專利名稱：：利用胎盤干細胞治療炎性疾病的制作方法利用胎盤干細胞治療炎性疾病本申請要求2007年2月12日提交的美國臨時申請?zhí)?0/901,067的優(yōu)先;f又，其通過引用^皮全文納入于本"i兌明書中。1.發(fā)明領域本發(fā)明^提供了利用人胎盤干細胞治療患有疾病、障礙或病狀的個體、的方法，所述疾病、障礙或病狀是由不希望或有害的免疫反應導致，或者與不希望的或有害的免疫反應相關，例如炎性腸病、移植物抗宿主疾病、多發(fā)性-埂化、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、紅斑狼瘡、糖尿病、蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)或;更皮病。2.
背景技術：
：人類干細胞是全能或多能前體細胞，能夠產(chǎn)生多種成熟的人細胞系。現(xiàn)有證據(jù)證實，許多種組織(即使不是所有組織)都能使用干細胞重建，并恢復生理學和組織學功能。已經(jīng)表^正了多種不同類型的哺乳動物干細胞。參見例如Caplan等人，美國專利號5，486,359(人間充質(zhì)干細胞)；Boyse等人，美囯專利號5,004,681(胎兒和新生兒造血干細胞和前體細胞)；Boyse等人，美國專利號5,192,553(同上)；Beltrami等人，Cell114(6):763-766(2003)(心肌干細胞)；Forbes等人，J.Pathol.197(4):510-518(2002)(肝臟干細胞)。臍帶血和來自臍帶血的全部有核細胞已被用于移植，在已進行了剝除療法(ablativetherapy)的患者中部分或完全恢復造血功能。胎盤是特別有吸引力的干細胞來源。由于哺乳動物胎盤來源充足，并且通常作為醫(yī)學廢物丟棄，它們代表了可用于醫(yī)療的干細胞的獨特來源。本發(fā)明提供了這樣的分離的胎盤干細胞、胎盤干細胞群，和利用上述細胞治療疾病、障礙或病狀的方法，所述疾病、障礙或病狀是由不想要或有害的免疫反應導致的，或者與不想要或有害的免疫反應相關的，例如炎性腸病、移植物抗宿主疾病、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、紅斑狼瘡、糖尿病、蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)或石更皮病。3.發(fā)明概述本發(fā)明^提供了治療、控制、改善或預防與免疫反應相關、或由免疫反應導致的疾病、障礙和/或病狀(例如與炎癥相關、導致炎癥或由炎癥導致的疾病、障礙和/或病狀)的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療已患有或有風險患有疾病、障礙或病狀的個體的方法，所述疾病、障礙或病狀是與有害的、不利的、不合適或不希望的免疫反應相關或由其導致的，例如炎癥，所述方法包括向個體施用治療有效量的胎盤干細胞或被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中治療有效量是足以可檢測地改善所述疾病、障礙或病狀的一種或多種癥狀或者減緩一種或多種癥狀的發(fā)展的量。本發(fā)明還提供了胎盤干細胞在制備下述藥物中的用途，所述藥物用于治療、控制、改善或預防與免疫反應相關、或由免疫反應導致的疾病、障礙和/或病狀，例如與炎癥相關、導致炎癥或由炎癥導致的疾病、障礙和/或病狀。在一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞是CD10+、CD34-、CD105+、CD200+的胎盤干細胞。在另一個實施方案中，所述胎盤干細胞表達CD200和HLA-G，或表達CD73、CD105和CD200，或表達CD200和OCT-4，或表達CD73、CD105和HLA-G，或表達CD73和CD105，并且當含有所述胎盤干細胞的千細胞群在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述胎盤干細胞利于在所述胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體，或者所述胎盤干細胞表達OCT-4并且當含有所述胎盤干細胞的千細胞群在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述胎盤干細胞利于在所述胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體。在一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞抑制免疫細胞的活性，例如抑制T細胞的增殖。在一個具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是炎性腸病。在一個更具體的實施方案中，所述炎性腸病是克隆氏病。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病是胃十二指腸的克隆氏病。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病是空腸回腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病是回腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病是回腸結腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病是克隆氏結腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述炎性腸病是潰瘍性結腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述炎性腸病的癥狀是部分胃腸道的一處或多處炎癥和肺大、腹痛、腸道的頻繁排空、腹瀉、直腸出血、貧血、體重減輕、關節(jié)炎、皮膚問題、發(fā)熱、小腸壁增厚、腸道疤痕組織形成、腸道中形成瘠和潰瘍、腸壁形成一處或多處瘺管、形成一處或多處肛門裂、發(fā)展成營養(yǎng)不良、發(fā)展成腎結石、發(fā)展成膽結石、發(fā)展成肝或膽系統(tǒng)的疾病、出血性腹瀉、惡心、腹部絞痛、貧血、疲勞、體重減輕、胃口喪失、體液或營養(yǎng)物喪失、皮膚損害、關節(jié)痛、生長遲緩、發(fā)展成骨質(zhì)疏松、或眼部炎癥。在另一個更具體的實施方案中，所述炎性腸病的癥狀是一處或多處搔癢或刺痛的皮滲、發(fā)熱、泛發(fā)性紅皮病、脫皮、膽紅素水平升高(例如高于正常)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平升高、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平升高、堿性磷酸酶(AP)的水平升高、腹瀉、腸道出血、痙攣、腹痛和腸梗阻，眼燒灼感、眼刺激、畏光、由于眼淚分泌減少導致眼睛疼痛、口干、對酸或l束食物敏感、腹痛、吞咽困難、吞咽痛、體重減輕、阻塞性肺病、肌無力、神經(jīng)性疼痛或肌痙攣。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是移植物抗宿主疾病。在更具體的實施方案中，所述移植物抗宿主疾病發(fā)生在同種異體骨髓移植之后。在另一個更具體的實施方案中，所述移植物抗宿主疾病發(fā)生在實體器官移植之后。在另一個更具體的實施方案中，所述移植物抗宿主疾病發(fā)生在復合組織同種異體移植之后。在另一個更具體的實施方案中，通過所述施用，所述移植物抗宿主疾病減輕至少一個級別。在另一個更具體的實施方案中，作為所述施用的結果，在移植后100天內(nèi)，所迷移植物抗宿主疾病的發(fā)展不超過II級。在另一個更具體的實施方案中，作為所述施用的結果，在移植后100天內(nèi)，所述移植物抗宿主疾病的發(fā)展不超過I級。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是類風濕性關節(jié)炎(RA)。在更具體的實施方案中，所述施用在患RA的個體的至少一個關節(jié)中，足以可檢測地改善一種或多種RA癥狀，或足以可檢測地降低一種或多種RA癥狀的發(fā)生。在另一個更具體的實施方案中，所述施用在患RA的個^^的至少一處非關節(jié)組織中，足以可檢測地改善一種或多種RA癥狀，或足以可檢測地降低一種或多種RA癥狀的發(fā)生。在更具體的實施方案中，所述非關節(jié)組織是皮膚(真皮)、肺、自身免疫系統(tǒng)或血液、腎組織、心血管8組織、眼組織或神經(jīng)組織。在更具體的實施方案中，所述RA癥狀是RA的并發(fā)病狀。在更具體的實施方案中，所述RA的并發(fā)病狀是壞疽性膿皮癥、嗜中性白細胞皮膚病、斯威特氏綜合征(Sweet'ssyndrome)、病毒感染、結節(jié)性紅斑、小葉性脂膜炎、肢端皮膚萎縮、掌紅斑、彌漫性變薄(米紙皮膚)、皮膚脆弱、在外表面的皮下結節(jié)(例如肘部)、肺纖維變性(例如甲氨蝶呤治療所導致的)、卡普蘭氏結節(jié)、血管炎性障礙、甲褶梗死、神經(jīng)病、腎病、淀粉樣變性、假性肌肥大、心內(nèi)膜炎、左心室衰竭、血管炎、鞏膜軟化、多發(fā)性單神經(jīng)炎、寰樞推不全脫位。在本發(fā)明方法的另一個具體的實施方案中，多個胎盤或臍帶干細胞被遺傳改造以表達包含IL-lRa和DHFR的融合蛋白。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是多發(fā)性硬化。在更具體的實施方案中，所述多發(fā)性硬化是復發(fā)/緩解型多發(fā)性硬化、繼發(fā)進行性多發(fā)性硬化、原發(fā)進行性多發(fā)性硬化，或進行性/復發(fā)性多發(fā)性硬化。在另一個更具體的實施方案中，所述多發(fā)性硬化的癥狀是四肢的一處或多處感覺障礙、視神經(jīng)機能障礙、錐體束機能障礙、膀胱機能障礙、腸機能障礙、性障礙、共濟失調(diào)或復視。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是紅斑狼瘡。在更具體的實施方案中，所述紅斑狼掩的癥狀是一處或多處面頰珍、蝶形發(fā)、盤狀狼瘡、脫發(fā)，口、鼻或陰道潰瘍，皮膚損害、關節(jié)痛貧血和/或鐵缺乏、低于正常的血小板和白血細胞計數(shù)、抗磷脂抗體綜合征、血液中出現(xiàn)抗心磷脂抗體、心包炎、心肌炎、心內(nèi)膜炎、肺和/或胸膜炎癥、胸膜炎、胸膜滲漏、狼掩性肺炎、慢性彌漫性肺間質(zhì)病、肺動月永高血壓、肺栓塞、肺出血、無痛性血尿或蛋白尿、狼瘡性腎炎、腎衰竭，和/或出現(xiàn)具有"線環(huán)狀"異常的膜性腎小^^腎炎；神經(jīng)病變(例如癲癇、精神病、腦脊液異常)；T-細胞異常(例如CD45磷酸酶缺乏和/或CD40配體表達增加)；和/或非特異性病變(例如狼癡性胃腸炎、狼瘡性胰腺炎、狼瘡性膀胱炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病、副交感神經(jīng)障礙、視網(wǎng)膜脈管炎、系統(tǒng)性脈管炎、FcsRIy表達增加、T細胞內(nèi)鈣水平升高和維持、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信號的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是硬皮病。在更具體的實施方案中，硬皮病是彌漫性硬皮病。在更具體的實施方案中，硬皮病是局限性硬皮病(CREST綜合癥)。在更具體的實施方案中，硬皮病是斑狀/線狀硬皮病。在另一個更具體的實施方案中，其中所述癥狀是面部皮膚的一處或多處硬化、手指皮膚的硬化、雷諾綜合癥、不合適的肢體血管收縮、釣化、毛細管擴張、食道運動障礙、或血中出現(xiàn)抗著絲粒抗體或抗scl70/抗拓樸異構酶抗體。在另一個更具體的實施方案中，本發(fā)明方法包括向所述個體施用第二治療劑。在另一個更具體的實施方案中，所述第二治療劑是抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑、免疫抑制化合物或血管擴張劑。在另一個更具體的實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)。在更具體的實施方案中，所述蕈樣真菌病處于斑塊期。在更具體的實施方案中，其中所述蕈樣真菌病處于皮膚腫瘤期。在更具體的實施方案中，所述蕈樣真菌病處于皮膚發(fā)紅階段(紅皮病)。在更具體的實施方案中，所述蕈樣真菌病處于淋巴結階段。在更具體的實施方案中，所述癥狀是出現(xiàn)一處或多處瘙癢的扁平紅斑；出現(xiàn)隆起且^e更的扁平紅斑(斑塊);出現(xiàn)隆起的腫塊(結節(jié))；在全身出現(xiàn)大的紅色、瘙癢、鱗片區(qū)；手掌和腳掌裂開；手掌和腳掌皮膚增厚；開裂；或淋巴結炎癥。在更具體的實施方案中，所述方法包括向所述個體施用第二治療劑。在更具體的實施方案中，所述第二治療劑是抗炎藥、免疫抑制化合物、暴露于陽光、暴露于紫外線、外用類固醇、局部表面放療、全皮膚電子束輻照、向被紅皮病感染的皮膚施用有才幾蜂蜜、干護C素、維甲西t、rexinoid或vorinostat。在另一個實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是糖尿病。在具體的實施方案中，所述糖尿病是l型糖尿病。在另一個實施方案中，所述疾病、障礙和/或病狀是牛皮癬。在更具體的實施方案中，所述牛皮痺是斑塊狀銀屑病(尋常性牛皮癬)。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮褲是屈側銀屑病(皮褶牛皮癬)。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮痺是滴狀牛皮癬。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮癬是膿皰性牛皮癬。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮癬是指(趾)甲牛皮褲。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮痺是牛皮癬關節(jié)炎。在另一個更具體的實施方案中，所述牛皮癬是紅皮性牛皮癬。在另一個更具體的實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以使牛皮癬區(qū)域嚴重性指數(shù)(PsoriasisAreaSeverityIndex)降低5、10、15、20、25、30、35、40或更多點的量。在一個實施方案中，發(fā)明提供了向患有牛皮癬的個體施用有效劑量的胎盤干細胞，其中所述有效劑量是所述量的胎盤干細胞足以可檢測地改善例如一種或多種牛皮痺癥狀、降低一種或多種牛皮癉癥狀的嚴重程度或減緩一種或多種牛皮痺癥狀的發(fā)展。在更具體的實施方案中，所述一種或多種癥狀是出現(xiàn)一處或多處被銀白色鱗狀皮膚覆蓋的發(fā)炎皮膚的隆起區(qū)域；出現(xiàn)斑塊;出現(xiàn)在皮膚皺褶處的皮膚光滑炎癥斑；出現(xiàn)一處或多處小橢圓狀丘疹；出現(xiàn)一處或多處膿包；一個或多個手指甲或腳趾甲外觀的改變；甲松離；一個ii或多個指(趾)甲剝落；關節(jié)和結締組織炎癥；指(趾)炎；脊推炎；大部分表皮膚的泛發(fā)炎癥和表皮脫落；或者嚴重的瘙癢、腫大和/或疼痛。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括再施用一種或多種治療劑或療法，其中，所述治療劑或療法包括一種或多種包含皮質(zhì)類固醇的乳膏或油膏、包含維生素D3類似物的乳膏或油膏、包含蒽啉的乳膏或油膏、包含堅果油的乳膏或油膏、包含類維生素A的乳膏或油膏、包含堅煤焦油的乳膏或油膏；在紫外線下暴露一次或多次，例如暴露約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20分鐘，例如波長在約280nm至約315nm之間的UVB，特別是約311nm至約312nm的UVB;局部施用補骨脂素，結合UVA暴露；或者一次或多次系統(tǒng)性施用一種或多種氨甲蝶呤、環(huán)孢霉素、類維生素A、石克鳥嘌呤、羥基力泉、辟u氮磺胺吡啶、麥考酚酸嗎乙酯、石克唑嘌呤、口服他克莫司和/或延胡索酸酯。在任何上述方法的另一個具體的實施方案中，所述方法包括向患有疾病、障礙或病狀的個體施用第二治療劑。在更具體的實施方案中，所述第二治療劑是抗炎劑、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、鎮(zhèn)痛藥或抗生素。在更具體的實施方案中，所述第二治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。在更具體的實施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)劑是免疫抑制劑。在更具體的實施方案中，所述免疫抑制劑是抗CD3抗體(例如OKT3，muronomab)、抗IL-2受體抗體(例如巴利昔單抗(SIMULECT)和達珠單抗(ZENAPAX))、抗T細胞受體抗體(例如Muronomab-CD3)、辟j坐噤i令、神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素、氨甲蝶呤、巰基嘌呤、麥考酚酸嗎乙酯、他克莫司或西羅莫司。在另一個更具體的實施方案中，所述第二治療劑包括另一種類型的干細胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞、骨髓或造血干細胞。3.1定義如本文中使用的，術語"SH2"指與標志物CD105上的表位結合的抗體。因此，被稱為SH2+的細胞是CD105+。如本文中使用的，術語"SH3"和"SH4"指與標志物CD73上的表位結合的抗體。因此，被稱為SH3+和/或SH4+的細胞是CD73+。如本文中使用的，術語"分離的干細胞"指基本上與干細胞來源的組織(例如胎盤)中的其它非干細胞分離的干細胞。如果至少去除了50%、60%、70%、80%、90%、95%,或至少99%的與干細胞天然相關的非干細胞(例如,在干細胞的收集和/或培養(yǎng)過程中)，則干細胞是"分離的"。如本文中使用的，術語"分離的細胞群"意指基本上與細胞群來源的組織(例如胎盤)中的其它細胞分離的細胞群。例如，如果至少去除了50%、60%、70%、80%、90%、95%,或至少99°/。的與干細胞群天然相關的細胞(例如，在干細胞群的收集和/或培養(yǎng)過程中)，則干細胞群是"分離的"。如本文中使用的，術語"胎盤干細胞"指源自哺乳動物胎盤的干細胞或前體細胞，而不考慮形態(tài)學、細胞表面標志物、或原代培養(yǎng)后的傳代數(shù)，其附著于組織培養(yǎng)基質(zhì)上(例如組織培養(yǎng)塑料或纖粘連蛋白包被的組織培養(yǎng)板)。然而，本文中使用的術語"胎盤干細胞"不是滋養(yǎng)層、細胞滋養(yǎng)層、生殖細胞或胚胎千細胞(如本領域技術人員所理解的那些細胞)。如果細胞保留了干細胞的至少一種屬性，則認為該細胞是"干細胞"，例如與一種或多種類型的干細胞相關的標志物或基因表達譜；在培養(yǎng)時復制至少10-40代的能力;多潛能，例如在體外、體內(nèi)或兩種情況下分化成三個胚層中的一層或多層細胞的能力；缺少成體(即，已分化)細胞的特征；等等。術語"胎盤干細胞"和"胎盤來源的干細胞"可以互換使用。除非另外注明，術語"胎盤"包括臍帶。在一些實施方案中，本發(fā)明中披露的胎盤干細胞是體外多潛能的(即，在分化條件下細胞在體外分化)、體內(nèi)多潛能的(即，細胞在體內(nèi)分化)，或兩者兼有。如本文中使用的，當標志物可檢測時，干細胞對該特定標志物是"陽性"的。例如，由于胎盤干細胞上存在可檢測的CD73，它的量可檢測地大于背景(例如，與同種型對照相比)，胎盤干細胞就是CD73陽性。在下述情況下細胞也是標志物陽性的所述標志物可用于區(qū)分所述細胞與至少一種其它類型細胞，或者當存在于該細胞或被該細胞表達時所述標志物可用于選擇或分離所述細月包。如本文中使用的，"免疫調(diào)節(jié)作用"和"免疫調(diào)節(jié)"指導致或能夠?qū)е旅庖邞鹂蓹z測的改變，以及導致免疫應答可檢測的改變的能力。如本文中使用的，"免疫抑制"和"免疫抑制性"意指導致，或具有能力導致免疫應答的可檢測的降低，以及導致免疫應答的可檢測的抑制的能力。4.圖1:來自灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶干細胞(E)的胎盤干細胞的活力。X-軸上的數(shù)字表示獲得干細胞的胎盤。圖2:由FACSCalibur確定的來自灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶干細胞(E)的HLAABC7CD457CD347CD133+細胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表示獲得干細胞的胎盤。圖3:由FACSAria確定的來自灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶(E)的HLAABC7CD457CD347CD133+細胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表示獲得干細胞的胎盤。圖4:源自胎盤灌流液的干細胞中的HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表達。圖5:源自羊膜的干細胞中的HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表達。圖6:源自絨毛膜的干細胞中的HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表達。圖7:源自羊膜-絨毛膜盤的干細胞中的HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表達。圖8:源自臍帶的干細胞中的HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200的表達。圖9:源自灌流液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶(E)的干細胞中，HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200表達的平均表達。圖10A和10B:混合淋巴細胞反應(MLR)是原始免疫應答模型，被胎盤干細胞抑制。通過門控的"活的"且CD8+和CD4+的T細胞門，監(jiān)控羧基熒光素琥珀酰酯(CFSE)L。w細胞的百分比(分別是圖IOA和IOB)。該百分比在6天MLR(圖10C和10D,MLR道)后增加，且在添加胎盤干細胞(圖3C和3D，PMLR道)后，在CD8+和CD4+T細胞室中效果被逆轉(zhuǎn)。圖11:來自羊膜絨毛膜盤(AC)和臍帶基質(zhì)(UC)的胎盤來源的干細胞抑制同種異體-MLR。用CD4+T細胞或CD8+T細胞，或者等量的CD4+T細胞和CD8+T細胞實施MLR。橫坐標增殖的抑制百分比。圖12:胎盤干細胞和臍帶干細胞抑制同種異體-MLR。在圓底96孔板的孔中進行6天實驗。胎盤細胞T細胞樹突細胞=約l:10:1。干細胞獲自羊膜絨毛膜(AC)、羊膜(AM)或臍帶(UC)。FB二成纖維細胞。BM=骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。圖13:來自不同供體的胎盤干細胞不同程度地抑制同種異體-MLR。該圖比較了來自兩個胎盤供體的胎盤干細胞對MLR的抑制，所述供體為61665和63450。來自胎盤63450的干細胞表現(xiàn)出比來自胎盤61665的干細胞更大程度的MLR抑制。圖14:17天回歸測定和被修飾的胎盤干細胞的回歸測定。X軸表示測定中添加的胎盤干細胞數(shù)。Y軸上測量了存活的CD23+LCL細胞數(shù)(淋巴母細胞系，人工創(chuàng)建的轉(zhuǎn)化的B細胞系)。圖15:在6天回歸測定中胎盤干細胞對T細胞增殖的抑制。利用CFSE染色的T細胞建立回歸測定。6天后，評定T細胞增殖。顯示了來自羊膜-絨毛膜(AC)、臍帶(UC)、羊膜(AM)或骨髓(BM)的干細胞對T細胞增殖的相對抑制。圖16:在MLR中，在引入跨膜插入物時抑制的百分比變化，其中將胎盤細胞與T細胞隔離，但允許培養(yǎng)基的交換。在25,000、50,000、75,000或100,000個臍帶干細胞/反應時，顯示相對高程度的抑制，以及為了實現(xiàn)抑制在高滴度中對細胞-細胞接觸的相對高程度的需要。16圖17:添加12,500(UCOP/TW12.5)至100,000(UCOP/TW100)的臍帶基質(zhì)干細胞(UC),通過膜將其與MLR分離(TW)或與MLR(OP)接觸。使用等量的CD4+T細胞和CD8+T細胞，計算MLR的百分比抑制(%CFSELow=89%)。圖18:胎盤干細胞劑量和細胞-細胞接觸依賴性之間的關系是非線性的。根據(jù)圖17給出的值計算在引入插入物時MLR抑制的改變。圖19:胎盤干細胞和BMSC對T細胞應答的差異抑制。通過比較CFSEL°W門中的MLRT細胞(高于70%)與貼壁細胞MLR中T細胞的百分比來計算胎盤干細胞或BMSC產(chǎn)生的抑制程度。MLR與貼壁細胞分離(跨膜)，或在開放孔中實施(開放)。X軸給出了貼壁細胞數(shù)，單4立為千，添加至500,000T細胞和50,000DC細胞中。貼壁細胞與T細胞的比為1:5至1:40圖20:對于胎盤干細胞和骨髓-來源的干細胞免疫抑制的差異性細胞-細胞接觸需求。根據(jù)圖15中給出的抑制數(shù)據(jù)，計算接觸依賴性，以貼壁細胞/T細胞的比例來顯示(n=3，除了UC:n=2)。圖21:胎盤干細胞-介導的T細胞抑制不需要T調(diào)節(jié)細胞。利用全PBMC或去除T調(diào)節(jié)細胞的PBMC來實施抑制測定，CFSE染色，在一些條件下加入UC胎盤干細胞。N=l。圖22:在次級MLR中CFSEHigh細胞的增殖。從使用了CFSE染色細胞的胎盤干細胞MLR中，在FACSAria上分離CFSEHighT細胞。所述細胞用于MLR。N=l。圖23:在75%替換時，來自抑制的干細胞MLR的上清液不抑制MLR。實施了UC(PUC)、AC(PAC)和BMSC(PBM)MLR，都抑制MLR超過50%。用來自實驗的上清液替換200pl用于新鮮MLR的培養(yǎng)基中的10-150pi。作為對照，以相同的方式使用來自T細胞和AC(T/AC)或T細胞和骨髓-來源的干細胞(T/BM)的共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基(N=2)。圖24A和24B:預孵育的T細胞和貼壁細胞不影響MLR抑制。在兩個獨立實驗中使用來自2個供體的T細胞。在添加DC(第0天，A)或CFSE+CD3+T纟田月包(B，從而開始MLR)前，將成熟的DC(A)或CFSE染色的CD3+T細胞(B)與臍帶干細胞(UC)或骨髓-來源的干細胞孵育指定的天數(shù)。然后，如常的進行貼壁細胞MLR6天。N=2。圖25A和25B:A.MLR中分泌的MIP-la和MIP-ip，胎盤干細胞或骨髓-來源的干細胞的MLR與MLR抑制反向相關。B:來自相同實驗的T細胞和NK細胞CFSE數(shù)據(jù)。從圖14B顯示的MLR中收獲上清液，分析MIP-la和MIP-1(3。B:如上述實施MLR，觀察到平均55%(T細胞)或83%(NK細胞)CFSE"w細月包。計算干細胞添加的抑制效應。N=2(NK部分N=l)。圖26:在修飾的回歸測定和MLR上清液中，測量了MCP-1。MLR的胎盤干細胞抑制和回歸測定與化學趨化物MCP-1分泌相關。AC:來自羊膜-絨毛膜盤的干細胞。UC:來自臍帶的干細胞。淺色條MLR測定結果。深色條回歸測定結果。Y軸檢測溶液中的MCP-1的pg。圖27:在修飾的MLR和回歸測定的上清液中，IL-6的測量。修飾的MLR和回歸測定的胎盤干細胞抑制與IL-6分泌相關。AC:來自羊膜-絨毛膜盤的干細胞。UC:來自臍帶的干細胞。淺色條MLR測定結果。深色條回歸測定結果。Y軸檢測溶液中的IL-6的pg。5.詳細i兌明18本發(fā)明提供了治療患有疾病、障礙或病狀的個體的方法，所述疾病、障礙或病狀是與不合適的、不需要的、有害的或不利的免疫反應相聯(lián)系的、由其產(chǎn)生的或相關的，例如自4本免疫性疾病，所述方法包括向患有疾病、障礙或病狀的個體施用一次或多次劑量的胎盤干細胞和/或臍帶干細胞。下文將詳細討i侖用于治療此類個體的方法，以及單獨施用此類干細胞或與其它療法組合的方法。5.1.利用胎盤干細胞的免疫調(diào)節(jié)本發(fā)明提供了通過將免疫細胞與多個胎盤干細胞接觸，調(diào)節(jié)(例如抑制)免疫細胞或多個免疫細胞的活性(例如增殖)的方法。這樣的免疫調(diào)節(jié)可用于治療患有疾病、障礙或病狀的個體，所述疾病、障礙或病狀是由不需要的或有害的免疫反應導致的、或與其相關的，例如炎性腸病、移植物抗宿主疾病、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、紅斑狼瘡、糖尿病、蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)或硬皮病。此類免疫調(diào)節(jié)還可用于例如降低或消除抗同種異體組織的宿主免疫應答，所述組織例如移植的器官，復合組織同種移植物等。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制免疫應答的方法，包括將多個免疫細胞與多個胎盤干細胞接觸一段時間，所述時間足夠使所述胎盤干細胞可檢測地抑制免疫反應，其中所述胎盤干細胞可檢測地抑制混合淋巴細胞反應(MLR)測定或回歸測定中的T細胞增殖。胎盤干細胞是例如本文中別處描述的胎盤干細胞(參見5.2節(jié))。用于免疫抑制的胎盤干細胞可以源自或獲自單個胎盤或多個胎盤。用于免疫抑制的胎盤干細胞還可以源自單個物種，例如預定接受者的物種，或者其功能需要被降低或抑制的免疫細胞的物種，或者可以源自多個物種。19在所述方法的描述中，"免疫細胞"指免疫系統(tǒng)的任何細胞，特別是T細胞和NK(天然殺傷)細胞。因此，在所述方法的不同實施方案中，胎盤干細胞接觸多個免疫細胞，其中所述多個免疫細胞是或者包括多個T細胞(例如:多個CD3+T細胞、CD4+T細胞和/或〔08+T細胞)和/或天然殺傷細胞。在所述方法的描述中，"免疫反應"可以是免疫細胞對免疫細胞通常接受的刺激的任何反應，例如對存在抗原的反應。在不同實施方案中，所述免疫反應可以是T細胞(例如CD3+T細胞、CD4+T細胞和/或CD8+T細胞)響應外來抗原的增殖，例如存在于灌流液或移植物中的抗原，或自身抗原(如在自身免疫性疾病中)。免疫反應還可以是移植物所含T細胞的增殖。所述免疫反應還可以是天然殺傷細胞的任何活動、樹突細胞的成熟，等等。所述免疫反應還可以是一類或多類免疫細胞活性的局部的、組織-特異性或器官-特異性效應或全身效應，例如免疫反應可以是移植物抗宿主病、炎癥、炎癥-相關皰痕組織的形成、自體免疫病狀(例如類風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病、紅斑狼瘡等)等。在本文中，"接觸"涵蓋了在單個容器(例如培養(yǎng)皿、瓶、小瓶等)中，或在體內(nèi)，例如同一個體(例如哺乳動物如人)，將胎盤干細胞和免疫細胞置于一起。在優(yōu)選的實施方案中，接觸足夠長的時間并接觸足夠數(shù)量的胎盤干細胞和免疫細胞，使得免疫細胞的免疫功能的改變可檢測。更優(yōu)選的，在多個實施方案中，與不存在胎盤干細胞的免疫功能相比，所述接觸足以抑制至少50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%的免疫功能(例如響應抗原的T細胞增殖)?？梢栽隗w外測定中確定體內(nèi)環(huán)境中的此類抑制(參見下文);也就是說，對于接受者個體中的特定胎盤干細胞數(shù)和免疫細胞數(shù)，從體在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在體外利用胎盤干細胞調(diào)節(jié)免疫反應的方法，或調(diào)節(jié)一類或多類的多個免疫細胞的活性的方法。胎盤干細胞和多個免疫細胞的接觸可以包括在相同物理空間中合并胎盤干細胞和免疫細胞，使多個胎盤干細胞中的至少一部分與多個免疫細胞中的至少一部分接觸；將胎盤干細胞和免疫細胞保持在具有相同培養(yǎng)基的分離的物理空間中；或者可以包括將來自胎盤干細胞或免疫細胞的一種培養(yǎng)物的培養(yǎng)基與另一類型的細胞接觸(例如從胎盤干細胞培養(yǎng)物獲得培養(yǎng)基，并將分離的免疫細胞重懸在該培養(yǎng)基中)。在具體的實施例中，在混合淋巴細胞反應(MLR)中進行所述接觸。在另一個具體的實施方案中，在回歸測定中進行所述接觸。這樣的接觸可以發(fā)生在為確定特定的多個胎盤干細胞免疫調(diào)節(jié)(如免疫抑制)的程度而設計的實驗設定中。此類實驗設定可以是例如混合淋巴細胞反應(MLR)或回歸測定。實施MLR和回歸測定的方法是本領域普遍已知的。參見例4口Schwarz,"TheMixedLymphocyteReaction:AnInVitroTestforTolerance,"J.Exp.Med.127(5):879-890(1968);Lacerda等人，"HumanEp-andInduceSelectiveRegressionsofAutologousEBV-InducedBLymphoprolif-erationsinXenograftedCB-17Scid/ScidMice,"J.Exp.Med.183:1215-1228(1996)。在優(yōu)選的實施方案中，實施的MLR中多個胎盤干細胞與多個免疫細胞接觸(例如淋巴細胞，如003+、CD4+和/或CD8+T淋巴細胞)。MLR可用于確定多個胎盤干細胞的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中測試這樣的多個胎盤干細胞，所述MLR包括以約10:1:2的比例組合CD4+或CD8+T細胞、樹突細胞(DC)和胎盤干細胞，其中T細胞用染料(例如CFSE，其分配至子細胞中)染色，并使T細胞增殖約6天。