專利名稱：人造多纖維素酶體及其用于酶分解彈性底物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于酶分解彈性底物(resilient substrates)的人造多纖維素酶體(cellulosome)。特別是，本發(fā)明提供了一種復(fù)合物，其包含具有至少四個能夠結(jié)合酶成分的結(jié)合位點的主鏈支架(backbone scaffold),其中，所述結(jié)合位點中的至少兩個具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性；和與所述至少四個結(jié)合位點隨機結(jié)合的至少三種不同的酶成分。另外，本發(fā)明涉及一種用于制備所述復(fù)合物的方法。此外，本發(fā)明涉及所述復(fù)合物以及所述不同酶成分用于酶分解如纖維素的彈性底物的用途。
背景技術(shù)：
對于生物技術(shù)而言，纖維素是一種豐富的可再生能源，生產(chǎn)生物燃料和化工用構(gòu) 造塊。隨著即將來臨的第二代白色生物技術(shù)的到來，來自木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的纖維素將成為用于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的最大糖源。目前，用于工業(yè)發(fā)酵的葡萄糖主要由淀粉產(chǎn)生。在糖生產(chǎn)中使用纖維素將使農(nóng)產(chǎn)品的每公頃產(chǎn)量至少加倍。另外，耕地面積可能會增加，這是因為將會種植大量能源植物，包括那些在惡劣的氣候條件下以及在干燥、潮濕、寒冷或富鹽環(huán)境中在普通土壤中生長的植物。然而，纖維素是一種難生物降解材料，同時耐酶降解和化學(xué)物理降解。纖維素由沒有分枝的線性分子的長纖維組成。從化學(xué)角度上講，它是形成Ia和Ιβ1型正方晶的高度均質(zhì)的β_1，4-葡聚糖。然而，晶體結(jié)構(gòu)不是完美的-它們或多或少地被非晶質(zhì)區(qū)有規(guī)則地中斷。因此，纖維素的結(jié)構(gòu)特征眾多，并且需要各種方式分解的酶。當(dāng)今的用于酶水解纖維素的技術(shù)必須使用大量的用于降解纖維素物質(zhì)的酶，通常為真菌來源的酶。這些酶通常不能被重復(fù)利用。由于下述多個原因，水解相當(dāng)不充分物質(zhì)的不均一性，與半纖維素、膠質(zhì)和木質(zhì)素的復(fù)合，纖維素的結(jié)晶性，因細(xì)胞壁和晶體中的緊密包裝而缺乏酶可達性，等等。這就增加了降解所需要的不同酶活性的數(shù)目以及降低了反應(yīng)速度而由此降低了該過程的效率。通過升高反應(yīng)溫度，可以提高反應(yīng)速度，但是以酶穩(wěn)定性為代價。這對于纖維素酶酶家族(其屬于必須對付晶體，即不溶性底物的本質(zhì)上緩慢反應(yīng)的酶)來說是特別復(fù)雜的。纖維素酶對纖維素作用的多樣性解釋了纖維素酶復(fù)合物中包含的不同酶的多重性纖維素纖維的結(jié)構(gòu)不均一性(結(jié)晶或非結(jié)晶，邊或面等)，晶體類型(Ια或Ιβ),行為方式(進行性(processive)外-葡聚糖酶或纖維二糖水解酶、進行性或非進行性內(nèi)-葡聚糖酶、葡萄糖苷酶)。盡管這些酶都切割相同的β_1，4-糖苷鍵，但是，它們必須協(xié)同作用以有效地降解結(jié)晶底物，。通常用于白色生物技術(shù)的商購纖維素酶包含真菌來源的可溶性酶的混合物。其中，最成功的生產(chǎn)者是長枝木霉(Trichoderma Iongibrachiatum)、里氏木霉(T. reesei ( = Hypocrea jecorina))、綠色木霉(T. viride (=哈茨木霉(T. harzianum)或Hypocrea atroviridis))、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium) > Chrysosporium Iucknowense 和微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。一些纖維素酶混合物由如長枝木霉(T.1ongibrachiatum)和黑曲霉(A. niger)或者如長枝木霉(T. longibrachiatum)和里氏木霉(T. reesei)的兩種微生物制備。這些真菌在其培養(yǎng)液中生產(chǎn)大量胞外蛋白質(zhì)，部分是在通過篩選以及通過遺傳工程進行深入的菌株開發(fā)之后。纖維素酶包括內(nèi)-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(外-葡聚糖酶)和葡萄糖苷酶，在一些菌株中還包括許多半纖維素酶。對于這項新技術(shù)，預(yù)計對用于水解可持續(xù)生產(chǎn)的可再生糖源(如木質(zhì)纖維素物質(zhì))的酶制品的需求急劇增加。纖維素酶利用的其它部門主要是食品、紡織品、洗滌劑、造紙工業(yè)以及動物飼料添加劑。雖然纖維素酶已經(jīng)具有龐大市場，但是對于在生物燃料和大批化學(xué)生物技術(shù)部門中新出現(xiàn)的和潛在的生物質(zhì)降解這一大的多的市場來說，未來應(yīng)用領(lǐng)域通常預(yù)計被纖維素酶生產(chǎn)所支配。然而，纖維素晶體的不同結(jié)構(gòu)特性及它們的不溶性性質(zhì)要求同時存在幾種不同活動，如進行性和非進行性纖維素酶。如果單獨存在，則單一活動具有較低的活性；只有在組 合的情況下，酶才顯示出高活性。混合物中單一酶和多種酶的不同被稱為協(xié)同作用，其中，混合物的活性要比單個活動的總和高。然而，這種協(xié)同是通過未復(fù)合(即，通過吸附聚集在一起)的單個酶的可溶性混合物中的真菌酶施行的，或者在可溶性單個酶之間的多肽協(xié)同排除了在底物的一個位點上至少兩個同時工作的活動的存在。在可溶性系統(tǒng)中，在混合物中的酶具有高濃度的情況下這是唯一的可能。真菌纖維素酶的局限性的例子是酶水解所需的相對高濃度、有限的熱穩(wěn)定性以及極易失敗的結(jié)合率。為了更高的性能，這些局限性必須被克服。商購的纖維素酶被真菌酶支配。然而，細(xì)菌酶系統(tǒng)也已被深入研究。Thermomonospora bispora的可溶性酶或其它嗜熱需氧細(xì)菌的可溶性酶已被討論作為真菌纖維素酶混合物的添加劑。一些厭氧細(xì)菌已被描述哪種細(xì)胞外酶系統(tǒng)對纖維素具有更高的比活和加工能力。后者大部分產(chǎn)生大的細(xì)胞外酶復(fù)合物，該復(fù)合物在主鏈支架(所謂的支架蛋白(scaffoldin)或Cip (多纖維素酶體整合蛋白))上結(jié)合單個酶。這些復(fù)合物通過物種特異的強蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合在一起。