專利名稱：富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法及蠟酯制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法及蠟酯制造方法，所述富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法能夠以低能量、低成本生產(chǎn)富含成為生物燃料的原料的蠟酯的微藻類的裸藻屬藻體。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，全球暖化問(wèn)題日益嚴(yán)重，抑制作為溫室效應(yīng)氣體之一的二氧化碳?xì)怏w的排放量、通過(guò)固定二氧化碳而降低大氣中的二氧化碳濃度成為大的課題。
這樣的情況下，使用含有被固定的二氧化碳的化石燃料作為能源會(huì)導(dǎo)致將固定的二氧化碳再次釋放到大氣中，而成為環(huán)境問(wèn)題。另外，由于化石燃料為有限的資源，因此也存在枯竭的問(wèn)題。
為了解決如上述那樣的問(wèn)題，需要除化石燃料以外的燃料源，對(duì)以高等植物或藻類為原料的生物燃料的開(kāi)發(fā)的期待升高。
作為成為生物燃料原料的候選的高等植物，已知有大豆、玉米、棕櫚等，但在以可食用作物為原料的情況下，有可能導(dǎo)致糧食不足而成為問(wèn)題。另一方面，利用麻風(fēng)樹(shù)、亞麻薺等非食用植物的生產(chǎn)也正在推進(jìn)，但是存在每單位面積的生產(chǎn)量低的問(wèn)題。
另一方面，普遍棲息于湖或沼澤中的光合微生物或原生動(dòng)物具有與植物相同的光合能力，從水與二氧化碳生物合成碳水化合物和脂質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)蓄積幾十質(zhì)量％。已知，與植物相比，其生產(chǎn)量以每單位面積計(jì)，為被認(rèn)為其生產(chǎn)量高的棕櫚的10倍以上。
但是，作為一種光合微生物的微藻類的裸藻屬藻體為鞭毛蟲(chóng)的一組，包括作為有運(yùn)動(dòng)性的藻類有名的 眼蟲(chóng)藻(日文$ K 'J ^ ) 0大部分的裸藻屬藻體具有葉綠體，進(jìn)行光合作用，而進(jìn)行獨(dú)立營(yíng)養(yǎng)生活，也有的捕食或者吸收營(yíng)養(yǎng)。裸藻屬(Euglena)為分類到動(dòng)物學(xué)與植物學(xué)的雙方的屬。
在動(dòng)物學(xué)中，有屬于原生動(dòng)物門(Protozoa)的鞭毛蟲(chóng)綱(Mastigophorea)、植鞭亞綱(Phytomastigophorea)的目中的眼蟲(chóng)目(Euglenida),其由三個(gè)亞目、即眼蟲(chóng)亞目 (Euglenoidina)、Peranemoidina、Petalomonadoidina 組成。
在眼蟲(chóng)亞目中，包括眼蟲(chóng)屬(Euglena)、殼蟲(chóng)藻屬(Trachelemonas)、陀螺藻屬 (Strombonas)、扁裸藻屬(Phacus)、鱗孔藻屬(Lepocinelis)、變胞藻屬(Astasia)、柄裸藻屬(Colacium)作為屬。在植物學(xué)中，有裸藻門(Euglenophyta),其下面有裸藻綱 (Euglenophyceae)、裸藻目(Euglenales),作為包括在該目中的屬，除了裸藻屬(Euglena) 以外，與動(dòng)物分類表相同。
裸藻屬藻體在細(xì)胞內(nèi)蓄積裸藻淀粉(Paramylon)作為碳水化合物。裸藻淀粉為約 700個(gè)葡萄糖通過(guò)β-1，3-鍵聚合的高分子體粒子。
裸藻屬藻體如果被置于厭氧狀態(tài)，則分解儲(chǔ)備多糖、即裸藻淀粉而進(jìn)行以由脂肪酸和脂肪醇形成的蠟酯為最終產(chǎn)物的蠟酯發(fā)酵。
在非專利文獻(xiàn)I中記載了，將裸藻屬藻體在光照射下培養(yǎng)后，在置換成無(wú)氮源的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)區(qū)，每I個(gè)細(xì)胞的裸藻淀粉蓄積量增加，但在置換成添加了氮源的培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)區(qū)，每I個(gè)細(xì)胞的裸藻淀粉含量降低。
在專利文獻(xiàn)I中記載了，通過(guò)將裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)后置于厭氧條件下，從而使儲(chǔ)備多糖裸藻淀粉發(fā)酵并轉(zhuǎn)換成蠟酯。
在專利文獻(xiàn)2中記載了如下方法通過(guò)將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)，添加不飽和脂肪酸后，置于厭氧條件下，從而使儲(chǔ)備多糖裸藻淀粉發(fā)酵并轉(zhuǎn)換成蠟酯，由此生產(chǎn)不飽和蠟酯，該不飽和蠟酯成為用作優(yōu)質(zhì)潤(rùn)滑油的抹香鯨油的代替原料。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:日本特公平3-65948號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2 :日本特公平5-27384號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1:Sumida et al. , Ammoni a-and Linght-1nduced Degradationof Paramylum in Euglena gracilis. Plant Cell Physiol.28 (8).P1587-1592 (1987)發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