如果與存在DC但不存在胎盤干細胞的條件下的T細胞增殖相比，在存在胎盤干細胞的條件下，6天的T細胞增殖可檢測地降低，則多個胎盤干細胞是免疫抑制的。在這樣的MLR中，胎盤干細胞是解凍的或從培養(yǎng)物中收獲的。約20,000個胎盤干細胞重懸在100pl的培養(yǎng)基(RPMI1640，1mMHEPES緩沖液，抗生素和5%合并的人血清)中，使它們與孔底貼壁2小時。利用Miltenyi磁珠從全外周血單核細胞中分離€04+和/或CD8+T細胞。所述細胞是CFSE染色的，每孔添加總量100,000個T細胞(僅CD4—T細胞，僅CD8+T細胞，或等量的CD4+和CD8+T細胞)。將孔內(nèi)體積補至200^1，進行MLR。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制免疫反應的方法，包括包括將多個免疫細胞與多個胎盤干細胞接觸一段時間，所述時間足夠使所述胎盤干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)測定或回歸測定中可檢測地抑制T細胞增殖。在一個實施方案中，在MLR中使用的所述胎盤千細胞表示來自更大胎盤干細胞群的胎盤干細胞樣品或等份。從不同胎盤或同一胎盤的不同組織獲得的胎盤干細胞群，調(diào)節(jié)免疫細胞活性的能力可以不同，例如抑制T細胞活性或增殖或NK細胞活性的能力可以不同。因此，理想地在使用前確定具體胎盤干細胞群的免疫抑制能力。例如，可以通過在MLR或回歸測定中檢測胎盤干細胞群的樣品，確定這種能力。在一個實施方案中，用樣品實施MLR，并確定該測定中胎盤干細胞群所導致的免疫抑制程度。然后，該免疫抑制的程度可以歸因于樣本來源的胎盤干細胞群。因此，MLR可以作為確定具體胎盤干細胞群抑制免疫功能的絕對能力和相對能力的方法使用。可以改變MLR的參數(shù)來提供更多的數(shù)據(jù)，或更好地確定胎盤干細胞樣品免疫抑制的能力。例如，由于胎盤干細胞的免疫抑制與測定中存在的胎盤干細胞數(shù)大致成比例地增加，在一個實施方案中,MLR可以用兩個或多個數(shù)目的胎盤干細胞實施，例如1x103、3x103、1X104和/或3X104胎盤干細胞/反應。還可以改變相對于測定中T細胞數(shù)的胎盤干細胞數(shù)。例如，測定中的胎盤干細胞和T細胞可以以任何比例存在，例如約10:1至約1:10,優(yōu)選約1:5，但也可以使用相對更多的胎盤干細胞數(shù)或T細胞數(shù)。可以以相〗以的方式4吏用回歸測定。本發(fā)明提供了在體內(nèi)使用胎盤干細胞調(diào)節(jié)免疫反應或者調(diào)節(jié)一類或多類的多個免疫細胞的活性的方法。可以在例如接受了多個胎盤干細胞的接受者個體中使胎盤干細胞和免疫細胞相接觸。在一個實施方案中，當在個體中進行接觸時，所述接觸是在外源性胎盤干細胞(即，不是來自該個體的胎盤干細胞)和該個4本的內(nèi)源性多個免疫細胞之間。在具體的實施方案中，個體體內(nèi)的免疫細胞是CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和/或NK細胞。對由不適當?shù)幕虿焕硐氲拿庖叻磻獙е?、使惡化或相關的任何病狀，利用胎盤干細胞的上述免疫抑制是有利的。例如，胎盤干細胞-介導的免疫調(diào)節(jié)，例如免疫抑制，可用于抑制由于個體的免疫系統(tǒng)抗一種或多種自身組織所導致的免疫失調(diào)反應。因此，在多個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制免疫反應的方法，其中所述免疫反應是自體免疫性疾病，例如紅斑狼瘡、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎或多發(fā)性硬化。多個胎盤干細胞與一種或多種類型的多個免疫細胞的接觸可以在例如向接受者個體植入或移植的一種或多種類型的組織的情形下在體內(nèi)發(fā)生或相伴進行。此類組織可以是例如骨髓或血液；器官；特定組織(例如皮膚移植物)；復合組織同種異體移植物(即，包括兩種或多種不同組織類型的移植物)等。在這方面，胎盤干細胞可用于抑制接受者個體內(nèi)、移植的組織或移植物內(nèi)、或兩者內(nèi)含有的一種或多種免疫細胞的一種或多種免疫反應。所述23接觸可以發(fā)生在植入或移植之前、過程中和/或之后。例如，可以在移植或植入時施用胎盤干細胞。胎盤干細胞還可以，或可選的，在移植或植入前施用，例如，在移植或植入的l、2、3、4、5、6或7天前。胎盤干細胞還可以，或可選的，在移植或植入后施用，例如，在移植或植入的1、2、3、4、5、6或7天后。優(yōu)選的，在免疫反應的任何可檢測的跡象或癥狀可被檢測出之前，將多個胎盤干細胞與多個免疫細胞接觸，所述跡象或癥狀是接受者個體的或移植的組織或植入物的，例如移植物抗宿主疾病的可檢測的跡象或癥狀，或可檢測的炎癥。在另一個實施方案中，個體內(nèi)的接觸主要是在外源性胎盤干細胞和外源性前體細胞或干細胞之間，例如分化為免疫細胞的外源性前體細胞或干細胞。例如，個體4妻受部分或全部免疫消融(immunoablation)或骨髓消融(myeloablation)作為癌癥輔助治療后，可以接受胎盤干細胞與一種或多種類型的干細胞或前體細胞的組合。例如，胎盤干細胞可以與多個CD34+細胞組合，如CD34+造血前^f本細胞。此類CD34+細胞可以是例如來自組織來源的CD34+細胞，如外周血、臍帶血、胎盤血或骨髓。CD34+細胞可以從此類組織來源;波分離出來，或者整個組織來源(例如臍帶血單位或骨髓單位)或所述組織來源的部分純化制品(例如來自臍帶血的白血細胞)可以和胎盤干細胞組合。胎盤干細胞與臍帶血的組合、或與來自臍帶的干細胞的組合，描述在Hariri，美國申請公開號2003/0180269中?？梢园幢壤騻€體施用胎盤干細胞，所述比例對于個體中已知的或預期的免疫細胞(如T細胞)數(shù)是約10:1至約1:10，優(yōu)選1:5。然而，在非限制性的實例中，可以以約10,000:1、約1,000:1、約100:1、約10:1、約1:1、約1:10、約1:100、約1:1,000或約1:10,000的比例，向個體施用多個胎盤干細胞24。通常，可以施用約1X105至約1X108胎盤干細胞/接受者千克，優(yōu)選約1X106至約1x107胎盤干細胞/接受者千克，來產(chǎn)生免疫抑制。在多個實施方案中，向個體或?qū)ο笫┯玫亩鄠€胎盤干細胞包括至少、大約、或不多于lx105、3x105、1x106、3x106、1x107、3x107、1x108、3x108、1x109、3x109胎盤干細胞，或更多。胎盤干細胞還可以與一種或多種第二類型的干細胞施用，例如來自骨髓的間充質(zhì)干細胞。此類第二干細胞可以按與胎盤干細胞的比例向個體施用，例如，約10:1至約1:10。為了便于在體內(nèi)使胎盤干細胞和免疫細胞接觸，可以通過任何途徑向個體施用胎盤千細胞，所述途徑足以使胎盤干細胞與免疫細胞4皮此接觸。例如，胎盤干細胞可以經(jīng)靜^c內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、目艮內(nèi)、胃腸道外向個4本施用，或直接施用到器官例如胰腺內(nèi)。對于體內(nèi)施用，可以將胎盤干細胞配制成藥物組合物，如下文5.6.1節(jié)所述。免疫抑制的方法還可以包括添加一種或多種免疫抑制劑，特別是在體內(nèi)的環(huán)境。在一個實施方案中，多個胎盤干細胞在個體體內(nèi)與多個免疫細胞接觸，并向個體施用包含免疫抑制劑的組合物。免疫抑制劑是本領域普遍已知的，包括例如抗T細胞受體抗體(單克隆或多克隆，或其抗體片段或衍生物)、抗IL-2受體抗體(例如巴利昔單抗(SIMULECT)或達(克)珠單抗(ZENAPAX))和T細胞受體抗體(例如鼠單克隆抗體-CD3)、疏唑嘌呤、皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素、他克莫司、麥考酚酸嗎乙酯、西羅莫司、神經(jīng)鈣蛋白抑制劑，等。在具體的實施方案中，免疫抑制劑是巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-la或MIP-1(3的中和抗體。優(yōu)選的，抗MIP-la或MIP-lp抗體的施用量足以可檢測地降低所述個^f本內(nèi)MIP-la和/或MIP-ip的量，例如在移植時。5.2胎盤干細胞和胎盤干細胞群本發(fā)明提供的免疫抑制方法使用胎盤干細胞，即可從胎盤或其部分獲得的干細胞，其(1)附著于組織培養(yǎng)底物；(2)具有分化為非胎盤細胞類型的能力；和(3)在足夠的數(shù)量下，具有可檢測地抑制免疫功能的能力，例如在混合淋巴細胞反應測定或回歸測定中的CD4+T和/或CD8+T細胞增殖。胎盤干細胞不源自血液，例如，胎盤血或臍帶血。在本發(fā)明提供的方法和組合物中使用的胎盤干細胞具有抑制個體免疫功能的能力，并依據(jù)它們的上述能力進行選擇。胎盤干細胞可以源自胎兒或母體(即，可以具有母親或胎兒的基因型)。胎盤干細胞群，或含有胎盤干細胞的細胞群，可包含在起源上僅為胎兒的胎盤干細胞或在起源上僅為母體的胎盤干細胞，或者可以包含胎兒和母體起源的胎盤干細胞的混合群體?？梢酝ㄟ^下文描述的形態(tài)學、標志物和培養(yǎng)特征筌別和選擇胎盤干細胞以及含有胎盤干細胞的細胞群。5.2.1物理和形態(tài)學特征本發(fā)明所使用的胎盤干細胞當在原代培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)時，附著于組織培養(yǎng)底物上，例如組織培養(yǎng)容器的表面(如組織培養(yǎng)塑料)。培養(yǎng)中的胎盤干細胞一般呈現(xiàn)成纖維細胞樣、星狀外觀，從中央細胞體延伸出大量胞質(zhì)突起。然而，胎盤干細胞與在相同條件下培養(yǎng)的成纖維細胞在形態(tài)學上不同，胎盤干細胞表現(xiàn)出的胞質(zhì)突起多于成纖維細胞的此類突起。形態(tài)學上，胎盤干細胞也可與造血干細胞相區(qū)分，其在培養(yǎng)中通常呈現(xiàn)出更圓的或鵝卵石狀的形態(tài)。5.2.2細胞表面、分子和遺傳標志物26本發(fā)明的方法和組合物中有效的胎盤干細胞和胎盤干細胞群表達多種標志物，可用于鑒別和/或分離千細胞或包含干細胞的細胞群。本發(fā)明的胎盤干細胞和干細胞群(即，兩種或多種胎盤干細胞)包括從胎盤或其任意部分(例如羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜盤、胎盤小葉、臍帶，等)直接獲得的干細胞和含有干細胞的細胞群。胎盤干細胞群還包括培養(yǎng)中的胎盤干細胞群(即，兩種或多種干細胞)，和容器(例如袋子)中的群體。然而，胎盤干細胞不是滋養(yǎng)層。胎盤干細胞一般表達標志物CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，不表達CD34、CD38,或CD45。月臺盤干細胞還可以表達HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。這些標志物可用于鑒別胎盤干細胞，以區(qū)別胎盤干細胞和其它干細胞類型。由于胎盤干細胞可以表達CD73和CD105，其可具有間充質(zhì)干細胞樣特征。然而，由于胎盤干細胞可以表達胎兒特異性標志物CD200和HLA-G，其可以與間充質(zhì)干細胞區(qū)分，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞既不表達CD200也不表達HLA-G。以相同的方式，由于不表達CD34、CD38和/或CD45，胎盤干細胞被確認為非造血干細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含多個CD200+、HLA-G+的免疫抑制性胎盤干細胞的分離的細胞群，其中所述多個干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)中可檢測地抑制T細胞增殖。在分離的群體的具體實施方案中，所述干細胞還是CD73+和CD105+。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是CD34—、CD38—或CD45—。在更具體的實施方案中，所述干細胞還是CD34—、CD38\CD45\CD73+和CD105+。在另一個實施方案中，當在允許胚狀體形成的條件培養(yǎng)下時，所述分離的群體產(chǎn)生一個或多個胚狀體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含多個CD73+、CD105+、CD200+的免疫抑制性胎盤干細胞的分離的細胞群，其中所述千細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)中可檢測地抑制T細胞增殖。在所述群體的具體實施方案中，所述干細胞是HLA-G+。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞是CD34—、CD3&或CD45、在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD34—、CD38—、CD45—和HLA-G+。在另一個具體的實施方案中，當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述分離群體產(chǎn)生一個或多個胚狀體?？捎糜诒景l(fā)明提供的組合物和方法中的分離的細胞群可包含多個。0200+、OCT-4+、免疫抑制性的胎盤干細胞，其中所述干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)中可檢測地抑制T細胞增殖。在具體的實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+。在另一個具體的實施方案中，所述千細胞是HLA-G+。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞是CD34—、CD38—和CD45—。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一個具體的實施方案中，當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述分離群體產(chǎn)生一個或多個胚狀體。本發(fā)明還提供了包含多個CD73+、CD105+和HLA-G+、免疫抑制性胎盤干細胞的分離的細胞群，其中所述干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)檢測中可檢測地抑制T細胞增殖。在上述多個所述細胞的特定實施方案中，所述干細胞還是CD34—、CD38—或CD45—。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是CD34—、CD38'和CD45—。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是OCT-4+。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是CD200+。在更具體的實施方案中，所述干細胞還是CD34—、CD38—、CD45_、OCT-4+和CD200+。本發(fā)明還提供了包含多個免疫抑制性胎盤干細胞的分離的細胞群，所述干細胞是CD73+、CD105+干細胞，其中所述多個細胞在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時形成一個或多個胚狀體，并且所述干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)檢測中可檢測地抑制T細胞增殖。在具體的實施方案中，所述干細胞還是CD3《、CD3&或CD45'。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是CD3《、CD3&和CD45、在另一個具體的實施方案中，所述干細胞還是0CT-4+。在更具體的實施方案中，所述干細胞還是OCT-4+、CD34'、CD38'和CD45-。本發(fā)明還提供了包含多個免疫抑制性胎盤干細胞的分離細胞群，所述胎盤干細胞是OCT-4+干細胞，其中所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時形成一個或多個胚狀體，并且其中所述干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)檢測中可檢測地抑制T細胞增殖。在多個實施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，或至少95%的所述分離的胎盤細胞是OCT-4+干細胞。在上述群體的具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+。在另一個具體的實施方案中，所述千細胞還是CD34—、CD38'或CD45—。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞是CD200+。在更具體的實施方案中，所述干細胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34\CD38—和CD45'。在另一個具體的實施方案中，所述群體已被擴增，例如傳代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次，或至少20次。本發(fā)明提供的免疫抑制性胎盤干細胞包括分離的胎盤干細胞、分離的胎盤干細胞群體，或包含胎盤干細胞的分離的細胞群，其中所述胎盤千細胞是CD10+、CD34-、CD105+和CD200+。本發(fā)明還提供包含多個免疫抑制性胎盤干細胞的分離的細胞群，其中所述胎盤干細胞是CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-和CD133-。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的組合物和方法中有用的干細胞是分離的胎盤干細胞，所述干細胞是HLA-A,B,CT、CD45—、CD133-和CD3《。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細胞群，其中至少約70%、至少約80%、至少約90%,至少約95%或至少約99%的所述胎盤干細胞是HLA-A,B，Cr、CD45—、CD133^口CD34、在具體的實施方案中，所述干細胞或胎盤干細胞群與非干細胞的胎盤細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群與不表現(xiàn)上述特性的胎盤干細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞群中的至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了獲得HLA-A,B,C—、CD45—、CD133—和CD34-的胎盤干細胞的方法，包括從胎盤灌流液中分離所述細胞在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的胎盤干細胞，所述干細胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45—、CD117.和CD133-。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細胞群，其中至少約70%、至少約80%、至少約卯％、至少約95%或至少約99%的所述胎盤干細胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45_、CD117-和CD133—。在具體的實施方案中，所述干細胞或胎盤干細胞群與非干細胞的胎盤細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，在所述分離的胎盤干細胞群中至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個具體30的實施方案中，所述胎盤干細胞群與不表現(xiàn)這些特性的胎盤干細胞分離。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了獲得CD10+、CD13+、CD33+、CD45\CD117—和CD133-的胎盤干細胞的方法，包括從胎盤灌流液中分離所述細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的胎盤干細胞，所述干細胞是CD1(T、CD33\CD44+、CD45—和CD11T。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細胞群，其中至少約70%、至少約80%、至少約90%,至少約95%或至少約99%的所述胎盤干細胞是CD10-、CD33\CD44+、CD45—和CD11T。在具體的實施方案中，所述干細胞或胎盤干細胞群與非干細胞的胎盤細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，在所述分離的胎盤干細胞群中的至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群與不表現(xiàn)上述特性的胎盤干細胞分離。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了獲得CD10'、CD33'、CD44+、CD45—和CD117—的胎盤干細胞的方法，包括從胎盤灌流液中分離所述細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的是分離的胎盤干細胞，所述干細胞是CD10-、CD13'、CD33_、CD45—和CD117_。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細胞群，其中至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述胎盤干細胞是CD1(T、CD13'、CD33'、CD45—和CD117'。在具體的實施方案中，所述干細胞或胎盤干細胞群與非干細胞的胎盤細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，在所述分離的胎盤干細胞群中的至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群與不表現(xiàn)上述特性的胎盤干細胞分離。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了獲得CD10-、CD13'、CD33\CD45—和CD11T的胎盤干細胞的方法，包括從胎盤灌流液中分離所述細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的是分離的胎盤干細胞，所述干細胞是HLA-A，B，Cr、CD45-、CD34和CD133-，是CDIO、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G陽性的，和/或CD117陰性的。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細胞群，其中所述干細胞是HLA-A，B,C'、CD45\CD3《和CD133-，且群體中至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或約990/o的干細胞是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G陽性的，和/或CD117陰性的。在具體的實施方案中，所述干細胞或胎盤干細胞群與非干細胞的胎盤細胞分離。在另一個具體的實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，在所迷分離的胎盤干細胞群中的至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群與不表現(xiàn)上述特性的胎盤干細胞分離。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了獲得HLA-A,B，C-、CD45-、CD34和CD133-，且CDIO、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G陽性，和/或CD117陰性的胎盤干細胞的方法，包括從胎盤灌流液中分離所述細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的胎盤干細胞，所述干細胞通過抗體結合確定是CD200+和CD10+，并通過抗體結合和RT-PCR確定是CD117_。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的胎盤干細胞，所述干細胞是CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G+、I類HLA—和(3-2-微球蛋白-。在另一個實施方案中，本發(fā)明才是^^了胎盤干細胞，其中至少一個標志物的表達比間充質(zhì)干細胞(例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞)高至少2倍。在另一個實施方案中，所述分離的胎盤干細胞是非母體起源的。在另一個具體的實施方案中，在所述分離的胎盤干細胞群中的至少約90%、至少約95%或至少約99%的所述細胞是非母體起源的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的胎盤干細胞群，通過醛脫氫酶活性測定評定，其中多個胎盤干細胞是醛脫氫酶(ALDH)陽性的。此類測定是本領域已知的(參見例如Bostian和Berts,Biochem.J.,173，787，(1978))。在具體的實施方案中，所述ALDH測定使用ALDEFLUOR(Aldagen，Inc.，Ashland,Oregon)作為^脫氬酶活性的標志物。在具體的實施方案中，所述多個指所述細胞群中約3%至約25%的細胞。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了臍帶干細胞群，其中通過使用ALDEFLUOR作為醛脫氫酶活性指示劑進行醛脫氫酶活性測定，多個所述臍帶干細胞是醛脫氫酶陽性的。在具體的實施方案中，所述多個指所述細胞群中約3%至約25%的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞或臍帶干細胞群體表現(xiàn)出的ALDH活性比相同條件下培養(yǎng)的相同數(shù)量的骨髓來源間充質(zhì)干細胞群高至少3倍，或至少5倍。對每種上述胎盤千細胞或胎盤干細胞群，所述胎盤干細胞或胎盤干細胞群都可以是或者包含這樣的干細胞，所述細胞已經(jīng)傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次，或更多次，或擴增了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40，或更多的群體倍增數(shù)。在任何上述胎盤細胞或細胞群的具體實施方案中，所述細胞的核型，或所述群體中至少約95%或至少約99%的細胞核型是正常的。在任何上述胎盤細胞或細胞群的另一個具體實施方案中，所述細胞或細胞群中的細胞是非母體起源的。具有任何上述標志物組合的分離的胎盤干細胞或分離的胎盤干細胞群，都可以以任何比例組合。可以分離或富集任何兩個或多個上述胎盤干細胞群，以形成胎盤干細胞群。例如，包含由上述一種標志物組合定義的第一胎盤干細胞群的分離的胎盤干細胞群可以和由上述另一種標志物組合定義的第二胎盤干細胞群組合，其中所述第一胎盤干細胞群和第二胎盤干細胞群組合的t匕侈寸是纟勺l:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或約99:1。以此方式，可以組合任何三種、四種、五種或多種上述胎盤干細胞或胎盤干細胞群。在上述胎盤干細胞的具體實施方案中，胎盤干細胞組成性地分泌IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)。所述多個免疫抑制性的胎盤干細胞可以大約包含、至少包含、或包含不超過1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1xio9、5xi09、1xio10、5xl010、1xio11或更多個胎盤干細胞。5.2.3選擇和制備胎盤干細胞群在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇胎盤細胞群，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所迷細胞是CD200+、HLA-G+胎盤干細胞，并且其中所述胎盤干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)測定中可檢測地抑制T細胞增殖34。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+和CD105+的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34'、CD38-或CD45-的干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38\CD45-、CD73+和CD105+的干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇還包括選擇當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，形成一個或多個胚狀體的多個胎盤干細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還4是供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇多個胎盤細胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95。/。的所述細胞是CD73+、CD105+、CD200+胎盤干細胞，并且其中所述胎盤干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)測定中可檢測地抑制T細胞增殖。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38—或CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34\CD38\CD45—和HLA-G+的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇還包括選擇當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，形成一個或多個胚狀體的胎盤細胞群。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇多個胎盤細胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95。/。的所述細胞是CD200+、OCT-4+胎盤干細胞，并且其中所述胎盤千細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)測定中可檢測地抑制T細胞增殖。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+和CD105+的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38—和CD45-的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA畫G十的胎盤干細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇多個胎盤細胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述細胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎盤干細胞，并且其中所述胎盤干細胞在混合淋巴細胞反應(MLR)檢測中可檢測地抑制T細胞增殖。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38—或CD451々胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、CD38—和CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD200+的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34\CD38\CD45\OCT-4+和CD200+的胎盤干細胞在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇多個胎盤細胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95。/。的所述細胞是CD73+、CD105+胎盤干細胞，并且其中所述多個細胞當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，形成一個或多個胚狀體的胎盤細胞群。