這些復(fù)合物被稱為多纖維素酶體。已知的是，只有相對很少的細(xì)菌產(chǎn)生多纖維素酶體。迄今，它們的名單包括在硬壁菌門中:毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)-溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、生黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(R. albus)；梭菌科(Clostridiaceae)-食纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)、產(chǎn)纖維二糖梭菌(C. cellobioparum)、溶紙梭菌(C. papyrosolvens)、約氏梭菌(C.josui)、解纖維素梭菌(C. Cellulolyticum)、熱解纖維梭菌(C. thermocellum)、C7 梭菌(C. sp. C7)、P-1擬桿菌(Bacteroides sp. P-1)、溶纖維素擬桿菌(B. cellulosovens)、解纖維醋弧菌(Acetivibrio Cellulolyticus)；在放線菌門中:擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)-揭色喜熱裂抱菌(Thermobifidafusca)、揭色高溫單抱菌(Thermonospora fusca)；在絲狀桿菌門中纖維桿菌科(Fibrobacteriaceae)-產(chǎn)玻拍酸絲狀桿菌長亞種(Fibrobactersuccinogenes)。
使用嚴(yán)格厭氧嗜熱細(xì)菌熱解纖維梭菌(Clostridium thermocellum)(其是一種在難生物降解底物結(jié)晶纖維素上具有最快生長速率的微生物)能夠?qū)崿F(xiàn)多纖維素酶體效率分析的一些改進，這是因為其具有最有效的酶促纖維素降解系統(tǒng)之一 3。在不受任何理論限制的情況下，積累了一些證據(jù)這種相對于其它纖維素分解系統(tǒng)較高的效率是由于巨大的酶復(fù)合物的形成，但這種酶復(fù)合物不能以工業(yè)數(shù)量生產(chǎn)。該復(fù)合物的直徑為 18nm并且其分子量超過2xl06Da4。針對酶的活性克隆已通過篩選熱解纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)的基因組文庫而或多或少地意外克隆了大約30種包含瑪因子(dockerin)的多纖維素酶體相關(guān)基因5’6。另外，已經(jīng)識別了支架蛋白CipA，支架蛋白CipA包含9個I型黏附因子組件(cohesin module)，依靠其I型塢因子組件7，酶和其它蛋白質(zhì)成分特異性地被引入塢。II型黏附因子-塢因子(cohesin-dockerin)相互作用使CipA蛋白錨定到細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白質(zhì)OlpB或SdbA，也可能到其它地方8’9。非酶的成分CspP被推測參與巨大的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)形成 ' 然而，關(guān)于復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及其如何裝配知之甚少。從其它細(xì)菌研究出的多纖維素酶體也包含支架蛋白，常常具有不同的架構(gòu)。在熱解纖維梭菌ATCC2740512的基因組序列11中識別了 72個多纖維素酶體基因。通過所分離的多纖維素酶體的蛋白質(zhì)組分析以及通過mRNA分析識別了最普遍的多纖維素 酶體成分。然而，這決不意味著哪些成分是纖維素分解所必需的以及復(fù)合物形成能夠起到什么作用是清楚的。迄今，只有通過構(gòu)建與兩種重組產(chǎn)生的酶成分結(jié)合的迷你支架蛋白的小型三級復(fù)合物而局部重建多纖維素酶體是可行的，并且顯示了明顯的協(xié)同效應(yīng)14。另一個研究團隊分離的突變體，稱作AD2，并不吸附到纖維素上，但是并沒有表征其分子機制、纖維素降解能力和多纖維素酶體形成15“6。從熱解纖維梭菌的誘變處理培養(yǎng)物中分離出了非多纖維素酶體形成(non-cellucosome-forming)突變體,其不吸附到結(jié)晶纖維素上17。其它團隊用例如用于相同數(shù)目的不同酶成分的靶向等摩爾結(jié)合的三種不同黏附因子組件構(gòu)建了主鏈支架(例如在W0=2010057064中)。使用構(gòu)建的“酵母聚生體(yeastconsortium) ”在酵母細(xì)胞表面上裝配了復(fù)合多纖維素酶體結(jié)構(gòu)。和本發(fā)明的復(fù)合物相反，預(yù)期只能發(fā)生非統(tǒng)計性的(有序的)結(jié)合，并且不能調(diào)節(jié)成分比例，而本發(fā)明是可以的。在W0=2010012805中，使用碳水化合物結(jié)合組件和來自多纖維素酶體支架蛋白的X-組件來在重組體宿主中更好地生產(chǎn)和分泌蛋白質(zhì)。在這種情況下，將纖維素酶基因遺傳上地融合到多肽鏈上，其中，使用CBM和X組件作為“輔助”組件用于表達，而目的不是用于最優(yōu)化纖維素分解。在US20090035811中，由酵母細(xì)胞在體內(nèi)生產(chǎn)包含黏附因子的蛋白質(zhì)和酶促纖維素酶并且將其保持連接到細(xì)胞表面上。這會導(dǎo)致在相對較大細(xì)胞表面上負(fù)載過多的酶復(fù)合物。其中沒有顯示如何控制酶成分的組成及其比例。所述生產(chǎn)多纖維素酶體的微生物(酵母)不能容易地用于適于另一種底物的組成。和本發(fā)明的非細(xì)胞結(jié)合的系統(tǒng)相反，現(xiàn)有技術(shù)中所述的酵母-細(xì)胞結(jié)合多纖維素酶體的缺點是取決于所要工程改造的微生物而與一種特異性產(chǎn)品結(jié)合。效率不能通過改變成分比例而優(yōu)化。此外，天然多纖維素酶體，如酵母-細(xì)胞結(jié)合的多纖維素酶體，不能以工業(yè)規(guī)模進行生產(chǎn)。全部三種方法均不能致使纖維素酶活性高于天然多纖維素酶體，這可能是由于不能適應(yīng)底物需要的欠佳復(fù)合物組成。體外裝配多纖維素酶體及其單個成分將仍然是在纖維素分解和纖維降解中研究單個基因的作用所必需的。但是，迄今為止，這些嘗試都失敗了，這是因為在其天然狀態(tài)下分開所述成分具有不能克服的困難-所述復(fù)合物中的緊密結(jié)合使得使用溫和的非變性方法不能容易地分開。不溶性結(jié)晶物質(zhì)(如結(jié)晶纖維素和非均質(zhì)的半纖維素)的酶分解依然是低效和緩慢的，并且需要高的酶濃度，這使得使用當(dāng)今的酶制品的工業(yè)開發(fā)昂貴且相對低效。