免疫反應(yīng)所致疾病之方法，包括：對患有該疾病之 患者施用肝細胞生長因子（HGF);誘發(fā)該患者之外周單個核細胞分化成免疫調(diào)節(jié)性白細 胞；及調(diào)節(jié)該異常免疫反應(yīng)。
【附圖說明】
[0014] 第1圖顯示骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSC)及胎盤衍生間充質(zhì)干細胞（P-MSC)之 特征，第1A圖：表面標記；第1B圖：BM-MSC及P-MSC之三譜系分化表型，Osteo :成骨系、 Chondro :成軟骨系、Adipo :成脂系；比例尺：200mm。
[0015] 第2圖系顯示在異體外周血白細胞（PBLs)中，間充質(zhì)干細胞擴增了功能性 ⑶14XD1 lb+⑶33+骨髓衍生的抑制細胞（MDSC)數(shù)量。第2A圖：藉由間充質(zhì)干細胞， CD14XDllb+CD33+細胞自外周血白細胞中增加，同種異體之外周血白細胞（30位提供者） 單獨培養(yǎng)或與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)（BM-間充質(zhì)干細胞及P-間充質(zhì)干細胞各有三位提 供者）。第2B圖：外周血白細胞之⑶llb+或⑶14TDllb+CD33+細胞與間充質(zhì)干細胞共 培養(yǎng)后之定量百分比，與外周血白細胞單獨培養(yǎng)相比較之P〈〇. 05。第2C圖：間充質(zhì)干 細胞誘發(fā)之骨髓衍生的抑制細胞之抑制功能，同種異體外周血白細胞（T，標的細胞）以 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)染色以評估細胞分裂，并在添加或不添 加間充質(zhì)干細胞擴增之骨髓衍生的抑制細胞（E，作用細胞）下，以抗-CD3/28(a-CD3/28)刺 激，其中該添加以不同E:T比例進行。以流式細胞分析評估PBL細胞分裂，右圖為量化結(jié)果， p〈0. 05。第2D圖：誘導型一氧化氮合酶（iNOS)之表達，第2E圖：MSC-擴增之骨髓衍生的 抑制細胞之精氨酸酶-1 (ARG1)之表達，由PBL負面選擇CDlf細胞，單獨培養(yǎng)或與間充質(zhì) 干細胞共培養(yǎng)，進一步以⑶11b、⑶33、及iNOS(第2D圖）或ARG1(第2E圖）染色。第2F 圖：藉由MSC-擴增之骨髓衍生的抑制細胞而增加⑶4+⑶25 mgh調(diào)控性T細胞（T ,egs)，將表現(xiàn) ⑶14_CDllb+⑶33+之MSC-擴增之骨髓衍生的抑制細胞分出（FACS)，并與經(jīng)抗-⑶3/28刺 激之異體PBL以不同比例共培養(yǎng)，并評估高表現(xiàn)CD4+CD25之T細胞之誘導作用，右圖為量 化結(jié)果，與PBL/a-CD3/28相較之p〈0. 05。
[0016] 第3圖顯示骨髓衍生的抑制細胞之間充質(zhì)干細胞擴增作用系經(jīng)由分泌之肝細胞 生長因子（HGF)所調(diào)控。第3A圖：骨髓衍生的抑制細胞受間充質(zhì)干細胞誘發(fā)之擴增作用系 經(jīng)分泌因子所調(diào)控。異體PBL與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，無論是直接接觸（MSC)或由培養(yǎng)盤 分隔（TW)者，均產(chǎn)生⑶14TDllb+⑶33+骨髓衍生的抑制細胞之擴增作用；*，p〈0.05與PBL 單獨培養(yǎng)者比較；n. s.:不顯著。