但是，在非專利文獻(xiàn)I中，僅對(duì)裸藻淀粉的分解控制有記載，并未暗示與蠟酯發(fā)酵的組合。
另外，在專利文獻(xiàn)I中，作為好氧培養(yǎng)的方法，僅公開(kāi)了添加葡萄糖等有機(jī)物作為碳源、或者在通常的光合條件下進(jìn)行培養(yǎng)等通常的方法。
在生物燃料的制造中，使用葡萄糖等碳源的培養(yǎng)法并不劃算，與二氧化碳的固定也無(wú)關(guān)。
此外，專利文獻(xiàn)2中所公開(kāi)的技術(shù)的目的在于，以高收量得到不飽和蠟酯，但作為生物燃料的原料，飽和蠟酯更為理想。
本發(fā)明的目的在于解決上述各問(wèn)題，提供富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法及蠟酯制造方法，所述富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法通過(guò)利用光合作用以二氧化碳為碳源將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)后，在氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，從而增加每一個(gè)細(xì)胞的裸藻淀粉蓄積量，然后置于厭氧狀態(tài)下，由此能夠生產(chǎn)富含蠟酯的裸藻屬藻體。
用于解決課題的手段
上述課題是根據(jù)本發(fā)明的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，通過(guò)包括如下工序來(lái)解決的 第I工序，將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)；第2工序，使培養(yǎng)有所述微藻類的裸藻屬藻體的培養(yǎng)基為氮饑餓狀態(tài)后進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng);第3工序，將細(xì)胞保持在厭氧狀態(tài)下。
如此，通過(guò)實(shí)施好氧培養(yǎng)一在氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)一將細(xì)胞保持在厭氧狀態(tài)下這樣的一系列工序，能夠有效生產(chǎn)蠟酯的含量高的裸藻屬藻體。
S卩，通過(guò)工序2的氮饑餓狀態(tài)下的培養(yǎng)，能夠使裸藻屬藻體充分蓄積碳水化合物。
因此，在工序3中，通過(guò)將在工序2中培養(yǎng)的細(xì)胞置于厭氧狀態(tài)，使在工序2中充分蓄積的碳水化合物轉(zhuǎn)換為蠟酯，因此結(jié)果是在工序3中的蠟酯蓄積量飛躍性增加。
換言之，通過(guò)組合這些工序I —工序2 —工序3，產(chǎn)生蠟酯的蓄積量飛躍性增加這樣的有益效果。
另外，在氮饑餓狀態(tài)下培養(yǎng)的裸藻屬藻體的細(xì)胞即使在剛剛厭氧處理后也呈現(xiàn)與培養(yǎng)時(shí)同樣的綠色，幾乎沒(méi)有死亡細(xì)胞，細(xì)胞的大小也與厭氧處理前沒(méi)有變化。
S卩，當(dāng)在不含氮源的培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧處理時(shí)，還產(chǎn)生與含有氮源的培養(yǎng)基的情況相比裸藻屬藻體的細(xì)胞的生存率大幅改善這樣的有益效果。
另外，此時(shí)，所述氮饑餓狀態(tài)如果通過(guò)將上述培養(yǎng)基置換成氮源缺乏培養(yǎng)基來(lái)創(chuàng)建，則能夠有效創(chuàng)建氮饑餓狀態(tài)，因此優(yōu)選。
如此，通過(guò)實(shí)施好氧培養(yǎng)一置換成氮源缺乏培養(yǎng)基進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)一將細(xì)胞保持在厭氧狀態(tài)下這樣的一系列工序，能夠有效生產(chǎn)蠟酯的含量高的裸藻屬藻體。
具體地說(shuō)，優(yōu)選地在所述第I工序中，在將所述微藻類的裸藻屬藻體用不含氮源的培養(yǎng)基開(kāi)始好氧培養(yǎng)的同時(shí)，適宜地調(diào)節(jié)流加量而加入氮源，進(jìn)行持續(xù)且好氧的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到一定水平時(shí)停止氮源的流加，在所述第2工序中，置于氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。
進(jìn)而，具體地說(shuō)，在所述第I工序中，通過(guò)通入二氧化碳?xì)怏w，而賦予混有二氧化碳源的氧氣源，所述二氧化碳?xì)怏w更優(yōu)選為從發(fā)電廠排放的二氧化碳?xì)怏w。
通過(guò)這樣構(gòu)成，可以將培養(yǎng)過(guò)程確定而進(jìn)行工業(yè)化，而 能夠進(jìn)行大量生產(chǎn)。
進(jìn)而，能夠有效利用作為排放氣體可得到的二氧化碳?xì)怏w，因此成為在成本方面上有利、且在環(huán)境方面也非常有用的技術(shù)。
另外，就工序2的氮饑餓狀態(tài)而言，由于在工序I中停止氮源的流加，因此產(chǎn)生裸藻屬藻體同化全部氮源的結(jié)果。
此外，優(yōu)選在所述第3工序中，利用從通入不活潑氣體、靜置處理、借助離心分離的濃縮中選擇的至少一種方法，進(jìn)行厭氧處理。