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的酶制品，其能夠更加高度有效地對彈性底物(如結(jié)晶纖維素和非均質(zhì)的半纖維素)進行酶分解。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的酶制品以及經(jīng)濟有效的體外方法和這些酶制品的用途，所述酶制品克服了現(xiàn)有技術(shù)中的酶混合物的缺點，特別是，酶分解需要較低的酶濃度，增強了酶制品的熱穩(wěn)定性，并且提高了酶的結(jié)合率。發(fā)明概沭根據(jù)本發(fā)明，通過在下文中更加詳細(xì)說明的本發(fā)明復(fù)合物可以實現(xiàn)活性的強勁增強。在此證明了這種酶系統(tǒng)活性的增強是造成連鎖催化事件或在彈性底物(包括但不限于結(jié)晶纖維素和非均質(zhì)的半纖維素)上協(xié)同作用的原因。令人驚訝地，本發(fā)明人能夠顯示，與從細(xì)菌中分離的天然多纖維素酶體相比，本發(fā)明的復(fù)合物，在體外重建時，顯示出更高的對結(jié)晶纖維素的活性。本發(fā)明人分離了一種熱解纖維梭菌的突變體，所述熱解纖維梭菌不形成復(fù)合物而是分泌天然的非復(fù)合形式的多纖維素酶體成分。這些蛋白質(zhì)最初用于重建具有增強活性的人造多纖維素酶體。使用這種突變體，通過復(fù)合物的體外重建，現(xiàn)在可以首次研究協(xié)同作用的作用。因此，本發(fā)明提供了一種顆粒結(jié)合的或無顆粒的復(fù)合物，其包含(a)主鏈支架，所述主鏈支架包含至少四個結(jié)合位點，其中，所述結(jié)合位點中的至少兩個具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性；和(b)與所述四個結(jié)合位點的每一個體外結(jié)合的酶成分，其中，所述酶成分中的至少三種是不同的酶成分。所述復(fù)合物包含的在主鏈支架(a)中的黏附因子組件與含有塢因子的酶成分(b)的總和的摩爾比為1:1。所述至少三種酶成分(b)優(yōu)選彼此在主鏈支架上以1:1至1:50、1:1. 5至1:30、優(yōu)選1:1. 8至1:15的摩爾比存在于所述復(fù)合物中。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述復(fù)合物是無顆粒的或分離的復(fù)合物；其不與活細(xì)胞結(jié)合，特別優(yōu)選的是不與酵母細(xì)胞結(jié)合。優(yōu)選地，所述酶成分在體外隨機地結(jié)合到所述至少四個結(jié)合位點上。本文所用術(shù)語“體外”指的是從活細(xì)胞或有機體中分離出來。本文所用術(shù)語“復(fù)合物”或“酶復(fù)合物”指的是通過化學(xué)或生物相互作用連接的多種成分的配位體或聯(lián)合體。如在下文中將更加詳細(xì)說明的，所述復(fù)合物可以連接在一起形成更高級的有序復(fù)合物(本文中同義使用“人造多纖維素酶體”或“纖維素酶復(fù)合物”)，其由一種或多種包含黏附因子的主鏈支架(優(yōu)選包含黏附因子的支架蛋白(本文中又稱為“迷你支架蛋白(min1-scaffoldin)”))和一種或多種包含塢因子的酶或非酶成分組成?；蛘?，所述人造多纖維素酶體由一種或多種包含塢因子的主鏈支架(優(yōu)選包含塢因子的支架蛋白(本文中又稱為“迷你支架蛋白”))和一種或多種包含黏附因子的酶或非酶成分組成。相反，本文所用術(shù)語“酶混合物”涉及工業(yè)生產(chǎn)的可溶性酶。本文所用術(shù)語“顆粒結(jié)合的”復(fù)合物指的是本發(fā)明的復(fù)合物與用作載體物質(zhì)的顆粒結(jié)合。例如，合適的顆粒有納米顆粒。在該項技術(shù)中使用的納米顆粒小于2000nm,優(yōu)選平均直徑小于lOOnm。它們可以由有機或無機材料(如硅、金屬氧化物、金、聚苯乙烯和其它有機聚合物)，以及其它非生命材料組成，或由不同材料的雜化物(如核殼納米顆粒)組成。優(yōu)選地，使用表現(xiàn)出超順磁性的鐵磁性納米顆粒。更優(yōu)選地，它們的核用聚合物殼(如聚苯乙烯)包覆，并且對顆粒表面進行化學(xué)修飾以允許進行生物分子的化學(xué)偶聯(lián)。優(yōu)選地，所述修飾是游離羧基(COOH)或游離氨基(NH2),用于與交聯(lián)劑進行偶聯(lián)反應(yīng)以偶聯(lián)蛋白質(zhì)或化學(xué)主鏈分子。
或者，所述納米顆粒表面，優(yōu)選用胺官能團或羧基官能團修飾，可如本領(lǐng)域中所述分別通過戊二醛(胺修飾)或EDC/Sulfo-NHS (羧基修飾)優(yōu)選被共價交聯(lián)到異雙官能團分子(如基于聚乙二醇的接頭)上并最終被共價交聯(lián)到到次氨基三乙酸(NTA)上。通過使用本領(lǐng)域中所述的鎳親和技術(shù)，將迷你支架蛋白主鏈分子經(jīng)由其蛋白質(zhì)末端(優(yōu)選6xHis標(biāo)記的)上的多組氨酸融合連接到NTA殘基上。如在復(fù)合物的重建中所述的，將所述用主鏈支架包覆的納米顆粒與酶混合。本文中所用術(shù)語“無顆粒的”指的是本發(fā)明的復(fù)合物分別是非細(xì)胞結(jié)合的或者是分離的。本文中所用術(shù)語“主鏈支架”涉及用作復(fù)合物的主鏈的支撐體，其提供合適的用于酶或非酶蛋白質(zhì)成分的結(jié)合位點。所述主鏈可為具有多個結(jié)合位點的主鏈蛋白質(zhì)、支架主鏈(scaffolding backbone)或聚合物有機分子。所述支架主鏈可由一種或多種迷你支架蛋白組成。在提到用于酶成分的結(jié)合位點時使用的術(shù)語“具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性”指的是在黏附因子組件和塢因子組件之間的結(jié)合特異性，由此只有完全相同結(jié)合特異性的黏附因子-塢因子對彼此結(jié)合。例如，可以通過使一對蛋白質(zhì)混合并在非變性凝膠電泳中評估運動行為(running behaviour)來對其進行測試。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及本文中限定的復(fù)合物，其中，主鏈支架是線性的。所述線性主鏈支架可為合成來源的或生物來源的。合成的主鏈支架可為，例如，具有能夠結(jié)合蛋白質(zhì)的官能團的合成聚合物載體或線性有機聚合物。所述蛋白質(zhì)可為將要在復(fù)合物中包含的酶，或者含有參與黏附因子-塢因子相互作用的一種或多種組件(其結(jié)合酶成分)的蛋白質(zhì)。