一種胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離冷凍的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離冷凍的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞（StemCells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing)的多潛能細(xì) 胞，是原始且未特化的細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組 織器官和人體的潛在功能。干細(xì)胞存在所有多細(xì)胞組織里，能經(jīng)由有絲分裂與分化來分裂 成多種的特化細(xì)胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細(xì)胞。干細(xì)胞的來源有很多，包括 胎盤、臍帶、臍帶血與骨髓等。
[0003] 銳膜間充質(zhì)干細(xì)胞（Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具 有間充質(zhì)干細(xì)胞一般表型及分化潛能外，還具有低免疫原性等獨特性質(zhì)，是一種多能基質(zhì) 細(xì)胞。蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞不但為妊娠期間胚胎植入提供適宜環(huán)境，而且通過表達免疫調(diào)控 因子與多種免疫細(xì)胞相互作用，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC等，發(fā)揮其在胚胎植入、免疫耐受 建立及正常妊娠維持中的重要作用。目前蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用于再生治療，具有較 高的臨床應(yīng)用價值。
[0004] 蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSC)與人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞UCMSC相比，都來源于廢棄組織， 取材方便、不對人體造成傷害、不涉及倫理道德問題，且免疫原性低、具有免疫抑制性，可以 抑制其他細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，減緩移植物抗宿主病，分泌多種細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞凋亡，具有造血支持作用，表達間充干細(xì)胞標(biāo)記。但DMSC具有更強的跨系分化能力， 能分化成外、中、內(nèi)胚層細(xì)胞，表達部分胚胎干細(xì)胞標(biāo)記（SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、C0T4、 REX-UTRA-1-61)，有人稱DMSC為亞全能干細(xì)胞，其發(fā)育階段上與胚胎干細(xì)胞接近。相對于 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC)，DMSC增殖迅速、更強的長期增殖能力、多系分化能力更佳。并 且，DMSC可以和UCMSC-樣進行深低溫保存，可用于建立細(xì)胞庫，而骨髓來源MSC卻很難實 現(xiàn)。
[0005] 胎盤壁脫膜中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，易于體外分離培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量更多，體外 可大量擴增，縮短細(xì)胞培養(yǎng)的時間，取材方便，且具有多向分化潛能，因而具有更大的臨床 應(yīng)用價值，是細(xì)胞移植治療和組織工程學(xué)的良好來源。
[0006] 壁蛻膜作為母胎組成部分之一，跟其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，符合2006年國際干細(xì) 胞協(xié)會發(fā)表的間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。貼壁生長，流式指標(biāo)合格，具有成骨、成脂、成軟骨的能 力。此外壁脫膜細(xì)胞還能產(chǎn)生某些免疫抑制因子而使其具有免疫抑制效應(yīng)，不但為妊娠期 間胚胎植入提供適宜環(huán)境，而且通過表達免疫調(diào)控因子與多種免疫細(xì)胞相互作用，從而對 胎兒成長發(fā)育免疫受排斥起著至關(guān)重要的作用。
[0007] 目前常規(guī)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞多用動物血清，如雞、豬、牛等，其中胎牛血清因獲取 量大、污染輕而被廣泛應(yīng)用。但近年隨著人畜共患病發(fā)病率的增加，以異種血清培養(yǎng)的組織 向臨床應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑，因此自體血清培養(yǎng)越來越受到重視。
[0008] 但目前公開的各類胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法雖均能獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，但都不 一定為母源性，也不符合臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明擬從原料采集開始直至細(xì)胞制備完成的 全過程進行臨床級、統(tǒng)一、系統(tǒng)監(jiān)控，以實現(xiàn)胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離冷凍的制備 方法，本發(fā)明制備方法在胎盤采集前對產(chǎn)婦進行篩選，以符合條件的健康足月產(chǎn)婦志愿者 作為采集目標(biāo)，且采集男嬰胎盤，之后進行分離擴增進行規(guī)?；囵B(yǎng)直至第三代，進行冷凍 保存，對分離過程及冷凍過程的的中間品進行一系列質(zhì)量檢測，冷凍后細(xì)胞復(fù)蘇洗滌待用， 活率無明顯降低。
[0010] 本發(fā)明提供一種胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離冷凍的制備方法，所述制備方法 為：