第3B圖：以細胞因子定量陣列分析間充質(zhì)干細胞之高量分 泌因子；IL :間白素、LAP :潛伏型勝肽、SDF :基質(zhì)衍生因子。第3C圖：添加外源性重組HGF 至PBL可增加骨髓衍生的抑制細胞數(shù)量（*，p〈0. 05線性趨勢）。第3D圖：經(jīng)HGF-擴增之 骨髓衍生的抑制細胞中iNOS (上行）及ARG1 (下行）表達之測試。第3E圖：經(jīng)HGF-擴增 之骨髓衍生的抑制細胞對于經(jīng)抗-CD3/28刺激之PBL增殖之抑制作用，以CFSE對細胞分裂 進行染色，并以流式細胞儀分析。第3F圖：以HGF專一性小片段干擾RNA(siRNA)抑制間充 質(zhì)干細胞之HGF分泌，會使骨髓衍生的抑制細胞擴增作用消失。異體外周血白細胞與間充 質(zhì)干細胞（來自3位提供者）共培養(yǎng)，并經(jīng)無標的小片段干擾RNA (siRNA Ctrl)或HGF專 一性siRNA(siHGF)轉(zhuǎn)染，并進行⑶14TDllb+CD33+細胞之評估；*，p〈0. 05與間充質(zhì)干細胞 (左圖）或PBL單獨培養(yǎng)（右圖）相較。
[0017] 第4圖顯示癌細胞分泌之HGF及小鼠體內(nèi)施用HGF可增加骨髓衍生的抑制細胞之 數(shù)量。第4A圖：間充質(zhì)干細胞所分泌之HGF之量，MG63 (骨肉瘤細胞系）、胚胎干細胞衍生 之間充質(zhì)前體細胞（EMP)、及JEG-3(絨毛膜癌細胞系）；第4B圖：四種細胞類型及PBL共培 養(yǎng)后之骨髓衍生的抑制細胞之倍數(shù)增生；*，P〈〇. 05線性趨勢。第4C圖：將重組HGF(lOOng) 以尾靜脈注射至C57BL/6小鼠，并于注射后一天及三天評估其外周血、脾臟及骨髓中之 CDllb+Grl+細胞；*，p〈0. 05 與 PBS 相較。
[0018] 第5圖顯示由HGF擴增之骨髓衍生的抑制細胞經(jīng)其受體c-met及增加STAT3磷酸 化所調(diào)控。第5A圖：以流式細胞儀分析骨髓衍生的抑制細胞上之c-met表達（12位提供 者），并提供量化之平均熒光強度（MFI)之圖表；*，p〈0. 05與同型免疫球蛋白對照組相較 (Ctrl)。第5B圖：c-met與HGF調(diào)控之骨髓衍生的抑制細胞擴增之關(guān)聯(lián)。以同型免疫球蛋 白（IsoAb)或c-met阻斷抗體（anti-c-Met)阻斷外周血白細胞，以重組HGF(20ng/ml)處 理，并評估CD14TDllb+CD33+細胞之增加。第5C圖：STAT3與HGF調(diào)控之骨髓衍生的抑制細 胞擴增之關(guān)聯(lián)。將重組HGF (20ng/ml)添加至⑶14_白細胞中，并對⑶1 lb、⑶33、及經(jīng)磷酸化 之STAT3 (pSTAT3)進行染色，以流式細胞儀評估（右上角數(shù)值為MFI)，一并提供量化之MFI 之圖表；*，p〈0. 05線性趨勢。第?圖：將重組HGF(20ng/ml)及不同劑量之cpdl88(STAT3 抑制劑）添加至PBL中，并對⑶11b、⑶33、及經(jīng)磷酸化之STAT3 (pSTAT3)進行染色，以流式 細胞儀評估，一并提供量化之⑶14TD1 lb+CD33+pSTAT3+細胞所占比例；a，p〈0. 05與PBL單 獨培養(yǎng)相較；b，p〈0. 05線性趨勢。
[0019] 第6圖顯示HGF所調(diào)控之骨髓衍生的抑制細胞擴增之機制。
[0020] 第7圖顯示胎盤衍生之間充質(zhì)干細胞所分泌之HGF對于經(jīng)抗-⑶3/28-活化之同 種異體外周血白細胞增殖之抑制作用。第7A圖：外周血白細胞，單獨培養(yǎng)（