生物主鏈支架可為具有用于天然或者通過對所述酶成分或結(jié)合組件進行遺傳工程而融合的塢因子的天然產(chǎn)生結(jié)合位點(黏附因子)的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的又一個實施方式中，通過黏附因子-塢因子相互作用使酶成分與線性主鏈支架結(jié)合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物的主鏈支架具有至少四個用于塢因子的黏附因子結(jié)合位點。優(yōu)選地，本發(fā)明復(fù)合物的主鏈由一種或多種蛋白質(zhì)組成，其中，所述一種或多種蛋白質(zhì)是通過化學(xué)相互作用或者通過結(jié)合特異性與在主鏈酶相互作用中的結(jié)合特異性不同的黏附因子-塢因子相互作用連接在一起的主鏈蛋白質(zhì)，由此所述連接相互作用的結(jié)合特異性與酶的結(jié)合特異性不同。更優(yōu)選地，所述一種或多種蛋白質(zhì)通過結(jié)合特異性與結(jié)合酶成分的黏附因子-塢因子相互作用的結(jié)合特異性不同的黏附因子-塢因子相互作用而被連接。本文中所用術(shù)語“黏附因子-塢因子相互作用”指的是在黏附因子和塢因子之間的相互作用。塢因子是在多纖維素酶體的成分中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)組件，優(yōu)選為在多纖維素酶體的各酶成分中的一種。塢因子的結(jié)合搭檔是黏附因子組件，黏附因子組件通常是多纖維素酶體中的主鏈支架蛋白質(zhì)的重復(fù)組件部分。這種相互作用對多纖維素酶體復(fù)合物的構(gòu)造是必需的。對于不同酶成分與復(fù)合物的結(jié)合，本發(fā)明的復(fù)合物中使用相同的黏附因子-塢因子系統(tǒng)。本發(fā)明的一種或多種主鏈支架蛋白質(zhì)可以通過黏附因子-塢因子相互作用而被連接；由此，與用于結(jié)合酶成分的黏附因子-塢因子對相比，該黏附因子-塢因子對具有不同的結(jié)合特異性。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，除了別的方法以外，所述成分與多糖的結(jié)合可以通過在非變性凝膠電泳中蛋白質(zhì)帶的阻滯或者通過在將液體部分與含有纖維 素顆粒的固體部分分開之后使用蛋白質(zhì)濃度測定用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量蛋白質(zhì)的數(shù)量來確定。在還一個實施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物的主鏈支架得自來自形成分解纖維素的多纖維素酶體的微生物的非催化支架蛋白或其遺傳修飾衍生物。在本文中提到的所述“形成分解纖維素的多纖維素酶體的微生物”涉及形成細(xì)胞外復(fù)合物(稱作多纖維素酶體)的那些細(xì)菌或真菌，其中，酶通過黏附因子-塢因子相互作用而與主鏈支架結(jié)合。此外，可以在本發(fā)明中使用的形成分解纖維素的多纖維素酶體的微生物是細(xì)菌，如解纖維醋弧菌(Acetivibrio Cellulolyticus)、溶纖維素擬桿菌(Bacterioides cellulosolvens)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、解纖維素梭菌(C. Cellulolyticum)、食纖維梭菌(C. cellulovorans)、產(chǎn)纖維二糖梭菌(C. cellobioparum)、約氏梭菌(C.josui)、溶紙梭菌(C. papyrosolvens)、熱解纖維梭菌(C. thermocellum)、C7 梭菌(C. sp. C7)、P-1 梭菌(C. sp. P-1)、產(chǎn)琥拍酸絲狀桿菌長亞種(Fibrobacter succinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、生黃瘤胃球菌(R. flavefaciens);以及真菌微生物，如 Piromycessp. E2。在又一個實施方式中，所述主鏈支架得自來自熱解纖維梭菌的非催化支架蛋白CipA或其遺傳修飾衍生物。本文中所用術(shù)語“遺傳修飾衍生物”指的是本發(fā)明的復(fù)合物的主鏈支架蛋白質(zhì)是遺傳修飾的，例如，所述主鏈支架是由熱解纖維梭菌的CipA蛋白質(zhì)進行遺傳修飾的衍生物，或者所述主鏈支架被遺傳上地與塢因子組件或His標(biāo)簽序列融合,或者改變(CipA中的)天然產(chǎn)生組件的數(shù)目或順序，或者改變核苷酸序列以引入或除去限制位點，以適應(yīng)密碼子選擇，或者改變特定位置的氨基酸殘基。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明復(fù)合物的主鏈支架包含如SEQ ID N0:24中所示的CBM-c1-C1-d3，如 SEQ ID NO: 22 所示的 c3-cl-cl_d2，如 SEQ ID NO: 26 所示的 c2-cl_cl，或它們在其黏附因子組件中具有超過60%的氨基酸序列同一性的衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的術(shù)語“序列同一性”表示在兩種或更多種核苷酸或多肽分子之間的親緣關(guān)系程度，其由序列之間的一致性確定?？紤]到缺口或其它序列特征，“同一性”百分比由在兩個或更多個序列中完全相同區(qū)域的百分比得到。
可以通過已知步驟確定彼此相關(guān)的多肽的同一性。通常，使用具有考慮特殊要求的算法的專門的計算機程序。用于確定同一性的優(yōu)選步驟首先在所研究的序列之間產(chǎn)生最大一致。用于確定兩個序列之間的同源性的計算機程序包括，但不限干，GCG程序包，其包括 GAP(Devereux J et al. , (1984) ;Genetics Computer Group Universityof Wisconsin, Madison (WI);BLASTP，BLASTN and FASTA (Altschul S et al. , (1990)) BLAST X程序可以得自美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)以及其它來源(BLASTHandbook, Altschul S et al. , NCB NLM NIH Bethesda MD20894;Altschul S et al.,1990)。還可以使用眾所周知的Smith Waterman算法用于確定序列同一注。用于序列比較的優(yōu)選的參數(shù)包括下列算法NeedlemanS. B.和 ffunsch, C. D. (1970)It 較矩陣(Comparison matrix) BL0SUM62,來自 Henikoff S.和 HenikoffJ. G. (1992).