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34-、CD38—或CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD3豐、CD38—和CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是OCT-4+的胎盤干細胞。在更具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是OCT-4+、CD34\CD38-和CD45—的胎盤干細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了從多個胎盤細胞中選擇多個免疫抑制性胎盤干細胞的方法，包括選擇多個胎盤細胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95o/o的所述分離的胎盤干細胞是OCT-4+干細胞，并且其中所述多個細胞當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，形成一個或多個胚狀體的胎盤細胞群。在具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+和CD105+的胎盤千細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34\CD3K或CD45—的胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD200+的胎盤干細胞。在更具體的實施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38—和CD45—的胎盤干細胞根據(jù)本發(fā)明提供的方法，可以制備免疫抑制性胎盤干細胞群或多個胎盤干細胞。例如，本發(fā)明提供了制備細胞群的方法，包括選擇任意上述多個胎盤干細胞，并從其它細胞(例如，其它胎盤細胞)中分離多個胎盤干細胞。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了制備細胞群的方法，包括選擇胎盤細胞，其中所述胎盤細胞(a)附著于底物；(b)表達CD200和HLA-G，或表達CD73、CD105和CD200，或表達CD200和OCT-4，或表達CD73、CD105和HLA-G，或表達CD73和CD105并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，利于在包含所述千細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體，或表達OCT-4并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，有利于在37包含所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；和(C)在MLR(混合淋巴細胞反應)或回歸測定中，可檢測地抑制CD4+或CD8+T細胞增殖；以及從其它細胞中分離所述胎盤細胞來形成細胞群。在更具體的實施方案中，可以通過這樣的方法制備免疫抑制性胎盤干細胞群，所述方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD200和HLA-G;和(c)在MLR(混合淋巴細胞反應)中，可檢測地抑制CD4、tCD8+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。在另一個具體的實施方案中，所述方法包括選擇胎盤干細胞，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD73、CD105和CD200，和(c)在MLR中，可檢測地抑制CD4、1CD8+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了制備細胞群的方法，包括選擇胎盤干細胞，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD200和OCT-4，和(c)在MLR中，可檢測地抑制CD4+或CD8+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了制備細胞群的方法，所述方法包括選擇胎盤干細胞，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD73和CD105，(c)當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時形成胚狀體，和(d)在MLR中，可檢測地抑制CD4+或CD8+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。在另一個具體的實施方案中，所述方法包括選擇胎盤干細胞，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD73、CD105和HLA-G，且(c)在MLR中，可檢測地抑制CD4+或CD8+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。制備細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達OCT-4，(c)當在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時形成胚狀體，和(d)在MLR中，可檢測地抑制004+或008+T細胞增殖；從其它細胞中分離所述胎盤干細胞來形成細胞群。在制備免疫抑制性胎盤干細胞群的方法的具體實施方案中，所述MLR中存在的所述T細胞和所述胎盤細胞的比例是約5:1。所述方法使用的胎盤細胞可以源自完整胎盤，或主要來自羊膜，或羊膜和絨毛膜。在另一個具體的實施方案中，與缺少所述胎盤干細胞的條件下MLR中T細胞增殖的量相比，所述MLR中的胎盤細胞抑制至少50%、至少75%、至少90%或至少95%的CD4、1CD8+T細胞增殖。所述方法還包括選擇和/或制備能夠免疫調(diào)節(jié)(例如抑制其它免疫細胞的活性，如天然殺傷(NK)細胞的活性)的胎盤干細胞群。5.2.4培養(yǎng)基中的生長對于任一哺乳動物細胞，本文描述的胎盤干細胞的生長部分地依賴于選擇用于生長的特定培養(yǎng)基。在最優(yōu)條件下，胎盤千細胞一般在3-5天內(nèi)數(shù)量加倍。在培養(yǎng)過程中，本發(fā)明^是供的胎盤干細胞附著在培養(yǎng)底物上，例如組織培養(yǎng)容器的表面(例如組織培養(yǎng)皿塑料、纖粘連蛋白包被的塑料，等)，形成單層細胞。分離的胎盤細胞群包括本發(fā)明拔—供的胎盤干細胞，當在合適的條件下培養(yǎng)時，形成胚狀體，即，在附著的干細胞層上生長的三維細胞培養(yǎng)物。胚狀#^內(nèi)的細胞表達與非常早期的干細胞相關的標志物，例如OCT-4、Nanog、SSE3和SSE4。與本文描述的胎盤干細胞不同，胚狀體內(nèi)的細胞一般不附著在培養(yǎng)底物上，但是在培養(yǎng)過程中仍然附在貼壁細胞上。胚狀體細胞的活力依賴于貼壁的胎盤干細胞，在缺少貼壁的干細胞時不形成胚狀體。因此，貼壁的胎盤干細胞有利于在包含貼壁胎盤干細胞的胎盤細胞群中生長一個或多個胚狀體。不希望受制于理論，認為胚狀體細胞在貼壁的胎盤干細胞上的生長與胚胎干細胞在滋養(yǎng)層細胞上的生長相似。間充質(zhì)干細胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，在培養(yǎng)中不形成胚狀體。5.2.5分化在治療疾病、障礙或病狀的方法中使用的所述胎盤干細胞可分化成不同的疋向纟田月包系，所述叛病、障石孚或病^j大與不適當?shù)幕蛴泻Φ拿庖邅V義應相關，或由其導致，例如炎癥。例如，胎盤干細胞可以分化成脂肪原性、軟骨原性、神經(jīng)原性或骨原性細胞系。例如，通過本領域已知的任何例如用于將骨髓來源的間充質(zhì)干細胞分化成相似細胞系的方法，或本文中別處描述的方法，可以實現(xiàn)此類分化。在體外、體內(nèi)，或既在體外也在體內(nèi)，本發(fā)明提供的胎盤干細胞和臍帶干細胞可以表現(xiàn)出分化成特定細胞系的能力。在具體的實施方案中，當被置于導致或促進分化成特定細胞系的條件下時，本發(fā)明提供的胎盤干細胞和臍帶干細胞可以在體外分化，但在體內(nèi)不發(fā)生可檢測的分化，例如在NOD-SCID小鼠模型中。5.3獲得胎盤干細胞的方法5.3.1干細胞收集組合物可以根據(jù)本發(fā)明提供的方法收集和分離胎盤干細胞。一般利用生理學可接受的溶液(例如，干細胞收集組合物)從哺乳動物胎盤獲得千細胞。在2005年12月29日提交的名為"用于收集和保藏胎盤干細胞的改良組合物及利用組合物的方法(ImprovedCompositionforCollectingandPreservingPlacentalStem40CellsandMethodsofUsingtheComposition)"的相關美國臨時中請?zhí)?0/754,969中，詳細描述了干細胞收集組合物。干細胞收集組合物可以包括適合收集和/或培養(yǎng)干細胞的任何生理學可接受的溶液，例如，鹽溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液、Kreb氏液、修飾的Kreb氏液、Eagle氏液、0.9%NaCl，等)、培養(yǎng)基(例如DMEM、HDMEM等)等。千細胞收集組合物可以包括傾向于保存胎盤干細胞的一種或多種組分，即，從收集的時間到培養(yǎng)的時間，保護胎盤干細胞免于死亡，或延緩胎盤干細胞死亡，降低細胞群中胎盤干細胞的死亡數(shù)，等。此類組分可以是例如，凋亡抑制劑(例如半胱天冬酶抑制劑或JNK抑制劑)；血管擴張劑(例如:疏酸鎂、抗高血壓藥物、心鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)激素釋放激素、亞硝基鐵氰化鈉、肼苯達嗪、三磷酸腺苷、腺苷、疏酸消炎痛或鎂、磷酸二酯酶抑制劑，等)；壞死抑制劑(例如2-(lH」引哚-3-基)-3-戊氨基-馬來酰亞胺、吡咯烷二疏代氨基甲酸鹽或氯硝西泮)；TNF-a抑制劑；和/或攜氧全氟化碳(例如全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。干細胞收集組合物可以包括一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶，等。此類酶包括但不限于膠原酶(例如膠原酶I、n、m或iv，來自溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原酶等)、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質(zhì)酸酶，等。干細胞收集組合物可以包括殺菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的實施方案中，抗生素是大環(huán)內(nèi)酯(例如妥布霉素)、頭孢菌素(例如:頭孢氨千、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢羅齊、頭孢克洛、頭孢克時或頭孢羥氨千)、克拉仙霉素、紅霉素、青霉素(例如青霉素V)或喹諾酮(例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素，等。在具體的實施方案中，抗生素是抗革蘭氏(+)和/或革蘭氏(-)細菌活性的，例如綠膿々i單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、金黃色釀膿葡萄球菌(staphylococcusaureus),等o干細胞收集組合物還可以包括一種或多種下列化合物腺苷(約1mM至約50mM);D-葡萄糖(約20mM至約100mM);鎂離子(約lmM至約50mM);分子量大于20,000道爾頓的大分子，在一個實施方案中，以足夠維持內(nèi)皮完整性和細胞活性的量存在(例如合成的或天然存在的膠體，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以約25g/1至約100g/1，或約40g/1至約60g/1存在);抗氧化劑(例如叔丁對甲氧酚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，以約25^M至約lOO夂iM存在)；還原劑(例如N-乙酰半胱氨酸，以約0.1mM至約5mM存在)；防止鈣進入細胞內(nèi)的試劑(例如維拉帕米，以約2(iM至約25(iM存在)；硝化甘油(例如約0.05g/1至約0.2g/1);抗凝劑，在一個實施方案中，存在足夠幫助防止殘留血液凝結的量(例如，濃度為約1000單位/1至約100,000單位/1存在的肝素或水蛭素)，或含有阿米洛利的化合物(例如存在約1.0pM至約5(iM的阿米洛利、異丙基阿米洛利乙酯、環(huán)己基阿米洛利、二甲基阿米洛利或異丁基阿米洛利)。5.3.2胎盤的收集和處理一般，在出生排出后立即回收人胎盤。在優(yōu)選的實施方案中，在知會同意并采集患者與胎盤相關的完整醫(yī)療史后，從患者處回收胎盤。優(yōu)選的，在回收后繼續(xù)記錄醫(yī)療史。此類醫(yī)療史可用于配合胎盤或從其收獲的干細胞的42后續(xù)應用。例如，根據(jù)醫(yī)療史，人胎盤干細胞可用于與胎盤相關的嬰兒、或嬰兒的父母、兄弟姐妹或其它親戚的個體化藥物。在回收胎盤干細胞之前，去除臍帶血和胎盤血。在一些實施方案中，在送達后回收胎盤中的臍帶血。胎盤可以用傳統(tǒng)的臍帶血回收方法處理。一般使用針頭或插管，在重力幫助下，將胎盤放血(參見例如Anderson,美國專利號5,372,581;Hessel等人，美國專利號5,415,665)。針頭或插管通常置于臍靜脈內(nèi)，可以輕柔的按摩胎盤幫助從胎盤放出臍帶血。可以商業(yè)實施此類臍帶血回收，例如LifeBank公司，CedarKnolls，N丄，ViaCord,CordBloodRegistryandCryocell。優(yōu)選的，不進行其它操作，將胎盤重力放血，從而使臍帶血回收過程中的組織破壞最小化。典型的，為了臍帶血回收和干細胞收集(例如，通過灌流或組織解離)，一般將胎盤從分娩室或初生室轉(zhuǎn)移至另一個地點，例如實驗室。優(yōu)選在無菌、絕熱(維持胎盤溫度在20-28。C)的轉(zhuǎn)移裝置中轉(zhuǎn)移胎盤，例如，將胎盤的臍帶近端夾緊放置在無菌、夾拉鏈封閉的塑料袋中，然后將其放置在保溫容器內(nèi)。在另一個實施方案中，在基本根據(jù)2005年9月19日提交的待決美國專利申請?zhí)?1/230,760中描述的臍帶血收集試劑盒中轉(zhuǎn)移胎盤。優(yōu)選的，在分娩后4至24小時將胎盤遞送至實驗室。在一些實施方案中，優(yōu)選的在臍帶血回收前，在插入胎盤的4-5cm(厘米)范圍內(nèi)夾緊臍帶殘端。在其它實施方案中，在回收臍帶血后但是在胎盤的其它處理前夾緊近端臍帶。在收集干細胞前，可以將胎盤儲存在無菌條件下，并儲存在室溫或者5至25°C(攝氏度)的溫度下。胎盤可以在灌流胎盤去除任何殘留的臍帶血前儲存超過48小時的時間，優(yōu)選的儲存4至24小時。胎盤優(yōu)選在5至25。C(攝氏度)下儲存在抗凝劑溶液中。合適的抗凝劑溶液是本領域普遍已知的。例如，可以使用肝素或華法令鈉(warfarinsodium)溶液。在優(yōu)選的實施方案中，抗凝劑溶液含有肝素溶液(例如，在l:1000溶液中l(wèi)%w/w)。在收集胎盤干細胞前，除血的胎盤優(yōu)選儲存不超過36小時。一旦如上述收集和制備，可以以任何本領域已知的方法處理哺乳動物胎盤或其部分，例如，可以灌流或解離(如，用一種或多種組織解離酶來解離)從而獲得干細胞。5.3.3胎盤組織的物理解離和酶消化在一個實施方案中，通過物理解離器官，例如酶消化(例如使用5.3.1節(jié)所述肝細胞收集組合物)，從哺乳動物胎盤中收集干細胞。例如，可以在接觸緩沖液、介質(zhì)或干細胞收集組合物的同時，例如將胎盤或其部分壓碎、剪碎、絞碎、切塊、切細、浸軟等，然后用一種或多種酶消化組織。還可以物理解離胎盤或其一部分，并用一種或多種酶消化，然后將獲得的材料浸入緩沖液、介質(zhì)或干細胞收集組合物或與之混合。如果通過例如臺盼藍不相容法確定解離方法使所述器官中大量的，更優(yōu)選大多數(shù)的，更優(yōu)選至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的細胞存活，則可以使用該物理解離的方法。在物理解離和/或酶消化和干細胞回收前，可以將胎盤分割成各組成部分。例如，可以從羊膜、絨毛膜、臍帶、胎盤絨毛葉、或它們的任意組合，或者臍帶，或其任意組合中獲得胎盤干細胞。優(yōu)選的，從包含羊膜和絨毛膜、或羊膜-絨毛膜和臍帶的胎盤組織獲得胎盤干細胞。在一個實施方案中，從約1:1重量比的羊膜-絨毛膜和臍帶中獲得干細胞。一般可以通過將胎盤組織分離為小塊來獲得胎盤干細胞，例如胎盤組織塊的體積是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、200、300、400、500、600、700、800、900或約1000立方毫米。優(yōu)選的干細胞收集組合物包含一種或多種組織解離酶。酶消化優(yōu)選^f吏用酶組合，例如基質(zhì)金屬蛋白酶和中性蛋白酶的組合(如，膠原酶和分散酶組合)。在一個實施方案中，胎盤組織的酶消化使用基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明質(zhì)酸的粘多糖酶的組合，例如膠原酶、分散酶和透明質(zhì)西吏酶的組合或者LIBERASE(BoehringerMannheimCorp.,Indianapolis,Ind,)和透明質(zhì)酸酶的組合?？捎糜诹呀馓ケP組織的其它酶包括木瓜蛋白酶、脫氧核糖核酸酶、絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性蛋白酶。血清中的(x2微球蛋白可以抑制絲氨酸蛋白酶，因此用于消化的培養(yǎng)基通常是無血清的。在酶消化過程中通常使用EDTA和DNA酶來增加細胞回收的效率。稀釋消化物是優(yōu)選的，從而避免干細胞陷入粘稠的消化物中?？梢允褂萌魏谓M織消化酶的組合。組織消化酶的典型濃度包括例如50-200U/ml的I型膠原酶和IV型膠原酶、1-10U/ml分散酶、和10-100U/ml彈性蛋白酶?？梢越M合使用蛋白酶，即，在同一消化反應中使用兩種或多種蛋白酶，或者可以相繼j吏用從而游離胎盤干細胞。例如，在一個實施方案中，首先用合適量的I型膠原酶在2mg/ml濃度下消化30分鐘，然后用0.25%的胰蛋白酶在37。C消化10分鐘。優(yōu)選在其它酶的使用后再繼續(xù)使用絲氨酸蛋白酶。在另一個實施方案中，可以通過向含有干細胞的干細胞收集組合物中添加螯合劑(例如，乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N,N,N，N，-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))，或者在用干細胞收集組合物分離干細胞前，向解離和/或消化組織的溶液中添加所述螯合劑，進一步解離組織。可以理解，當完整的胎盤或胎盤的一部分同時含有胎兒和母體細胞(例如，胎盤的一部分包含絨毛膜或絨毛小葉)時，收集的胎盤干細胞將同時包含源自胎兒和母體的胎盤干細胞的混合物。當胎盤的部分不含有或只含有可忽略量的母體細胞(例如，羊膜)時，收集的胎盤干細胞將幾乎只含有胎兒的胚胎干細胞。53.4.胎盤灌流還可以通過灌流哺乳動物胎盤來獲得胎盤干細胞。灌流哺乳動物胎盤獲得干細胞的方法公開在例如Hariri,美國專利申請公開號2002/0123141中，和于2005年12月29日提交的，名為"用于收集胎盤干細胞和保存器官的改良基質(zhì)(ImprovedMediumforCollectingPlacentalStemCellsandPreservingOrgans)，，的美國臨時申請?zhí)?0〃54，969中?？梢岳美绺杉毎占M合物作為灌流液，通過灌流例如胎盤^c管系統(tǒng)收集胎盤干細胞。在一個實施方案中，通過使灌流液流經(jīng)臍動脈和/或臍靜月氷來灌流哺乳動物胎盤?？梢岳萌缰亓α魅胩ケP來實現(xiàn)灌流液在整個胎盤的流動。優(yōu)選的，利用泵(如，蠕動泵)迫使灌流液流經(jīng)整個胎盤。例如，可以用套管(如，TEFLON⑧或塑料套管)對臍靜脈插管，所述套管與無菌的連接裝置(如，無菌管道)相連。無菌的連接裝置與灌流歧管相連。在準備灌流中，優(yōu)選的按臍動脈和臍靜脈位于胎盤最高點的方式來定位(如，懸掛)胎盤。可以通過灌流液(例如，所述干細胞收集組合物)在整個胎盤脈管系統(tǒng)、或在整個胎盤脈管系統(tǒng)和相鄰組織中的流通，來灌流胎盤。在一個實施方案中，臍動脈和臍靜脈同時連接移液器，后者通過柔性連接管與灌流液的儲器相連。灌流液流入臍靜脈和動"永。灌流液滲出和/或流經(jīng)血管壁進入周圍的胎盤組織，并從孕期附著在母親子宮上的胎盤表面合適的開46放脈管收集。還可以通過臍帶開口導入灌流液，并允許從與母體子宮壁接觸的胎盤壁內(nèi)的開口流出或滲出。在另一個實施方案中，灌流液流經(jīng)臍靜脈并從臍動脈收集，或者流經(jīng)臍動脈并從臍靜脈收集。在一個實施方案中，在灌流過程中夾緊臍帶近端，更優(yōu)選的，在插入胎盤的臍帶插入物的4-5cm(厘米)范圍內(nèi)夾緊。在除血過程中，從哺乳動物胎盤首先收集的灌流液一般都被臍帶血和/或胎盤血殘留的紅血細胞著色。隨著灌流繼續(xù)和殘留的臍帶血細胞從胎盤中洗出，灌流液變得越來越無色。一般30至100ml(毫升)灌流液足以初步將胎盤除血，但根據(jù)觀察的結果可以使用更多或較少的灌流液。用于收集胎盤干細胞的灌流液體積可以根據(jù)待收集的干細胞數(shù)量、胎盤大小、單個胎盤的收集次數(shù)等來變化。在不同的實施方案中，灌流液的體積可以自50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL、或750mL至2000mL。一般地，在除血后用700-800mL灌流液灌流胎盤。可以在數(shù)小時或數(shù)天的過程中多次灌流胎盤。當多次灌流胎盤時，可以在容器或其它合適的器皿中在無菌條件下維持或培養(yǎng)胎盤，并用干細胞收集組合物或標準灌流液(例如，普通的鹽溶液如磷酸鹽緩沖液("PBS"))灌流，其中含有或不含抗凝劑(如，肝素、華法令鈉、香豆素、雙香豆素)，和/或含有或不含抗微生物劑(如，(3-巰基乙醇(0.1mM)，以及抗生素如鏈霉素(如40-100嗎/ml)、青霉素(如40U/ml)、兩性霉素B(如0.5嗎/ml))。在一個實施方案中，將分離的胎盤維持或培養(yǎng)一段時間而不收集灌流液，從而在灌流和收集灌流液前，維持或培養(yǎng)胎盤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個小時，或47者2或3或更多天。被灌流的胎盤可以被維持一次或多次，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個小時，再用例如700-800mL灌流液灌流第二次。可以灌流胎盤1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小時一次。在優(yōu)選的實施方案中，重復灌流胎盤和收集灌流液(如，干細胞收集組合物)，直到回收的有核細胞數(shù)低于100細胞/ml。可以分別進一步處理不同時間點的灌流液，來回收時間依賴性的細胞群(如，干細胞)。也可以混合不同時間點的灌流液。不希望被任何理論約束，在除血并對胎盤灌流足夠長時間后，認為胎盤干細胞遷移到被除血和灌流的胎盤微循環(huán)中，根據(jù)本發(fā)明的方法，在那里收集干細胞，優(yōu)選通過灌流沖洗到收集器皿中。灌流被分離的胎盤不僅用來去除殘留的臍帶血，而且為胎盤提供了合適的營養(yǎng)，包括氧氣?？梢杂门c用來去除殘留臍帶血細胞的相似溶液來培養(yǎng)和灌流胎盤，優(yōu)選不添加抗凝劑。根據(jù)本發(fā)明的方法灌流，導致獲得的胎盤干細胞數(shù)量顯著多于未用所述溶液灌流哺乳動物胎盤、或者未對哺乳動物胎盤進行其它處理(例如，通過組織解離如酶消化)所獲得的干細胞數(shù)量。在本文的上下文中，"顯著多于"意指多至少10%。根據(jù)本發(fā)明的方法灌流產(chǎn)生的胎盤干細胞顯著多于例如，從培養(yǎng)胎盤或其一部分的培養(yǎng)基中可獲得的胎盤干細胞數(shù)量。通過用包含一種或多種蛋白酶或其它組織解離酶的溶液灌流，可以從胎盤中分離干細胞。在具體的實施方案中，將胎盤或其一部分(例如，羊膜、羊膜和絨毛膜、胎盤小葉或絨毛小葉、臍帶或任何上述的組合)的溫度保持25-37t，并在200mL培養(yǎng)基中用一種或多種組織解離酶孵育30分鐘。收集灌流液中的細胞，降至4。C，并用包含5mMEDTA、2mM二硫蘇糖醇和2mMp-巰基乙醇的冷卻抑制劑混合物洗滌。數(shù)分鐘后，用本發(fā)明的冷卻的(如4°C)干細胞收集組合物洗滌干細胞?？梢岳斫?，利用盤式法灌流(即，收集從胎盤的母體側滲出的灌流液)獲得的是胎兒和母體細胞的混合物。結果，通過該方法收集的細胞包含胎兒和母體來源的胎盤干細胞混合群體。相反，僅通過胎盤脈管系統(tǒng)灌流，因為灌流液流經(jīng)一根或兩根胎盤血管，并僅通過其余血管收集，導致胎盤干細胞群的收集物幾乎都是胎兒來源的。5.3.5胎盤干細胞的分離、分類和鑒別不論是否由灌流或酶消化獲得的，可以通過聚蔗糖梯度離心從其它細胞中初步純化(即，分離)來自哺乳動物胎盤的干細胞。此類離心可以遵循任意標準規(guī)程的離心速度等。例如，在一個實施方案中，在5000xg室溫離心15分鐘從灌流液中回收從胎盤收集的細胞，將細胞與例如污染的殘渣和血小板分離開。在另一個實施方案中，將胎盤灌流液濃縮至約200ml，輕柔的鋪在聚蔗糖上，在22t以約1100xg離心20分鐘，收集細胞的低密度中間層用于進一步處理?？梢詫⒓毎恋碇貞以谛迈r的干細胞收集組合物或適合維持干細胞的培養(yǎng)基中，例如含有2U/ml肝素和2mMEDTA的IMDM無血清培養(yǎng)基(GibcoBRL，NY)。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦程序，可以利用例如LYMPHOPREP(NycomedPharma，Oslo,挪威)分離總單核細月包部分。如本文中使用的，"分離"胎盤干細胞意指將一般與干細胞相關的完整哺乳動物胎盤中的細胞去除至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。當細胞群包含少于50%的一般在完整器官內(nèi)與干細胞相關的細胞時，來自該器官的干細胞就是"分離的"。例如，通過灌流或消化獲得的胎盤細胞可以進一步或初步的利用例如具有0.2%EDTA的0.05%胰蛋白酶(Sigma,StLouisMO)溶液通過差別胰酶消化來分離。由于胎盤千細胞一般在約5分鐘內(nèi)從塑料表面脫離，而其它貼壁的群體一般要消化超過20-30分鐘，因此差別胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex)中和胰蛋白酶后，可以收獲脫離的胎盤干細胞。在分離貼壁細胞的一個實施方案中，在每個T75瓶(優(yōu)選纖連蛋白包被的T75瓶)中，放置等份的5-10x106個細胞。在此實施方案中，可以用商購的間充質(zhì)干細胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)(Cambrex)培養(yǎng)細胞，置于組織培養(yǎng)箱(37°C，5%C02)中。10-15天后，用PBS洗滌從瓶中去除非貼壁細胞。然后用MSCGM替代PBS。優(yōu)選每天檢查瓶中不同貼壁細胞類型的存在，以特別鑒定和擴增成纖維樣細胞簇?？梢酝ㄟ^如下方法監(jiān)控從哺乳動物胎盤收集的細胞數(shù)量和類型，例如利用標準的細胞檢測技術，例如流式細胞4義、細胞分選、免疫細胞化學(例如用組織特異性或細胞標志物特異性抗體染色)熒光活化的細胞分選(FACS)、磁性活化細胞分選(MACS)來測量形態(tài)學和細胞表面標記物的變化；通過利用光學顯微鏡或共聚焦顯微鏡檢查細胞的形態(tài)學；和/或利用本領域普遍已知的技術(例如PCR和基因表達譜)檢測基因表達的改變。這些技術也可用于鑒別對一種或多種特定標志物呈陽性的細胞。例如，利用CD34的抗體，利用上述技術，可以確定細胞是否含有可檢測量的CD34;如果是，則該細胞是CD34+。同時，如果細胞產(chǎn)生可被RT-PCR檢測的足夠多的OCT-4RNA，或者顯著多于成體細胞的OCT-4RNA,則該細胞是OCT-4+。細胞表面標志物(例如CD標志物如CD34)的抗體，和干細胞特異性基因例如OCT-4的序列，也是本領域普遍已知的。可以利用熒光活化細胞分選儀(FACS)分選胎盤細胞，特別是對已經(jīng)經(jīng)過聚蔗糖分離、差別附著、或兩者的結合所分離的細胞。熒光活化細胞分選(FACS)是基于顆粒的熒光性質(zhì)，用于分離顆粒(包括細胞)的普遍已知方法(Kamarch,1987,MethodsEnzymol,151:150-165)。激光激發(fā)單個顆粒中的熒光部分，產(chǎn)生微小電荷，從而可以電磁分離混合物中的正電顆粒和負電顆粒。在一個實施方案中，用不同的熒光標簽標記細胞表面標志物的特異性抗體或配體。細胞經(jīng)過細胞分選儀，基于細胞與所用抗體的結合能力來分離細胞。經(jīng)FACS分選的顆?？梢灾苯幼⑷?6-孔或384-孔板的單個孔中，以便分離和克隆。在一個分選技術方案中，基于標志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表達來分選來自胎盤的干細胞。其可以通過結合下述方法來實現(xiàn)，即基于細胞在培養(yǎng)中的附著性質(zhì)來選擇干細胞。例如，可以在基于標志物表達進行分選之前或之后進行附著選擇干細胞。例如，在一個實施方案中，首先基于CD34的表達分選細胞；保留CD34—的細胞，并將CD200+HLA-G+的細胞與所有其它CD34-細胞分離。在另一個實施方案中，基于標志物CD200和/或HLA-G的表達來分選胎盤細胞；例如，分離表現(xiàn)出任一上述兩種標志的細胞供進一步使用。在具體的實施方案中，表達例如CD200和/或HLA-G的細胞可以基于CD73和/或CD105的表達來進一步分選，或基于抗體SH2、SH3或SH4識別的表位來進一步分選，或基于缺少CD34、CD38或CD45的表達來進一步分選。例如，在一個實施方案中，通過CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表達或缺失來分選胎盤細胞，將CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38—和CD45—的細胞與其它胎盤細胞分離，供進一步使用。在另一個實施方案中，可以使用磁珠分離細胞?？梢岳么判曰罨毎诌x(MACS)技術分選細胞，所述技術是基于顆粒結合磁珠(0.5-100iim直徑)的能力分選顆粒。對磁微珠可以實施多種有效的修飾，包括共價添加特異性識別特定細胞表面分子或半抗原的抗體。然后混合磁珠和細胞，使它們結合。然后將細胞通過磁場，分離出具有特定細胞表面標志物的細胞。在一個實施方案中，可以分離這些細胞，再與偶聯(lián)了針對其它細胞表面標志物的抗體的磁珠混合。細胞再次通過磁場，分離結合了兩種抗體的細胞。然后可以將此類細胞稀釋入不同的盤中，例如微滴定盤中用于克隆分離。還可以基于細胞形態(tài)學和生長特4正來表4正和/或分選胎盤干細胞。例如，胎盤干細胞可以被表征為在培養(yǎng)中具有成纖維細胞樣表型，和/或基于成纖維細胞樣表型來選擇。胎盤干細胞還可以被表征為具有形成胚狀體的能力，和/或基于上述能力來選擇。在一個實施方案中，例如，將形狀為成纖維細胞樣,表達CD73和CD105,并在培養(yǎng)中產(chǎn)生一個或多個胚狀體的胎盤細胞與其它胎盤細胞分離。在另一個實施方案中，將培養(yǎng)中產(chǎn)生一個或多個胚狀體的OCT-4+胎盤細胞與其它胎盤細胞分離。在另一個實施方案中，可以通過集落生成單位試驗來鑒別和表征胎盤干細胞。集落生成單位試驗是本領域普遍已知的，例如MESENCULTTM培養(yǎng)基(StemCellTechnologies,Inc.,VancouverBritishColumbia)。利用本領域已知的標準技術，可以分析胎盤干細胞的活力、增殖潛力和壽命，例如臺盼藍不相容試驗、醋酸熒光素攝取試驗、碘化丙錠攝取試驗(評估活力)；和胸腺嘧啶核苷攝取試驗、MTT細胞增殖試驗(評估增殖)。通過本領域普遍已知的方法可以確定細胞壽命，例如通過確定延長培養(yǎng)中群體倍增的最大數(shù)。利用本領域已知的其它技術也可以分離胎盤干細胞和其它胎盤細胞，例如所需細胞的選擇性生長(陽性選擇)；不需要的細胞的選擇性破壞(陰性選擇)；基于混合群體與例如大豆凝聚素的差別細胞可凝集性的分離；凍融步驟；過濾；低速離心和區(qū)帶離心；離心沖洗(逆流離心)；單〗立重力分離；逆流分布；電泳；等等。5.4胎盤干細胞的培養(yǎng)5.4.1培養(yǎng)基分離的胎盤干細胞、胎盤干細胞群、或者從中可以生長出胎盤干細胞的細胞或胎盤組織可用于開始或接種細胞培養(yǎng)。細胞一般轉(zhuǎn)移到無菌的組織培養(yǎng)容器內(nèi)，所述容器用或未用胞外基質(zhì)或配體包被，例如層粘連蛋白、膠原(如天然的或變性的)、明膠、纖連蛋白、鳥氨酸、玻璃體粘附蛋白和胞外膜蛋白(例如MATRIGEL(BDDiscoveryLabware,Bedford,Mass.))。可以在本領域認為適合干細胞培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基和任何條件下培養(yǎng)胎盤干細胞。優(yōu)選的，培養(yǎng)基包含血清。胎盤千細胞可以培養(yǎng)在例如DMEM-LG(Dulbecco修飾的基礎培養(yǎng)基，低糖)/MCDB201(雞成纖維細胞基礎培養(yǎng)基)，其含有ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒)、LA+BSA(亞油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗壞血酸、PDGF、EGF、IGF-1，和青霉素/鏈霉素;含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15%FBS的DMEM-HG;含有10。