可以選擇其中一種方法，也可以組合多種方法。
另外，上述課題是根據(jù)本發(fā)明的蠟酯制造方法，通過(guò)使用富含蠟酯的裸藻屬藻體， 該裸藻屬藻體利用方案I至方案5中任一項(xiàng)所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法來(lái)生產(chǎn)，并實(shí)施如下工序來(lái)解決的用有機(jī)溶劑提取油組份而得到提取液，將該提取液濃縮而得到蠟成分的工序；利用柱從所述蠟成分中分離蠟酯而進(jìn)行第I精制的工序。
如此，在本發(fā)明中，可以利用培養(yǎng)后的裸藻屬藻體，簡(jiǎn)易地精制蠟酯成分。
該裸藻屬藻體可以利用上述方案I至方案6中所述的方法，以富含蠟酯的狀態(tài)簡(jiǎn)易且大量培養(yǎng)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可以利用大量培養(yǎng)的裸藻屬藻體，穩(wěn)定地供給優(yōu)質(zhì)且清潔的燃料。
具體地說(shuō)，所述濃縮優(yōu)選在50°C 土 10°C的范圍內(nèi)實(shí)施。
如果低于該溫度，則因蠟成分的粘性而突沸，無(wú)法消除蠟成分噴出到濃縮器、即蒸發(fā)器內(nèi)的可能性。
更具體地說(shuō)，優(yōu)選實(shí)施如下的工序作為后續(xù)工序?qū)νㄟ^(guò)所述進(jìn)行第I精制的工序而得到的所述蠟酯進(jìn)行水解，進(jìn)行第2精制的工序。
如果這樣構(gòu)成，則可以將在第I精制中粗制的物質(zhì)通過(guò)第2精制進(jìn)一步精制，而可以提供更優(yōu)質(zhì)的燃料。
即，通過(guò)在進(jìn)行第I精制的工序后，在第2精制中進(jìn)行水解，從而碳鏈變短，揮發(fā)性增加，作為燃料的價(jià)值升高。
另外，在所述進(jìn)行第I精制的工序中，作為適用于所述柱的洗脫溶劑，優(yōu)選使用己烷或者將醚以10體積％以下混合后的己烷和醚的混合溶劑。
如果這樣構(gòu)成，則可以有效分離葉綠素，并且可以有效排除其他色素，因而優(yōu)選。
因此，可以提供更優(yōu)質(zhì)的燃料。
另外，利用上述蠟酯制造方法由裸藻屬藻體制造的蠟酯成為優(yōu)質(zhì)的生物燃料，這些生物燃料可以大量且穩(wěn)定地提供。
此外，其為清潔能源，大大有助于改善環(huán)境問(wèn)題等。
如上所述，為了解決上述課題，本發(fā)明的蠟酯制造方法的最大特征在于，包括將裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)的培養(yǎng)工序；通過(guò)在培養(yǎng)工序后、在氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)使碳水化合物蓄積的培養(yǎng)工序；通過(guò)將培養(yǎng)的細(xì)胞置于厭氧狀態(tài)而使碳水化合物轉(zhuǎn)換為蠟酯的厭氧發(fā)酵工序。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以由通過(guò)光合作用而固定的二氧化碳廉價(jià)地提供油脂含量多的生物質(zhì)原料。
另外，如果根據(jù)本發(fā)明來(lái)制造生物燃料，則也帶來(lái)能源自給率的提高。


圖1為示出本發(fā)明的第I實(shí)施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法的工序圖。
圖2為示出本發(fā)明的第2實(shí)施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法的流程圖。
圖3為示出本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及的蠟酯的制造方法的工序圖。
具體實(shí)施方式
下面，基于附圖，說(shuō)明本發(fā)明的一實(shí)施方式。
需要說(shuō)明的是，下面說(shuō)明的構(gòu)成并不限定本發(fā)明，而在本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)能夠進(jìn)行各種改變。
本實(shí)施方式涉及一種裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法,其通過(guò)在好氧條件下培養(yǎng)裸藻屬藻體后，在氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，然后置于厭氧狀態(tài)，從而使裸藻屬藻體富含蠟酯。
(第I實(shí)施方式)
根據(jù)圖1，對(duì)本發(fā)明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法的第I實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
本生產(chǎn)方法包括工序1(相當(dāng)于第I工序)，將裸藻屬藻體用添加了氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行好氧培養(yǎng)；工序2 (相當(dāng)于第2工序)，置換成不含氮源的培養(yǎng)基而進(jìn)行好氧培養(yǎng)；工序3 (相當(dāng)于第3工序)，進(jìn)行厭氧處理，使碳水化合物發(fā)酵成蠟酯。
首先，工序I中的裸藻屬藻體的培養(yǎng)也可以通過(guò)將大氣通入培養(yǎng)基中作為二氧化碳源來(lái)進(jìn)行，但為了提高培養(yǎng)效率，優(yōu)選將二氧化碳?xì)怏w通入培養(yǎng)基中。