空位罰分(Gap penalty) :12空位長度罰分2GAP程序也適合用于具有上述參數(shù)的應(yīng)用。對于氨基酸序列比較，上述參數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(缺省參數(shù))，其中，末端空位不會降低同一性值。對于與參考序列相比非常小的序列，可以進一歩地需要將預(yù)期值增加到最高至100，000,并且在一些情況下，將字長(字號)減至2。此外,可以使用更多的模型算法、空位開放罰分(gap opening penalties)、空位拓展罰分(gap extension penalties)和比較矩陣，包括在 Program Handbook, WisconsinPackage, Version9, Septemberl997中命名的那些。選擇將取決于將要進行的比較，并且進一歩地取決于比較是否要在序列對之間進行(其中，GAP或Best Fit是優(yōu)選的)，還是要在ー個序列與龐大序列數(shù)據(jù)庫之間進行(其中，F(xiàn)ASTA或BLAST是優(yōu)選的)。使用前述算法測定的60%的一致性被描述為60%同一‘注。同樣適用于更高程度的同一‘注。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的變體，衍生物在其黏附組件中具有超過60%的氨基酸序列同一性、優(yōu)選超過70%的氨基酸序列同一性、更優(yōu)選超過80%或90%的氨基酸序列同一性。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物的主鏈支架包含碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate binding module, CBM)。優(yōu)選地，所述碳水化合物結(jié)合組件是來自熱解纖維梭菌的cipA基因的根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(http://www. cazy. cxtr/Carbohydrate-BindinR-Modules. html)分類的CBM3家族的碳水化合物結(jié)合組件,所述碳水化合物結(jié)合組件被整合到或附加到線性主鏈支架上。本文中所用術(shù)語“碳水化合物結(jié)合組件(CBM) ”指的是具有碳水化合物結(jié)合活性的連續(xù)的氨基酸序列。既可以將CBM引入到本發(fā)明的復(fù)合物(“迷你支架蛋白”)中，又可以使CBM存在于酶成分中，或者還可以使CBM經(jīng)由融合到蛋白質(zhì)成分上而與迷你支架蛋白遺傳上地結(jié)合。不同的CBM可以識別不同的多糖或多糖結(jié)構(gòu)。CBM還可以通過遺傳修飾或者與主鏈支架的官能團進行化學(xué)反應(yīng)而與迷你支架蛋白結(jié)合。CBM引出“靶向作用”，即，±曾強在復(fù)合物與底物之間的結(jié)合，這對不溶性底物尤為有利。CBM被定義為與多糖或復(fù)雜碳水化合物結(jié)合的離散折疊的非催化多肽組件。它們還可被發(fā)現(xiàn)或遺傳工程改造成以組件形式融合到酶或支架蛋白上，或者經(jīng)由黏附因子-塢因子相互作用或其它手段成為與主鏈支架結(jié)合的遺傳融合。在優(yōu)選的實施方式中，它們與結(jié)晶纖維素結(jié)合并且屬于CBM第3家族(CBM3)。(見http: //www. cazy. org/Carbohydrate-Binding-Modules. html)。除了 另Ij 的方法以外，可以通過蛋白質(zhì)在非變性凝膠電泳(其中多糖均勻地分布在凝膠中)中的阻滯來測定與多糖的結(jié)合。在又一個實施方式中，本發(fā)明涉及ー種如在此所定義的復(fù)合物，其中，所述酶成分至少包含塢因子組件和酶的催化組件。術(shù)語“組件”描述在多肽內(nèi)分離地折疊的部分，其可以利用遺傳工程或自然重組用類似“Lego”的方式裝配具有新特性的蛋白質(zhì)。本文中所用的“酶的催化組件”指的是使多肽具有催化活性的蛋白質(zhì)組件。多纖維素酶體的所有酶都是多組件(multimodular)酶，并且由催化組件和非催化組件組成，至少由催化組件和塢因子組件組成。非催化組件可為塢因子、黏附因子、CBM、S-層同源組件，或者具有尚未知功能的組件(通常稱作X-組件)。在又一個實施方式中，本發(fā)明涉及ー種如在此所定義的復(fù)合物，其中，所述酶成分選自來自多糖分解或糖分解微生物的進行性或非進行性內(nèi)-P -1，4-葡聚糖酶、進行性外-P -1，4-葡聚糖酶和糖苷酶或它們遺傳修飾的衍生物。除了別的以外，與本發(fā)明的復(fù)合物結(jié)合的酶成分包含來自熱解纖維梭菌的多纖維素酶體的纖維素酶，例如，嗜熱細(xì)菌熱解纖維梭菌的成分CbhA、CelA, CelE, CelJ, CelK,CelR, CelS或CelT ;或者熱穩(wěn)定的P _糖苷酶，例如，來自嗜熱細(xì)菌那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的葡萄糖苷酶 BglB。其它活性酶交換、去掉或加入酶成分或者改變它們的摩爾比可以擴展或增強所述復(fù)合物對其它底物的活性。新成分可以包括3 -葡萄糖苷酶，半纖維素酶(木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖-酯酶等)，果膠酶，果膠裂合酶，淀粉酶和其它用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解的酶、其它多糖，或者用于生物化學(xué)合成途徑的酶的組
ロ o本文中所用的“多糖分解微生物”指的是能夠降解多糖的水解微生物，如淀粉分解微生物、膠質(zhì)分解微生物、纖維素分解微生物或半纖維素分解微生物。本文中所用的“糖分 解微生物”指的是使用碳水化合物作為主要碳源和能源的微生物。在又一個實施方式中，本發(fā)明涉及ー種如在此所定義的復(fù)合物，其中，所述至少三種酶成分選自來自其它微生物的纖維素分解酶和半纖維素分解酶。多糖的實例為acetan、瓊脂、藻酸鹽、支鏈淀粉、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、羧甲基纖維素、纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、金藻昆布多糖、凝膠多糖、環(huán)槐多糖(cyclosophoran)、葡聚糖、糊精、emulsan、果聚糖、半乳聚糖、半乳甘露聚糖、膠凝糖、a -葡聚糖、P -葡聚糖、葡萄糖酸聚糖(glucuronan)、葡糖醛酸木聚糖、糖原、N-こ酰-肝糖(N-acetyl-heparosan)、輕こ基纖維素、糖苷、菊粉、開菲爾多糖(kefiran)、昆布多糖、蘑菇多糖、果聚糖、地衣淀粉、地衣多糖、羽扇豆、甘露聚糖、茯苓聚糖、果膠半乳聚糖、果膠、戊聚糖、糙皮側(cè)耳多糖(Pleuran)、聚半乳糖醛酸、芽霉菌糖、鼠李聚糖半乳糖醛酸、裂殖菌多糖、硬葡聚糖、淀粉、琥拍酰聚糖、,蘭膠(welan)、黃原膠、木質(zhì)葡聚糖(xyloglucan)、酵母聚糖。