/。FBS、10%馬血清和氬化可的松的IMDM(Iscove修飾的Dulbecco培養(yǎng)基)；含有10%FBS、EGF和肝素的M199;含有10%FBS、GLUTAMAXTM和慶大霉素的a-MEM(最低基礎培養(yǎng)基)；含有10%FBS、GLUTAMAX和慶大霉素的DMEM，等。優(yōu)選的培養(yǎng)基是含有2%FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗壞血酸、PDGF、EGF、和青霉素/鏈霉素的DMEM-LG/MCDB-201?？捎糜谂囵B(yǎng)胎盤干細胞的其它培養(yǎng)基包括DMEM(高糖或低糖)、Eagle基礎培養(yǎng)基、Ham的F10培養(yǎng)基(F10)、Ham的F12培養(yǎng)基(F12)、Iscove的修飾的Dulbecco培養(yǎng)基、間充質(zhì)干細胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)、Liebovitz的L-15培養(yǎng)基、MCDB、DMIEM/F12、RPMI1640、改良的DMEM(Gibco)、DMIEM/MCDB201(Sigma)，和CELL-GROFREE。培養(yǎng)基可以添加一種或多種組分，包括例如血清(如胎牛血清(FBS)，優(yōu)選的約2-15%(v/v);馬血清(ES);人血清(HS));(3-巰基乙醇(BME)，優(yōu)選約0.001%(v/v);—種或多種生長因子，例如，血小板右f生的生長因子(PDGF)、上皮生長因子(EGF)、基礎成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素-樣生長因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，和促紅細胞生成素(EPO);氨基酸包括L-纈氨酸；和一種或多種用于控制徵生物污染的抗生素和/或抗真菌劑，例如青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、和制霉菌素，單獨或組合使用。5.4.2胎盤干細胞的擴增和增殖一旦胎盤干細胞或干細胞群^皮分離(例如，干細胞或干細胞群與至少50%—般與干細胞或干細胞群在體內(nèi)相關的胎盤細胞分離)，就可以在體外增殖或擴增干細胞或干細胞群。例如，可以在組織培養(yǎng)容器(例如皿、瓶、多孔板等)中培養(yǎng)胎盤干細胞群一段時間，使干細胞增殖至70-90%匯合度，即，直到干細胞及其后代占據(jù)組織培養(yǎng)容器的70-90%的培養(yǎng)表面區(qū)域。胎盤干細胞可以以允許細胞生長的密度接種在培養(yǎng)容器內(nèi)。例如，可以低密度(例如約1,000至約5,000細胞/cm2)至高密度(例如約50,000或更多細胞/cm2)接種細胞。在優(yōu)選的實施方案中，在約0至約5。/o體積CO2的空氣中培養(yǎng)細胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，在約2至約25%體積02的空氣中培養(yǎng)細胞，優(yōu)選的在約5至約20%體積02的空氣中培養(yǎng)細胞。細胞優(yōu)選的培養(yǎng)在約25。C至約40。C,優(yōu)選的37t。細胞優(yōu)選的在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以是靜態(tài)或攪動的，例如，利用生物反應器。胎盤干細胞優(yōu)選生長在低氧化壓力下(例如，添加谷胱甘肽、抗壞血酸、過氧化氫酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。一旦獲得70%-90%匯合度，細胞就可以傳代。例如，細胞可以利用本領域普遍已知的技術進行酶處理，例如胰蛋白酶消化，將其與組織培養(yǎng)表面分離。在移液去除細胞和計數(shù)細胞后，約20,000-100,000個干細胞，優(yōu)選50,000個干細胞傳代到含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)容器內(nèi)。一般新培養(yǎng)基與移除干細胞的培養(yǎng)基是相同類型。本發(fā)明4是供已經(jīng)傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次的胎盤干細胞群，以及這些胎盤干細胞群的組合。5.4.3胎盤干細胞群本發(fā)明提供了胎盤干細胞的群體。胎盤干細胞群可以直接分離自一個或多個胎盤；即，胎盤干細胞群可以是包含胎盤干細胞的胎盤細胞群體，所述胎盤肝細胞獲得自或包含于灌流液，或者獲得自或包含于消化液(即，酶消化胎盤或其部分從中獲得的細胞收集物)。還可以培養(yǎng)和擴增本發(fā)明的分離的胎盤干細胞來制備胎盤干細胞群。還可以培養(yǎng)和擴增包含胎盤干細胞的胎盤細胞群來制備胎盤干細胞群。本發(fā)明的胎盤干細胞群包含胎盤干細胞，例如本文中描述的胎盤干細胞。在多個實施方案中，在分離的胎盤干細胞群中，至少10%、20%、30%、5540%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的細胞是胎盤干細胞。即，胎盤干細胞群可以包含例如多至1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%非干細胞。本發(fā)明提供通過例如選擇表達特定標志物和/或特定培養(yǎng)或形態(tài)學特征的胎盤干細胞(不論來自酶消化或灌流)，從而制備分離的胎盤干細胞群的方法。例如，在一個實施方案中，可以通過這樣的方法制備細胞群，所述方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，且(b)表達CD200和HLA-G;并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在另一個實施方案中，制備細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，且(b)表達CD73、CD105和CD200;并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在另一個實施方案中，制備細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，且(b)表達CD200和0CT-4;并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在另一個實施方案中，制備細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，(b)表達CD73和CD105,且(c)當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，利于在含有所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在另一個實施方案中，生產(chǎn)細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，和(b)表達CD73、CD105和HLA-G;并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在另一個實施方案中，生產(chǎn)細胞群的方法包括選擇胎盤干細胞，所述胎盤干細胞(a)附著于底物，(b)表達OCT-4，且(c)當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，利于在含有所述干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；并將所述細胞與其它細胞分離，形成細胞群。在任意上述實施方案中，所述方法還可以包括選擇表達ABC-p(胎盤特異性ABC轉(zhuǎn)運蛋白；參見例如Allikmets等人，CancerRes.58(23):5337-9(1998))的胎盤細胞。所述方法還可以包括選擇表現(xiàn)出至少一種對例如間充質(zhì)干細胞特異性的特征的細胞，例如表達CD29、表達CD44、表達CD90，或上述組合的表達。在上述實施方案中，所述底物可以是任何表面，其上可以實現(xiàn)細胞(例如胎盤干細胞)的培養(yǎng)和/或選擇。典型底物是塑料，例如組織培養(yǎng)皿或多孔板塑料。組織培養(yǎng)塑料可以用生物分子例如層粘連蛋白或纖連蛋白包被?？梢酝ㄟ^細胞選擇領域任何已知的方法選擇形成胎盤干細胞群的細胞(例如胎盤干細胞)。例如，可以利用針對一種或多種細胞表面標志物的抗體選擇細胞，例如，通過流式細胞儀或FACS進行選擇。利用與磁珠連接的抗體可以實現(xiàn)選擇。特異性針對一些干細胞相關標志物的抗體是本領域已知的。例如，抗OCT-4抗體(Abeam,Cambridge,MA)、CD200抗體(Abcam)、HLA-G抗體(Abcam)、CD73抗體(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego,CA)、CD105抗體(Abeam;BioDesignInternational,Saco,ME)等。其它標志物的4元體也是可商購的，例如可以從如StemCellTechnologies或BioDesignInternational獲得CD34、CD38和CD45抗體。分離的胎盤干細胞群可以包括非干細胞的胎盤細胞，或者非胎盤細胞的細胞。分離的胎盤干細胞群可以結合一個或多個非干細胞或非胎盤細胞的群體。例如，分離的胎盤干細胞群可以結合血液(例如胎盤血或臍帶血)、血液來源的干細胞(例如來自胎盤血或臍帶血的千細胞)、血液來源的有核細胞群體、骨髓來源的間充質(zhì)細胞、骨來源的干細胞群、原始骨髓、成人(成體)干細胞、包含在組織內(nèi)的干細胞群、培養(yǎng)的干細胞、完全分化的細胞57群體(例如軟骨細胞、成纖維細胞、羊膜細胞、成骨細胞、肌細胞、心肌細胞等)等。分離的胎盤干細胞群內(nèi)的細胞可以結合另一種類型的多個細胞，比較每個群體中有核細胞的總數(shù)，結合比例為約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5，000，000:1、2,000，000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1;1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、l:l，OOO,OOO、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10，000，000、1:20,000,000、1:50,000，000，或約1:100,000,000。在分離的胎盤干細胞群中的細胞也可以與多個細胞類型的多個細胞結合。在一個實施方案中，分離的胎盤干細胞群與多個造血干細胞結合。此類造血干細胞可以是例如，包含在未處理的胎盤、臍帶血或外周血中的造血干細胞；來自胎盤血、臍帶血或外周血總有核細胞的的造血干細胞；來自胎盤血、臍帶血或外周血的分離的CD34+細胞群中的造血干細胞；來自未處理的骨髓中的造血干細胞；來自骨髓總有核細胞中的造血干細胞；來自骨髓的分離的CD34+細胞群中的造血干細胞；等等。5.5胎盤干細胞的保存胎盤干細胞可以被保存，即，將其置于允許長期儲存的條件下，或置于4中制細胞死亡(如凋亡或壞死)的條件下?？梢岳美绨蛲鲆种苿?、壞死抑制劑和/或攜氧全氟化碳的組合物保存胎盤干細胞，如2005年12月25日提交的名為"用于收集和保藏胎盤干細月包的改良組合物及利用組合物的方法(ImprovedCompositionforCollectingandPreservingPlacentalStemCellsandMethodsofUsingtheComposition)"的相關美國臨時申請?zhí)?0/754,969中描述的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了保存千細胞群的方法，包括將所述干細胞群接觸含有凋亡抑制劑和攜氧全氟化碳的干細胞收集組合物，與未接觸凋亡抑制劑的干細胞群相比，其中所述凋亡抑制劑存在的量和時間足夠降低或預防干細胞群凋亡。在一個具體的實施方案中，所述凋亡抑制劑是半胱天冬酶抑制劑。在另一個具體的實施方案中，所述凋亡抑制劑是JNK抑制劑。在更具體的實施方案中，所述JNK抑制劑不調(diào)節(jié)所述干細胞的分化或增殖。在另一個實施方案中，所述干細胞收集組合物在分離的相中包含所述凋亡抑制劑和所述攜氧全氟化碳。在另一個實施方案中，所述干細胞收集組合物在乳劑中包含所述凋亡抑制劑和所述攜氧全氟化碳。在另一實施方案中，所述該細胞收集組合物還包含乳化劑，例如卯磷脂。在另一個實施方案中，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳在接觸干細胞時處于約0。C和約25t之間。在另一個更具體的實施方案中，在接觸干細胞時，所迷凋亡抑制劑和所述全氟化^^處于約2。C和約10t之間，或約2。C和約5t之間。在另一個更具體的實施方案中，所述接觸是在轉(zhuǎn)移所述干細胞群的過程中實施的。在另一個更具體的實施方案中，所述接觸是在冷凍和融化所述干細胞群的過程中實施的。在另一個實施方案中，本發(fā)明，是供了保存胎盤干細胞群的方法，包括將所述干細胞群接觸凋亡抑制劑和器官防腐化合物，與未接觸凋亡抑制劑的干細胞群相比，其中所述凋亡抑制劑存在的量和時間足夠降低或預防干細胞群中的凋亡。在具體的實施方案中，器官防腐化合物是UW溶液(描述在美國專利號4,798,824中；也被稱為ViaSpan;還參見Southard等人,Transplantation5949(2):251-257(1990))或者在Stern等人，美國專利號5,552,267中描述的溶液。在另一個實施方案中，所述器官防腐化合物是羥乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖，或其組合。在另一個實施方案中，干細胞收集組合物還包含位于兩相或位于乳劑中的攜氧全氟化碳。在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，胎盤干細胞在灌流過程中接觸包含凋亡抑制劑和攜氧全氟化碳、器官防腐化合物、或其組合的干細胞收集組合物。在另一個實施方案中，所述干細胞在組織破壞過程中(例如，酶消化)接觸所述干細胞收集組合物。在另一個實施方案中，在灌流、或在組織破壞(例如，酶消化)收集所述胎盤干細胞后，所述胎盤干細胞接觸所述干細胞收集化合物。典型的，在胎盤細胞收集、富集和分離過程中，優(yōu)選最小化或消除由缺氧和機械壓力導致的細胞應激。因此，在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，在收集、富集和分離過程中，干細胞或干細胞群在保存中暴露在低氧條件下少于6個小時，其中所述低氧條件是氧濃度低于正常的血氧濃度。在更具體的實施方案中，所述干細胞群在保存中暴露在所述低氧條件下少于2個小時。在另一個更具體的實施方案中，在收集、富集和分離過程中，所述干細胞群暴露在所述低氧條件下少于1個小時，或少于30分鐘，或不暴露于低氧條件下。在另一個具體的實施方案中，在收集、富集和分離過程中，所述干細胞群不暴露在剪切應力下。本發(fā)明的胎盤干細胞可以冷凍保存，例如置于小容器(如安瓿瓶)中的冷凍保存培養(yǎng)基中。合適的冷凍保存培養(yǎng)基包括但不限于培養(yǎng)基，包括例如生長培養(yǎng)基或細胞冷凍培養(yǎng)基，例如可商購的細胞冷凍培養(yǎng)基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷凍保存培養(yǎng)基優(yōu)選包含DMSO(二甲亞砜)，濃度為例如約10%(V/V)。冷凍保存培養(yǎng)基可以包含其它試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。在冷凍保存過程中，胎盤干細胞優(yōu)選以約rc/分鐘冷卻。優(yōu)選的冷凍保存溫度是約-80。C至約-180。C,優(yōu)選約-125。C至約-140。C。在解凍z使用前，冷凍^呆存的細胞可以轉(zhuǎn)移到液氮中。例如，在一些實施方案中，一旦安瓿瓶達到約-90t，就轉(zhuǎn)移至液氮儲存區(qū)域。冷凍保存的細胞優(yōu)選在溫度約25。C至約40°C、優(yōu)選在溫度約37t解凍。5.6胎盤干細胞的用途5.6.1包含胎盤干細胞的組合物本發(fā)明的免疫抑制方法可以使用包含胎盤干細胞或其來源的生物分子的組合物。以相同的方式，本發(fā)明的多個胎盤干細胞和胎盤干細胞群可以結合任何生理學可接受的、或醫(yī)學可接受的化合物、組合物或儀器在例如研究或治療中使用。5.6.1.1冷凍保存的胎盤干細胞可以保存(例如冷凍保存)本發(fā)明的免疫抑制性胎盤干細胞和細胞群供以后使用。冷凍保存細胞(例如干細胞)的方法是本領域普遍已知的。胎盤干細胞群可以制備成易于向個體施用的形式。例如，本發(fā)明提供了包含在適合醫(yī)學使用的容器內(nèi)的胎盤干細胞群。此類容器可以是例如，無菌的塑料袋、瓶、罐，或其它可以方便配制的胎盤干細胞群容器。例如，容器可以是血袋或其它塑料的、醫(yī)學可接受的袋，適合向接受者靜脈施用液體。容器優(yōu)選是允許冷凍保存組合的干細胞群的容器。冷凍保存的免疫抑制性胎盤干細胞群可以包括源自單個供體、或多個供體的胎盤干細胞。胎盤干細胞群可以與目標接受者HLA完全匹配，或者HLA部分不匹配或HLA完全不匹配。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了位于容器中的包含免疫抑制性胎盤干細胞群的組合物。在具體的實施方案中，干細胞群是冷凍保存的。在另一個具體的實施方案中，容器是袋、瓶或罐。在更具體的實施方案中，所述袋是無菌塑料袋。在更具體的實施方案中，所述袋適合、允許或有利于所述胎盤干細胞群的靜脈施用。所述袋可以包括相互連接的多個內(nèi)腔或隔室，允許在施用前或施用過程中混合胎盤干細胞和一種或多種其它溶液，例如藥物。在另一個具體的實施方案中，組合物包括利于冷凍保存組合干細胞群的一種或多種化合物。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群被包含在生理上可接受的水溶液中。在一個更具體的實施方案中，所述生理上可接受的水溶液是0.9%NaCl溶液。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞群包含與所述干細胞群的接受者HLA匹配的胎盤細胞。在另一個具體的實施方案中，所述組合的干細胞群包括與所述千細胞群的接受者至少部分HLA不匹配的胎盤細胞。在另一個具體的實施方案中，所述胎盤干細胞源自多個供體。5.6.1.2藥物組合物可以將免疫抑制性的胎盤干細胞群或包含胎盤干細胞的細胞群配制成體內(nèi)使用的藥物組合物。此類藥物組合物在藥物接受的載體(例如用于體內(nèi)給藥的鹽溶液或其它生理學可接受的溶液)中包含胎盤干細胞群、或包含含有胎盤干細胞的細胞群。本發(fā)明的藥物組合物可以包含本文描述的任何胎盤干細胞群、或胎盤干細胞類型。所述藥物組合物可以包含胎兒胎盤干細胞、62母體胎盤干細胞，或同時包含胎兒胎盤干細胞和母體胎盤干細胞。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含源自單個個體或胎盤的胎盤干細胞，或源自多個個體或胎盤的胎盤干細胞。本發(fā)明的藥物組合物可以包含任意數(shù)量的免疫抑制性胎盤干細胞。例如，在不同的實施方案中，單個單位劑量的胎盤干細胞可以包含大約、至少、或不超過約1x105、5x105、1xio6、5x106、1x107、5x107、1xio8、5x108、1x109、5x109、1x101Q、5x101G、1x10"或更多個胎盤干細胞。本發(fā)明4是供的藥物組合物包含含有50%或更多活細胞的細胞群(即，群體中至少50%的細胞是有功能的或活的)。優(yōu)選的，群體中至少60%的細胞是活的。更優(yōu)選的，藥物組合物的群體中至少70%、80%、90%、95%或99%的細胞是活的。本發(fā)明提供的藥物組合物可以包括一種或多種例如有利于植入的化合物(例如抗-T細胞受體抗體、免疫抑制劑等)；穩(wěn)定劑例如白蛋白、葡聚糖40、明膠、羥乙基淀粉等。5.6.1.3胎盤千細胞條件培養(yǎng)基本發(fā)明拔:供的胎盤干細胞可用于制備免疫抑制性的條件化培養(yǎng)基，即，含有干細胞分泌或排出的一種或多種生物分子的培養(yǎng)基，所述生物分子對多個一種或多種類型的免疫細胞具有可檢測的免疫抑制性效果。在多個實施方案中，條件化培養(yǎng)基包括胎盤干細胞已經(jīng)在其中生長了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培養(yǎng)基。在其它實施方案中，條件培養(yǎng)基包括胎盤干細胞已經(jīng)在其中生長至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%匯合度，或高達100%匯合度的培養(yǎng)基。此類條件化培養(yǎng)基可用于支持不同胎盤干細胞群、或另一類干細胞的培養(yǎng)。在另一個實施方案中，條件化培養(yǎng)基包括其中的胎盤干細胞已經(jīng)分化為成體細胞類型的培養(yǎng)基。在另一個實施方案中，本發(fā)明的條件化培養(yǎng)基包括其中已經(jīng)培養(yǎng)了胎盤干細胞和非胎盤干細胞的培養(yǎng)基。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明才是供了包含來自胎盤干細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的組合物，其中所述胎盤干細胞(a)附著于底物；(b)表達CD200和HLA-G，或表達CD73、CD105和CD200，或表達CD200和OCT-4，或表達CD73、CD105和HLA-G，或表達CD73和CD105并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，利于在包含胎盤干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體，或表達OCT-4并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，有利于在包含干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；和(c)在MLR(混合淋巴細胞反應)中，可檢測地抑制CD4+或CD8+T細胞增殖，其中所述胎盤干細胞培養(yǎng)物已經(jīng)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)了24小時或更久。在具體的實施方案中，所述組合物還包含多個所述胎盤干細胞。在另一個具體的實施方案中，所述組合物包含多個非胎盤細胞。在更具體的實施方案中，所述非胎盤細胞包括CD34+細胞，例如造血前體細胞，如外周血造血祖細胞、臍帶血造血祖細胞、或胎盤血造血祖細胞。非胎盤細胞還可以包含其它干細胞，例如間充質(zhì)干細胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。非胎盤細胞還可以是一種或多種類型的成體細胞或細胞系。在另一個具體的實施方案中，組合物包含抗增殖劑，例如，抗MIP-la抗體或抗MIP-l(3抗體。5.6.1.4包含胎盤千細胞的基質(zhì)本發(fā)明還才是^f共了包含免疫抑制性胎盤干細胞(例如免疫抑制性的胎盤干細胞群)的基質(zhì)、水凝膠、支架等。64本發(fā)明的胎盤干細胞可以種植在天然基質(zhì)上，例如胎盤生物材料，如羊膜材料。此類羊膜材料可以是例如直接從哺乳動物胎盤切下的羊膜；固定的或熱處理的羊膜、基本干燥(即，<20%H2O)的羊膜、絨毛膜、基本干燥的絨毛膜、基本干燥的羊膜和絨毛膜，等?？梢苑N植胎盤干細胞的優(yōu)選的胎盤生物材料描述在Hariri,美國申請公開號2004/0048796中。本發(fā)明提供的胎盤干細胞可以懸浮在適合例如注射的水凝膠溶液中。適合此類組合物的水凝膠包括自組裝的肽，例如RAD16。在一個實施方案中，包含所述細胞的水凝膠溶液可以在例如模具中;s更化，從而形成具有細胞分散在其中的、用于移植的基質(zhì)。在此類基質(zhì)中的胎盤干細胞也可以被培養(yǎng)，從而在移植前分裂擴增。水凝膠是例如通過共價鍵、離子鍵或氫鍵交聯(lián)的有機聚合物，從而產(chǎn)生三維開放的點陣結構，將水分子陷于其中形成凝膠。水凝膠形成材料包括多糖，例如褐藻膠及其鹽、肽、聚膦嗪和離子交聯(lián)的聚丙烯酸脂，或嵌段聚合物，例如分別通過溫度或pH交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在一些實施方案中，本發(fā)明的水凝膠或基質(zhì)是可生物降解的。在本發(fā)明的一些實施方案中，劑型包含原位的可聚合凝膠(參見例如美國專利申請公開號2002/0022676;Anseth等人，J.ControlRelease,78(1-3):199-209(2002);Wang等人，Biomaterials,24(22):3969畫80(2003)。)在一些實施方案中，所述聚合物在水性溶液(例如水、緩沖鹽溶液或乙醇水溶液)中至少部分溶解，所述聚合物具有帶電的側基或其單價離子鹽。具有酸性側基、可以與陽離子反應的聚合物實例是聚(膦"秦)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙歸酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如磺酸化聚苯乙烯。還可以使用通過丙蹄酸或甲基丙烯酸和乙烯醚單體或聚合物反應形成的具有酸性側基的共聚物。酸性基團的實例是羧酸基、磺酸基、卣代醇基(優(yōu)選氟代)、酚OH基和酸性OH基。本發(fā)明的胎盤干細胞或其共培養(yǎng)物可以被種植在三維框架或支架上，并植入體內(nèi)。此類框架可以與任意一種或多種生長因子、細胞、藥物或其它組分組合植入，刺激組織形成或者增強或改善本文描述的治療方法的實踐。本文描述的治療方法中可以使用的支架的實例包括非織造物墊、多孔泡沫，或自組裝肽。非織造物墊可以利用含有合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(例如PGA/PLA)的纖維形成(VICRYL,Ethicon,Inc.,Somerville,N丄)。也可以使用泡沫作為支架，例如聚(s-己內(nèi)酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物通過例如冷凍干燥或低壓凍干處理形成的泡沫(參見例如美國專利號6,355,699)。在另一個實施方案中，所述支架是或包括納米纖維的支架，例如電紡絲納米纖維支架。在更具體的實施方案中，所述納米纖維支架包括聚(L-乳酸)(PLLA)、I型月交原、偏二氟乙雄和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚己內(nèi)酯、聚(L-環(huán)二酉旨-共聚-s-己內(nèi)酯)[P(LLA-CL)](例如75:25)，和/或聚(3-羥丁酸-共聚-3-羥纈氨酸)(PHBV)和I型膠原的共聚物。在另一個具體的實施方案中，所述支架促進胎盤干細胞分化成軟骨細胞。生產(chǎn)納米纖維支架例如電紡絲納米纖維支架的方法是本領域已知的。參見例如Xu等人，TissueEngineering10(7):1160-1168(2004);Xu等人，Biomaterials25:877-886(20040;Meng等人，J.BiomaterialsSci"PolymerEdition18(1):81-94(2007))本文描述的胎盤干細胞，例如免疫抑制性胎盤干細胞，還可以種植在生理學可接受的陶瓷材料上，或與生理學可接受的陶乾材料接觸，所述生理學可接受的陶瓷材料包括但不限于磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、a-磷酸三鈣、p-磷酸三鈣和磷酸四鈣、羥磷灰石、氟磷灰石、-琉酸鈣、氟化鈣、氧化鈣、碳酸4丐、碳酸鎂鈣、生物學活性玻璃例如BIOGLASS,及其混合物。目前可商購的多孔生物相容性陶瓷材料包括SURGIBONE(CanMedicaCorp.,Canada)、ENDOBON(MerckBiomaterialFrance,France)、CEROS(Mathys,AG3Bettlach,Switzerland)，和礦化膠原骨骼移植產(chǎn)品，例如HEALOS(DePuy,Inc.,Raynham,MA)和VITOSS、RHAKOSStm和CORTOSS(Orthovita,Malvern,Pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、摻合物或復合材料。在另一個實施方案中，胎盤干細胞可以種植在氈上，或與氈接觸，所述氈可以是由生物可吸收性材料制成的復絲構成，例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物，或透明質(zhì)酸。在另一個實施方案中，本文描述的胎盤干細胞可以種植在泡沫支架上，該泡沫支架可以是復合結構。此類泡沫支架可以鑄造成有效的形狀，例如需要修復、取代或強化的機體特定結構的一部分。在一些實施方案中，在接種免疫抑制性胎盤干細胞前，用例如0.1M乙酸處理框架，再將框架孵育在聚賴氨酸、PBS和/或膠原中，從而增加細胞附著?？梢孕揎椈|(zhì)的外表面來改善細胞的附著或生長以及組織的分化，例如通過血漿包纟皮基質(zhì)，或添加一種或多種蛋白質(zhì)(例如膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖(例如為i酸肝素、4-石克酸軟骨素、6-石克酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素，等)、細胞基質(zhì)，和/或其它材料，例如但不限于明膠、褐藻膠、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等。67在一些實施方案中，所述支架包括使其不形成血栓的材料，或用上述材料處理。這類處理和材料還可以促進和維持內(nèi)皮生長、遷移和胞外基質(zhì)沉積。這類材料和處理的實例包括但不限于天然材料例如基膜蛋白(如層粘連蛋白和IV型膠原)、合成材料例如EPTFE，和含硅的嵌段聚氨酯脲例如PURSPAN(ThePolymerTechnologyGroup,Inc.,Berkeley,Calif.)。支架還可以包含抗血栓形成劑例如肝素；還可以在接種胎盤干細胞之前處理支架來改變表面電荷(例如用血漿包被)。5.6.2遺傳修飾的胎盤干細胞在另一個方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的胎盤干細胞和臍帶干細胞，例如用于制備感興趣的核酸或多肽。使用例如基于病毒的載體可以實現(xiàn)遺傳修飾，所述載體包括但不限于非整合性復制載體，例如乳頭狀瘤病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；整合性病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺相關病毒載體；或復制缺陷性病毒載體。其它向細胞引入DNA的方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、基因槍、直接DNA注射等。可以用DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染干細胞，所述DNA由一個或多個合適的表達控制元件控制或與其可操作的連接，例如，啟動子或增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點、內(nèi)核糖體進入位點。優(yōu)選的，此類DNA整合了選擇性標志物。在引入外源DNA后，改造的干細胞可以例如生長在富集培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。在一個實施方案中，用于改造胎盤干細胞的DNA包括編碼目標多肽的核脊酸序列，例如細胞因子、生長因子、分化劑或治療性多肽。用于改造干細胞的DNA可以包括本領域已知的任何用于在哺乳動物細胞，例如人細胞內(nèi)驅(qū)動核脊酸序列表達的啟動子。例如，啟動子包;l舌但不限于CMV啟動子/增強子、SV40啟動子、乳頭瘤病毒啟動子、埃-巴二氏病毒啟動子、彈性蛋白基因啟動子等。在具體的實施方案中，啟動子是可調(diào)控的,使核苷酸序列僅在需要時才表達。啟動子可以是誘導型的(例如與金屬疏蛋白和熱休克蛋白相關的)或組成型的。在另一個具體的實施方案中，啟動子是組織特異性的或表現(xiàn)出組織特異性。此類啟動子的實例包括但不限于髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)域(Readhead等人，1987，Cell48:703)(少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞);彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域(Swit等人，1984，Cell38:639;Ornitz等人，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol50:399;MacDonald,1987,Hepatology7:425)(胰腺腺泡細胞)；胰島素基因控制區(qū)域(Hanahan，1985,Nature315:115)(胰腺卩細胞)；肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)域(Shani,1985,Nature314:283)(骨骼肌)?？