S卩，由于在大氣或二氧化碳?xì)怏w中還含有氧氣，由此進(jìn)行好氧培養(yǎng)。
二氧化碳?xì)怏w的通入可以通過(guò)利用例如從工廠或發(fā)電廠等排放的燃燒排氣來(lái)進(jìn)行。此時(shí)，優(yōu)選利用集塵機(jī)、脫硝裝置、脫硫裝置等預(yù)先去除燃燒排氣中的塵埃、NOx和S0X。 另外，攪拌可以采用借助通氣的氣升(airlift)方式、或使用攪拌葉片的方法等通常的技術(shù)。
對(duì)于光而言，可以通過(guò)照射熒光燈等人工光進(jìn)行培養(yǎng)，但為了以更低能量、更低成本進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選僅用太陽(yáng)光進(jìn)行培養(yǎng)。
另外，培養(yǎng)基的水溫優(yōu)選控制在29± 1°C。
但是，為了對(duì)水溫控制不投入能量而不進(jìn)行溫度控制，或者若進(jìn)行水溫控制，則優(yōu)選進(jìn)行如下的最小限度的控制按照不會(huì)達(dá)到裸藻屬藻體死亡那樣的高溫的方式進(jìn)行冷卻、按照在冬季或夜間水溫不會(huì)下降過(guò)低的方式加熱等。
作為裸藻屬藻體的培養(yǎng)基組成，例如可以使用改良Cramer-Myers培養(yǎng)基 ((NH4)2HPO41. Og/L, KH2PO41. Og/L、MgSO4 · 7H20 O. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2 (SO2)3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、鹽酸硫胺素(維生素 B1) 0. lmg/L、 氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ3·5))。另外，(NH4)2HPO4可以改變?yōu)?NH4)2S04或NH3aq。
需要說(shuō)明的是，培養(yǎng)基組成當(dāng)然并不限于此。
培養(yǎng)基的pH只要在2 7. 5的范圍內(nèi)即可，但優(yōu)選調(diào)節(jié)到3. 5或5. 5。特別是，通過(guò)使pH為4. 5以下的酸性，能夠有效抑制動(dòng)物性浮游生物或細(xì)菌等的污染。
接著，在工序2中，置換成不含氮源的培養(yǎng)基，進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。
工序2中的不含氮源的培養(yǎng)基組成例如可以使用Resting培養(yǎng)基、I %甘露醇、 O. 2% MgCl2 · 6Η20、0· 14% ΚΗ2Ρ04。
需要說(shuō)明的是，培養(yǎng)基組成只要不含氮源則當(dāng)然并不限于此。
接著，在工序3中，進(jìn)行培養(yǎng)后的裸藻屬藻體的厭氧處理。
厭氧處理通常通過(guò)向培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中通入氮?dú)獾炔换顫姎怏w來(lái)進(jìn)行。此外，厭氧處理也可以通過(guò)將培養(yǎng)基靜置來(lái)進(jìn)行。這是因?yàn)?，如果將培養(yǎng)基不攪拌而靜置則細(xì)胞會(huì)沉淀，形成高密度，結(jié)果導(dǎo)致缺氧。也可以通過(guò)利用離心分離制造高密度狀態(tài)來(lái)進(jìn)行厭氧處理。
此時(shí)的pH只要不是極度低或高的值即可，光照射的有無(wú)對(duì)蠟酯發(fā)酵沒(méi)有影響。保持溫度只要不是裸藻屬藻體死亡那樣的高溫、培養(yǎng)基凍結(jié)那樣的低溫即可。通常在6小時(shí) 72小時(shí)內(nèi)蠟酯發(fā)酵結(jié)束。
另外，通過(guò)在工序2的氮饑餓狀態(tài)下的培養(yǎng)，能夠使碳水化合物充分蓄積在裸藻屬藻體內(nèi)。
因此，在工序3中，通過(guò)將在工序2中培養(yǎng)后的細(xì)胞置于厭氧狀態(tài)，使在工序2中充分蓄積的碳水化合物轉(zhuǎn)換為蠟，因此結(jié)果是工序3中的蠟酯蓄積量飛躍性增加。
換言之，通過(guò)將這些工序I —工序2 —工序3組合，產(chǎn)生蠟酯的蓄積量飛躍性增加這樣的、由各單獨(dú)工序得不到的有益效果。
另外，在下述實(shí)施例中會(huì)進(jìn)行詳述，在氮饑餓狀態(tài)下培養(yǎng)的裸藻屬藻體的細(xì)胞在剛剛厭氧處理后也呈現(xiàn)與培養(yǎng)時(shí)同樣的綠色，幾乎沒(méi)有死亡的細(xì)胞，細(xì)胞的大小也與厭氧處理前沒(méi)有變化。
S卩，如果用不含氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧處理，則還產(chǎn)生與含有氮源的培養(yǎng)基相比裸藻屬藻體的細(xì)胞的生存率大幅改善這樣的有益效果。
如上所述，通過(guò)將這些工序I —工序2 —工序3組合，可以得到與以往相比含有顯著多的蠟酯的細(xì)胞活性高的裸藻屬藻體。
(第2實(shí)施方式)
根據(jù)圖2，對(duì)本發(fā)明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法的第2實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
需要說(shuō)明的是，由于培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等與第I實(shí)施例相同，因此省略同樣的說(shuō)明，僅對(duì)不同點(diǎn)進(jìn)行說(shuō)明。