纖維素分解微生物的實例為細(xì)菌，如解纖維醋弧菌(AcetivibrioCellulolyticus),洛纖維醋弧菌(A. cellulosolvens), Anaerocellum thermophilum,溶纖維素擬桿菌(Bacterioides cellulosolvens)，溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)，解糖熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor saccharoIyticus)，產(chǎn)乳酸乙酸熱解纖維素菌(Cs. lactoaceticus)，Cs. Krist jansonii，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，阿氏梭菌(C. aldrichii)，快生梭菌(C. celerescens)，產(chǎn)纖維 ニ糖梭菌(C. celIobioparum)，纖維素發(fā)酵梭菌(C. celIulofermentas)，解纖維素梭菌(C. Cellulolyticum)，纖維素梭菌(C. cellulosi)，嗷細(xì)胞梭菌(C. cellulovorans)，解紙梭菌(C. chartatabidum)，食植物梭菌(C. herbivorans)，C. hungatei，約氏梭菌(C. josui)，溶紙梭菌(C. papyrosolvens)，C7 梭菌(C. sp. C7)，P-1 梭菌(C. spP-1)，類堆梭菌(C. stercorarium)，熱解纖維梭菌(Clostridium thermocellum)，C. thermocopriae,嗜熱解紙莎草梭菌(C. thermopapyroIyticum)，產(chǎn)玻拍酸絲狀桿菌長亞種(Fibrobacter succinogenes)，解纖維真桿菌(Eubacterium Cellulolyticum)，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)，生黃瘤胃球菌(R. flavefaciens)，R. succinogenes，Achromobacter piechaudii， Actinoplanes aurantiaca，環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)，巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)，短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)，しaldibacillus celluiovorans，しellulomonas biazotea,しm. cartae, Cm. celiasea， しm.celluians，Cm. fimi，Cm. flavigena,しm.gelida, Cm.1ranensis,しm.persica,Cm. uda，Cellvibrio fulvus，Cv. Gilvus，混合纖維弧菌(Cv. Mixtus)，Cv. vulgaris,Curtobacterium falcumfaciens， 嗟纖 維囷(Cytophaga sp.), Flavobacteriumjonnsoniae，雙抱小ス又T包囷(Microbispora bispora)，Micromonospora melonosporea，AL-1 粘球菌(Myxobacter sp. AL-1)，螢光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)，門多薩假單胞菌(Ps. mendocina)，Streptomyces alboguseolus，抗生素鏈霉菌(Sm. antibioticus)，金黃色鏈霉菌(Sm. aureofaciens)，解纖維素鏈霉菌(Sm. Cellulolyticus)，黃灰鏈霉菌(Sm. flavogriseus)，Sm. lividans，硝抱鏈霉菌(Sm. nitrosporeus)，產(chǎn)撤攬色鏈霉菌(Sm. olivochromogenes)，網(wǎng)鏈霉菌(Sm. reticuli)，婁徹鏈霉菌(Sm. rochei)，熱普通鏈霉菌(Sm. thermo vulgaris)，綠孢鏈霉菌(Sm. viridosporus)，擬粘球生孢嗷纖維菌(Sporocytophaga myxcoccoides)，XY 熱放線菌(Thermoactinomyces sp. XY)，白色喜熱裂孢菌(Thermobifida alba)，解纖維素喜熱裂孢菌(Tb. cellulolytica)，褐色喜熱裂孢菌(Tb. fusca)，彎曲高溫單抱菌(Thermonospora curvata)，黃單包桿菌(Xanthomonas sp.)；真菌，如 Anaeromyces mucronatus，黑曲樣(Aspergillus nigerノ，しaesomyces comunis，uyllamyces aberensis, Hypocrea sp. ， Weocailimastix frontalis, Orpmomyces sp.，Phanerochaete chrysosporium, Piptoporus cinnabarinus， Piromyces sp. ， Piromycesequi， Piromyces sp.E2,匍 g 霉菌(Rhizopus stolonifer)， Serpula lacrymans,Sporotrichum pulverulentum，Trichoaerma ( = Hypocrea) harzianum，T. koningii，長枝木霉(T. longibrachiatum)，T. pseudokoninii，里氏木霉(T. reesei)，綠色木霉(T. viride) 0在又一個實施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物包含至少三種酶成分，所述至少三種酶成分得自熱解纖維梭菌的含有塢因子的成分，或者得自具有被融合到其中的塢因子的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的成分。本發(fā)明的復(fù)合物還可以來自其它細(xì)菌的包含含有瑪因子的酶成分或者具有被融合到其中的塢因子的酶成分。在優(yōu)選的實施方式中，所述酶成分包含如SEQ ID N0:8中所示的CelK-dl，如SEQID N0:10 中所示的 CelR-dl，如 SEQ ID NO: 14 中所示的 CelT-dl，如 SEQ ID NO: 16 中所示的CelE-dl，如SEQ ID N0:6中所示的CelS-dl，以及如SEQ ID N0:4中所示的BglB-dl，或它們的衍生物，或來自其它細(xì)菌的具有超過50%，優(yōu)選超過60%、超過70%，更優(yōu)選超過80%，更優(yōu)選超過90%且最優(yōu)選超過97%的氨基酸序列同一性的相關(guān)基因。在又一個實施方式中，本發(fā)明的復(fù)合物包含含有如SEQ ID N0:24中所示的CBM-cl-cl-d3 蛋白質(zhì)，如 SEQ ID NO:22 中所示的 c3-cl-cl_d2 蛋白質(zhì)，如 SEQ ID NO:26中所示的c2-cl-cl蛋白質(zhì)的主鏈支架以及含有如SEQ ID NO:8中所示的CelK-dl，如SEQID N0:10 中所示的 CelR-dl，如 SEQ ID NO: 14 中所示的 CelT-dl，如 SEQ ID NO: 16 中所示的CelE-dl，如SEQ ID NO: 6中所示的CelS-dl和如SEQ ID NO: 4中所示的BglB-dl的酶成分。本發(fā)明還提供了一種制備如在本文中所定義的復(fù)合物的的方法，該方法包括以下步驟