梢愿脑焯ケP干細胞，"敲除"或"降低"一個或多個基因的表達。通過例如同源重組使基因完全失活來抑制表達，可以消除細胞天然基因的表達。在一個實施方案中，例如，通過陽性選擇標志物如NEO，阻斷編碼蛋白質(zhì)的重要區(qū)域的外顯子，或所述區(qū)域5，的外顯子，阻止耙基因生產(chǎn)正常的mRNA，導致基因失活。還可以通過去除基因的一部分或刪除整個基因來失活該基因。通過利用具有兩個區(qū)域的構建體(所述區(qū)域與靶基因同源但在基因組上相隔較遠)可以刪除插入兩個區(qū)域之間的序列(Mombaerts等人，1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084)。還可以使用抑制耙基因表達的反義核酸、DNA酶、小干擾RNA和核酶分子，來降低干細胞內(nèi)的靶基因水平。例如，就免疫反應而言，抑制主要組織相容基因復合體(HLA)表達的反義RNA分子已經(jīng)表現(xiàn)出多種用途。在減低靶基因活性水平中可以使用三螺旋分子。參見例如69L.G.Davis等人(編著)，1994,BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY,第2版，Appleton&Lange,Norwalk,Conn.，其通過引用被納入本文中。在具體的實施方案中，可以用包含編碼目標多肽的核苷酸序列的核酸分子來遺傳修飾胎盤或臍帶干細胞，其中目標多肽的表達可以通過外源因子來控制，例如多肽、有機小分子等。此類多肽可以是治療性多肽D在更具體的實施方案中，目標多肽是IL-12或白介素-1受體拮抗劑(IL-lRa)。在另一個更具體的實施方案中，目標多肽是白介素-1受體拮抗劑和二氫葉酸還原酶(DHFR)的融合肽，外源因子是抗葉酸劑，例如氨甲蝶呤。通過接觸氨甲喋呤,此類構建體可用于改造胎盤干細胞或臍帶干細胞表達IL-lRa、或IL-lRa和DHFR的融合肽。此類構建體可用于例如治療類風濕性關節(jié)炎。在該實施方案中，暴露于抗葉酸劑如氨甲喋呤后，翻譯性上調(diào)IL-lRa和DHFR的融合肽。因此，在另一個具體的實施方案中，用于遺傳改造胎盤干細胞或臍帶干細胞的核酸可以包括編碼第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一多肽和第二多肽作為融合蛋白表達，在存在外源因子的條件下被翻譯性上調(diào)?？梢运矔r地或長期地(例如數(shù)周或數(shù)月的過程)表達多肽。此類核酸分子還可以包括編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽允許陽性選擇經(jīng)改造的干細胞，或使經(jīng)改造的干細胞可視化。在另一個更具體的實施方案中，核苷酸序列編碼的多肽例如在合適的可視化條件下(如熒光素酶(Luc))發(fā)出熒光。在更具體的實施方案中，此類核酸分子可以包括IL-IRa-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是內(nèi)核糖體進入位點。5.6.3永生化的胎盤干細胞系70通過用任何含有促生長基因的合適的載體轉(zhuǎn)染，可以使哺乳動物胎盤細胞條件化永生，所述促生長基因編碼在合適條件下促進轉(zhuǎn)染細胞生長的蛋白質(zhì)，使促生長蛋白質(zhì)的生成和/或活性可以通過外部因子進行調(diào)控。在優(yōu)選的實施方案中，促生長基因是原癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多形瘤大T抗原、Ela腺病毒或人乳頭瘤病毒的E7蛋白。通過將促生長基因置于外部可調(diào)控啟動子的控制之下，例如該啟動子的活性可以通過調(diào)節(jié)被轉(zhuǎn)染細胞的溫度或調(diào)節(jié)與被轉(zhuǎn)染細胞接觸的培養(yǎng)基的組成來控制，以實現(xiàn)促生長蛋白的外部調(diào)控。在一個實施方案中，可以使用四環(huán)素(tet)-控制的基因表達系統(tǒng)(參見Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551,1992;Hoshimaru等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996)。在缺少tet的條件下，該栽體內(nèi)的tet-控制的反式作用子(tTA)強烈地活化來自phCMVM的轉(zhuǎn)錄，后者是與tet操縱子序列融合的人巨細胞病毒的最小啟動子。tTA是大腸桿菌轉(zhuǎn)座子-10-來源的tet抗性操縱子的阻遏物(tetR)與單純性皰滲病毒VP16的酸性結構域的融合蛋白。低毒、無毒濃度的tet(例如0.01-1.0|ig/mL)幾乎完全消除了tTA的反式激活。在一個實施方案中，所述載體還包括編碼選擇性標志物的基因，例如產(chǎn)生藥物抗性的蛋白質(zhì)。細菌的新霉素抗性基因(neoR)是一個此類標志物，可以在本文描述的方法中使用。通過本領域普通技術人員已知的方法可以選擇攜帶neoR的細胞，例如向生長培養(yǎng)基中添加如100-200pg/mL的G418?？梢酝ㄟ^本領域普通技術人員已知的多種不同方法實施轉(zhuǎn)染，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。一般而言，可以通過與收集的條件培養(yǎng)基的混合物孵育來轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基收集自用于制備載體的制備細胞系和含有N"忝加物的DMEM/F12。例如，在體外，可以通過在1體積的條件化培養(yǎng)基和2體積含有N"忝加物的DMEM/F12中孵育約20小時，5天之后上述制備的胎盤細胞培養(yǎng)物被感染。然后，可如上述選擇攜帶選擇性標志物的轉(zhuǎn)染的細胞。轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)物傳代至允許增殖的表面，例如允許至少30%的細胞在24小時期間內(nèi)倍增。優(yōu)選的，底物是聚鳥氨酸/層粘連蛋白底物(其由聚鳥氨酸(10pg/mL)和/或?qū)诱尺B蛋白(10|ig/mL)包被的組織培養(yǎng)塑料構成)、聚鳥氨酸/層粘連蛋白底物底物、或纖粘連蛋白處理的表面。然后，每3-4天加入生長培養(yǎng)基到培養(yǎng)物中，所述培養(yǎng)基可以添加或不添加一種或多種促增殖因子。當培養(yǎng)物低于50%匯合度時，可以向生長培養(yǎng)基中添加促增殖因子條件化的永生胎盤干細胞系可以使用標準技術傳代，例如當80-95%匯合度時，通過胰酶消化。在一些實施方案中，維持選擇直到約第20代時是有利的(例如，對于含有新霉素抗性的基因，添加G418)。還可以在液氮中冷凍細胞供長期儲存?？梢詮娜缟鲜鲋苽涞臈l件化的永生人胎盤干細胞系中分離克隆細胞系。一般而言，可以利用標準技術分離此類克隆細胞系，例如通過有限稀釋或利用克隆環(huán)，并擴增。通常可以如上所述培養(yǎng)和傳代克隆細胞系。條件化的永生人胎盤干細胞系可以是克隆的，但不是必需，其通?？梢酝ㄟ^在有利于分化的培養(yǎng)條件下抑制促生長蛋白的生成和/或活性，來被誘導分化。例如，如果編碼促生長蛋白的基因是可由外部-可調(diào)控啟動子控制，則可以改變條件(例如溫度或培養(yǎng)基組成)來抑制促生長基因的轉(zhuǎn)錄。對于上述四環(huán)素控制的基因表達系統(tǒng)，可以通過添加四環(huán)素來抑制促生長基因的轉(zhuǎn)錄從而實現(xiàn)分化。一般而言，4-5天用1ng/mL四環(huán)素足以啟動分化。為了促進進一步的分化，生長培養(yǎng)基中可以包含其它試劑。5.6.4測定在測定中，可以使用胎盤干細胞來確定培養(yǎng)條件、環(huán)境因子、分子(例如生物分子、小無機分子等)等對干細胞增殖、擴增和/或分化的影響(與不暴露在下述條件下的胎盤干細胞相比)。在一個實施方案中，可以將胎盤干細胞與分子接觸，測定胎盤干細胞在增殖、擴增或分化中的改變。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了鑒別調(diào)節(jié)多個胎盤干細胞增殖的化合物的方法，包括將所述多個干細胞和所述化合物在允許增殖的條件下接觸，其中，與不接觸所述化合物的多個千細胞相比，如果所述化合物導致所述多個干細胞增殖改變，則鑒別所述干細胞是調(diào)節(jié)胎盤干細胞的增殖的化合物。在具體的實施方案中，鑒別所述化合物是增殖的抑制劑。在另一個具體的實施方案中，鑒別所述化合物是增殖的增強劑在另一個實施方案中，可以鑒別調(diào)節(jié)多個胎盤干細胞擴增的化合物，包括將所述多個干細胞和所述化合物在允許擴增的條件下接觸，其中，與不接觸所述化合物的多個干細胞相比，如果所述化合物導致所述多個干細胞擴增改變，則鑒別所述干細胞是調(diào)節(jié)胎盤干細胞的擴增的化合物。在具體的實施方案中，鑒別所述化合物是擴增的抑制劑。在另一個具體的實施方案中，鑒別所述化合物是擴增的增強劑。在另一個實施方案中，可以鑒別調(diào)節(jié)多個胎盤干細胞分化的化合物，包括將所述多個干細胞和所述化合物在允許分化的條件下接觸，其中，與不接觸所述化合物的多個干細胞相比，如果所述化合物導致所述多個干細胞分化改變，則鑒別所述干細胞是調(diào)節(jié)胎盤干細胞的分化的化合物。在具體的實施方案中，鑒別所述化合物是分化的抑制劑。在另一個具體的實施方案中，鑒別所述化合物是分化的增強劑。5.6.5胎盤干細胞庫可以用多種不同的方式培養(yǎng)來自產(chǎn)后胎盤的干細胞，制備一組多批次的胎盤干細胞，例如一組可獨立施用的胎盤干細胞制劑。例如，此類批次可以獲自來自胎盤灌流液或酶消化的胎盤組織的干細胞。從多個胎盤獲得的多組多批次胎盤干細胞，可以置于胎盤干細胞庫中，用于例如長期儲存。通常，來自胎盤材料初始培養(yǎng)物的貼壁干細胞用于形成種子培養(yǎng)物，所述種子培養(yǎng)物在受控的條件下擴增，經(jīng)過幾乎等量的倍增后形成細胞群。優(yōu)選胎盤干細胞批次來自單個胎盤組織，但也可以來自多個胎盤組織。在一個實施方案中，如下所述獲得干細胞批次。首先裂解胎盤組織，例如通過絞碎、用合適的酶如膠原酶消化(參見上文5.2.3節(jié))。胎盤組織優(yōu)選包含例如來自單個胎盤的完整羊膜、完整絨毛膜、或完整羊膜和完整絨毛膜，但也可以僅包含羊膜或絨毛膜的一部分。培養(yǎng)消化的組織例如約1-3周，優(yōu)選約2周。在去除不貼壁細胞后，通過例如胰酶消化來收集形成的高密度克隆。在適宜體積的培養(yǎng)基中收集并重懸這些細胞，定義為第0代細胞。使用第0代細胞接種擴增培養(yǎng)。擴增培養(yǎng)可以是任意排列的分離的細胞培養(yǎng)裝置，例如NUNC的CellFactory。第0代的細胞可以任意程度的再分，從而用例如lx103、2xl03、3x103、4xl03、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8xl04、9x104或10乂104的干細胞接種擴增培養(yǎng)。優(yōu)選的，使用約2x104至約3x104個第O代細胞接種各擴增培養(yǎng)。擴增培養(yǎng)的數(shù)量可依賴于第0代細胞的數(shù)量，并根據(jù)獲得干細胞的特定胎盤，數(shù)量可以更大或更小。擴增培養(yǎng)生長直到培養(yǎng)中的細胞密度達到一定值，例如約1x105細胞/cm2。此時，可以收集或冷藏細胞，或如上述傳代到新的擴增培養(yǎng)中。在使用前，細胞可以傳代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在擴增培養(yǎng)期間，優(yōu)選持續(xù)記錄群體倍增的累計數(shù)。細胞從第0代培養(yǎng)可以擴增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增，或多達60次倍增。然而，優(yōu)選在將細胞群分為個體劑量前，群體倍增的次數(shù)在約15和約30次之間，優(yōu)選約20次倍增。細胞可以在整個擴增過程持續(xù)培養(yǎng)，或者可以在擴增過禾呈中一個或多個時間點被冷凍。用作單個制劑的細胞可以被冷凍，例如冷藏保存供以后使用。單個制劑可以包括例如約1百萬至約1億個細胞/ml，可以包括共計約106至約109個細胞。在方法的具體的實施方案中，培養(yǎng)第0代細胞約4次倍增，然后冷凍為第1細胞庫。解凍來自第1細胞庫的細胞并用來接種第2細胞庫，所述細胞再經(jīng)過約8次倍增。收集該階段的細胞并冷凍，用來接種新的擴增培養(yǎng)，允許再進行約8次額外的倍增，使累計的細胞倍增數(shù)達到約20次?？梢岳鋬鲈趥鞔虚g點的細胞，單位為約100,000至約1千萬個細胞/ml，優(yōu)選約1百萬個細胞/ml供后續(xù)擴增培養(yǎng)中使用。在約第20次倍增時的細胞可以冷凍成約1百萬至約1億個細胞/ml的單個制劑，以供施用或用于制備含有干細胞的組合物。在一個實施方案中，在10%HAS、10%DMSO的plasmalyte中稀釋細胞至約2百萬/ml。在優(yōu)選的實施方案中，對獲得胎盤的供體(例如母體)測試至少一種病原體。如果母體對測試的病原體呈陽性，則拋棄來自所述胎盤的整個批次。在制備胎盤干細胞批次過程中的任何時間點都可以實施此類測試，包括在建立第0代細胞之前或之后，或在擴增培養(yǎng)的過程中。測試存在的病原體可以包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人類免疫缺陷性病毒(I型和II型)、巨細胞病毒、皰滲病毒等。5.6.6疾病的治療本發(fā)明提供了治療患有疾病、障礙或病狀的個體的方法，其中所述疾病、障礙或病狀與不合適或不希望的免疫反應相關或由其導致的，例如通過免疫抑制可以有利地治療的疾病、障礙或病狀，包括向個體施用胎盤干細胞。在具體的實施方案中，所述量是足以可檢測地抑制個體內(nèi)免疫反應的量。此類免疫反應可以是例如用所述個體的T細胞實施的MLR或回歸測定中的T細月包增殖?？梢杂枚鄠€胎盤干細胞，和任選的一種或多種治療劑，在疾病發(fā)展過程中的任何時間治療患有與不合適或不希望的免疫反應相關的、或由其導致的疾病、障礙或病狀的個體，例如患有或有風險發(fā)生多發(fā)性硬化的個體；患有或有風險發(fā)生炎性腸病的個體，如克隆氏病或潰瘍性結膜炎；患有或有風險發(fā)生移植物抗宿主疾病的個體；患有或有風險發(fā)生硬皮病的個體；患有或有風險發(fā)生類風濕性關節(jié)炎的個體；患有或有風險發(fā)生糖尿病的個體；患有或有風險發(fā)生牛皮癬的個體；患有或有風險發(fā)生蕈樣真菌病的個體；等。例如，可以在診斷后立即治療個體，或在診斷的l、2、3、4、5、6天內(nèi)，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多周內(nèi)，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年內(nèi)治療所述個體。76在疾病的臨床過程中，可以治療所述個體1次或多次?？梢栽诩毙园l(fā)作期間、緩解期間或慢性退行性階段內(nèi)治療所述個體。用于治療此類疾病、障礙或病狀的胎盤干細胞可以是本文中公開的任何胎盤干細胞。在具體的實施方案中，胎盤干細胞表達CD200和HLA-G;表達CD73、CD105和CD200;表達CD200和OCT-4;表達CD73、CD105和HLA-G;表達CD73和CD105，并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，利于在包含胎盤干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；或表達OCT-4，并且當所述群體在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，有利于在包含干細胞的胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體；或任意前述的組合。在具體的實施方案中，胎盤干細胞是CD10+、CD105+、CD200+、CD34,胎盤干細胞。在具體的實施方案中，胎盤干細胞是CD117—。在一個實施方案中，施用于個體的劑量是約3億個胎盤干細胞。然而可以根據(jù)個體的生理學特征，例如體重，來改變劑量，范圍可以從1百萬至100億胎盤干細胞/劑，優(yōu)選的在1千萬和10億/劑之間，或在1億和5千萬胎盤干細胞/劑之間。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用，但也可以是用于活細胞給藥的任何醫(yī)學可接受的途徑，例如腸道外、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)等。在一個實施方案中，胎盤干細胞來自細胞庫。在一個實施方案中，在適合彈丸注射或通過導管給藥的血袋或類似的袋中含有來自例如羊膜、羊膜/絨毛膜、絨毛膜或臍帶的胎盤干細胞的制劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有疾病、障礙或病狀的個體的方法，其中所述疾病、障礙或病狀是與不合適或不希望的免疫反應相關的或由其導致，例如通過免疫抑制可以有利地治療的疾病、障礙或病狀，包括向個體施用已經(jīng)被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，所用量足以可檢測地抑制個77體內(nèi)免疫反應。此類免疫反應可以是例如在利用來自個體的T細胞實施的MLR或回歸測定中的T細胞增殖。胎盤干細胞或臍帶干細胞，或被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，可以單次劑量施用，或以多次劑量施用。當以多次劑量施用胎盤干細胞時，所述劑量可以是治療性技術方案的一部分，所述方案被設計用來緩解疾病、障礙或病狀的一種或多種急性癥狀，其中所述疾病、障礙或病狀是與不合適或不希望的免疫反應相關或由其導致的，或者可以是長期治療方案的部分，所述方案設計為防止或減輕此類疾病、障礙或病狀的慢性過程的嚴重程度。5.6.7治療多發(fā)性硬化在一個方面，本發(fā)明提供了治療患有多發(fā)性硬化的個體，或與多發(fā)性硬化相關的癥狀的方法，包括向所述個體施用多個胎盤干細胞，或被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，施用的量和時間足以可檢測地調(diào)節(jié)(例如抑制)該個體中的免疫反應。多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、復發(fā)性炎癥疾病。該疾病損傷圍繞CNS和PNS軸突的髓鞘、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞自身。該疾病是通過自體反應性T細胞，特別是CD4+T細胞介導的，所述細胞在細胞附著分子和原炎癥細胞因子的影響下擴增、穿過血腦屏障并進入CNS。MS的癥狀包括四肢的感覺障礙、視神經(jīng)障礙、錐體束障礙、膀胱障礙、腸道障礙、性障礙、共濟失調(diào)和復視。已經(jīng)鑒別了4種不同類型或臨床進程的MS。第一種，復發(fā)/緩解型MS(RRMS),特征是表現(xiàn)為急性神經(jīng)障礙的自限性發(fā)作，持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的過程，后續(xù)持續(xù)數(shù)月的恢復期，有時恢復不完全。第二種類型，繼發(fā)進行性多發(fā)性硬化(SPMS)，以RRMS開始，但之后的變化使臨床過程的特征變?yōu)榕c急性發(fā)作無關的持續(xù)性功能破壞。第三種，原發(fā)進行性多發(fā)性硬化(PPMS),特征是從開始即功能持續(xù)衰退，沒有急性發(fā)作。第四種類型，進行性/復發(fā)性多發(fā)性硬化(PRMS)，也是以進行性過程開始，在功能衰退過程中偶有發(fā)作通常利用運動技能評估來評定患有MS的人，任選的使用MRI。例如如下所述的運動技能評估、擴展的殘疾狀態(tài)評分、對病患個體的能力的分數(shù)評級0.0正常的神經(jīng)性檢查1.0無殘疾，一種FS的最小信號1.5無殘疾，多于一種FS的最小信號2.0—種FS的最小殘疾2.5—種FS的輕微殘疾或兩種FS的最小殘疾3.0—種FS的中等殘疾，或者三種或四種FS的輕微殘疾。完全能走動的3.5完全能走動的，但具有一種FS的中等殘疾，以及若個其它FS的最小以上的殘疾4.0雖然有相對嚴重的殘疾，但是每天約12小時或以上，在不輔助的條件下完全能走動的，自理的；不需要幫助或休息能夠步行超過500米4.5每天大部分的時間不需要幫助完全能走動的，能夠工作整天，但在全面活動力中可以具有一些局限性，或需要最小的幫助；特征是相對嚴重的殘疾；不需要幫助或休息能夠步行約300米。5.0不需要幫助或休息能夠走動約200米；殘疾嚴重足以損害全天日常活動(在沒有特別規(guī)定的條件下工作全天)5.5不需要幫助或休息能夠走動約100米；殘疾嚴重足以妨礙全天日常活動6.0步行約100米，需要間歇或單側持續(xù)的幫助(手杖、撐拐、支架)，需要或不需要休息6.5步行約20米，需要持續(xù)的雙側幫助(手杖、撐拐、支架)，不需要休息7.0即使有幫助也不能步行超過約5米，基本局限在輪椅上；在標準輪椅中自己旋轉(zhuǎn)并移動；在輪椅中一天活動約12小時7.5不能走出數(shù)步；局限于輪椅；可能移動需要幫助；在標準輪椅中可自己旋轉(zhuǎn)但不能堅持一整天；可能需要助動輪椅8.0基本局限于床或椅子或在輪椅中徘徊，但可以在一天的大部分時間在床以外；保留了大部分的自理功能；通常具有手臂的有效使用8.5—天的大部分時間基本局限于床；具有手臂的一些有效使用，保留了一些自理功能9.0局限在床上；但仍可以交流和進食9.5完全無助的臥床患者；不能有效交流或進食/吞咽10.0死于MS在上述評分系統(tǒng)中，"FS"指測量的8種功能系統(tǒng)，包括推體、小腦、腦干、感覺、腸和膀胱、；f見覺、大腦和其它系統(tǒng)。已知其它相似的評分系統(tǒng)，包括Scripps神經(jīng)評定量表、步行指數(shù)和多發(fā)性硬化功能性復合評分(MSFC)。還通過確定發(fā)作率評估MS的進程。還通過磁共振成像評估MS的進程，其可以確定與MS相關的神經(jīng)損傷(例如新?lián)p傷、增加的損傷或組合的特殊活性損傷)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明4是供了治療患有MS的個體，和確診患有MS的個體的方法，包括向個體施用足以在個體內(nèi)有效地可檢測地抑制免疫反應的多個胎盤干細胞。在具體的實施方案中，MS是復發(fā)/緩解型。在另一個具體的實施方案中，MS是繼發(fā)進行性多發(fā)性硬化。在另一個具體的實施方案中，MS是原發(fā)進行性多發(fā)性硬化。在另一個具體的實施方案中，MS是進行性/復發(fā)性多發(fā)性硬化。在另一個具體的實施方案中，所述施用可檢測地改善了個體內(nèi)MS的一種或多種癥狀。在更具體的實施方案中，所述癥狀是例如四肢的一處或多處感覺障礙、視神經(jīng)機能障礙、錐體束機能障礙、膀胱機能障礙、腸機能障礙、性障礙、共濟失調(diào)或復視。在另一個具體的實施方案中，所述給藥導致EDSS評分改善至少0.5點。在另一個具體的實施方案中，根據(jù)至少一個MS評分系統(tǒng)，在病程的例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月，所述施用導致功能的維持。在另一個具體的實施方案中，所述施用導致EDSS評分改善至少1.0點。在另一個具體的實施方案中，所述施用導致EDSS評分改善至少2.0點。在其它具體的實施方案中，所述施用可檢測地改善多發(fā)性硬化評分或MRI。合適時，可以在急性發(fā)作期間、恢復期間或慢性退行性階段期間治療個體。在另一個實施方案中，產(chǎn)后向患有MS的女性施用胎盤干細胞，維持在懷孕期間經(jīng)歷的恢復或減少發(fā)生的狀態(tài)本發(fā)明還提供了治療患有MS的個體，和確診患有MS的個體的方法，包括向個體施用足以在個體內(nèi)有效地可檢測地抑制免疫反應的多個胎盤干細胞，以及一種或多種治療劑，其中施用可檢測地改善個體內(nèi)的一種或多種MS癥狀。在一個實施方案中，所述治療劑是糖皮質(zhì)激素。在具體的實施方案中，所述糖皮質(zhì)激素是促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、甲基潑尼松龍或地塞米松。在另一個實施方案中，所述治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑。在不同的實施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)劑或免疫抑制劑是IFN(3-la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢霉素或米托蒽醌。在其它實施方案中，治療劑是靜脈免疫球蛋白、血漿交換或柳氮磺胺吡啶。在另一個實施方案中，給予個體任何上述治療劑的組合。5.6.8炎性腸病的治療在一個實施方案中，使用胎盤干細胞、胎盤干細胞群和/或含有胎盤干細胞或胎盤干細胞群的組合物，治療患有或有風險患上炎性腸病(IBD)，例如克隆氏病或潰瘍性結腸炎。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了治療患有炎性腸病的個體或與炎性腸病相關的癥狀的方法，包括向個體施用多個胎盤干細胞，或施用被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，施用的量和時間足以可檢測地調(diào)節(jié)(例如抑制)個體中的免疫反應。^發(fā)沃病。在一個實施方案中，所述炎性腸病是克隆氏病，有時稱為回腸炎或腸炎?？寺∈喜∈菍е孪?也稱為胃腸道，或GI道)炎癥的慢性疾病?？寺∈喜】梢杂绊懳改c道的任何部分，從口到肛門，但通常大部分影響小腸的下段，也稱為回腸。已知5種類型的克隆氏病。胃十二指腸的克隆氏病影響胃和十二指腸(小腸的最前部分)?？漳c回腸炎是空腸回腸的克隆氏病，空腸回腸是小腸的最長的部分?；啬c炎是回腸的克隆氏病，是小腸最低的部分。回腸結腸炎是最常見的克隆氏病，影響回腸和結腸。最后，克隆氏結腸炎(肉芽胂性結腸炎)影響結腸，與潰瘍性結腸炎的區(qū)別是，在克隆氏病中，患病組織之間通常存在健康的組織，且克隆氏結腸炎可以僅涉及結腸，不涉及直腸。認為克隆氏病源自機體免疫系統(tǒng)對胃腸道內(nèi)抗原不希望的反應，包括例如食物、益生菌等，導致血白細胞在小腸內(nèi)膜積累。與克隆氏病相關的炎癥還歸因于細胞因子腫瘤壞死因子(TNF-a)的作用。^f湊遂^U^j^。在另一個實施方案中，所述IBD是潰瘍性結腸炎。潰瘍性結腸炎是導致直腸和/或結腸內(nèi)膜炎癥和瘡(潰瘍)的疾病。炎癥殺死通常排列在結腸中的細胞后形成潰瘍；潰瘍通常流血并產(chǎn)生pus。當炎癥在直腸和下結腸發(fā)生時，該疾病>^皮稱為潰瘍性直腸炎。如果感染了整個結腸，則疾病被稱為全結腸炎。如果僅感染結腸的左側，則該疾病被稱為局部或遠端結腸炎。潰瘍性結腸炎的癥狀包括但不限于腹痛、血性腹瀉、發(fā)熱、惡心、腹部絞痛、貧血、疲勞、體重減輕、胃口喪失、直腸出血、體液或營養(yǎng)物喪失、皮膚損害、關節(jié)痛、和生長遲緩(兒童中)。潰瘍性結腸炎還可以導致并發(fā)癥，例如眼部炎癥、肝病和骨質(zhì)疏;松。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明才是供了治療患有炎性腸病的個體的方法，包括向所述個體施用治療有效量的胎盤干細胞，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善導致上述炎性腸病(IBD)的至少一種癥狀的量。在具體的實施方案中，所述IBD是克隆氏病。在具體的實施方案中，所述克隆氏病是胃十二指腸的克隆氏病、空腸回腸炎、回腸炎、回腸結腸炎或克隆氏結腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述癥狀是克隆氏病的癥狀。在更具體的實施方案中，所述克隆氏病的癥狀是部分GI道的炎癥和水肺，腹痛、腸道的頻繁排空和/或腹瀉。在另一個更具體的實施方案中，所述克隆氏病的癥狀是直腸出血、貧血、體重減輕、關節(jié)炎、皮膚問題、發(fā)熱、小腸壁增厚、腸道皰痕組織形成、腸道中形成癡和潰瘍、腸壁形成一處或多處瘺管、膽門形成83一處或多處龜裂、出現(xiàn)營養(yǎng)不良(例如蛋白質(zhì)、卡路里、維生素中一種或多種缺乏)、出現(xiàn)腎結石、出現(xiàn)膽結石、出現(xiàn)肝或膽系統(tǒng)的疾病。在另一個更具體的實施方案中，IBD是潰瘍性結腸炎。在更具體的實施方案中，所述潰瘍性結腸炎是潰瘍性直腸炎、全結腸炎、局部或遠端結腸炎。在另一個更具體的實施方案中，所述癥狀是潰瘍性結腸炎的癥狀。在更具體的實施方案中，所述癥狀是腹痛、血性腹瀉、發(fā)熱、惡心、腹部絞痛、貧血、疲勞、體重減輕、胃口喪失、直腸出血、體液或營養(yǎng)物喪失、皮膚損害、關節(jié)痛，和生長遲緩(兒童)。在另一個更具體的實施方案中，癥狀是骨質(zhì)疏松、眼部炎癥或肝病。在另一個具體的實施方案中，對所述施用了胎盤干細胞的個體還施用一種或多種第二治療，其中所述第二治療包括抗炎劑、甾類激素、免疫抑制劑和/或抗生素。用于治療克隆氏病或潰瘍性結腸炎的抗炎藥物的實例包括但不限于美沙拉嗪、5-ASA(5-氨基水楊酸)試劑(例如ASACOL(美沙拉嗪，緩釋)、DIPENTUM(Osalazine)、PENTASA(美沙拉*控制-釋放)、柳氮磺胺吡啶(5-ASA和磺胺吡啶的組合)、抗炎抗體(例如英夫利昔單抗(REMICADE)))，等。用于治療克隆氏病或潰瘍性結腸炎的甾類激素的實例包括但不限于可的松、氫化可的松、潑尼松、甲基潑尼松等。典型的，如本領域?qū)嵺`的，甾類激素的劑量首先遞送相對大劑量，再在炎癥消退時使用較小劑量。用于治療克隆氏病或潰瘍性結腸炎的免疫抑制劑的實例包括但不限于環(huán)孢霉素A、6-巰基噤呤或疏唑嘌呤。在克隆氏病治療中可以使用任何抗生素，包括例如青霉素、磺胺、頭孢菌素、四環(huán)霉素和/或甲硝唑。在另一個具體的實施方案中，第二治療是施用豬鞭蟲，例如豬鞭蟲的卵巢。5.6.9移植物抗宿主疾病的治療在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有移植物抗宿主病(GVHD)、或正在經(jīng)歷(GVHD)癥狀、或有風險出現(xiàn)GVHD的個體(例如移植接受者或?qū)⒔邮芤浦驳膫€體)的方法，包括向該個體施用治療有效量的胎盤干細胞，或被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中治療有效量是足以可檢測地改善GVHD的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低GVHD的一種或多種癥狀。GVHD通常在完全或部分的同種異體組織移植后出現(xiàn)，或作為其結果出現(xiàn)，特別是在同種異體造血干細胞移植后，可以包括通常在移植的5-100天內(nèi)出現(xiàn)的一種或多種皮炎、腸炎和肝炎。GVHD可以是急性的或慢性的。急性GVHD的特征可以是搔癢或刺痛，通常在移植后5-47天出現(xiàn)。超急性GVHD還可以伴隨發(fā)熱、泛發(fā)性紅皮病和脫皮。還可以涉及肝臟，表現(xiàn)為膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(AP)水平升高。急性GVHD還可以涉及結腸，導致腹瀉、內(nèi)出血、痙攣、腹痛和腸梗阻。慢性GVHD可以發(fā)生在已經(jīng)經(jīng)歷了急性GVHD的移植患者中，或原來無癥狀的個體中。慢性GVHD的表現(xiàn)包括眼內(nèi)的燒灼感、眼澀、畏光和由于眼淚分泌減少導致的眼疼痛；口干、對辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽困難(難以吞咽)、吞咽痛(吞咽時疼痛)、體重減輕、阻塞性肺疾病、肌無力、神經(jīng)性疼痛和/或肌肉痙攣。因此，在本發(fā)明方法的具體實施方案中，胎盤干細胞的治療有效量是足以可檢測地改善導致急性GVHD的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低急性GVHD的一種或多種癥狀的發(fā)生。在更具體的實施方案中，所述種或多種癥狀包括皮炎、皮膚瘙癢、皮疹、腸炎、肝炎、發(fā)熱、紅皮病、脫皮、升高水平的ALT、升高水平的AST、升高水平的AP;升高水平的膽紅素；腹痛、痙攣、內(nèi)出血或腸梗阻。在該方法的另一個更具體的實施方案中，胎盤干細胞的治療有效量是足以可檢測地改善慢性GVHD的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低慢性GVHD的一種或多種癥狀的發(fā)生，其中所述癥狀包括眼內(nèi)的燒灼感、眼澀、眼淚生成減少、畏光和由于眼淚分泌減少導致的眼疼痛；口干、對辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽困難(難以吞咽)、吞咽痛(吞咽時疼痛)、體重減輕、阻塞性肺疾病(包括任何哮喘性呼吸困難和/或慢性咳嗽)、肌無力、神經(jīng)性疼痛和/或肌肉痙攣。在方法的另一個具體的實施方案中，急性GVHD和/或慢性GVHD的癥狀包括高膽紅素血、黃癥、門靜脈高血壓、肝硬化、出血性結膜炎、形成假膜、兔眼、慢性角膜結膜炎、干燥、間斷角膜病、口腔粘膜萎縮、紅斑、頰或唇緣粘膜出現(xiàn)苔蘚樣破損、閉塞性細支氣管炎、陰道炎、陰道狹窄、自身免疫性血小板減少癥和/或貧血。本發(fā)明方法不限于供體和或接受者的性質(zhì)。