一種細(xì)胞色素p450酶的特異性探針底物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)胞色素P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合物及其在細(xì)胞色素P450酶亞型酶活檢測中的應(yīng)用，所述組合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成，通過所述特異性探針底物組合物和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以同時(shí)檢測多離子通道的特性，同時(shí)間測定6種CYP450酶的抑制情況，極大地提高了實(shí)驗(yàn)通量效率，降低了實(shí)驗(yàn)成本。
【專利說明】一種細(xì)胞色素 P450酶的特異性探針底物組合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶學(xué)和生物分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種特異性探針底物組合物及其 應(yīng)用，尤其涉及一種細(xì)胞色素 P450酶的特異性探針底物組合物及其在細(xì)胞色素 P450酶亞 型酶活檢測中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞色素 P450(CYP450)酶分布于肝臟、小腸和腎臟，其中CYP1A2、2A6、2B6、2C8、 2C9、2C19、2D6、2E1和3A4等亞型與外源性物質(zhì)（如藥物）代謝清除密切相關(guān)，參與90%的 藥物代謝。在新藥研發(fā)過程中，可以通過這些CYP450酶的探針底物在體外代謝體系（如人 肝微粒體等）生成特異性代謝產(chǎn)物的速率，判斷藥物是否會抑制特定的CYP酶亞型，進(jìn)而推 斷該藥物是否會引起體內(nèi)藥物間相互作用，降低藥效或增加毒性。
[0003] 近年來，對高通量藥物篩選的需求日益增加，目前，用于研究CYP活性的方法主要 中，"cocktail"探針?biāo)幬锓ㄝ^為常見，但其仍有很多不足之處，如構(gòu)成該cocktail的幾種 藥物在共同孵育時(shí)可能存在著相互作用，而且對分析方法的靈敏度和特異性要求較高，這 樣就會提高分析成本。
[0004] 隨著組合化學(xué)和高通量篩選手段的采用，需要進(jìn)行CYP450酶抑制作用篩選的化 合物急劇增多，而目前由于分析方法（如高效液相、紫外或熒光）的靈敏度限制，每次分析 僅能預(yù)測化合物對單個(gè)酶的抑制作用，耗時(shí)低效。
[0005] 因此，尋找一種可靠的混合探針底物和高靈敏度的分析方法是目前亟待解決的問 題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性探針底物組合物及其應(yīng)用，特別是一種細(xì)胞色 素 P450酶的特異性探針底物組合物及其在細(xì)胞色素 P450酶亞型酶活檢測中的應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素 P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合 物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成。本發(fā)明的 特異性探針底物組合物例如可以是：非那西丁與香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸或 睪酮中任意一種或至少兩種的組合，或者，香豆素與非那西丁、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚 酸或睪酮中任意一種或至少兩種的組合等等，優(yōu)選為非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙 芬、雙氯酚酸和睪酮的組合物。
[0009] 其中，所述非那西丁的濃度為7. 5-30 μ M，例如可以是：7. 5 μ M、8. 5 μ M、10. 5 μ M、 12. 5 μ Μ、15 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ、23 μ Μ、25 μ Μ、30 μ Μ，優(yōu)選為 15-25 μ Μ，更優(yōu)選為 15 μ Μ。
[0010] 所述香豆素的濃度為1.25-5以]?，例如可以是1.25以]\1、1.5以]\1、2.(^]\1、2.25 4]\1、 2·5μΜ、2·75μΜ、3μΜ、3·5μΜ、4μΜ、4·5μΜ、5μΜ，優(yōu)選為 1·25-3·5μΜ，更優(yōu)選為 2· 5 μ Μ。
[0011] 所述安非他酮的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 75μΜ、5μΜ、5· 25μΜ、6· 5μΜ、7μΜ、7· 5μΜ、8μΜ、8· 25μΜ、8· 5μΜ、9μΜ、9· 5μΜ、 10 μ Μ，優(yōu)選為3. 5-8 μ Μ，更優(yōu)選為5 μ Μ。
[0012] 所述右美沙芬的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 優(yōu)選為3. 5-8 μ Μ，更優(yōu)選為5 μ Μ。
[0013] 所述雙氯酚酸的濃度為2. 5-10μΜ，例如可以是2. 5μΜ、3μΜ、3. 5μΜ、4μΜ、 4· 5 μ Μ、5 μ Μ、5· 25 μ Μ、6· 5 μ Μ、7 μ Μ、7· 5 μ Μ、8 μ Μ、8· 25 μ Μ、8· 5 μ Μ、9 μ Μ、9· 5 μ Μ、10 μ Μ, 優(yōu)選為3. 5-8 μ Μ，更優(yōu)選為5 μ Μ。
[0014] 所述睪酮的濃度為5-20μΜ，例如可以是5μΜ、6· 5μΜ、8μΜ、10μΜ、12μΜ、 15 μ Μ、16 μ Μ、17 μ Μ、18 μ Μ、20 μ Μ，優(yōu)選為 8-18 μ Μ，更優(yōu)選為 10 μ Μ。
[0015] 第二方面，本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一方面所述的特異性探針底物組合物在檢 測細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型酶活性的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的細(xì)胞色素 Ρ450酶可以是來源于肝、腎和胃腸道等含有Ρ450酶的細(xì)胞和 亞細(xì)胞器，如肝細(xì)胞、微粒體和S9等。
[0017] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明的應(yīng)用包括利用如本發(fā)明第一方面所述的特異性探針 底物組合物檢測細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
[0018] 在進(jìn)行檢測時(shí)，可以結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)進(jìn)行，或者采用高效液相 色譜等檢測手段，都可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
[0019] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟：
[0020] (1)將所述的特異性探針底物組合物同時(shí)與肝微粒體在體外進(jìn)行孵化反應(yīng)；
[0021] (2)采用液相色譜-質(zhì)譜分析方法同時(shí)測定所述的特異性探針底物組合物及其生 成的對應(yīng)的6種代謝產(chǎn)物；
[0022] (3)選擇6種細(xì)胞色素 Ρ450酶的特異性抑制劑加入到其所對應(yīng)酶的單個(gè)探針底物 及混合探針底物的反應(yīng)體系中，測定生成的代謝物，計(jì)算相應(yīng)IC50值。