[0011] A、壁蛻膜分離：將分離獲得的胎盤用生理鹽水清洗后，剝離壁蛻膜，并將撕下的壁 蛻膜剪成小塊置于離心管中；
[0012] B、使用膠原酶對離心管中的壁蛻膜進行消化；
[0013]C、間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)：將消化后的壁蛻膜進行過濾，洗滌后得間充質(zhì)干細(xì)胞， 將間充質(zhì)干細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；細(xì)胞密度達約8000-9000個/cm2,此后每3天換液一 次，至細(xì)胞融合度達80%以上時，用胰蛋白酶消化傳代，用原培養(yǎng)上清終止；
[0014]D、間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)：傳代時，傳代細(xì)胞接種密度約為8000-9000個/cm2;3 天后，細(xì)胞密度達80 %以上，再次傳代；傳至第三代，收集細(xì)胞并計數(shù)和活率，按2X107/ml/ 管進行冷凍保存；
[0015]E、胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞使用：液氮取出冷凍細(xì)胞，復(fù)蘇，復(fù)蘇后洗滌兩遍， 統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率，根據(jù)計數(shù)結(jié)果按臨床需要將細(xì)胞和人白蛋白溶液混勻待用；并留 樣進行內(nèi)毒素和細(xì)菌檢測。
[0016] 優(yōu)選地，步驟A中，所述胎盤為經(jīng)過篩選、采集的健康足月男嬰胎盤，分離獲得的 胎盤需置于胎盤保存盒中4°C冷藏，并于24小時內(nèi)進行處理。
[0017] 優(yōu)選地，所述篩選的檢測項目包括攜帶病毒、遺傳家族史等；所述病毒如乙肝、丙 肝、艾滋、梅毒等。
[0018] 所述壁蛻膜組織來自母體。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟A中，將撕下的壁蛻膜剪成1~4mm3的小塊。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟B中，使用濃度為2mg/ml的II型膠原酶對壁蛻膜進行消化，消化 溫度37°C，消化1小時，恒溫振蕩。本發(fā)明采用濃度為2mg/ml的II型膠原酶對壁蛻膜進行 消化，操作過程比較簡單方便，且其消耗組織塊用時少，縮短了細(xì)胞培養(yǎng)時間及培養(yǎng)周期， 且從獲取細(xì)胞數(shù)量上講也有大量研究數(shù)據(jù)表明其數(shù)量較多。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟C中，采用輸血器濾網(wǎng)進行過濾，所述在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條 件為37°C、5%C02、飽和濕度環(huán)境；所述胰蛋白酶的濃度為0. 125%，由0. 25%成品胰酶稀 釋1倍制成。本發(fā)明中用的是濃度為〇. 125%的胰蛋白酶，研究表明在其他條件相同的情況 下，濃度為〇. 125%的胰蛋白酶在細(xì)胞貼壁生長的環(huán)境下的其消化能力達到最強，細(xì)胞也不 會受到相應(yīng)的影響。
[0022] 優(yōu)選地，所述輸血器濾網(wǎng)孔徑< 17μm，總有效過濾面積為24-34厘米可以濾除 血液和血液成分制品中可能存在的聚集的血小板、白細(xì)胞和纖維蛋白；所述完全培養(yǎng)基由 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例為10%，谷氨酰胺比例 0· 02mmol/ml〇
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟D中，對收集的細(xì)胞統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率，并對細(xì)胞上清進行 無菌檢測、支原體檢測；以及對間充質(zhì)干細(xì)胞進行表面標(biāo)志、分化檢測。
[0024] 優(yōu)選地，所述無菌檢測包括用血培養(yǎng)儀進行細(xì)菌和真菌檢測；所述支原體檢測包 括用PCR法進行支原體檢測。
[0025] 優(yōu)選地，所述對間充質(zhì)干細(xì)胞進行表面標(biāo)志、分化檢測具體為：按照間充質(zhì)干細(xì)胞 標(biāo)準(zhǔn)檢測陽性指標(biāo)以及陰性指標(biāo)；對第三代間充質(zhì)干細(xì)胞進行分化實驗檢測干細(xì)胞分化能 力，分別向成脂、成骨、成軟骨三個方向分化，進行油紅〇染色、茜素紅染色和阿爾新藍染色 鑒定。
[0026] 優(yōu)選地，所述陽性指標(biāo)如⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105等；所述陰性指標(biāo)如⑶19、 CD14、CD34、CD45、HLA-DR。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟E中，復(fù)蘇條件為40°C，2min;復(fù)蘇后用生理鹽水300g，洗滌兩 次每次l〇min。
[0028] 優(yōu)選地，步驟D中，所述冷凍保存所用細(xì)胞冷凍保護液由完全培養(yǎng)基和二甲基亞 砜配制而成，其中二甲基亞砜終濃度10%。
[0029] 本發(fā)明制備的胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過PCR擴增Y染色體上的一段保守序 列SRY來鑒定性別，確定為壁蛻膜來源。
[0030] 本發(fā)明所述的胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離冷凍的制備方法的優(yōu)點在于從原 料采集開始直至細(xì)胞制備完成的全過程進行臨床級、統(tǒng)一、系統(tǒng)監(jiān)控，以實現(xiàn)胎盤源壁蛻膜 間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。胎盤源壁蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞冷凍也使得自體胎盤源壁蛻膜 間充質(zhì)干細(xì)胞能夠較長時間在體外保存，從而選擇最佳時間進行胚胎