移植可以跨越物種界限。在優(yōu)選的實施方案中，供體和接受者是同一物種，例如都是人。移植接受者可以與供體是完全或部分同種異體的。移植可以是自體的。移植接受者或供體年齡可以小于5歲，從1到10歲、從5到15歲、從10到20歲、從15到25歲、從20到30歲、從25到35歲、從30到40歲、從35到45歲、從40到50歲、從45到55歲、從50到60歲、從55到65歲、從60到70歲，或70歲，或更老。GVHD通常通過癥狀的嚴重程度評分。例如，在一個實施方案中，對GVHD的癥狀進行階段劃分，根據(jù)皮膚、肝和/或腸道癥狀，將GVHD分為0(無GVHD)至IV級(威脅生命的GVHD),如表1和2所示表l.急性移植物抗宿主病的階段劃分階段++++++++++皮膚在<25%的肌體表面都有斑丘滲刺痛在25-50%的肌體表面都有斑丘發(fā)刺痛全身性紅皮病脫皮和水泡表2.急性GVHD的分級整體分級階段I皮膚0(無)卞o1(輕微)i+至++n(中度+至+++)iii(嚴重++至+++iv(威脅1++至++++生命)i肝(膽紅素水平,mg/dL02-33-66-15>15肝臟00+++至+++++至++++小腸腹瀉500-1OOOmL/d或持續(xù)惡心腹瀉腦0-1500mL/d腹瀉>1500mL/d疼痛伴隨或不伴隨腸梗阻腸00+++至+++++至++++功能損傷00++++++因此，在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞是足以改善個體的移植物抗宿主疾病的一種或多種癥狀的量，例如，已經(jīng)接受移植的個體(移植接受者)，使所述移植物抗宿主疾病的分級降低至少一級。在具體的實施方案中，所述移植物抗宿主病從IV級降低至III級；從IV級降低至II級；從IV級降低至I級；從IV級降低至0級；從III級降低至II級；從III級降低至I級；從III級降低至0級；從II級降低至I級；從II級降低至O級；或從I級降低至O級。在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，胎盤干細胞的治療有效量是這樣的量，在移植后的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100天內(nèi)，所述量使所述個體中的移植物抗宿主病發(fā)展不超過0級、I級、II級或III級。在不同的具體實施方案中，患有或有風險出現(xiàn)GVHD的個體是這樣的個體，所述個體是接受同種異體造血細胞移植的個體(例如沒有接受任何GVHD預防處理的個體；大齡個體；HLA-不完全匹配的造血干細胞的受體；來自異體敏感供體的移植物的受體；無血緣關系供體移植物的受體)；接受實體器官移植的個體，特別是包括淋巴組織的器官移植，例如小腸移植；和接受未經(jīng)照射的血液產(chǎn)品的個體(例如新生兒和胎兒，具有先天性免疫缺陷綜合征的個體，接受免疫抑制化療的個體，接受來自HLA-部分匹配、HLA-同源個體直接供血的個體)，接受復合組織同種異體移植物的個體(即，具有超過一種組織類型的同種異體移植物)；等。GVHD還可以發(fā)生在自體移植或同系造血細胞移植之后。在另一個具體的實施方案中，作為移植的附屬物，個體已經(jīng)接受了亞致死或致死劑量的照射(例如已經(jīng)過輻射)。在具體的實施方案中，在移植前的14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天前，向個體施用胎盤干細胞或臍帶干細胞。在另一個具體的實施方案中，在移植的同時施用胎盤或臍帶干細胞。在另一個具體的實施方案中，在移植的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內(nèi)施用胎盤或臍帶干細胞?？梢远啻螌嵤┨ケP或臍帶干細胞給藥，例如在移植前、移植中或移植后多次施用，或其任意的組合。在另一個實施方案中，當個體(移植接受者)表現(xiàn)出II級或更嚴重的移植物抗宿主病時，可以在移植后的任何時間施用臍帶或胎盤干細胞。88在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，向個體，例如移植接受者或即將接受移植的個體，施用胎盤干細胞或臍帶干細胞和另外的至少一種其它的治療劑。在具體的實施方案中，所述治療劑是抗胸腺細胞球蛋白、麥考酚酸嗎乙酯、西羅莫司、Campath-IH、角質(zhì)化細胞生長因子(KGF)、辛二酰替苯胺異羥坊酸(SAHA)、可的松、氫化可的松、潑尼松或甲基潑尼松。在另一個具體的實施方案中，所述治療劑是免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑?？捎糜贕VHD的免疫抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑是本領域已知的，包括但不限于氨甲蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)胞素A、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(例如，F(xiàn)K506(他克莫司))、甲潑尼龍(MP)、皮質(zhì)激素、類固醇、麥考酚酸莫酯、雷帕霉素(西羅莫司)、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如，來氟米特)、T細胞受體調(diào)節(jié)劑和細胞因子受體調(diào)節(jié)劑、肽模擬物和抗體(例如，人的、人源化的、嵌合的、單克隆、多克隆、Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)2片段或表位結合片段)、核酸分子(例如，反義核酸分子和三螺旋)、小分子、有機化合物，和無機化合物。特別的，免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于甲氨蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、石克唑嘌呤(Immuran)、環(huán)胞素A、米諾環(huán)素、疏唑嘌呤、抗生素(例如，F(xiàn)K506(他克莫司))、甲潑尼龍(MP)、皮質(zhì)激素、類固醇、麥考酚酸莫酯、雷帕霉素(西羅莫司)、咪唑立賓、脫氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如，來氟米特)、T細胞受體調(diào)節(jié)劑和細胞因子受體調(diào)節(jié)劑。T細胞受體調(diào)節(jié)劑的實例包括但不限于抗T細胞受體抗體(例如，抗CD4抗體(如，cM-T412(Boehringer)、IDEC-CE9.Is(IDEC和SKB)、mAb4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗CD3抗體(如,Nuvion(ProductDesignLabs)、OKT3(Johnson&Johnson)或Rituxan(IDEC))、抗CD5抗體(如，抗CD5連接蓖麻毒素的免疫綴合物)、抗CD7抗體(如，CHH-380(Novartis))、抗CD8抗體、抗CD40配體單克隆抗體(如，IDEC-B1(IDEC))、抗CD52抗體(如，CAMPATH1H(Ilex))、抗CD2抗體、抗CD1a抗體(如，Xanelim(Genentech))和抗B7抗體(如，IDEC-114)(IDEC)))、CTLA4-免疫球蛋白、撒利多邁德胺，或5.6.6節(jié)中的化合物之一。在具體的實施方案中，T細胞受體調(diào)節(jié)劑是CD2拮抗劑。在其它實施方案中，T細胞受體調(diào)節(jié)劑不是CD2拮抗劑。在另一個具體的實施方案中，試劑是抗體MEDI-501(T10B9)。在另一個具體的實施方案中，T細胞受體調(diào)節(jié)劑是CD2結合分子，優(yōu)選MEDI-507。在其它實施方案中，T細胞受體調(diào)節(jié)劑不是CD2結合分子?？梢允┯眠m合治療GVHD或GVHD癥狀的上述治療劑任意組合。此類治療劑可以與胎盤干細胞或臍帶干細胞以任意組合，同時施用或作為獨立的治療分別進行。5.6.10類風濕性關節(jié)炎的治療在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有類風濕性關節(jié)炎(RA)、或正在經(jīng)歷RA癥狀、或有風險患RA的個體的方法，包括向個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或施用被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善RA的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低RA的一種或多種癥狀發(fā)生的量。類風濕性關節(jié)炎是慢性、炎性自體免疫綜合癥，其中機體的免疫系統(tǒng)通常攻擊機體的關節(jié)矛口其它纟且織。在具體的實施方案中，在患RA的個體的至少一個關節(jié)中，所述施用足以可檢測地改善RA的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低RA的一種或多種癥狀發(fā)生。在另一個具體的實施方案中，在患RA的個體的至少一種非關節(jié)組織中，所述施用足以可檢測地改善RA的一種或多種癥狀的量，或90足以可檢測地降低RA的一種或多種癥狀發(fā)生。RA可以影響的非關節(jié)組織的實例包括但不限于皮膚(表皮)、肺、自體免疫系統(tǒng)或血液、腎組織、心血管組織、眼組織或神經(jīng)組織。在具體的實施方案中，RA的癥狀是但不限于晨間強直(例如持續(xù)超過l小時)、一處或多處關節(jié)或關節(jié)群的軟組織腫脹、關節(jié)痛、皮下結節(jié)、類風濕因子高于95%，或提示關節(jié)受損的放射學變化。在具體的實施方案中，所述施用足以可檢測地改善一種或多種RA并發(fā)癥，或足以可檢測地降低一種或多種RA并發(fā)癥的發(fā)生。此類病狀的實例包括但不限于壞疽性膿皮癥、嗜中性白細胞皮膚病、斯威特氏綜合征(Sweet'ssyndrome)、病毒感染、結節(jié)性紅斑、小葉性脂膜炎、肢端皮膚萎縮、掌紅斑、彌漫性變薄(米紙皮膚)、皮膚脆弱、在外表面的皮下結節(jié)(例如肘部)、肺纖維變性(例如甲氨蝶呤治療所導致的)、卡普蘭氏結節(jié)、血管炎性障礙、甲褶梗死、神經(jīng)病、腎病、淀粉樣變性、假性肌肥大、心內(nèi)膜炎、左心室衰竭、血管炎、鞏膜軟化、多發(fā)性單神經(jīng)炎、寰樞推不全脫位等等。在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，向患有RA的個體施用胎盤干細胞或臍帶干細胞和另外至少一種其它治療劑。在具體的實施方案中，所述治療劑是例如止痛劑，或抗炎劑。在另一個具體的實施方案中，所述治療劑是緩解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)。在更具體的實施方案中，DMARD是一種或多種異型生物質(zhì)(例如疏唑嘌呤、環(huán)胞素A、D-青霉胺、金鹽、羥氯喹、)或生物學試劑(例如胂瘤壞死因子a(TNF-a)阻斷劑，如依那西普(ENBREL)、英夫利昔單抗(REMICADE)、阿達木單抗(HUMIRA),或上文5.6.8節(jié)公開的化合物之一；白介素-1阻斷劑；抗B細胞(CD20)抗體(例如利妥昔單抗或RITUXAN);或T細胞活化的阻斷劑(例如:阿巴西普或ORENCIA))。在另一個更具體的實施方案中，鎮(zhèn)痛劑或抗炎劑是糖皮質(zhì)激素、非固醇類抗炎藥、對乙酰氨基酚、布洛芬、阿司匹林、鴉片劑或利多卡因(局部的)?？梢允┯眠m合治療GVHD或GVHD癥狀的上述治療劑的任意組合。此類治療劑可以與胎盤干細胞或臍帶干細胞以任意組合，同時施用或作為獨立的治療過程進行。在具體的實施方案中，向患有RA的個體施用的多個胎盤干細胞或臍帶干細胞已經(jīng)被遺傳改造，以表達治療RA的多肽。在更具體的實施方案中，治療RA的多肽是IL-lRa(白介素-l受體拮抗劑)。在另一個更具體的實施方案中，治療RA的多肽是含有IL-lRa和DHFR(二氫葉酸還原酶)的融合蛋白。在更具體的實施方案中，用編碼IL-lRa-DHFR融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)化胎盤干細胞或臍帶干細胞，其中通過抗葉酸劑，例如氨甲喋呤，增加融合蛋白的表達。在另一個更具體的實施方案中，向患有RA的個體施用多個第二類型的干細胞，其中，所述多個第二類型的干細胞已經(jīng)被遺傳改造，表達治療RA的多肽，例如任何上文公開的多肽。在更具體的實施方案中，核酸編碼IL-lRa-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是內(nèi)核糖體進入位點，Luc是熒光素酶。在另一個更具體的實施方案中，所述核酸包括能夠控制IL-lRa或IL-1Ra-DHFR融合多肽表達的核普酸序列。用于治療RA的經(jīng)遺傳改造的胎盤干細胞、臍帶干細胞或其它類型的干細胞，可以與未經(jīng)過遺傳改造的此類干細胞以任意組合向患有RA的個體施用。5.6.11硬皮病的治療92在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有硬皮病、正在經(jīng)歷癥狀硬皮病、或有石更皮病風險的個體的方法，包括向所述個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或施用被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中治療有效量是足以可檢測地改善硬皮病的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低硬皮病的一種或多種癥狀發(fā)生。硬皮病是慢性疾病，其特征是膠原在皮膚或其它器官中的過度沉淀。硬皮病可以是局部的或全身的。硬皮病的局部形式是致殘的，但不趨向致死。硬皮病的全身形式表現(xiàn)為彌漫性硬皮病或系統(tǒng)性硬化，由于心、腎、肺或腸的破壞，導致該疾病可以是致死的。硬皮病的三種類型是彌漫性硬皮病、局限性(CREST綜合征)硬皮病(也是全身性的)，和硬斑/線形硬皮病(其局限于皮膚)。彌漫性硬皮病是最嚴重的形式，受害者發(fā)病迅速、皮膚廣泛硬化、內(nèi)臟(特別是肺和胃腸道)損害嚴重。硬皮病的局限性形式比較溫和，發(fā)病和發(fā)展緩慢。局限性硬皮病的皮膚硬化通常限于手和面部，相比彌漫性硬皮病，其對內(nèi)臟器官的損害較不嚴重。通常，雷諾現(xiàn)象(Reynaud'sphenomenon)可以經(jīng)過數(shù)年發(fā)展成為石更皮病。雷諾現(xiàn)象的原因是在寒冷中，棵露體表的小動脈血管收縮，特別是在手和足，典型表現(xiàn)為是三相變色首先白色，然后是藍色和最后回暖后的紅色。局限性硬皮病形式常被稱為CREST綜合征，其中"CREST"是五種主要特征的首字母縮寫鈣化(calcinosis,軟組織的鈣沉淀，例如皮膚)、雷諾氏綜合征(Raynaud'ssyndrome)、食道運動障礙(esophagealdysmotility)、指端硬化(sclerodactyly，手指的石更皮病)，和毛細管擴張(telangiectasia,蛛網(wǎng)l爭月永)硬皮病的發(fā)展與存在自身抗體相關，特別是抗著絲粒和抗scl70/抗拓樸異構酶抗體。多達90%的患者都有可檢測到的抗核抗體。抗著絲?？贵w在局限性硬皮病(80-90%)中比在全身性硬皮病(10%)中更常見，而抗scl70則在彌漫性硬皮病(30-40%)和非洲-美洲患者中更常見。因此，本發(fā)明提供的治療方法中，施用胎盤干細胞或臍帶干細胞抑制了硬皮病的一種或多種癥狀的發(fā)展，降低了其嚴重程度，或減慢了硬皮病的一種或多種癥狀的進展。在一個實施方案中，硬皮病是局限性硬皮病。在另一個實施方案中，石更皮病是彌漫性石更皮病。在另一個實施方案中，石更皮病是硬—斑病。在另一個具體的實施方案中，所述癥狀是面部皮膚的一處或多處硬化、手指皮膚的硬化、雷諾綜合癥、加壓素極度失當、鈣化、毛細管擴張、食道運動障礙。在另一個具體的實施方案中，施用胎盤干細胞或臍帶千細胞可檢測地降低了個體一毫升血液中一種或多種抗核抗體的量或濃度，例如，抗著絲粒抗體或抗拓樸異構酶抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明才是供的治療方法包括施用第二療法或治療劑，其中所述第二療法或治療劑是抗炎藥，例如，甾類抗炎藥物或非甾類抗炎藥物(NSAID)、對乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、阿斯匹林等。在更具體的實施方案中，施用NSAID，還施用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，例如，奧美拉唑。在另一個實施方案中，所述第二療法是免疫抑制化合物，例如麥考酚酸嗎乙酯、環(huán)磷酰胺或氨甲喋呤。在另一個實施方案中，患者具有手指潰瘍和肺動脈高血壓，向其施用血管擴張劑例如前列環(huán)素(伊洛前列素)。在另一個實施方案中，所述第二療法是第二種類型的細胞，例如造血干細胞如CD34+造血干細胞，以一種或多種劑量(約1()S細胞/kg至約1(^細胞/kg)。在具體的實施方案中，所述第二類型的干細胞是間充質(zhì)干細胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。所述第二類型的干細胞，例如造血干細胞或間充質(zhì)干細胞，可以與胎盤干細胞以任意比例施用，例如，約100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75或1:100。此類間充質(zhì)干細胞可以商業(yè)獲得或自原始來源獲得，例如骨髓、骨髓吸出物、脂肪組織等?？梢允┯眠m合治療硬皮病或硬皮病癥的上述治療劑的任意組合。此類治療劑可以與本發(fā)明的胎盤干細胞或臍帶干細胞以任何組合，同時施用或作為獨立的治療過程進行。向患有硬皮病的個體施用的胎盤干細胞或臍帶干細胞可以是藥物組合物的形式，例如適合如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)注射的藥物組合物。5.6.12治療牛皮癬在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有牛皮癬、正在經(jīng)歷牛皮癬癥狀、或有風險患牛皮褲的個體的方法，包括向所迷個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或施用被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善牛皮癬的一種或多種癥狀的量，或足以可檢測地降低硬皮病的一種或多種癥狀發(fā)生的量。牛皮癬是影響皮膚和關節(jié)的疾病，通常導致皮膚上出現(xiàn)紅色的有鱗斑塊，稱為牛皮癬斑。牛皮褲斑是炎性和皮膚過度生成的結果。皮膚在這些位置快速積累，并呈現(xiàn)銀白色外觀。斑通常發(fā)生在肘和膝蓋的皮膚，但也可以影響任何區(qū)域，包括頭皮和生殖器。推測牛皮褲是免疫介導的。已經(jīng)鑒別了一些不同類型的牛皮癬，如下斑塊狀牛皮癬(尋常性牛皮褲)是最常見形式的牛皮痹，通常表現(xiàn)為升高的發(fā)炎皮膚區(qū)域，覆蓋了銀白色鱗狀皮膚，稱為斑。95屈側銀屑病(皮褶牛皮癬)表現(xiàn)為發(fā)生在皮膚褶皺處的光滑的發(fā)炎皮膚塊，例如圍繞生殖器(在大腿和鼠蹊之間)、腋下、超重的胃部下方和乳房下方的光滑發(fā)炎皮膚塊。滴狀牛皮癬表現(xiàn)為在大面積的軀體(例如軀干、四肢和頭皮)上出現(xiàn)大量小圓點(淚滴狀的)。滴狀牛皮痺與鏈球菌咽部感染相關。膿皰性牛皮癬表現(xiàn)為充滿非感染性膿液的升高的腫塊(膿皰)。膿皰性牛皮癬可以是局部的，通常在手和足(掌跖牛皮癬)，或全身性的，具有在機體任何部分隨機發(fā)生的廣泛的斑塊。指(趾)甲牛皮癬使手指和腳趾甲的外觀產(chǎn)生多種改變，包括甲板下變色、指甲凹陷、跨越指甲的橫線、指甲下方皮膚增厚，和指甲的松動(甲松離)和碎裂。牛皮褲關節(jié)炎涉及關節(jié)和結締組織炎癥，例如，在手指和腳趾的關節(jié)中，可以導致手指和腳趾的香腸樣腫大，稱為指炎。牛皮癬關節(jié)炎還可以影響臀部、膝關節(jié)和脊柱(脊推炎)。紅皮性牛皮癬表現(xiàn)為在大部分軀體表面皮膚的廣泛炎癥和剝落?？梢园殡S嚴重的瘙癢、腫脹和疼痛。通常是不穩(wěn)定的斑塊狀牛皮癬惡化的結果，特別是在突然停止系統(tǒng)治療后。由于極端的炎癥和剝落破壞了機體調(diào)節(jié)體溫的能力以及皮膚實施屏障功能的能力，該類型的牛皮癉可以是致死的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了向患有牛皮癬的個體施用治療有效量的胎盤干細胞，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善例如上文列舉的牛皮癬的一種或多種癥狀、降低其嚴重程度或降低其進展的量。96可以通過例如牛皮癬區(qū)域嚴重程度指數(shù)(PASI)，來評估牛皮癬的嚴重程度。PASI將損傷的嚴重程度和受影響區(qū)域的評估組合，在0(無病)至72(最大程度的疾病)范圍內(nèi)打一個分數(shù)。為了計算PASI,軀體被劃分為四個部分大腿、身體(軀干區(qū)域胃、胸、背，等)、手臂和頭。每個上述區(qū)域分別評分，然后將四個分數(shù)組合，形成最終PASI。對于每個部分，評定受牛皮癬影響的皮膚面積的百分比，然后轉(zhuǎn)化成0-6級，如下受損皮膚面積百分比0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>通過四種不同的參數(shù)評估嚴重程度，分為0-4級瘙瘁(itching)、紅斑(erythema,發(fā)紅)、鱗狀剝落(scaling)和增厚(thickness)。然后計算每一部分皮膚所有四種嚴重程度參數(shù)的總和，乘以相應區(qū)域的面積分數(shù)，并乘以各部分的權重(頭O.l、手臂0.2、身體0.3和大腿0.4)。實例(I身體+E身體+S身體+T身體)xA身體乂0.3=總和身體。最后，總PASI計算為所有四個皮膚部分的PASI的總和。還可以通過對患牛皮痺的個體照相，通過計算機計算被牛皮褲損傷所覆蓋的軀體面積百分比，來評估嚴重程度。因此，在本發(fā)明提供的治療方法的具體實施方案中，牛皮褲是斑塊狀牛皮褲(尋常性牛皮癬)、屈側牛皮褲(皮褶牛皮褲)、滴狀牛皮痺、膿皰性牛皮癬、指(趾)甲牛皮癬、牛皮痺關節(jié)炎或紅皮性牛皮癬。在本發(fā)明方法的具體實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以改善牛皮癬的一種或多種癥狀的、推遲其發(fā)作，或減輕其進展的量，其中所述一種或多種癥狀是皮膚的鱗狀剝落、皮膚發(fā)紅、皮膚增厚、形成斑塊、甲板下變色、指甲凹陷、跨越指甲的橫線、指甲下方皮膚增厚、甲松離、出現(xiàn)膿包、關節(jié)和結締組織炎癥、皮膚炎癥或皮膚剝落。在另一個實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞是足以使牛皮癬區(qū)域嚴重性指數(shù)降低5、10、15、20、25、30、35、40或更多的量。在另一個實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，與第二療法結合施用。所述第二療法可以是局部的，例如乳膏或油膏，其包含類固醇(例如去羥米松)、維生素D3類似物(例如鈣泊三醇)、地蒽酚、堅果油、維甲酸或煤焦油中的一種或多種。在另一個具體的實施方案中，所述第二療法包括一次或多次曝光于紫外光下，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20分鐘，例如波長在約280nm至約315nm之間的UVB，特別是約311nm至約312nm之間的UVB。在另一個具體的實施方案中，所述第二療法包括局部施用補骨脂內(nèi)酯結合曝露于UVA光下。在另一個具體的實施方案中，所述第二療法包括一種或多種以下物質(zhì)的一次或多次系統(tǒng)性給藥，所述物質(zhì)例如是氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素、維甲酸、疏鳥嘌呤、羥基脲、柳氮磺胺吡啶、麥考酚酸嗎乙酯、疏唑噤呤、口服他克莫司和/或延胡索酸酯。5.6.13治療紅斑狼瘡在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有紅斑狼瘡(LE)、或正在經(jīng)歷LE癥狀、或有風險出現(xiàn)LE的個^^的方法，包括向所述個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或施用被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中治療有效量是足以可檢測地改善LE的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低LE的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減慢LE的進展的量。LE有許多癥狀，并且在不同的個體中，疾病可以進展不同。所述癥狀可以包括皮膚病表現(xiàn)形式(例如面頰疹(也稱蝶形疹)，盤狀狼瘡(皮膚上的增厚、紅色鱗狀斑塊)，脫發(fā)，口、鼻或陰道潰瘍，和/或皮膚損害)；肌肉和骨骼的表現(xiàn)形式(例如關節(jié)痛)；血液病的表現(xiàn)形式(例如貧血和鐵缺乏、低于正常血小板和白血細胞計數(shù)、抗磷脂抗體綜合征(血栓性脈管炎，其中患者血清中存在針對磷脂的自身抗體)，和/或血液中出現(xiàn)抗心磷脂抗體);心臟病的表現(xiàn)形式(例如心包炎、心肌炎和/或心內(nèi)膜炎)；肺病的表現(xiàn)形式(例如肺和/或胸膜炎癥、胸膜炎、胸膜滲漏、狼瘡性肺炎、慢性彌漫性肺間質(zhì)病、肺動脈高血壓、肺栓子和/或肺出血)；肝病的表現(xiàn)形式(例如自身免疫性肝炎；黃疸；在血流中存在抗核抗體(ANA)、平滑肌抗體(SMA)、肝/腎微粒體抗體(LKM-I)和/或抗線粒體抗體(AMA));腎病的表現(xiàn)形式(例如無痛性血尿或蛋白尿、狼瘡性腎炎、腎衰竭，和/或出現(xiàn)具有"環(huán)狀"異常的膜性腎小球腎炎)；神經(jīng)病的表現(xiàn)形式(例如癲癇、精神病、腦脊液異常)；T-細胞異常(例如CD45磷酸酶缺陷和/或CD40配體表達增加)；和/或非特異性表現(xiàn)形式(例如狼瘙性胃腸炎、狼瘡性胰腺炎、狼瘡性膀胱炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病、副交感神經(jīng)障礙、視網(wǎng)膜脈管炎、系統(tǒng)性脈管炎、FceRT/表達增加、T細胞內(nèi)鈣水平升高并保持升高、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信號的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。因此，在具體的實施方案中，所述治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以可檢測地改善LE的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低LE的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減慢LE的一種或多種癥狀惡化的量，其中所述一種或多種癥狀包括一種或多種LE的皮膚、血液、肌肉和骨骼、神經(jīng)、腎、肝或T細胞的表現(xiàn)形式。在另一個具體的實施方案中，所述治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以可檢測地改善LE的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低LE的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減緩LE的一種或多種癥狀惡化的量，其中所述一種或多種癥狀包括面頰滲、蝶形滲、盤狀狼瘡、脫發(fā)，口、鼻或陰道潰瘍，皮膚損害、關節(jié)痛貧血和/或鐵缺乏、低于正常血小板和白血細胞計數(shù)、抗磷脂抗體綜合征、血液中出現(xiàn)抗心磷脂抗體、心包炎、心肌炎、心內(nèi)膜炎、肺和/或胸膜炎癥、胸膜炎、胸膜滲漏、狼癡性肺炎、慢性彌漫性肺間質(zhì)病、肺動脈高血壓、肺才全子、肺出血、自身免疫性肝炎；黃疸；在血流中存在抗核抗體(ANA)、平滑肌抗體(SMA)、肝/腎微粒體抗體(LKM-I)和/或抗線粒體抗體(AMA),無痛性血尿或蛋白尿、狼瘡性腎炎、腎衰竭，和/或出現(xiàn)具有"環(huán)狀"異常的膜性腎小球腎炎;神經(jīng)病變(例如癲癇、精神病、腦脊液異常)；T-細胞異常(例如CD45磷酸酶缺陷和/或CD40配體表達增加)；和/或非特異性病變(例如狼瘡性胃腸炎、狼瘡性胰腺炎、狼瘡性膀胱炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病、副交感神經(jīng)障礙、視網(wǎng)膜脈管炎、系統(tǒng)性脈管炎、FcsRIy表達增加、T細胞內(nèi)鈣水平升高并保持、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信號的降低，和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。向患有紅斑狼掩的個體施用的胎盤干細胞或臍帶干細胞可以是藥物組合物的形式，例如適合如靜^jc內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)注射的藥物組合物。5.6.14治療蕈樣真菌病在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有蕈樣真菌病、正在經(jīng)歷蕈樣真菌病癥狀、或有風險患蕈樣真菌病的個體的方法，包4臺向所述個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞，或施用被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中所述治療有效量是量足以可檢測地改善蕈樣真菌病的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低蕈樣真菌病的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減緩蕈樣真菌病的進展的量。蕈樣真菌病是最常見的皮膚T細胞淋巴瘤，一組生長在皮膚內(nèi)的罕見癌癥。在所有蕈樣真菌病例中的約5%發(fā)生Sezary綜合征，是T細胞影響外周血和皮膚的更罕見的形式。蕈樣真菌病的發(fā)展階段通常用皮膚癥狀限定(1)斑塊期(patchphase)，其中皮膚出現(xiàn)扁平紅斑，或在深色皮月夫的個體中出現(xiàn)非常淺或非常深色的斑塊，很瘙癢，升高且堅硬(斑塊)；(2)皮膚腫瘤期，出現(xiàn)紅-紫色的、升高的肺塊(結節(jié))，其可以是半球形(類似蘑菇)或潰瘍樣的；(3)皮膚發(fā)紅階段(紅皮病)，其中，個體的皮膚出現(xiàn)大面積紅色區(qū)域，非常瘙癢且有鱗片狀脫落，其中手掌和腳掌皮膚增厚并脫落；和(4)淋巴結階段，其中蕈樣真菌病通過淋巴結開始轉(zhuǎn)移到身體的其它部分，使其開始發(fā)炎，并通常是癌性的，可以擴散到肝、肺或骨髓。因此，在具體的實施方案中，所述治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以可檢測地改善蕈樣真菌病的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低蕈樣真菌病的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減慢蕈樣真菌病的一種或多種癥狀惡化的量，其中所述一種或多種癥狀包括一種或多種蕈樣真菌病的皮膚病、血液病、肌肉和骨骼、神經(jīng)、腎、肝或T細胞的表現(xiàn)形式。在另一個具體的實施方案中，所述治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基是足以可檢測地改善蕈樣真菌病的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低蕈樣真菌病的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減慢蕈樣真菌病的一種或多種癥狀惡化的量，其中所述一種或多種癥狀包括皮膚上的瘙癢的淺色或深色斑、皮膚斑塊、皮膚胂瘤、升高的腫塊、發(fā)紅、鱗狀剝落和瘙癢、手掌和腳掌皮膚增厚、手掌和腳掌皮膚脫落；或淋巴結炎癥。在另一個具體的實施方案中，治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞或者被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基與第二療法或第二治療劑結合施用。在更具體的實施方案中，所述第二療法或第二治療劑是將所述個體的患病皮膚區(qū)域一次或多次暴露于陽光或紫外光、局部類固醇、局部表層放射治療、全皮膚電子束照射、向患有紅皮病的皮膚施用有機(Manuka)蜜，或生物學療法。在更具體的實施方案中，所述生物學療法包括向所述個體施用一種或多種干擾素、維甲酸、rexinoid、vorinostat(例如ZOLINZA⑧)。