工序I中的好氧培養(yǎng)工序中，使用從第I實(shí)施方式的工序I中的改良 Cramer-Myers培養(yǎng)基中去掉氮源的培養(yǎng)基。
S卩，在開(kāi)始階段，用不含氮源的培養(yǎng)基開(kāi)始裸藻屬藻體的好氧培養(yǎng)。
工序I中，首先，在步驟SI中，向接種了裸藻屬藻體的培養(yǎng)基流加氮源。
然后，由步驟S2進(jìn)行好氧培養(yǎng)。
接著，在步驟S3中，判定能否終止氮源添加。
在步驟3中，如果判定為不終止氮源添加(步驟S3 :否)，則處理返回至步驟SI而流加氮源。
另外，在步驟3中，如果判定為可以終止氮源添加(步驟S3 :是)、則處理推進(jìn)至步驟S4，終止氮源添 加。
S卩，在工序I中，逐漸流加氮源，進(jìn)行含氮源的好氧培養(yǎng)。
該氮源的流加量等依賴于氣候、氣溫等條件，通過(guò)考慮這些條件來(lái)適宜地調(diào)節(jié)。
另外，作為終止氮源添加的大概標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)施方式中，在考慮上述條件等的同時(shí)， 選擇例如細(xì)胞濃度達(dá)到一定水平的時(shí)期等。
接著，在工序2(步驟S5)中，繼續(xù)進(jìn)行必要期間的好氧培養(yǎng)。
此時(shí)，雖然在初始階段殘留有氮源，但隨著時(shí)間的推移氮源被裸藻屬藻體同化，形成氮源饑餓狀態(tài)。
由此，實(shí)現(xiàn)所謂工序2的“好氧培養(yǎng)工序、無(wú)氮源”這樣的培養(yǎng)工序。
接著，在步驟S6中，實(shí)施工序3的厭氧發(fā)酵工序，該工序與第I實(shí)施方式相同。
另外，作為添加氮源的方法，還可以考慮將氮源在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)一次性投入的方法。
該情況下，雖然在初始階段殘留有氮源，但隨著時(shí)間的推移氮源被裸藻屬藻體吸收，形成氮源饑餓狀態(tài)。
由此，實(shí)現(xiàn)氮饑餓狀態(tài)下的好氧培養(yǎng)、即“好氧培養(yǎng)工序、無(wú)氮源”這樣的培養(yǎng)工序。
上述第2實(shí)施方式涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法在對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)線進(jìn)行放大時(shí)有效。
S卩，可通過(guò)連續(xù)操作進(jìn)行培養(yǎng)，而不需要用于置換培養(yǎng)基的離心分離作業(yè)等。
因此，減少培養(yǎng)所需的能源用量，有效應(yīng)用于富含蠟酯的裸藻屬藻體的大量生產(chǎn)。
接著，參照?qǐng)D3，對(duì)本實(shí)施方式涉及的由裸藻屬藻體制造蠟酯的方法的工序進(jìn)行說(shuō)明。
首先，在工序i中培養(yǎng)裸藻屬藻體。這是上述第I實(shí)施方式或第2實(shí)施方式涉及的生產(chǎn)工序中的培養(yǎng)。
接著，在工序2中提取蠟酯。
然后，將工序2中所得到的成分在工序3中進(jìn)行第I精制，接著，在工序4中進(jìn)行第2精制，得到蠟酯。
在第I精制中，利用有機(jī)溶劑由裸藻屬藻體提取蠟酯，在第2精制中，利用柱進(jìn)行蠟酯的分離精制。
這樣精制的蠟酯有效用作含有該蠟酯的生物燃料。
實(shí)施例
(關(guān)于富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法)
下面，對(duì)本發(fā)明涉及的富含蠟酯的裸藻屬藻體，示出一實(shí)施例而進(jìn)行具體說(shuō)明。
在該實(shí)施例中，使用了 Euglena graclilis Z株。
培養(yǎng)基通過(guò)對(duì)改良Cramer-Myers 培養(yǎng)基((NH4) 2HP041. Og/L、KH2PO4L Og/L、 MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、Fe2(SO2)3 · 7H20 3mg/L、 MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、 CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、 鹽酸硫胺素(維生素B1W. lmg/L、氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ5· 5)) 進(jìn)行高壓鍋滅菌來(lái)制備。
(工序1:好氧培養(yǎng))
將制備的培養(yǎng)基880ml放入IL容量的振蕩培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)后，以初始濃度為約O. 05g/ L的方式接種裸藻屬藻體的種藻體，在設(shè)定為29°C的人工氣候箱(SANYO公司制、GROWTH CABINET)內(nèi)振蕩培養(yǎng)9天。光照射強(qiáng)度設(shè)為約100 μ mol/(m2 · s)，光照射時(shí)間設(shè)為24小時(shí)連續(xù)進(jìn)行。向培養(yǎng)瓶中，供給二氧化碳?xì)怏w至其濃度為10%。
(工序2:缺氮培養(yǎng))
培養(yǎng)9天后，將培養(yǎng)液分成2份，分別置換成不含氮源的培養(yǎng)基、含有氮源的培養(yǎng)基。