a)重組生產(chǎn)如在本文中所定義的至少三種酶成分；b)重組生產(chǎn)權(quán)利要求1-8中任一項所述的主鏈支架；c)在體外混合a)和b)的純化的、部分純化的或未純化的成分；和d)使酶成分與主鏈支架隨機地結(jié)合。在又一個實施方式中，制備如在本文中所定義的復(fù)合物的方法包括使重組生產(chǎn)的主鏈支架或酶顆粒與載體顆粒結(jié)合的步驟。適合的顆粒包括如上所述的納米顆粒，優(yōu)選聚苯こ烯包覆的納米顆粒，例如，聚苯こ烯包覆的鐵磁性納米顆粒，或者化學(xué)官能化的超順磁性納米顆粒，或其它小納米顆粒，優(yōu)選地，直徑為10至2000nm,更優(yōu)選30至50nm,優(yōu)選顆粒表面上附加有羧基或氨基。所述酶成分的重組生產(chǎn)可以通過本領(lǐng)域眾所周知的基因克隆和修飾技術(shù)進行，例如，工程酶成分可被融合到塢因子、黏附因子和/或其它非催化組件中，非必需地隨后用蛋白質(zhì)工程改造所述成分以提高重組生產(chǎn)，例如，通過使分泌信號最優(yōu)化，改變減少成功表達或分泌的蛋白質(zhì)片段，或改變密碼子選擇。在進ー步的步驟中，本發(fā)明的主鏈支架(“迷你支架蛋白”)由重組生產(chǎn)，非必需地融合黏附因子組件，并且通過混合酶成分和主鏈支架自發(fā)地組合以形成復(fù)合物。所述成分可為純化的、部分純化的或未純化的，優(yōu)選為部分純化的或未純化的。優(yōu)選地，在酶-主鏈支架混合物中黏附因子組件與塢因子組件的摩爾比是1:1。所述至少三種酶成分以1:1至1:50、1:1. 5至1:30、優(yōu)選1:1. 8至1:15的摩爾比在體外被混合在一起。所述酶成分因此與所述主鏈支架隨機地結(jié)合。如本文中所述的黏附因子-塢因子相互作用的塢因子組件和黏附因子組件是可互換的，即是說，黏附因子組件既可存在于主鏈支架中，又可以存在于酶成分中，并且塢因子組件反之亦然。優(yōu)選地，多纖維素酶體成分中的至少三種，例如，嗜熱細(xì)菌熱解纖維梭菌的成分CbhA、CelA, CelE, CelJ, CelK, CelR, CelS 或 CelT,或者熱穩(wěn)定的 P _ 糖苷酶，例如，來自嗜熱細(xì)菌那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的P -葡萄糖苷酶BglB,被組合在主鏈分子上，優(yōu)選地，BglB, CbhA、CelE, CelJ或CelT的各部分的摩爾比為0. 05至1. 5，CelK和CelR的各部分的摩爾比為0.1至3. 0，以及CelA和CelS的各部分的摩爾比為0. 2至6. O。在另ー個實施方式中，8§18、031^、(^把、(^11或(^1丁的各部分的摩爾比為0.1至1. O，CelK和CelR的各部分的摩爾比為O. 2至1. O，以及CelA和CelS的各部分的摩爾比為O. 5至1. O。在最優(yōu)選的實施方式中，BglB、CbhA, CelE, CelJ或CelT的各部分的摩爾比為
O.06至1. 6，CelK和CelR的各部分的摩爾比為O.1至1. 8，以及CelA和CelS的各部分的摩爾比為O. 3至2. O。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種制備如在本文中上述所定義的復(fù)合物的方法，其中，步驟c)中主鏈支架的總量和酶成分的總量以I黏附因子組件與I酶成分的摩爾比被混合在一起，以及所述至少三種酶成分彼此以1:1至1:50、1:1. 5至1:30,優(yōu)選1:1. 8至1:15、優(yōu)選1:1至1:15的摩爾比在體外被混合在一起。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了使用如在本文中所述的方法制成的復(fù)合物。就“摩爾比”而言，其涉及主鏈支架與酶成分的比例，計算為I結(jié)合位點(優(yōu)選在主鏈支架中包含的黏附因子組件)與I結(jié)合位點(優(yōu)選在酶成分中包含的塢因子組件)的 摩爾比。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種酶水解多糖底物的方法，該方法包括以下步驟a)使本發(fā)明的復(fù)合物與不溶性纖維素混合；和非必需地b)分離降解產(chǎn)物。使本發(fā)明的復(fù)合物與不溶性纖維素混合優(yōu)選地在最適或接近最適pH和溫度下的水環(huán)境中進行。所述最適或接近最適PH是6. 5±0.5。所述最適溫度是在25-65° C、優(yōu)選30-65° C的范圍內(nèi)；最優(yōu)選大約55° C。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的復(fù)合物用于酶水解多糖底物的用途。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，如在本文中所述的多糖底物是結(jié)晶纖維素或者含有結(jié)晶纖維素的底物。


圖1顯示選定的熱解纖維梭菌不吸附培養(yǎng)物的菌落。在混濁的瓊脂表面上，可見由水解了的纖維素的黑色(=清除)光圈圍繞的菌落。標(biāo)尺顯示Icm和2cm標(biāo)記。圖2顯示重組支架蛋白構(gòu)成物的大約3D結(jié)構(gòu)(curtesy H. Gilbert)。熱解纖維梭菌的CipA蛋白質(zhì)的衍生物(首行cl=黏附因子I等；CBM=碳水化合物結(jié)合組件)。圖3顯示具有來自突變體SMl的天然可溶性多纖維素酶體成分(SM901)的復(fù)合物、具有迷你支架蛋白的復(fù)合物以及具有熱解纖維梭菌的完整天然支架蛋白CipA的復(fù)合物的比活[mU/mg葡萄糖當(dāng)量]。對照來自熱解纖維梭菌的天然多纖維素酶體。對O. 5%微晶粉末纖維素(Avicel)的活性測定(T=60° C，ρΗ6. O)。(Coh :黏附因子，CBM :碳水化合物結(jié)合組件)。圖4顯示納米顆粒-接頭-支架蛋白-纖維素酶復(fù)合物(NLSC)。為了簡單，只用2個黏附因子(而非9個)顯示支架蛋白。納米顆粒和各種分子未按照比例尺繪制。圖5顯示各種復(fù)合物在使用納米顆粒結(jié)合及不使用納米顆粒結(jié)合的情況下的活性。SM901 :沒有支架蛋白的突變體多纖維素酶體成分。圖6比較游離酶(SM901)和與納米顆粒結(jié)合的酶(NP+SM901)的pH穩(wěn)定性。
圖7比較游離酶(SM901)和與納米顆粒結(jié)合的酶(NP+SM901)的溫度穩(wěn)定性。圖8顯示由可溶性(CMC)和不溶性(結(jié)晶)纖維素(微晶粉末纖維素)作為底物的水解產(chǎn)物的薄層色譜圖。顯示了可溶性酶(SM901)、人造復(fù)合物和天然多纖維素酶體的比較。圖9顯示重組多纖維素酶體成分與支架蛋白質(zhì)的各種混合物的活性。使用結(jié)晶纖維素作為底物。圖10顯示可溶性多纖維素酶體成分(SM901)、以復(fù)合物(與支架蛋白)形式的相同的酶、具有重組成分(SM901+CipA +內(nèi)+外[NTC])的合成混合物、商購的里氏木霉(Trichoderma reesei)酶制品以及來自熱解纖維梭菌的天然多纖維素酶體的比活。結(jié)晶纖維素(O. 5%w/v)作為底物。活性以葡萄糖當(dāng)量按照ymol/min計算。圖11 顯示主鏈支架 CBM-cl-cl-d3、c3-cl-cl-d2、c2-cl_cl 以及酶成分 CelK-dl、CelR-dl, CelT-dl, CelE-dl, CelS-dl和BglB-dl的核苷酸序列和氨基酸序列。圖12顯示優(yōu)選的納米顆粒的示意圖。圖13顯示使用強圓盤式磁體因顆粒的超順磁性從溶液中分離的顆粒?？梢砸?3%以上的回收率容易地移除反應(yīng)溶液。
實施例將通過下列實施例進一步地解釋本發(fā)明，實施例的目的純粹是示例性地顯示本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)以任何方式構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例顯示了用與蛋白質(zhì)載體(一種模仿支架蛋白CipA(多纖維素酶體整合蛋白質(zhì))的主鏈支架)結(jié)合的6種重組表達纖維素酶系統(tǒng)進行的水解纖維素降解。主鏈支架攜帶與形成酶成分的C末端的塢因子組件緊密地且特異地結(jié)合的黏附因子結(jié)合組件。這是一種體外裝配的復(fù)合物，類似嗜熱厭氧細(xì)菌熱解纖維梭菌的多纖維素酶體。黏附因子和塢因子自發(fā)地彼此結(jié)合。這種復(fù)合物，在以正確的比例與正確的成分體外重建時，在結(jié)晶纖維素上表現(xiàn)出比從細(xì)菌中分離的天然多纖維素酶體高的活性。實施例1 :不形成多纖維素酶體的突變體的分離從熱解纖維梭菌的誘變處理培養(yǎng)物中分離突變體(圖1)。隨機選擇在菌落周圍的纖維素中形成清晰色圈的能力下降或喪失的六個菌落。熱解纖維梭菌突變體之一，SMl，完全喪失了生產(chǎn)支架蛋白CipA或活性黏附因子的能力。在大麥β_葡聚糖、CMC(雙對照)和微晶纖維素ΜΝ300上測試來自野生型的酶(具有多纖維素酶體)和來自突變體SMl的酶(沒有多纖維素酶體；游離酶)。對于兩個菌株，在大麥β -葡聚糖和CMC上的酶活性分別為約8. 5和1. OU mg—1蛋白質(zhì)(表I)。相反，在突變體SMl中，在結(jié)晶纖維素上的比活急劇下降，與野生型相比下降了高達15倍。除了完全消失的CipA成分(支架蛋白CipA)以外，突變體產(chǎn)生的多纖維素酶體成分的數(shù)量與野生型相比大致相同。在突變體中超分子復(fù)合物完全消失。這說明突變體不能適當(dāng)?shù)匦纬啥嗬w維素酶體。大約50種多纖維素酶體蛋白質(zhì)成分因此以分散的、可溶性的、非復(fù)合蛋白質(zhì)出現(xiàn)，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的數(shù)量和分布類似于在野生型中觀察到的。表1:突變體SMl和野生型的濃縮培養(yǎng)物上清液在大麥β-葡聚糖、CMC (二者均是可溶性的)和麗300纖維素(結(jié)晶)上的酶活性。