5.6.15治療糖尿病在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有糖尿病、正在經(jīng)歷糖尿病癥狀、或有風險患糖尿病的個體的方法，包括向所述個體施用治療有效量的胎盤干細胞或臍帶干細胞、或被胎盤干細胞或臍帶干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善糖尿病的一種或多種癥狀、足以可檢測地降低糖尿病的一種或多種癥狀發(fā)生、或足以減緩糖尿病進展的量。在具體的實施方案中，糖尿病是糖尿病I型，也稱為1型糖尿病、I型糖尿病、TID，或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)。在病程中，可以一次或多次施用胎盤干細胞。優(yōu)選的，在首次診斷的1、2、3、4、5或6天內(nèi)，或l周內(nèi)施用干細胞。在一個實施方案中，所述治療有效量的干細胞是足以逆轉(zhuǎn)、降低1型糖尿病的嚴重程度，或者減輕其癥102狀(包括異常的高血糖、經(jīng)葡萄糖耐量試驗確定的胰島素耐受性缺少、疲勞或意識喪失)的量。胎盤干細胞可以與第二療法結合施用，例如胰腺組織和/或胰島細胞移植；自體或同種異體干細胞療法等。5.6.16第二治療性組合物和第二療法在任意上述治療方法中，本發(fā)明方法可以包括施用第二治療性組合物或第二療法。上文中，在治療特定疾病的方法中引用的特定第二治療性組合物或第二療法并非意在排他。例如，可以使用本文描述的任意抗炎性化合物或免疫抑制性化合物來治療本文中討論的任意疾病、障礙或病狀。在施用胎盤干細胞和第二治療劑、或第二類型的干細胞的實施方案中，胎盤干細胞和第二治療劑、和/或第二類型的干細胞可以同時或不同時施用，例如胎盤干細胞以及第二治療劑和/或第二類型的干細胞的施用可以相繼發(fā)生在l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分鐘內(nèi)，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22小時內(nèi)，或l、2、3、4、5、6、7、8、9或10天內(nèi)。在具體的實施方案中，對與不恰當、不利或有害的免疫反應相關，或由其導致的疾病、障礙或病狀的治療，包括施用第二類型的干細胞、或第二類型的干細胞的群體。在具體的實施方案中，所述第二類型的干細胞是間充質(zhì)干細胞，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。在其它實施方案中，所述第二類型的干細胞是多能干細胞、全能性干細胞、前體細胞、造血干細胞(例如€034+造血干細胞)、成體干細胞、胚胎干細胞或胚胎生殖細胞。所述第二類型的干細胞，例如間充質(zhì)干細胞，可以與胎盤干細胞或臍帶干細胞以任意比例施用，例如，比例為約100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75或1:100。間充質(zhì)干細胞可以商業(yè)獲得或自原始來源獲得，例如獲自骨髓、骨髓吸出物、脂肪組織等。在另一個具體的實施方案中，所述第二療法包括免疫調(diào)節(jié)性化合物，其中免疫調(diào)節(jié)性化合物是3-(4-氨基-l-酮-l,3-二氫異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'-氨基異吲哚啉酮-l'-酮)-l-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2，6-二氧(3-哌啶))-異吲哚啉酮-l，3-二酮；或a-(3-氨基苯二酰亞氨基)戊二酰亞胺。在更具體的實施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)性化合物是具有以下結構的化合物，或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映體、非對映體、外消旋體，或其立體異構體的混合物其中，X和Y之一是CO，X和Y的另一個是CO或CH2，R"是氫或低級烷基。在另一個更具體的實施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)性化合物是具有以下結構的化合物，或其藥學上可接受的鹽、水化物、溶劑化物、包合物、對映體、非對映體、外消旋體，或其立體異構體的混合物其中，X和Y之一是CK),另一個是C-O;R1是H、(C廣C8)烷基、(CrC7)環(huán)烷基、(C2-Cs)烯基、苯基、芳香基、(Co-C4)烷基-(C廣C6)異環(huán)烷基、(C『C4)烷基-(C2-C5)異芳香基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(d-Cs)烷基-N(R6)2、(C廣Q)烷基-OR5、(C廣Q)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(0)NR3R3'、C(S)NR3R3'或(Q-Cs)烷基-0(CO)R5;R2是H、F、苯甲基、(C廣Q)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基;R3和R3'分別是(C廣C8)烷基、(CrC7)環(huán)烷基、(C2-Q)烯基、(C2-Q)炔基、苯甲基、芳香基、(Co-C4)烷基-(C廣C6)異環(huán)烷基、(C『C4)烷基-(C2-C5)異芳香基、(Co-C8)烷基-N(R6)2、(C,-C8)烷基-OR5、(C廣C8)烷基-C(0)OR5或C(O)OR5R4是(C廣Cs)烷基、(C2-C8)烯基、(CVC8)炔基、(C,-C4)烷基-OR5、苯甲基、芳香基、(QrC4)烷基-(CrC6)異環(huán)烷基或(QrC4)烷基-(C2-C5)異芳香基；R5是(C廣C8)烷基、(C2-Cs)烯基、(CVC8)炔基、苯甲基、芳香基或(CrCs)異芳香基；每個W各自獨立的是H、(C廣C8)烷基、(C2-Q)烯基、(CrC8)炔基、苯甲基、芳香基、(CVC5)異芳香基，或(Co-C8)烷基-C(0)0-R5,或W基團可以連接形成異環(huán)烷基；n是0或1;和*代表手性碳中心。在另一個更具體的實施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)性化合物是具有以下結構的化合物，或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映體、非對映體、外消旋體，或其立體異構體的混合物其中，X和Y之一是C二O，另一個是CH2或C:0;R是H或CH20COR';(i)R1、R2、113或114各自獨立的是卣素、l-4碳原子的烷基、或l-4碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、113或W之一是氮或-NHR5，其余的R1、R2、R3或R4是氫；W是氫或l-8碳的烷基；W是氫、l-8碳原子的烷基、苯并、氯或氟；R，是r7畫CHR'0-N(r8r9);R"是間亞苯基或?qū)啽交?(CnH2n)-，其中n為0-4;118和119各自獨立的是氫或l-8^炭原子的烷基，或118和119一起形成環(huán)丁烷基、環(huán)戊烷、環(huán)己烷或-CH2CH2X,CH2CH2-，其中X,是-O-、-S-或-NH-;R^是氫、l-8碳原子的烷基或苯基；和*代表手性碳中心?？梢允┯眠m合治療炎性腸病或炎性腸病癥狀的任意組合的上述治療劑。此類治療劑可以與胎盤干細胞或臍帶千細胞以任意組合，同時施用或作為獨立的治療過程進行。向患有IBD的個體(例如克隆氏病)施用的胎盤干細胞或臍帶干細胞可以是藥物組合物的形式，例如適合如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射的藥物組合物。胎盤干細胞可以以單次劑量或多次劑量施用。當以多次劑量施用胎盤干細胞時，所述劑量可以是為緩解IBD(例如克隆氏病)的一種或多種急性癥狀設計的治療方案的一部分，也可以是長期治療方案的一部分，所述長期治療方案被設計用于預防或減輕該疾病的慢性病程的嚴重程度。在施用胎盤干細胞和第二治療劑或第二類型的千細胞的實施方案中，胎盤干細胞和第二治療劑以及/或第二類型的干細胞可以同時或不同時施用，例如:可以在l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分鐘內(nèi)相繼施用，或在l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22小時內(nèi)相繼施用，或在l、2、3、4、5、6、7、8、9或10天內(nèi)相繼施用。6.實施例6.1實施例l:分離貼壁的胎盤千細胞該實施例說明了對貼壁的胎盤干細胞的收集和分離。Y^^和方法從在私人臍帶血庫項目中登記的待產(chǎn)婦中征集胎盤供體，提供知會同意，同意在回收了臍帶血后將排盡血的胎盤用于研究目的。這些個體同意使用從常規(guī)處理她們的冷凍臍帶血樣品中產(chǎn)生的盲數(shù)據(jù)。從而能夠比較收集的臍帶血組成以及利用下文描述的實驗方法回收的流出灌流液。在臍帶和胎盤排盡血后，在室溫下將胎盤置于無菌隔熱容器中，并在分娩后4小時內(nèi)送至實驗室。如果經(jīng)檢查，胎盤有物理傷害的證據(jù)例如器官碎片化或臍血管撕裂，則拋棄胎盤。在室溫(23±2°C)或冷藏(4°C)下維持胎盤，在無菌容器中放置2-20小時。在25士3。C的無菌生理鹽水中周期性浸泡和洗滌胎盤，去除任何可見的表面血液或^晬片。從插入胎盤處約5cm處橫切月齊帶，用TEFLON或聚丙烯導管插入臍血管，所述導管與無菌的液體通路相連，允許對胎盤進行雙向灌流并回收流出液。這里使用的系統(tǒng)使得條件化、灌流和流出液收集的所有方面都可以在受控的環(huán)境大氣條件下進行，并且可以實時監(jiān)控月氷管內(nèi)壓和流速、核心和灌流液溫度以及回收的流出液體積。在24小時的產(chǎn)后期中評估一系列條件化程序，并通過流式細胞儀、光學顯微鏡和克隆形成單位實驗來分析流出液的細胞組成。v衫產(chǎn)務斧化將胎盤維持在不同條件下，以試圖刺激和維持增殖和收集胎盤干細胞的生理相容性環(huán)境。用含有2U/ml肝素(EJkins-Sinn,N.J.)的IMDM無血清培養(yǎng)基(GibcoBRL，NY)沖洗導管。以50mL/分的速度實施胎盤灌流，直到收集了約150mL灌流液。將該灌流液體積標記為"早期部分"。以相同流速灌流胎盤，再收集約150mL的第二部分，標記為"后期部分"。在處理過程中，輕柔地按摩胎盤，幫助灌流過程，輔助細胞材料的回收。同時通過重力排出和動脈導管抽吸，從灌流回路收集流出液體。在獲得父母的書面同意后，從遞送室獲得胎盤以及臍帶血，在遞送后12-24小時內(nèi)在室溫下處理。在處理前，去除膜，并洗凈母體位置的殘留血液。用20號Butterfly針頭制成的導管對臍血管插管，用于血樣收集。然后用肝素化(2U/mL)的Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(HDMEM)灌流胎盤，以流速15mL/分鐘灌流10分鐘，從母體位置收集1小時內(nèi)的灌流液，計數(shù)有核細胞。重復灌流和收集過程1或2次，直到回收的有核細胞數(shù)低于100/pL。倒出灌流液，輕離心去除血小板、殘片和去核的細胞膜。然后，通過聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心分離有核細胞，洗滌后，重懸在HDMEM中。為了分離貼壁細胞，將等分的5-10x10S田胞置于各個T-75瓶中，用自BioWhittaker商購的間充質(zhì)干細胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)培養(yǎng)，置于組織培養(yǎng)孵育箱中，37°C，5%C02。在10-15天后，用PBS洗滌去除未貼壁細胞，然后用MSCGM替換。每天檢查培養(yǎng)瓶中存在的不同類型貼壁細胞，特別是鑒定和擴展成簇的成纖維細胞樣細胞。勿^敏夢炎和為、豸在室溫下，約200xg離心15分鐘，從灌流液中回收細胞。該過程用于從被殘片和血小板污染的樣本中分離細胞。將細胞團塊重懸在含有2U/ml肝素和2mMEDTA(GibcoBRL,NY)的IMDM-無血清培養(yǎng)基中。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦方法，利用LYMPHOPREP(NycomedPharma,Oslo,挪威)分離總單核細胞部分，并將單核細胞部分重懸。利用血球計數(shù)器計數(shù)細胞。通過臺盼藍排除實驗評估活力。利用含0.2%EDTA的0.05%胰蛋白酶(Sigma)溶液，通過差別胰酶消化來分離間充質(zhì)干細胞。由于胎盤干細胞一般在約5分鐘內(nèi)從塑料表面脫離，而其它貼壁的細胞群體一般要求孵育超過20-30分鐘，因此差別胰酶消化是可能的。在胰酶消化和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS,BioWhitaker)中和胰蛋白酶后，收獲脫離的胎盤干細胞。用HDMEM洗滌細胞，并重懸于MSCGM中。基于骨髓來源MSC(間充質(zhì)干細胞)的已知標志物，選擇FITC和PE標記的單克隆抗體，利用Becton-DickinsonFACSCalibur儀器，進行細胞的流式細胞計數(shù)?？贵w購自B.D.和Caltag實驗室(SouthSanFrancisco,Calif.),從AM.Cul.獲得生成SH2、SH3和SH4抗體的雜交瘤，并通過FITC或PE標記的F(ab)，2羊抗小鼠抗體檢測上述抗體在其培養(yǎng)上清液中的活性。利用可商購的誘導和維持培養(yǎng)基(BioWhittaker)進行種系分化，根據(jù)生產(chǎn)商的指導說明使用。/-產(chǎn)于勿應^為、岸顯徵鏡檢查培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞，揭示形態(tài)學不同的細胞類型，包括紡錘體形的細胞、具有大核和多個核周小囊泡的圓形細胞、以及具有數(shù)個突起物的星形細胞，細胞通過其中一個突起物附著在瓶上。對這些貼壁細胞的類型不作進一步鑒定，因為在骨髓、臍帶血和外周血培養(yǎng)中可以觀察到相似的非干細胞。但是，通過差別胰酶消化分離成纖維細胞樣細胞，并在次級瓶中亞培養(yǎng)，所述細胞最后表現(xiàn)為成簇，且視覺觀察與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞相似。細胞在胰酶消化后外觀變圓，相差顯微鏡顯示它們是高度顆?；模c實驗室制備或購自BioWhittaker的骨髓來源的MSC相似。亞培養(yǎng)時，這些貼壁胎盤細胞與其早期相反，在數(shù)小時內(nèi)貼壁，表現(xiàn)出特征性的成纖維細胞樣細胞外形，生長模式與對照的骨髓來源的MSC相似。此外，在亞培養(yǎng)和重新飼喂的過程中，洗去松散結合的單核細胞，保持培養(yǎng)物均質(zhì)，避免任何視覺可見的非成纖維細胞樣細胞的污染。在下列實驗中，表征了自不同灌流實驗獲得的這些貼壁細胞的細胞表面標志物表型，或在0CT-4的情況下，表征了基因的表達表型。下表3中顯示了這些實驗的結果110<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>6.2實施例2:胎盤干細胞的培養(yǎng)從產(chǎn)后的哺乳動物胎盤，通過灌流或物理破壞(例如酶消化)獲得胎盤干細胞。細胞培養(yǎng)在含有以下成分的培養(yǎng)基中60%DMEM-LG(Gibco)、40%MCDB-201(Sigma);2%胎牛血清(HycloneLabs.);lx胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS);lx亞麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA);l(T9M地塞米松(Sigma);10-4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma);上皮生長因子(EGF)10ng/ml(R&DSystems);血小板衍生生長因子(PDGF-BB)lOng/ml(R&DSystems)，和100U青霉素/1000U鏈霉素。如下準備培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶。向瓶內(nèi)添加含有5ng/ml人纖粘連蛋白(FN)(SigmaF0895)的5mLPBS,用FN包被T75瓶。將含有FN溶液的培養(yǎng)瓶置于37。C下30分鐘。然后，在細胞培養(yǎng)前去除FN溶液。在處理后不需要干燥培養(yǎng)瓶?？蛇x的，將培養(yǎng)瓶在4。C下與FN溶液接觸過夜或更久；在培養(yǎng)前，溫暖培養(yǎng)并瓦并去除FN溶液。如下形成來自胎盤灌流液的胎盤干細胞培養(yǎng)物。來自聚蔗糖梯度的細胞被接種在如上制備的FN包被的T75瓶中，密度為15ml培養(yǎng)基中50-100x106個細胞/瓶。典型的，接種5至10瓶。在37。C孵育培養(yǎng)瓶12-18小時，使貼壁細胞附著。每個瓶添加10ml溫暖的PBS,去除懸浮細胞，并輕柔混合。然后去除15ml培養(yǎng)基，并用15ml新鮮培養(yǎng)基換液。在開始培養(yǎng)后，3-4天更換所有的培養(yǎng)基。之后在培養(yǎng)基更換中，去除50。/?；?.5ml培養(yǎng)基。從約第12天開始，在顯微鏡下檢查培養(yǎng)物，檢查貼壁細胞克隆的生長。當細胞培養(yǎng)物形成約80%匯合度時，一般在開始培養(yǎng)后第13至18天之間，通過胰酶消化收獲貼壁細胞。從這些原代培養(yǎng)中收獲的細胞命名為0代(零代)。如下從消化的胎盤組織建立胎盤干細胞培養(yǎng)。將灌流后的胎盤的母體面向上置于無菌紙片上。用刀片刮去胎盤母體側約0.5cm的表層，并用刀片切除約1x2x1cm的胎盤組織塊。然后將該胎盤組織切碎成約1mm3的小片。將這些小片收集在50ml的Falcon管中，并用膠原酶IA(2mg/ml，Sigma)消化30分鐘，再用胰酶-EDTA(0.25%，GIBCOBRL)在37。C水浴中處理10分鐘。獲得的溶液在400g室溫離心IO分鐘，去除消化溶液。將細胞沉淀重懸在約IO倍體積的PBS中(例如，5ml的細胞沉淀用45mlPBS重懸)，上述管在400g室溫離心10分鐘。組織/細胞沉淀重懸在130mL培養(yǎng)基中，在每個纖粘連蛋白包被的T-75瓶中接種13ml細胞。細胞在37。C和5%C02的濕潤空氣下孵育。任選的，在該階段冷凍保存胎盤干細胞。在37。C水浴中快速解凍冷凍保存的細胞。用10ml溫暖的培養(yǎng)基迅速從冷凍管中移出胎盤干細胞，并轉(zhuǎn)移至15ml無菌管中。細胞在400g室溫離心IO分鐘。通過吹打?qū)⒓毎p柔地重懸在10ml溫暖的培養(yǎng)基中，通過臺盼藍排除實驗確定活細胞數(shù)。然后，以約6000-7000個細胞/cm2將細胞接種在如上準備的FN-包被瓶中(約5x105細胞/丁-75瓶)。細胞在37。C、5%(:02和90%濕度下孵育5分鐘。當細胞達到75-85%匯合度時，從瓶中無菌地去除并拋棄所有使用過的培養(yǎng)基。加入3ml的0.25。/o胰蛋白酶/EDTA(w/v)溶液覆蓋細胞層，在37。C、5%032和90%濕度下孵育細胞5分鐘。輕叩瓶一次或兩次促進細胞脫離。一旦>95%的細胞變圓并脫離，就向每個T-75瓶中加入7ml溫暖的培養(yǎng)基，并通過移液吹打?qū)⑷芤悍稚⒃谡麄€細胞層表面若干次。如上計數(shù)細胞并確定活力后，在室溫下1000RPM離心細胞5分鐘。用培養(yǎng)基輕柔地重懸一個T-75瓶中的細胞沉淀，并將細胞平均置于兩個FN-包被的T-75瓶中，進行細胞傳代。利用上述方法，鑒別表達CD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CDIO、CD卯和CD133標志物，并且不表達CD34和CD45標志物的貼壁胎盤干細胞群。這些胎盤干細胞的一部分而非全部培養(yǎng)物表達HLA-ABC和/或HLA-DR。6.3實施例3:從胎盤結構中分離胎盤干細胞6.3.1材料和方法6.3.1.1感興趣表型的分離從正常足月妊娠胎盤中獲得五個不同的胎盤細胞群。所有供者均提供了對其胎盤供研究目的使用的完整的書面同意。檢查了五個胎盤細胞群，分別來自(1)胎盤灌流液(來自胎盤脈管系統(tǒng)的灌流)、(2)羊膜的酶消化物、(3)絨毛膜的酶消化物、(4)羊膜-絨毛膜盤的酶消化物、以及(5)臍帶的酶消化物。在無菌PBS(Gibco-InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)中清潔不同的胎盤組織，并將其置于分別的無菌Petri亞中。用無菌外科手術刀切碎各組織，并置于50mLFalcon錐形管內(nèi)。用1x膠原酶(Sigma-Aldrich，St丄ouis，MO)在37。C水浴中消化切碎的組織20分鐘，離心，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco-InvitrogenCorp)在37°C水浴中消化10分鐘。消化后離心各組織，并用無菌PBS(Gibco-InvitrogenCorp)漂洗一次。然后過濾重新溶解的細胞兩次，一次用100[im細胞過濾器，一次用30(im分離濾器，去除任何殘留的胞外基質(zhì)或細胞碎片。6.3丄2細胞活力評估和細胞計數(shù)在消化后使用人工臺盼藍排除方法計算細胞數(shù)和評估細胞活力。細胞按l:l的比例與臺盼藍染料(Sigma-Aldrich)混合，利用血球計數(shù)器確定細胞活力。6.3.1.3細胞表面標志物表征選擇HLAABC7CD457CD347CD133+的細胞用于表征。通過兩臺Becton-Dickinson流式細胞儀鑒別、定量和表征具有該表型的細胞，所述流式細胞儀是FACSCalibur和FACSAria(Becton-Dickinson,SanJose，CA，USA)。以約10|xL抗體/1百萬個細胞的比例對不同的胎盤細胞染色，在室溫下?lián)u床上染色30分鐘。使用下列抗人抗體異疏氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗HLA-G單克隆抗體(Serotec，Raleigh,NC)、抗CD10單克隆抗體(BDImmunocytometrySystems,SanJose,CA)、抗CD44單克隆抗體(BDBiosciencesPharmingen,SanJose，CA)和抗CD105單克隆抗體(R&DSystemsInc.,Minneapolis,MN);藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗CD44、CD200、CD117和CD13單克隆抗體(BDBiosciencesPharmingen);藻紅蛋白-Cy5(PECy5)偶聯(lián)的抗生物素蛋白鏈菌素和抗CD117單克隆抗體(BDBiosci-encesPharmingen);藻紅蛋白-Cy7(PECy7)偶聯(lián)的抗CD33和CD10單克隆抗體(BDBiosciences);別藻藍蛋白(APC)偶聯(lián)抗生物素蛋白鏈菌素和抗CD38單克隆抗體(BDBiosciencesPharmingen);和生物素化的CD90(BDBiosciencesPharmingen)。在聘育后，漂洗細胞一次，去除未結合的抗體115，用4%多聚甲醛(USB,Cleveland,OH)在4°C固定過夜。第二天，漂洗細胞兩次，通過30分離濾器過濾，在流式細胞4義上計數(shù)。用抗小鼠IgG抗體(BDBiosciencesPharmingen)染色的樣本作為陰性對照，調(diào)節(jié)光電倍增管(PMTs)。用抗人抗體單次染色的樣本作為陽性對照，調(diào)節(jié)光譜重疊/補償。6.3.1.4細胞分選和培養(yǎng)用7-氨基放線菌素D(7AAD;BDBiosciencesPharmingen)和特異性針對目標表型的單克隆抗體對一組胎盤細胞染色。以約10pL抗體/1百萬個細胞的比例對不同的胎盤細胞染色，在室溫下?lián)u床上染色30分鐘。然后，在BDFACSAria上陽性分選這些細胞中表達目標表型的活細胞，并鋪盤培養(yǎng)。將分選的(目標群體)和"所有"(未分選的)的胎盤細胞群鋪盤，用于比較。以表4中列舉的細胞密度(細胞/cm2)將細胞鋪在纖粘連蛋白(Sigma-Aldrich)包被的96孔板上。根據(jù)表達目標表型的細胞數(shù)來確定和管理細胞密度，以及是以兩次重復還是三次重復來將細胞類型鋪盤。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>向96孔板的每個孔加入完全培養(yǎng)基(60%DMEM-LG(Gibco)和40%MCDB-201(Sigma);2%胎牛血清(HycloneLabs.);1x胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS);lx亞麻酸-牛血清白蛋白(LA-BSA);10-9M地塞米松(Sigma);1()4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma);上皮生長因子(EGF)10ng/ml(R&DSystems);和血小板衍生生長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&DSystems)),將平板置于50/。CO2/37。C孵育箱中。在第7天，向每個孔中加入100完全培養(yǎng)基。監(jiān)控96孔板約2周，在第12天完成培養(yǎng)物的最終評估。6.3.1.5數(shù)據(jù)分析利用才示準的月永沖選通才支術(gatingtechnique)在FlowJo(TreeStar,Inc)中分析FACSCalibur數(shù)據(jù)。利用FACSDiva軟件(Becton-Dickinson)分析BDFACSAria數(shù)據(jù)。利用偶極甄別脈沖選通和標準脈沖選通技術分析FACSAria數(shù)據(jù)，使偶極最小化。所有結果均匯編于MicrosoftExcel中，所有數(shù)值在本文中均呈現(xiàn)為平均值士標準差(數(shù)字，均值的標準誤)。63.2結果6.3.2.1細胞活力利用人工臺盼藍排除方法評估消化后的活力(附圖1)。獲自大部分的消化組織(來自羊膜、絨毛膜或羊膜-絨毛膜盤)的細胞的平均活力約為70%。獲自羊膜的細胞平均活力為74.35%±10.31%(n=6，SEM=4.21)，獲自絨毛膜的細胞平均活力為78.18%±12.65%(n=4，SEM=6.32),獲自羊膜-絨毛膜盤的細胞平均活力為69.05%±10.80%(n=4,SEM=5.40)，獲自臍帶的細胞平均活力為63.30%±20.13%(n=4，SEM=10.06)。獲自灌流，但未經(jīng)過消化的細胞保留了最高的平均活力，為89.98%±6.39%(n=5,SEM=2.86)。6.3.2.2細胞定量分析了五個不同的來自胎盤的細胞群，來確定HLAABC7CD457CD347CD133+細胞的數(shù)量。根據(jù)BDFACSCalibur數(shù)據(jù)的分析結果，觀察到羊膜、灌流液和絨毛膜分別含有最大總數(shù)的這些細胞30.72±21.80個細胞(n=4，SEM=10.90)，26.92±22.56個細胞(n=3，SEM=13.02)，和18.39士6.44個細胞(n=2，SEM=4.55)。羊膜-絨毛膜盤和臍帶分別含有最少總數(shù)表達目標表型的細胞4.72±4,16個細胞(n=3，SEM=2.40)和3.94士2.58個細胞(n=3,SEM=1.49)(數(shù)據(jù)未顯示)。相似的，當分析表達目標表型的總細胞百分比時，觀察到羊膜和胎盤灌流液含有表達該表型的最高百分比，分別是0.0319%±0.0202%(n=4，SEM=0.0101)和0.0269%±0.0226%(n=3，SEM=0.0130)(附圖2)。雖然臍帶含有較少數(shù)量表達目標表型的細胞(附圖2)，但是它含有第三高百分比表達目標表型的細胞0.020%±0.0226%(n=3,SEM=0.0131)(附圖2)。絨毛膜和羊膜-絨毛膜盤含有最低百分比表達目標表型的細胞分別是0.0184%±0.0064%(n=2，SEM=0.0046)和0.0177%±0.0173%(n=3,SEM=0.010)(附圖2)。與BDFACSCalibur分析的結果一致，BDFACSAria數(shù)據(jù)也顯示羊膜、灌流液和絨毛膜比其它來源提供更高數(shù)量的HLAABC7CD457CD347CD133+細胞。在羊膜、灌流液和絨毛膜中表達目標表型的細胞平均總數(shù)分別是126.47±55.61個細胞(n=15，SEM=14.36),81.65±34.64個細胞(n=20，SEM=7.75)和51.47±32.41個細胞(n=15，SEM=8.37)。羊膜-絨毛膜盤和臍帶含有最小總數(shù)表達目標表型的細胞，分別是44.89±37.43個細胞(n=9，SEM=12.48)和11.00±4.03個細胞(n=9，SEM=1.34)(數(shù)據(jù)未顯示)。BDFACSAria數(shù)據(jù)揭示了B和A細胞來源含有最高百分比的HLAABC7CD457CD347CD133+細胞，分另'J是0.1523±0.0227%(n=15，SEM=0.0059)和0.0929±0.0419%(n=20，SEM=0.0094)(附圖3)。D細胞來源含有第三高百分比表達目標表型的細胞，為0.0632±0.0333%(n=9，SEM=0.0111)(附圖3)。C和E細胞來源含有最低百分比表達目標表型的細胞，分別是0.0632±0,0249%(n=15，SEM=0.0064)和0.0457±0.0055%(n=9，SEM=0.0018)(附圖3)。在對每種細胞來源的HLAABC7CD457CD347CD133+細胞鑒別和定量后，還進一步分析和表征了它們的細胞表面標志物HLA-G、CDIO、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200和CD105的表達。6.3.2.3胎盤灌流液來源的細胞胎盤灌流液來源的細胞是HLA-G、CD33、CD117、CDIO、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13—致陽性的(附圖4)。對于灌流液來源的細胞，每種標志物的平均表達如下37.15%±38.55%(n=4，SEM=19.28)的細胞表達HLA-G;36.37%±21.98%(n=7,SEM=8.31)的細胞表達CD33;39.39%±39.91%(n=4，SEM=19.96)的細胞表達CD117;37.15%±38.55%(n=4，SEM=19.28)的細胞表達HLA-G;54.97%±33.08%(n=4，SEM=16.54)的細胞表達CDIO;36.79%±11.42%(n=4，SEM=5.71)的細胞表達CD44;41.83%±19.42%(n=3，SEM=I1.21)的細胞表達CD200;74.25%±26.74%(n=3,SEM=15.44)的細胞表達CD90;35.10%±23.10%(n=3，SEM=I3.34)的細胞表達CD38;22.87%±6.87%(n=3，SEM=3.97)的細胞表達CD105;和25.49%±9.84%(n=3，SEM=5.68)的細胞表達CD131196.3.2.4羊膜來源的細胞羊膜來源的細胞是HLA-G、CD33、CD117、CDIO、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13—致陽性的(附圖5)。對于羊膜來源的細胞，每種標志物的平均表達如下57.27%±4U1%(n=3，SEM=23.73)的細胞表達HLA陽G;16.23%±15.81%(n=6，SEM=6.46)的細胞表達CD33;62.32%±37.89%(n=3，SEM=21.87)的細胞表達CD117;9.71%±13.73%(n=3，SEM=7.92)的細胞表達CDIO;27.03%±22.65%(n=3，SEM=13.08)的細胞表達CD44;6.42%±0.88%(n=2，SEM=0.62)的細胞表達CD200;57.61%土22.10%(n=2，SEM=15.63)的細胞表達CD90;63.76%±4.40%(n=2，SEM=3.11)的細胞表達CD38;20.27%±5.88%(n=2，SEM=4.16)的細胞表達CD105;和54.37%±13.29%(n=2，SEM=9.40)的細胞表達CD13。6.3.2.5絨毛膜來源的細胞絨毛膜來源的細胞是HLA-G、CD117、CDIO、CD44、CD200、CD90、CD38和CD13—致陽性的，而CD33和CD105的表達不同(附圖6)。對于絨毛膜來源的細胞，每種標志物的平均表達如下53.25%±32.87%(n=3,SEM=18.98)的細胞表達HLA畫G;15.44%±11.17%(n=6，SEM=4.56)的細胞表達CD33;70.76%±11.87%(n=3，SEM=6.86)的細胞表達CD117;35.84%±25.96%(n=3，SEM=14.99)的細胞表達CDIO;28.76%±6.09%(n=3，SEM=3.52)的細胞表達CD44;29.20%±9.47%(n=2，SEM=6.70)的細胞表達CD200;54.88%±0.17%(n=2，SEM=0.12)的細胞表達CD90;68.63%±44.37%(n=2，SEM=31.37)的細胞表達CD38;23.81%±33.67%(n=2,SEM-23.81)的細胞表達CD105;和53.16%士62.70%(n=2，SEM=44.34)的細胞表達CD13。6.3.2.6羊膜-絨毛膜盤來源的細胞羊膜-絨毛膜盤來源的細胞是HLA-G、CD33、CD11、CDIO、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105和CD13—致陽性的(附圖7)。