轉(zhuǎn)基因玉米mon88017品系特異定量pcr精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁皇，同時(shí)彌補(bǔ)和完 善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和 選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法已成為必要。
[0003] 目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法， 尚無(wú)關(guān)于擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)（基因序列）的 高靈敏度定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高和靈敏度高的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉 米M0N88017及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針，
[0007]其中，
[0008]上游引物序列：EventM0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
[0009]下游引物序列：EventM0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCAITTACA-3'；
[0010] 熒光探針序列：
[0011]EventM0N88017-Probe:5' -FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3' 〇
[0012] 轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0013](1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
[0014]上游引物序列：EventM0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
[0015]下游引物序列：EventM0N88017-Reverse:5,-CCGGACATGAAGCCAITTACA-3，；
[0016] 熒光探針序列：
[0017]EventM0N88017-Probe:5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'；
[0018] (2)制備M0N88017品系的DNA稀釋液；
[0019] (3)配制PCR反應(yīng)體系；
[0020] (4)定量PCR檢測(cè)。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟（1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為10ym〇l/l，步驟（2) 所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/y1。
[0022] 再進(jìn)一步地，步驟（3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3y 1的DNA稀釋液加入到 反應(yīng)體系中，所得的反應(yīng)體系包括以下組分：
[0023]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列：Event M0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3' ； 下游引物序列：Event M0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3' ； 焚光探針序列： Event M0N88017-Probe :5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3' 。
2. 轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列：Event M0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3' ； 下游引物序列：Event M0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3' ； 焚光探針序列： Event M〇N88〇17-Pr〇be ： 5'-Fam-Cttttttgccggagtatgacggtgacg-S'； (2) 制備M0N88017品系的DNA稀釋液； (3) 配制PCR反應(yīng)體系； (4) 定量PCR檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其 特征在于，步驟（1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟（2)所述制備的 DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其 特征在于，步驟（3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中， 所得的反應(yīng)體系包括以下組分： 2. Taqman Master mix 12. 5M-1 上游引物 ιμL 下游引物 ιμL 熒光探針 0. 8μ1 DNA稀釋液 3. 〇μ1 水 6· 7μ1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的轉(zhuǎn)基因玉米Μ0Ν88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方 法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，60°C退 火60s，45個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列Event MON88017-Forward、下游引物序列Event MON88017-Reverse、熒光探針序列Event MON88017-Probe、MON88017品系的DNA稀釋液以及Taqman Master mix（2×）和水配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明主要建立了一種高擴(kuò)增效率、高準(zhǔn)確度的Taqman定量PCR檢測(cè)技術(shù)，適用于國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)、進(jìn)出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗(yàn)、企業(yè)內(nèi)部進(jìn)口原材料含轉(zhuǎn)基因MON88017品系生物成分檢測(cè)。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104830857
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510280706
【發(fā)明人】王東, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 常麗娟, 張富麗, 尹全, 劉文娟
【申請(qǐng)人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日