權(quán)利要求
1.一種無顆粒的或顆粒結(jié)合的復(fù)合物，其包含 a)主鏈支架，所述主鏈支架包含至少四個結(jié)合位點，其中，所述結(jié)合位點中的至少兩個具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性；和 b)與所述四個結(jié)合位點的每一個結(jié)合的酶成分，其中，所述酶成分中的至少三種是不同的酶成分。
2.權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其中，所述復(fù)合物與選自納米顆粒、優(yōu)選涂覆的和化學(xué)官能化的納米顆粒、更優(yōu)選聚苯乙烯涂覆的鐵磁性納米顆粒中的顆粒結(jié)合。
3.權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架是線性的、合成的或生物的主鏈。
4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架具有至少四個用于塢因子的黏附因子結(jié)合位點。
5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架由一種或多種蛋白質(zhì)組成，其中，所述一種或多種蛋白質(zhì)通過化學(xué)相互作用或者通過黏附因子-塢因子相互作用被連接在一起，由此連接相互作用的結(jié)合特異性與所述酶的結(jié)合特異性不同。
6.權(quán)利要求1至5中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架得自來自形成分解纖維素的多纖維素酶體的微生物的非催化支架蛋白或其遺傳修飾的衍生物。
7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架得自來自熱解纖維梭菌的非催化支架蛋白CipA或其遺傳修飾的衍生物。
8.權(quán)利要求7所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架包含如SEQID NO:24中所示的CBM-c1-C1-d3，如 SEQ ID NO: 22 所示的 c3-cl-cl_d2，如 SEQ ID NO: 26 所示的 c2-cl_cl，或它們的衍生物，所述衍生物在其黏附因子組件中具有超過60%的氨基酸序列同一性。
9.權(quán)利要求1至8中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述主鏈支架包含碳水化合物結(jié)合組件(CBM)。
10.權(quán)利要求9所述的復(fù)合物，其中，所述碳水化合物結(jié)合組件是被整合到或附加到線性主鏈支架上的來自熱解纖維梭菌cipA基因的碳水化合物結(jié)合組件(CBM3)。
11.權(quán)利要求1至10中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述酶成分包含塢因子組件和酶的催化組件。
12.權(quán)利要求1至11中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述酶成分選自來自多糖分解微生物的進行性或非進行性內(nèi)_β -1，4-葡聚糖酶、進行性外_β -1，4-葡聚糖酶和糖苷酶或其遺傳修飾的衍生物。
13.權(quán)利要求12所述的復(fù)合物，其中，所述酶成分得自熱解纖維梭菌多纖維素酶體的含有塢因子組件的成分，或者得自具有被融合到其中的塢因子組件的熱解纖維梭菌非多纖維素酶體成分。
14.權(quán)利要求1至13中任一項所述的復(fù)合物，其中，所述酶成分包含如SEQID ΝΟ:8中所示的 CelK-dl，如 SEQ ID NO: 10 中所示的 CelR-dl，如 SEQ ID NO: 14 中所示的 CelT-dl，如 SEQ ID NO:16中所示的CelE-dl，如SEQ ID NO:6 中所示的CelS-dl，以及如 SEQ ID N0:4中所示的BglB-dl，或它們的衍生物，所述衍生物在其塢因子組件中具有超過50%的氨基酸序列同一性。
15.—種制備根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟a)由重組體生產(chǎn)權(quán)利要求1和11-14中任一項所述的酶成分； b)由重組體生產(chǎn)權(quán)利要求1和3-9中任一項所述的主鏈支架； c)在體外混合a)和b)的純化的、部分純化的或未純化的成分；和 d)使所述酶成分與主鏈支架隨機地結(jié)合。
16.權(quán)利要求15所述的方法，該方法進一步包括使重組體生產(chǎn)的主鏈支架或重組體生產(chǎn)的酶成分與顆粒結(jié)合的步驟。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述顆粒是納米顆粒，優(yōu)選是聚苯乙烯涂覆的鐵磁性納米顆粒。
18.權(quán)利要求15至17中任一項所述的方法，其中，步驟c)中主鏈支架的總量和酶成分的總量以I黏附因子組件與I酶成分的摩爾比被混合在一起，以及所述至少三種酶成分彼此以1:1至1:15的摩爾比被混合在一起。
19.一種使用權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法制成的復(fù)合物。
20.一種酶水解多糖底物的方法，該方法包括以下步驟 a)使權(quán)利要求1至13中任一項所述的復(fù)合物與不溶性纖維素混合；和非必需地 b)分離降解產(chǎn)物。
21.權(quán)利要求1至14中任一項所述的復(fù)合物用于酶水解多糖底物的用途。
22.權(quán)利要求20所述的方法或者權(quán)利要求21所述的用途，其中，所述多糖底物是結(jié)晶纖維素或者含有結(jié)晶纖維素的底物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于酶分解彈性底物的體外生產(chǎn)的人造多纖維素酶體。特別是，本發(fā)明提供了一種在如結(jié)晶纖維素的彈性底物上具有增強活性的復(fù)合物。該體外形成的復(fù)合物包含主鏈支架，所述主鏈支架具有至少四個能夠結(jié)合酶成分的結(jié)合位點，其中，所述結(jié)合位點中的至少兩個具有本質(zhì)上相同的結(jié)合特異性；和與所述至少四個結(jié)合位點隨機結(jié)合的至少三種不同的酶成分。本發(fā)明還提供制備所述復(fù)合物的方法以及所述復(fù)合物用于酶分解彈性底物的用途。
文檔編號C12N9/42GK103025879SQ201180035095
公開日2013年4月3日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者沃爾夫?qū)·施瓦茨, 揚·克勞斯, 弗拉迪米爾·V·茲維勒夫, 丹尼爾·霍恩布爾格, 達尼埃拉·柯克, 路易斯-菲利普·許爾德 申請人:沃爾夫?qū)·施瓦茨