[0023] 優(yōu)選地，所述孵化時(shí)間為5_20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、 lOmin、12min、14min、15min、16min、18min、20min,優(yōu)選為 7_15min,更優(yōu)選為 10min〇 優(yōu)選 地，步驟（2)所述的代謝產(chǎn)物為對乙酰氨基酚、羥基香豆素、羥基安非他酮、右羥嗎喃、4-羥 基雙氯酚酸和6 β -羥基睪酮。
[0024] 本發(fā)明的肝微粒體包括但不限于人源性的，還包括大鼠、小鼠、狗、猴、樹駒等靈長 類動(dòng)物，優(yōu)選為人肝微粒體。
[0025] 第三方面，本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一方面所述的特異性探針底物組合物制成 藥學(xué)上可接受的制劑。
[0026] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述的制劑為溶液劑。
[0027] 第四方面，本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一方面所述的特異性探針底物組合物在制 備測定肝藥酶活性藥物的應(yīng)用。
[0028] 第五方面，本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第三方面所述的制劑在制備測定肝藥酶活性 藥物的應(yīng)用。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0030] 本發(fā)明采用的6種混合CYP450酶探針底物，特異性強(qiáng)，任一探針底物均可被目標(biāo) 細(xì)胞色素 P450高特異性地代謝成為相應(yīng)的單羥化產(chǎn)物；相互間的干擾低，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)樣 品中多個(gè)反應(yīng)互不干擾，可用于檢測待測物對多個(gè)酶的抑制情況；
[0031] 此外，本發(fā)明采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定量分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量效率， 大大節(jié)約了檢測的成本和時(shí)間，而且更接近肝組織代謝過程，更好地模擬了肝酶代謝環(huán)境。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物1A2對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。
[0033] 圖2是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物2A6對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。
[0034] 圖3是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物2B6對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。
[0035] 圖4是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物3A4對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。
[0036] 圖5是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物2D6對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。
[0037] 圖6是本發(fā)明的特異性探針底物組合物與單獨(dú)底物2C9對各CYP450酶的產(chǎn)物-時(shí) 間曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明 了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。
[0039] 實(shí)施例1篩詵特異件強(qiáng)的CYP450酶探針底物
[0040] (1)分別測定CYP450酶和其常用的探針底物間的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示， 作為挑選探針底物的參考和依據(jù)。
[0041] 表 1
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)胞色素 P450(CYP450)酶的特異性探針底物組合物，其特征在于，所述組合物 由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、雙氯酚酸和睪酮中的至少兩種組成；其中，非那 西丁的濃度為7. 5-30 μ M，香豆素的濃度為1. 25-5 μ M，安非他酮的濃度為2. 5-10 μ M，右美 沙芬的濃度為2. 5-10 μ Μ，雙氯酚酸的濃度為2. 5-10 μ Μ，睪酮的濃度為5-20 μ Μ。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性探針底物組合物在檢測細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型酶 活性中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括采用權(quán)利要求1所述的特 異性探針底物組合物檢測細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用； 優(yōu)選地，采用權(quán)利要求1所述的特異性探針底物結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)或高效 液相色譜技術(shù)檢測細(xì)胞色素 Ρ450酶6種亞型的抑制作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測方法包括以下步驟： (1) 將所述的特異性探針底物組合物同時(shí)與肝微粒體在體外進(jìn)行孵化反應(yīng)； (2) 采用液相色譜-質(zhì)譜分析方法同時(shí)測定所述的特異性探針底物組合物及其生成的 對應(yīng)的6種代謝產(chǎn)物； (3) 選擇6種細(xì)胞色素 Ρ450酶的特異性抑制劑加入到其所對應(yīng)酶的單個(gè)探針底物及混 合探針底物的反應(yīng)體系中，測定生成的代謝物，計(jì)算相應(yīng)IC50值； 優(yōu)選地，所述孵化時(shí)間為5-20min，優(yōu)選為lOmin。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2)所述的代謝產(chǎn)物為對乙酰氨基 酚、7-羥基香豆素、羥基安非他酮、去甲右美沙芬、4-羥基雙氯酚酸和6 β -羥基睪酮。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性探針底物組合物制成藥學(xué)上可接受的制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于，所述的制劑為溶液劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性探針底物組合物在制備測定肝藥酶活性藥物的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑在制備測定肝藥酶活性藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/26GK104195218SQ201410446334
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】張素行, 張飛鵬, 葉沛珍, 陳濤, 龍娜, 張科之, 黃曉勇 申請人:廣東中西達(dá)一新藥開發(fā)有限公司