具體地說(shuō)，從880ml的培養(yǎng)液分盛各420ml的培養(yǎng)液，分別離心分離舍棄上清液后，向一方沉淀中加入去掉氮源的改良Cramer-Myers培養(yǎng)基(以下,稱為氮源缺乏培養(yǎng)基，KH2PO41. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、CaCl2 · 2H20 0. 02g/L、EDTA · 2Na 0. 05g/L、 Fe2 (SO2) 3 · 7H20 3mg/L、MnCl2 · 4H201. 8mg/L、CoSO4 · 7H201. 5mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 4mg/ UNa2MoO4 · 2H20 0. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、鹽酸硫胺素(維生素 B1) 0. lmg/L、氰鈷胺素(維生素B12)、(ρΗ5· 5) 420ml，向另一方沉淀中，加入新的CM培養(yǎng)基(包含氮源)420ml， 并將沉淀混懸。
將置換成氮源缺乏培養(yǎng)基的培養(yǎng)液作為樣品1，將置換成新的CM培養(yǎng)基的培養(yǎng)液作為樣品2。
替換培養(yǎng)基后，在設(shè)定為29°C的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)一步將樣品I與樣品2同時(shí)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。光照射強(qiáng)度設(shè)為約100 μ mol/(m2 · s)，光照射時(shí)間設(shè)為24小時(shí)連續(xù)進(jìn)行。向培養(yǎng)瓶中，供給通入濃度為10%的二氧化碳?xì)怏w。
(工序3:厭氧處理)
進(jìn)行培養(yǎng)基置換培養(yǎng)后，測(cè)定樣品I和樣品2的干燥重量(表1A)，在設(shè)定為29°C 的人工氣候箱內(nèi)遮光密封培養(yǎng)瓶，靜置，由此將細(xì)胞置于厭氧狀態(tài)。
培養(yǎng)液中的裸藻屬藻體細(xì)胞的干燥重量的測(cè)定方法如下。
在干燥機(jī)內(nèi)、于105°C，預(yù)先干燥30分鐘，用測(cè)定了重量的具有約I μ m的孔徑的玻璃纖維濾紙GS-25(ADVANTEC公司制)過(guò)濾培養(yǎng)液1ml。接著，將玻璃纖維濾紙放入設(shè)定為 105 °C的干燥機(jī)內(nèi)，干燥I小時(shí)。其后，在真空干燥器內(nèi)一邊進(jìn)行減壓一邊進(jìn)行20分鐘的脫濕、冷卻，然后用精密天平秤測(cè)定重量。將過(guò)濾前后的濾紙的重量之差作為每Iml的干燥重量。
進(jìn)行厭氧處理48小時(shí)后，回收兩個(gè)樣品。使用離心分離機(jī)(K0KUSAN公司制、 H-103FN)，在常溫下，以3000rpm將回收的400ml的培養(yǎng)液離心分離5分鐘后，舍棄上清液， 回收沉淀的藻體。將回收的藻體冷凍后，進(jìn)行冷凍干燥。
(脂質(zhì)的提取)
將50ml容量的茄型燒瓶在真空干燥器內(nèi)干燥約I小時(shí)，測(cè)定茄型燒瓶本身的重量。將冷凍干燥后的裸藻屬藻體粉末用抹刀等破碎，將該粉末稱量并放入50ml容量的三角培養(yǎng)瓶中。此時(shí)，樣品I的重量為O. 693g、樣品2的重量為O. 480g(表1B)。
接著，在各樣品中加入20ml的己燒，進(jìn)彳丁混懸。為了進(jìn)一步破碎粉末塊，進(jìn)彳丁 30秒鐘的超聲波破碎。將自然沉淀后的上清液用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移到50ml容量的帶蓋玻璃制離心管中，以3000rpm離心分離10分鐘,上清液通過(guò)濾紙(Advantec公司、NO. 2)進(jìn)行過(guò)濾。
提取操作在更換溶劑的條件下反復(fù)進(jìn)行計(jì)9次。
S卩，使用己烷將上述的提取操作反復(fù)進(jìn)行3次后，將有機(jī)溶劑更換為丙酮而同樣地進(jìn)行提取操作3次，最后使用將己烷與丙酮以1:1混合的溶劑進(jìn)行提取操作3次。
其后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化器械公司制、ROTARY VACCUUMEVAP0RAT0R)，將含有濾液的茄型燒瓶在40 50°C下進(jìn)行熱水浴，使己烷、丙酮蒸發(fā)。使用少量的己烷，一邊刷洗茄型燒瓶?jī)?nèi)，一邊轉(zhuǎn)移到已秤量的茄型燒瓶?jī)?nèi)。將該操作反復(fù)進(jìn)行4次后，與上述同樣地蒸發(fā)己烷。
用鋁箔蓋住茄型燒瓶，放入真空干燥器內(nèi)，使剩余的己烷蒸發(fā)，并干燥30分鐘 I 小時(shí)左右。
測(cè)定從裸藻屬藻體粉末提取脂質(zhì)后的茄型燒瓶的重量，減去最初測(cè)定的茄型燒瓶本身的重量，而計(jì)算出脂質(zhì)重量(表1C)。
需要說(shuō)明的是，利用本提取方法來(lái)提取的脂質(zhì)的絕大部分由蠟酯構(gòu)成。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，就最終的粗脂質(zhì)的提取量而言，用氮源缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品I 為O. 188g，用含有氮源的CM培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品2為O. 157g，用氮源缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品的粗脂質(zhì)的收量多O. 031g(表1C)。