對于羊膜-絨毛膜盤來源的細胞，每種標志物的平均表達如下78.52%±13.13%(n=2，SEM=9,29)的細胞表達HLA-G;38.33%±15.74%(n=5，SEM=7.04)的細胞表達CD33;69.56%±26.41%(n=2,SEM二18.67)的細胞表達CD117;42.44%±53.12%(n=2，SEM=37.56)的細胞表達CD10;32.47%±31.78%(n=2，SEM=22.47)的細胞表達CD44;5.56%(n=l)的細胞表達CD200;83.33%(n=l)的細胞表達CD90;83.52%(n=l)的細胞表達CD38;7.25%(n=l)的細胞表達CD105;和81.16%(n=l)的細胞表達CD13。6.3.2.7臍帶來源的細胞膝帶來源的細胞是HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105和CD13—致陽性的，而CD117、CDIO、CD44和CD200的表達不同(附圖8)。對于臍帶來源的細胞，每種標志物的平均表達如下62.50%±53.03%(n=2，SEM=37.50)的細胞表達HLA陽G;25.67%±11.28%(n=5，SEM=5,04)的細胞表達CD33;44.45%±62.85%(n=2，SEM=44.45)的細胞表達CD117;8.33%±11.79%(n=2，SEM=8.33)的細胞表達CDIO;21.43%±30.30%(n=2，SEM=21.43)的細胞表達CD44;0.0%(n=l)的細胞表達CD200;81.25%(n=l)的細胞表達CD90;64.29%(n=l)的細胞表達CD38;6.25%(n=l)的細胞表達CD105;和50.0%(n=l)的細胞表達CD13。附圖9中顯示了對所有標志物平均表達的總結。6.3.2.8BDFACSAria分選報告用7AAD和抗HLAABC、CD45、CD34和CD133的抗體對表達最大百分比HLAABC、CD45、CD34和CD133的三種不同胎盤細胞群(來自灌流液、羊膜和絨毛膜的細胞)進行染色。陽性選擇這三個群體中表達目標表型總^的％0.0377860.0544140.003701將三種不同的陽性選擇的細胞群(分選的)及其相應的未分選的細胞鋪盤，并于第12天評估培養(yǎng)的結果(表3)。分選的灌流液來源的細胞，以40,600/cm2的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。三組未分選的灌流液來源的細胞中的兩組，均以40,600/cm2的密度鋪盤，獲得大部分小、圓、未貼壁的細胞，以及圍繞孔邊緣分布的若干貼壁細胞。未分選的灌流液來源的細胞，以93，800/cm2的密度鋪盤，獲得大部分小、圓、未貼壁的細肐，以及圍繞孔邊緣分布的若干貼壁細胞。分選的羊膜-來源的細胞，以6,300/cm2的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。未分選的羊膜-來源的細胞，以6,300/cm2的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。未分選的羊膜-來源的細胞，以62,500/cm2的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。分選的絨毛膜-來源的細胞，以6,300/cm2的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。未分選的絨毛膜-來源的細胞，以6，300/cm2的密度鋪盤，獲得122的活細胞。BDFACSAria分選的結果如表5所示。表5:細胞來源灌流液羊膜絨毛膜處理事件BDFACSAria分選報告分選事件(目標表型)135540110[51215738593340191084981224016小、圓、未貼壁的細胞。未分選的絨毛膜-來源的細胞，以62,500/cn^的密度鋪盤，獲得小、圓、未貼壁的細胞。在實施上述相關實驗和進一步培養(yǎng)胎盤干細胞之后，確定抗CD117和CD133抗體的標記產(chǎn)生了足以產(chǎn)生陽性讀數(shù)的顯著背景，在所述標記中，抗生物素蛋白鏈菌素偶連的抗體標記了生物素偶連的藻紅蛋白(PE)。起初，該背景導致胎盤干細胞被視為對兩種標志物是陽性的。當使用不同標記物APC或PerCP時，降低了背景，從而正確地確定胎盤干細胞對CD117和CD133都是陰性的。6.4實施例4:胎盤干細胞的分化貼壁的胎盤干細胞分化為若千不同的細胞系。通過物理解離來自胎盤內(nèi)的解剖學位點的組織，包括羊膜、絨毛膜、胎盤絨毛葉或其任意組合，從胎盤分離出貼壁的胎盤干細胞，并通過物理解離臍帶組織獲得臍帶干細胞。在含有低濃度的胎牛血清和有限的生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胎盤干細胞和臍帶干細胞。流式細胞儀分析顯示，胎盤干細胞典型地以270%的百分比呈現(xiàn)出CD200+CD105+CD73+CD34'CD45—表型。發(fā)現(xiàn)胎盤干細胞分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞系。在含有IBMX、胰島素、地塞米松和消炎痛的誘導培養(yǎng)基中，胎盤干細胞在3-5周內(nèi)轉(zhuǎn)變成脂肪超負載的脂肪細胞。在成骨誘導培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)胎盤干細胞形成骨小結，并在其胞外基質(zhì)中有鈣沉積。胎盤干細胞的軟骨分化在撰t丸(micropellet)狀態(tài)下進行，并通過組織積聚中有糖胺聚糖形成加以了驗證。6.5實施例5:利用胎盤干細胞進行免疫調(diào)節(jié)123胎盤干細胞具有免疫調(diào)節(jié)效應，包括抑制T細胞和天然殺傷細胞的增殖。下列實^r證實胎盤干細胞具有在混合淋巴細胞反應測定和回歸測定這兩種測定中調(diào)節(jié)T細胞應答刺激的能力。6.5,1混合淋巴細胞反應測定MLR測量效應子群體對把群體的反應。所述效應子可以是淋巴細胞或純化的亞群，例如CD8+T細胞或NK細胞。耙群體是經(jīng)輻射的同種異體PBMS，或如在本研究中，是成熟的DC。所述應答子群體由異體特異性細胞組成,估計占總丁細胞的20%。經(jīng)改動的胎盤干細胞MLR在反應中使用胎盤干細胞。胎盤干細胞4皮鋪在96孔板的孔中，并加入了效應子群體。在添加靶群體(成熟的DC)前，胎盤干細胞和5(6)-羧基熒光素二醋酸N-琥珀酰酯(CFSE)染色的效應子被預孵育24小時。6天后，收獲上清液和未貼壁的細胞。通過Luminex微珠實驗分析上清液，并通過流式細胞儀分析細胞。通常，CD4+和CD8+T細胞部分在MLR中都產(chǎn)生增殖性應答。當兩個同種異體供體從未相互遭遇之前，該應答是天然的T細胞應答。在標準的MLR中，CD4+和CD8+T細胞都增殖活躍。當在MLR中添加了胎盤干細胞時，測量CFSEL。w應答子細胞的百分比，證實CD4+和CD8+T細胞的增殖都被抑制了。在圖IOA和10B(PMLR道)和圖11中可見向MLR(PMLR)中添加的胎盤干細胞的效應。不論只分別使用CD4、1CD8+T細胞，還是同時使用等量的CD4+T細胞和CD8+T細胞，結果都是相似的。獲自羊膜-絨毛膜或臍帶基質(zhì)的胎盤干細胞抑制MLR的程度相似，并且沒有觀察到對CD4+T細胞和124CD8+T細胞在抑制上的差異。大量T細胞(bulkTcell)反應的結果也是如此利用CD4+T細胞、CD8+T細胞，或CD4+T細胞和CD8+T細胞，以及同種異體的樹突狀細胞(DC)實施另外的MLR。將胎盤干細胞添加到該MLR中，評估T細胞增殖的程度，利用不添加胎盤干細胞的MLR作為對照。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用MiltenyiMACS柱和珠從血沉椋黃層中分離CD4+T細胞、CD8+T纟田月包、以及CD14+單核細胞。從以下培養(yǎng)物中獲得樹突細胞，所述培養(yǎng)物是單核細胞在添加了1%供體血漿、IL-4和GM-CSF的RPMI1640中的6天培養(yǎng)物，以及在添加了IL-1(3、TNF-a和IL-6的RPMI1640中的2天培養(yǎng)物。同種異體T細胞和DC以T:DC=10:1的比例孵育，進行經(jīng)典的6天MLR。在加入MLR檢測前，用CFSE(羧基熒光素二醋酸琥珀酰酯)對T細胞染色來評估T細胞增殖。通過測量子代細胞群中染料的稀釋,利用CFSE評估增殖的程度。對于該測定，胎盤干細胞的添加比例是T:DC:PSC二10:1:2。反應在96孔板中進行，終體積為添加了5%混合人血清(R5)的200^1RPMI1640。6天后，將未貼壁細胞簡單重懸，轉(zhuǎn)移到5mL管中，用RPMI洗滌，并用CD4和CD8抗體染色。在BDFACSCalibur對CD4和CD8組分的增殖進行了評估>#產(chǎn)于勿應如上文實施例1和2所述獲得胎盤干細胞。胎盤干細胞獲自以下胎盤組織羊膜(AM)或羊膜/絨毛膜(AC)。臍帶干細胞獲得自臍帶(UC)。加入成纖維細胞(FB)和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BM)作為對照。潛來當在MLR中添加胎盤干細胞時，抑制了T細胞增殖(圖12)。圖10反映的實驗中使用的胎盤干細胞源自同一個胎盤，命名為61665。對于所有測試的胎盤干細胞，當使用CD4+T細胞和CD8+T細胞中的一種，但不同時使用CD4+T細胞和CD8+T細胞時，對CD4+T細胞的抑制程度大于對CD8+T細胞的抑制(圖12A)。AM胎盤干細胞和UC胎盤干細胞對CD4+T細胞活化的抑制大致與MSC介導的抑制作用相等，約60%-75%的抑制。當同時利用CD4+T細胞和CD8+T細胞進行MLR時，胎盤千細胞對CD4+T細胞的抑制程度遠大于對CD8+T細胞的抑制(圖12B)。特別地，AM胎盤干細胞對CD4+T細胞增殖的抑制接近90%，超過了MSC顯示的抑制作用。兩種組分之間抑制作用的差異對AM胎盤千細胞和AC胎盤干細胞是最顯著的在MLR中，來自不同供體的胎盤干細胞不同程度地抑制T細胞增殖(圖13)。在MLR中，來自編號為65450的另一個胎盤的胎盤干細胞對CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖的抑制不同于來自胎盤61665的胎盤干細胞。令人驚訝的是，來自胎盤65450的ACPSC和UCPSC抑制T細胞增殖80%-95%，超過該測定中MSC的抑制作用。然而，來自胎盤65450的AC胎盤干細胞對T細胞增殖的抑制沒有達到理想的程度(比較圖10A中AM胎盤干細胞的抑制)。胎盤干細胞也抑制天然殺傷(NK)細胞在MLR中的活性。6.5,2回歸測定在回歸測定中，胎盤干細胞顯示抑制了T細胞對表達埃-巴二氏病毒(EB病毒)抗原的B細胞系的應答?；貧w測定是對效應子T細胞機制的喚起測定，其中所述效應子T細胞機制是由在EBV-轉(zhuǎn)化的B細胞的I類和II類MHC上呈遞EBV抗原肽所引起的。該測定通過將T細胞與人為創(chuàng)造的轉(zhuǎn)化B細胞系，來自相同供體的類淋巴母細胞系(LCL)混合來實施。LCL表達九種埃-巴二氏病毒抗原，可以在它們之間S1發(fā)一系列適應性T和B細胞反應，但在經(jīng)典的回歸測定中，只測量T細胞效應子機制?？紤]到LCL表達活化的B細胞標志物CD23,回歸測定提供了方便的方法，測量針對天然存在病原體感染的耙標的細胞毒性。因此，在該測定中，通過計數(shù)CD23表達細胞來測量存活的LCL數(shù)目。經(jīng)典的17天回歸測定所得結果與圖14中第一簇條帶中所觀察的相似。未檢測到CD23+細胞，因為它們都已被CD4+和CD8+T細胞殺死。如其后兩簇條帶所示，添加胎盤千細胞后，CD23+細胞的存活增加了。不希望受理論約束，可以對所觀察到的結果給出兩種解釋。或者T細胞已經(jīng)死亡，留下LCL任意擴增，或者主要是因為胎盤干細胞增加了LCL的壽命，而對T細胞影響較少。在獨立的回歸測定中，自實驗供體獲得了T細胞和樹突細胞。通過將外周血單核細胞(PBMC)與細胞溶解性EBV系B95.8上清液和環(huán)孢菌素A孵育2周，獲得埃-巴二氏病毒轉(zhuǎn)化的B細胞系，LCL。LCL表達9種EBV抗原。將過度生長的LCL系維持在添加了10%胎牛血清的RPMI1640中。通過將CD4+T細胞和CD8+T細胞與自體LCL以TiCL=10:l比例混合，進行回歸測定。在96孔板中，在添加了5%混合人血清(R5)的200^1RPMI1640中進行測定。對于該測定，胎盤干細胞的添加比例是T:LCL:PSC=10:1:2。測定進行6、10或17天。利用CFSE標記的T細胞實施6天回歸測定。來自胎盤65450的胎盤干細胞在回歸測定中抑制T細胞增殖約65°/。至約97%，與PSC在MLR中的結果相對應(圖15)。再一次證實，來自胎盤65450的UC和AC細胞系顯著抑制T細胞增殖，同時65450AMPSC不抑制增殖。在另一個試驗中，證實在MLR和回歸測定中天然殺傷細胞被抑制。當MLR或回歸測定中包含50U/mlIL-2時，NK細胞的抑制效應約為45%(范圍在約40%至約65%，SEM5%)。/^^"f勿應不乂^^f^《在任何情況下，針對來自任何個體或任何胎盤解剖學部分的胎盤干細胞，觀察到的背景T細胞增殖都不超過5%。;T要勿應勿應凝農(nóng)回歸測定中的細胞毒性效應，和MLR中的異體識別，都依賴于靶標和效應細胞之間TCR(T細胞受體)MHC的相互作用。利用跨膜(transwell)測定評估了胎盤干細胞介導的抑制對細胞-細胞接觸的需要。在該測定中，用膜分隔T細胞和胎盤干細胞來實施MLR。如圖16所示，MLR中使用的胎盤干細胞數(shù)量越高，抑制降低越多，暗示特別是在較高密度下，胎盤干細胞(UC)需要與T細胞顯著接觸來抑制T細胞增殖。一個單獨的測定驗-〖正胎盤干細胞對T細胞的免疫抑制至少部分涉及可溶因子。為了確定胎盤干細胞介導的免疫抑制是否依賴于細胞-細胞接觸，進行了跨膜測定，其中，胎盤干細胞被置于插入物中，在該插入物的底部的膜僅允許可溶性因子通過。在孔的底部是MLR或T細胞，與胎盤干細胞分隔。為了確定觀察到的效應是否依賴于胎盤干細胞的相對劑量，以對于T細胞和DC不同的相對密度添加干細胞。當臍帶胎盤干細胞與MLR分隔時，抑制效應被部分消除。當胎盤干細胞的密度與與圖11中所用密度相似時，對CD4+T細胞的MLR抑制消除為75%，對008+T細胞消除為85%(圖17、圖18)。當只使用四分之一劑量的胎盤干細胞時(UCOP25)，抑制效應仍然是66%，當添加12,500UC胎盤干細胞時抑制效應跌至背景水平。利用插入物分離時未觀察到抑制的任何改變(圖17)。在25,000胎盤干細胞時，除了抑制效應仍然顯著，還觀察到對引入的插入物的抑制作用相對下降最小(圖18)。6.6實施例6:胎盤干細胞免疫抑制的接觸依賴不同于骨髓來源的間充質(zhì)干細胞確定免疫調(diào)節(jié)的接觸依賴程度的實驗顯示，臍帶干細胞的免疫調(diào)節(jié)對細胞-細胞接觸的需要與骨髓來源的干細胞明顯不同。特別地，胎盤干細胞更依賴細胞-細胞接觸來產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)，尤其是較高數(shù)量的胎盤或間充質(zhì)干細胞。根據(jù)混合淋巴細胞反應測定(MLR)中貼壁細胞與T細胞的比例，骨髓來源的干細胞(BMSC)和臍帶干細胞(UC)對細胞-細胞接觸的需要不同。在跨膜實驗中，MLR中的胎盤干細胞與T細胞和樹突細胞(DC)是分隔的，兩種類型的貼壁細胞之間抑制作用不同。圖19相鄰地顯示了開放孔和跨膜的結果。當開放孔模式中，當使用約100,000或75,000UC或BMSC時，觀察到了相似的抑制。然而，在跨膜模式中，與BMSC相比，UC抑制MLR的程度較低，表明在較高胎盤干細胞/T細胞比例下，接觸依賴性更高。當胎盤干細胞/T細胞比例較低時，胎盤干細胞抑制性更強。根據(jù)抑制數(shù)據(jù)，計算接觸依賴性程度。圖20顯示UC和BMSCMLR的依賴性。在BM/T細胞比例較高時，骨髓來源的細胞對接觸的依賴比UC低。換言之，對于重要的機制參數(shù)，對細胞-細胞接觸的需要，UC胎盤干細胞和BMSC的行為不同。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是BMSC介導的T細胞抑制必需的。參見Aggarwal&Pittenger，"HumanMesenchymalStemCellsModulateAllogeneicImmuneCellResponses,"Blood105(4):1815-1822(2004)。去除來自健康供體的外周血單核細胞(PBMC)的CD4+CD25+Treg，利用自體的EBV(埃-巴二氏病毒)轉(zhuǎn)化129的細胞實施回歸測定。在一些條件下添加UC。如圖21可見，不論是否存在Treg，在回歸測定中，胎盤干細胞介導的T細胞應答抑制都沒有差別。因此，雖然據(jù)報道T調(diào)節(jié)性T細胞是BMSC介導的T細胞抑制所必需的，但T調(diào)節(jié)性細胞在胎盤干細胞介導免疫抑制中似乎沒有發(fā)揮作用。實施了下述MLR，其中T細胞獲自被胎盤干細胞抑制的MLR，加入新鮮的樹突細胞。用CFSE染色T細胞，CFSE將在增殖過程中均等地分入子細胞中。CFSEHigh細胞是未增殖的T細胞(例如圖21圖表中最左側的峰)。通過在FACSAria上分選染色的T細胞獲得該群體。將這些細胞用于第二次MLR，使用新鮮的樹突細胞。如圖22中可見，未觀察到持續(xù)抑制，因為原來被抑制的細胞對于DC增殖良好。CFSEL°W細胞(即，子細胞)似乎不是抑制的原因，因為這類細胞自身也隨之增殖。CFSEHigh群體由對該DC供體不增殖的非異種特異性細胞以及被胎盤干細胞抑制的T細胞組成。一旦去除胎盤干細胞，#皮抑制的細胞即增殖。當用BMSCMLR的上清液替換約10%的上清液時，BMSC抑制MLR。明顯相反的，當用包含胎盤干細胞的MLR上清液替換上清液時，即使替換了75%的培養(yǎng)基時，也沒有觀察到T細胞增殖的改變(圖23)。在開始MLR前，DC或剩余的T細胞有可能受到與胎盤干細胞孵育時間不同的影響。因此，在開始測定前，通過將胎盤干細胞或BMSC與T細胞(圖24A)或DC(圖24B)孵育不同長度的時間，進行測試。預孵育T細胞和胎盤干細胞不明顯改變抑制性表型(圖20A)。然而，BMSCT細胞抑制依賴于DC/胎盤干細胞預孵育的長度而改變。如圖20B中所示，當在T細胞1天后添加DC，BMSC的抑制是最強的。然而，當DC與T細胞同時添加時，表現(xiàn)出明顯較弱的抑制。將DC與BMSC孵育更久可以逆轉(zhuǎn)該抑制缺失。在預孵育第2天，抑制作用接近在T細胞后1天添加DC的方案(+1天)。胎盤干細胞介導的抑制沒有觀察到類似的趨勢。6.7實施例7:在MLR和回歸測定中胎盤干細胞和臍帶干細胞的細胞因子譜確定了臍帶干細胞(UC)和來自羊膜絨毛膜盤的胎盤干細胞(AC)向MLR培養(yǎng)基中分泌一些細胞因子。在一些測定中，利用細胞因子陣列測量上清液中細胞因子和趨化因子的水平。發(fā)現(xiàn)一些因子被分泌到上清液中，與MLR和回歸測定最相關的是巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-la和MIP-1(3。兩種趨化因子都吸引T細胞，是CD84T細胞在應答人免疫缺陷病毒(HIV)感染時分泌的。在MLR中進行測定時，這些趨化因子的分泌與胎盤干細胞和MSC對MLR的抑制反向相關(圖25)。胎盤干細胞和MSC都不分泌MIP-la和MIP-l(3。在另一項研究中，發(fā)現(xiàn)了MCP-1和IL-6分泌的相關性，兩者都是重要的免疫調(diào)節(jié)因子(圖26和圖27;與圖ll相比)。胎盤干細胞本身不分泌IL-6和MCP-1,而抑制MLR和在回歸測定中抑制T細胞增殖的UC和AC系，都分泌MCP-l和IL-6(圖26和圖27)。雖然，IL-6與促炎性作用最相關(參見例如Kishimoto等人，Annu.Rev.Immunol.23:1-21(2005))，但它還具有其它功能，例如在小鼠的肝損傷過程中的保護作用(參見例如Klein等人，丄Clin.Invest115:860-869(2005))。在獨立的研究中，分析了在MLR或回歸測定中使用的AC的細胞因子分泌。在Luminex系統(tǒng)中測量了來自6天干細胞培養(yǎng)物、干細月包MLR或干細胞回歸測定中的細胞因子。MLR包括干細胞、樹突細胞(DC)和T細胞，比例是2/1/10。埃-巴二氏病毒(EBV)回歸測定包括干細胞、EBV肺瘤細胞(Ts)和T細胞，TS:干細胞:T的比例是2:1:10。發(fā)現(xiàn)在干細胞單培養(yǎng)物、MLR和回歸測定中，IL-6(11ng/ml)和IL-8(16ng/ml)的水平保持恒定。確定在干細胞單培養(yǎng)物和非抑制性對照的貼壁細胞MLR和回歸測定中，MCP-1的濃度是約2ng/ml，但是在抑制的干細胞MLR和干細胞回歸測定中增加到約10ng/ml。上述值落入報道的MCP-1血清水平內(nèi)。白介素-2(IL-2)是T細胞存活因子，也是€04+0025+T調(diào)節(jié)細胞的專性因子。該T細胞子集不是AC干細胞對T細胞抑制所必需的，但是在AC干細胞對MLR抑制的過程中IL-2水平持續(xù)下降。在缺少AC干細胞時，MLR上清液含有約35pg/mlIL-2，而含有AC干細胞的MLR則包含高達440pg/mlIL-2。IL-2的濃度與抑制相關。例如，表現(xiàn)出85%抑制的CD4+T細胞MLR含有330pg/mlIL-2,而使用AC干細胞，表現(xiàn)出85%抑制的CD8+T細胞MLR含有66pg/mlIL-2。這些結果表示，傳統(tǒng)上是免疫應答刺激因子的IL-2和MCP-l,在免疫抑制中也可以發(fā)揮作用。6.8實施例8:生產(chǎn)冷凍保藏的干細胞產(chǎn)物和干細胞庫該實例展示了胎盤干細胞的分離，和制備冷凍的干細胞產(chǎn)品。凝迷將胎盤組織切成小塊并消化，在原代培養(yǎng)和擴增培養(yǎng)后，獲得了擴增的細胞制品，可以制備許多劑細胞。細胞被儲存在兩層的細胞庫中，并被分裝成冷凍的細胞產(chǎn)品。將源自單個供體胎盤的所有細胞制劑定義為一個批次，利用無菌技術在指定房間和Class100層流室中，同時處理一個胎盤批次。將細胞產(chǎn)品限定為CD105+、CD200+、CD10+和CD34-,具有正常的核型，沒有或基本沒有母體細胞內(nèi)容物。6.8.1獲得千細胞逸織席岸和;才化在排出后24小時內(nèi)獲得胎盤。從羊膜、羊膜和絨毛膜的組合，或絨毛膜獲得胎盤組織。將組織絞碎成小塊，大小約lmm。在1mg/ml膠原酶1A中，在37°C下將絞碎的組織消化1小時，然后用胰蛋白酶-EDTA在37°C處理30分鐘。在含5%FBS的PBS中洗滌三次，將組織重懸在培養(yǎng)基中。在另一個實施方案中，在排出后24小時內(nèi)獲得胎盤。在洗凈胎盤后，用止血鉗夾在臍帶遠端。在與胎盤連接的地方切斷臍帶，并移至無菌皿中。在止血鉗之下切斷臍帶后，按摩胎盤去除血凝塊，并轉(zhuǎn)移至含有慶大霉素和兩性霉素B的500mlPBS中。使用5g該臍帶。使用手術刀修剪剩余的胎盤材料,從臍帶附著點切割約3英寸的半徑，從剩余材料中排出血凝塊，將以臍帶根部為中心的5g的羊膜-絨毛膜轉(zhuǎn)移至放置臍帶的同一容器中。將臍帶和羊膜-絨毛膜組織切片，然后絞碎成大小約lmm3的小片。然后用lmg/ml膠原酶IA(20ml/g組織)中，在37。C下消化組織1小時，然后再用胰蛋白酶-EDTA(20ml/g組織)在37t處理30分鐘。在含5%FBS的PBS中洗滌三次后，將組織重懸在培養(yǎng)基(20ml/g組織)中，并以約0.22ml/cn^轉(zhuǎn)移至T瓶中。f^t'潛^:原代培養(yǎng)的目的是從消化的胎盤組織中建立細胞。將消化的組織懸浮在培養(yǎng)基中，置于ComingT并瓦中，在濕潤的腔室內(nèi)在37°C5%C02下孵育。在培養(yǎng)5天后補充一般的培養(yǎng)基。培養(yǎng)2周形成了高密度細胞克隆。用胰蛋白酶-EDTA收獲克隆，然后用含2%FBS的PBS終止。離心細胞，133重懸在培養(yǎng)基中用于接種擴增培養(yǎng)物。這些細胞定義為第0代，已倍增過0次。從原代培養(yǎng)物中，或從擴增培養(yǎng)物中收獲細胞，或從細胞庫中解凍細胞，用于接種擴增培養(yǎng)。用含5。/oC02的空氣，以50ml/分/托盤的速度通過無菌濾器來處理CellFactories(NUNC)10分鐘，并在維持在37t、5。/。C02的濕潤孵育箱中加溫。用臺盼藍在血球計數(shù)器上計數(shù)種子細胞，記錄細胞數(shù)、活力、傳代數(shù)和累計倍增數(shù)。細胞以約2.3x10S田胞/ml懸浮在培養(yǎng)基中，和110ml/托盤接種在CellFactories中。在3-4天后以及培養(yǎng)的5-6天，去除培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基換液，再用含5%C02的空氣處理一次。當細胞達到約105細胞/cm2時，用胰蛋白酶-EDTA收獲克隆，然后用含2%FBS的PBS終止。然后，離心細胞并重懸在培養(yǎng)基中。冷<^^#:用于冷凍的細胞是用胰蛋白酶-EDTA從培養(yǎng)物中收獲的(例如0.44ml/cm2、5分鐘)，用含2%FBS的PBS終止并在血球計數(shù)器上計數(shù)。離心后(例如300xg)，用含10%DMSO的FBS重懸細胞至濃度為約1百萬細胞/ml，用于構建細胞庫，和重懸細胞至濃度為1千萬細胞/ml，用于單個的冷凍細胞制劑。在另一個實施方案中，細胞在10%HAS、10%DMSO的Plasmalyte中稀釋至約2百萬細胞/ml。將細胞溶液轉(zhuǎn)移至冷凍容器中，置于-80。C冰箱的異丙醇浴中。第二天，細胞轉(zhuǎn)移至液氮中。6.8.2設計千細胞庫"批次"定義為源自單個供體胎盤的所有細胞制劑。在擴增培養(yǎng)過程中，細胞在超過8次傳代和30次倍增的情況下，維持正常的生長、核型和細胞表面標志物表型。考慮到該限制，制劑包含來自5代和約20次倍增的細胞。為了供應等價細胞，在培養(yǎng)中擴增一個批次，并以冷凍制劑儲存在兩層的細胞庫中。特別地，從原代培養(yǎng)收獲的細胞定義為第0代細胞，經(jīng)過0次倍增，用于起始擴增培養(yǎng)。在第一次傳代后，發(fā)生了約4次倍增，而細胞冷凍在主細胞庫(MCB)中。使用來自MCB的小瓶接種其它擴增培養(yǎng)。將解凍自MCB的細胞再傳代2代后，將細胞冷凍至工作細胞庫(WCB)中，約12次累計倍增。使用來自WCB的小瓶接種擴增培養(yǎng)，再傳代2次，獲得第5代細胞，約20次倍增，冷凍成單個制劑。6.8.3解凍細胞用于培養(yǎng)將細胞的冷凍容器置于密封的塑料袋中，浸泡在37t水浴中。輕柔的轉(zhuǎn)動容器，直到內(nèi)容物融化至只有小塊冰時。從密封塑料袋中取出容器，將10x體積的培養(yǎng)基緩慢加入到細胞中，輕柔混合。在血球計數(shù)器上計數(shù)樣品，接種至擴增培養(yǎng)中。6.8.4解凍細胞用于注射將細胞的冷凍容器轉(zhuǎn)移至液氮托中的施用位點，將容器置于密封的塑料袋中，浸泡在37。C水浴中。輕柔轉(zhuǎn)動容器，直到內(nèi)容物融化至只有小塊冰時。從密封塑料袋中取出容器，并加入等體積的2.5%HAS/5。/。葡聚糖。注射細胞不需要進一步洗滌。6.8.5測試和j兌明所有的供體胎盤都附有母體血樣。篩選樣品的乙肝核心抗體和表面抗原、丙肝病毒抗體和核酸、以及fflVI和II抗體和核酸。在收到測試結果前開始處理胎盤和原代培養(yǎng)，但只繼續(xù)處理所有病毒母體血樣測試陰性的相關胎盤。如果供體對任何病原體測試陽性，則拋棄相應批次。此外，對MCB、WCB和來自WCB的小瓶的細胞制劑材料樣品，實施表6中描述的測試。只有當滿足所有說明時，才釋放相應批次。表6:細胞測試和-說明測試無菌性內(nèi)毒素活力支原體同一性方法!要求的結果BDBACTECPEDSPLUS/F陰性和BACTECMyco/FLyticLAL凝膠塊《EU/ml*臺盼藍；>70%存活直接培養(yǎng)、DNA熒光染料(FDAPTC1993)流式細胞儀(見下文)陰性CD105+、CD200+CD10+、CD34-未檢測到污染細胞正常細胞純度；微衛(wèi)星核型對分裂中期細胞的G顯帶和染色體計數(shù)*對于設計為40ml冷凍細胞/劑以及最大5EU/ml的產(chǎn)品，當受者的體重超過40kg時，細胞產(chǎn)品在5EU/kg/劑的上限以下。6.8.6表面標志物的表型分析將細胞置于含1%多聚甲醛(PFA)的PBS中20分鐘，在染色前(共1周)儲存在冰箱中。用含2。/。FBS、0.05。/。疊氮化物的PBS(染色緩沖液)洗滌細胞，然后重懸在染色緩沖液中。用下列抗體偶聯(lián)物對細胞染色CD105-FITC、CD200-PE、CD34-PECy7、CD10-APC。還用同種型對照染色細胞。在孵育30分鐘后，洗滌細胞并用染色緩沖液重懸，再用流式細胞儀分析。與同種型對照相比，熒光增加的細胞作為標志物陽性來計數(shù)。6.9利用胎盤干細胞或臍帶干細胞治療免疫相關疾病這個實施例摘_供了免疫相關疾病或病狀的治療方案實例。6.9.1治療克隆氏病患有回腸結腸炎的個體，形式為克隆氏病，經(jīng)歷腹痛、血樣腹瀉和發(fā)熱。向該個體靜脈內(nèi)施用含1-5x1()S個CD10+CD34'CD105+CD200+胎盤干細胞和/或臍帶干細胞的0.9%NaCl溶液。在隨后兩周監(jiān)控該個體，評估一種或多種癥狀的降低。在下一年中監(jiān)控個體，如需要，施用相同劑量的胎盤干細胞6.9.2治療移植物抗宿主病向等待同種異體骨髓移植的個體，在骨髓移植前24小時靜脈內(nèi)施用含5-10x1()8個CD10+CD34X:D105+CD200+胎盤干細胞和/或臍帶干細胞的0.9%NaCl溶液。在骨髓移植后24小時內(nèi)，重復施用所述干細胞。在之后的100天內(nèi)監(jiān)控該個體，施用后續(xù)劑量5-10x1()S個CD10+CD34-CD105+CD200+胎盤干細胞和/或臍帶干細胞，所述個體GVHD發(fā)展和進展超過I級。6.9.3治療類風濕關節(jié)炎個體在一個或多個關節(jié)存在類風濕關節(jié)炎。向該個體施用胎盤或臍帶干細胞的組合，修飾胎盤干細胞生成包含IL-lRa和DHFR的融合多肽，其中兩種類型的干細胞施用比例是1:1。工程改造的和非工程改造的細胞是0.9%NaCl溶液中的l-5x1()8個CD10+CD3《CD105+CD200+胎盤干細胞和/或臍帶干細胞。給予該個體標準劑量的甲氨蝶呤，并監(jiān)控關節(jié)炎癥的減輕。等同物本文公開的組合物和方法不受本文描述的具體實施方案的限制。實際上，除所描述的以外，根據(jù)上述說明書和其后附圖，所述組合物和方法的不同改變形式對本領域技術人員都是顯而易見的。此類改變形式意在落入所附權利要求范圍內(nèi)。本文中引用了不同的出版物、專利和專利公開文本，其公開內(nèi)容通過引用^皮全文納入到本文中。權利要求1、治療患有或有風險發(fā)展成疾病、障礙或病狀的個體的方法，所述疾病、障礙或病狀是與不合適或不希望的免疫反應相關或由其導致的，所述方法包括向個體施用治療有效量的胎盤干細胞或被胎盤干細胞條件化的培養(yǎng)基，其中所述治療有效量是足以可檢測地改善所述疾病、障礙或病狀的一種或多種癥狀的量。2、權利要求1的方法，其中所述胎盤干細胞是CD10+、CD3《、CD105+、CD200+的胎盤干細胞。3、權利要求l的方法，其中所述胎盤干細胞表達CD200和HLA-G，或者表達CD73、CD105和CD200，或者表達CD200和OCT-4，或者表達CD73、CD105和HLA-G，或者表達CD73和CD105，并且當含有所述胎盤干細胞的干細胞群在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述胎盤干細胞利于在所述胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體，或者所述胎盤干細胞表達OCT-4并且當含有所述胎盤干細胞的干細胞群在允許胚狀體形成的條件下培養(yǎng)時，所述胎盤干細胞利于在所述胎盤細胞群中形成一個或多個胚狀體。4、權利要求2的方法，其中所述疾病、障礙和/或病狀是》更皮病。5、權利要求4的方法，其中硬皮病是彌漫性硬皮病。6、權利要求4的方法，其中硬皮病是局限性硬皮病(CREST綜合征)。7、權利要求4的方法，其中硬皮病是斑狀/線狀硬皮病。8、權利要求4的方法，其中所述癥狀是以下癥狀中的一種或多種面部皮膚的硬化、手指皮膚的硬化、雷諾綜合癥、不合適的肢體血管收縮、鈣化、毛細管擴張、食道運動障礙、或血中出現(xiàn)抗著絲?？贵w或抗scl70/抗拓樸異構酶抗體。9、權利要求4的方法，包括向所述個體施用第二治療劑。10、權利要求9的方法，其中所述第二治療劑是抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑、免疫抑制化合物或血管擴張劑。11、權利要求2的方法，其中所述疾病、障礙和/或病狀是蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)。12、權利要求ll的方法，其中所述蕈樣真菌病處于斑塊期。13、權利要求ll的方法，其中所述蕈樣真菌病處于皮膚肺瘤期。14、權利要求ll的方法，其中所述蕈樣真菌病處于皮膚發(fā)紅階段(紅皮病)。15、權利要求ll的方法，其中所述蕈樣真菌病處于淋巴結階段。16、權利要求ll的方法，其中所述癥狀是以下癥狀中的一種或多種出現(xiàn)瘙癢的扁平紅斑；出現(xiàn)隆起且硬的扁平紅斑(斑塊)；出現(xiàn)隆起的腫塊(結節(jié))；在全身出現(xiàn)大的紅色、瘙癢、鱗片區(qū)；手掌和腳掌裂開；手掌和腳掌皮膚增厚；開裂；或淋巴結炎癥。17、權利要求ll的方法，包括向所述個體施用第二治療劑。18、權利要求9的方法，其中所述第二治療劑是抗炎藥、免疫抑制化合物、暴露于陽光、暴露于紫外線、外用類固醇、局部表面放療、全皮膚電子束輻照、向被紅皮病感染的皮膚施用有機蜂蜜、干擾素、維甲酸、rexinoid或vorinostat。全文摘要本發(fā)明提供了利用胎盤干細胞或臍帶干細胞治療患有免疫相關疾病、障礙或病狀的個體的方法，例如炎性腸病、移植物抗宿主疾病、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、紅斑狼瘡、糖尿病、蕈樣真菌病(阿-巴二氏綜合癥)或硬皮病。文檔編號A61K35/44GK101657206SQ200880011754公開日2010年2月24日申請日期2008年2月12日優(yōu)先權日2007年2月12日發(fā)明者倩葉,王佳倫,羅伯特·J·哈黎里,詹姆士·W·愛丁格,赫伯特·費萊克申請人:人類起源公司