另外，就相對(duì)于厭氧處理前的干燥重量的粗脂質(zhì)的含有率而言，用氮源缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品I為23%，用含有氮源的CM培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品2為16%，用氮源缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品的脂質(zhì)含有率也高7% (表1C/A)。
進(jìn)而，樣品I在厭氧處理的前后細(xì)胞重量減少約O. 120g，在樣品2中細(xì)胞重量也減少了 O. 507g(表1B)。剛剛厭氧處理后的樣品2的培養(yǎng)液變?yōu)椴枭M(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果，死亡的細(xì)胞多，生存的細(xì)胞的大小也變小。另一方面，樣品I在剛剛厭氧處理后也呈現(xiàn)與培養(yǎng)時(shí)同樣的綠色，進(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果，幾乎沒(méi)有死亡的細(xì)胞，細(xì)胞的大小也與厭氧處理前沒(méi)有變化。由以上的結(jié)果可知，如果用不含氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧處理，則與含有氮源的培養(yǎng)基相比細(xì)胞的生存率大幅改善。
將結(jié)果總結(jié)于表I。
[表 I]
AB.CCxA厭氧處理前干燥重量 (g /'400ml)厭氧處理后干燥重量 (g / 4 O Oml)粗脂質(zhì)提取量 (g / 4 0 0ml'}脂質(zhì)含有率 ■%；樣品I (氮源缺乏培養(yǎng)基)O. 8 13O. 6 9 3O18 82 3樣品2 (CM 培養(yǎng)基)O 9 8 7O. 4 8 0O, I 5 7I b
由以上結(jié)果可知，與用含氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)相比，在被置于氮饑餓狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)區(qū)中，不僅最終的脂質(zhì)的收量增加，而且厭氧處理前后的細(xì)胞的生存率也顯著改善。
(關(guān)于蠟酯的分離精制)
接著，對(duì)于從裸藻屬藻體提取蠟酯并精制的步驟的一實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
本實(shí)施方式中，使用粉末化的裸藻屬藻體，提取貯藏于裸藻屬藻體體內(nèi)的蠟酯并精制(工序2)。
(材料)
裸藻屬藻體粉末I Okg己烷60L乙醚ILWakogel C-300300g
1.提取及過(guò)濾
(I)秤量裸藻屬藻體Ikg,混懸于2. 5L己燒中
(2)用攪拌機(jī)劇烈攪拌
30 秒鐘 X3 次
(3)在室溫下放置10分鐘，使裸藻屬藻體粉末自然沉淀
(4)將上清液用濾紙抽濾
(5)將沉淀物轉(zhuǎn)移到布氏漏斗中，擠出附著于沉淀物的油成分
(6)將(4)的濾液和(5)的回收液轉(zhuǎn)移到茄型燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(濃縮條件溫度50°C 土 10°C、減壓度IOOmmHg 150mmHg)。以下將該濃縮液記作“濃縮樣品”。
2.分離精制(工序3)
(I)向玻璃柱(I 00φ)內(nèi)填充30厘米左右(填充約300g)的用己烷混懸的Wakogel C-300
(2)流過(guò)I個(gè)柱容積的己烷使柱平衡
(3)將約500g左右的濃縮樣品投入柱內(nèi)
(4)用洗脫溶劑從保持在柱上的濃縮樣品分離蠟成分，其中所述洗脫溶劑使用如下3種溶劑
a.己烷乙醚=100 0(以下，記作“洗脫溶劑a”)
b.己烷乙醚=95 5 (以下，記作“洗脫溶劑b”)
c.己烷乙醚=90 10 (以下，記作“洗脫溶劑c”)
(5)通過(guò)對(duì)分離的蠟成分進(jìn)行酸水解來(lái)進(jìn)行第2精制(工序4)。
結(jié)果
示出利用上述方法來(lái)實(shí)施的蠟酯的提取結(jié)果。
(I)由裸藻屬藻體IOKg提取到約3L左右的蠟成分。
根據(jù)最終的回收率可認(rèn)為，通過(guò)一次的己烷提取能夠?qū)⑾灣煞謳缀跞炕厥铡?br> (2)進(jìn)行過(guò)濾時(shí)，過(guò)濾性不良，因此在濾紙上散撒硅藻土后進(jìn)行過(guò)濾。
(3)進(jìn)行濃縮時(shí)，如果在30°C左右進(jìn)行濃縮，則因揮發(fā)熱而濃縮液冷卻，從表面開(kāi)始蠟成分的粘性變高，因突沸 而噴出到蒸發(fā)器內(nèi)。為了避免該現(xiàn)象，如果在50°C左右進(jìn)行濃縮，則蠟成分的粘性下降，能夠避免因突沸噴出到蒸發(fā)器內(nèi)。
(4)流過(guò)I個(gè)柱容積的己烷使柱平衡后，將約500g左右的濃縮樣品投入柱內(nèi)，但 280g左右未得到保持，而直接洗脫下來(lái)。因此，流過(guò)2個(gè)柱容積的洗脫溶劑a，將未保持的成分洗脫而濃縮。
(5)然后，流過(guò)3個(gè)柱容積的洗脫溶劑b，進(jìn)行洗脫及濃縮，結(jié)果可知，蠟成分與黃色的色素一起被洗脫下來(lái)。
(6)接著，為了完全洗脫蠟成分，流過(guò)3個(gè)柱容積的洗脫溶劑C，進(jìn)行洗脫及洗脫。
此時(shí)，能夠回收約240g(300mL)左右的蠟成分。
另外，雖然能夠分離出葉綠素成分，但若干色素雖然濃度很低但殘留下來(lái)。
考察
根據(jù)上述的結(jié)果，用于保持240g左右的蠟成分所需的柱容量為約2L(約Ikg)，洗脫所需的溶劑的量為9個(gè)柱容積(約18L)。
可知，在蠟成分為2. 5kg的情況下，所需的柱容量為約24L(約12kg)，洗脫所需的溶劑的量為約200L左右。
如上所述，通過(guò)在分離后，進(jìn)行水解，從而蠟酯的碳鏈變短，揮發(fā)性增加，作為燃料的價(jià)值升高。
并且，該蠟酯可以有效使用作為生物燃料。
裸藻屬藻體在健康食品等中也使用，如此，其是容易獲得的微生物，并且能夠大量培養(yǎng)。
通過(guò)從這樣的微生物、即裸藻屬藻體回收優(yōu)質(zhì)的蠟酯，能夠穩(wěn)定地供給清潔的能量。
需要說(shuō)明的是，本例中，雖然用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，但提取方法并不限于此，例如， 也可以使 用這樣的方法用水分離、使用二氧化碳流體的方法、壓榨等物理方法。
權(quán)利要求
1.一種富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其包括第I工序?qū)⑽⒃孱惖穆阍鍖僭弩w好氧培養(yǎng)；第2工序?qū)⑴囵B(yǎng)有所述微藻類的裸藻屬藻體的培養(yǎng)基設(shè)為氮饑餓狀態(tài)后進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)；以及第3工序?qū)⒓?xì)胞保持在厭氧狀態(tài)下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述氮饑餓狀態(tài)通過(guò)將所述培養(yǎng)基置換成氮源缺乏培養(yǎng)基來(lái)創(chuàng)建。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述第I工序中，在將所述微藻類的裸藻屬藻體用不含氮源的培養(yǎng)基開(kāi)始好氧培養(yǎng)的同時(shí)，適宜地調(diào)節(jié)流加量而加入氮源，進(jìn)行持續(xù)且好氧的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到一定水平時(shí)停止氮源的流加，所述第2工序中，置于氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求3所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述第I工序中，通過(guò)通入二氧化碳?xì)怏w，而賦予混有二氧化碳源的氧氣源。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述二氧化碳?xì)怏w為從發(fā)電廠排放的二氧化碳?xì)怏w。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述第3工序中，利用選自通入不活潑氣體、靜置處理、借助離心分離的濃縮中的至少一種方法，進(jìn)行厭氧處理。
7.一種蠟酯的制造方法，其特征在于，使用利用權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法所生產(chǎn)的富含蠟酯的裸藻屬藻體，并實(shí)施如下工序用有機(jī)溶劑提取油組份而得到提取液，將該該提取液濃縮而得到蠟成分的工序；利用柱從所述蠟成分中分離蠟酯而進(jìn)行第I精制的工序。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，所述濃縮在50°C±10°C的范圍內(nèi)實(shí)施。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，實(shí)施如下的工序作為后續(xù)工序?qū)νㄟ^(guò)所述進(jìn)行第I精制的工序而得到的所述蠟酯進(jìn)行水解而進(jìn)行第2精制的工序。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蠟酯的制造方法，其特征在于，所述進(jìn)行第I精制的工序中， 使用己烷或?qū)⒚岩?0體積％以下混合后的己烷和醚的混合溶劑作為適用于所述柱的洗脫溶劑。
全文摘要
本發(fā)明提供富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法及蠟酯制造方法，所述裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法通過(guò)利用光合作用以二氧化碳為碳源將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)后，在氮饑餓狀態(tài)下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，從而增加每一個(gè)細(xì)胞的裸藻淀粉蓄積量，然后置于厭氧狀態(tài)下，由此能夠生產(chǎn)富含蠟酯的裸藻屬藻體。本發(fā)明涉及富含蠟酯的裸藻屬藻體的生產(chǎn)方法，其包括第1工序，將微藻類的裸藻屬藻體好氧培養(yǎng)；第2工序，將培養(yǎng)基設(shè)為氮饑餓狀態(tài)后進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)；第3工序，將細(xì)胞保持在厭氧狀態(tài)下。
文檔編號(hào)C12N1/12GK103003413SQ201180035039
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者嵐田亮, 莎拉巴妮·米特拉 申請(qǐng)人:優(yōu)瑞納股份有限公司