一種用于特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的引物、探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的引 物、探針及其應(yīng)用，并進(jìn)一步公開了一種特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸桿菌科細(xì)菌隸屬于細(xì)菌界，腸桿菌科包括無芽孢、周身鞭毛或無鞭毛的革蘭氏 染色陰性直桿菌，具有分布廣的特點，其寄主范圍大，人、動物、植物都有寄生或共生、附生、 腐生，也可在土壤或水中生存，與人類關(guān)系密切。腸桿菌科細(xì)菌易于培養(yǎng)，繁殖快（在適宜 條件下每20~30分鐘可增殖一代）。
[0003] 腸桿菌科細(xì)菌具有化能有機(jī)營養(yǎng)，兼營呼吸代謝和發(fā)酵代謝；可通過氧化多種簡 單有機(jī)化合物或發(fā)酵糖、有機(jī)酸或多元醇來獲取能量；大部分能在含有一種碳源的無機(jī)氮 培養(yǎng)基上生長；有些種生長時需要某種氨基酸或水溶性維生素；除個別血清型外，接觸酶 均為陽性，氧化酶陰性；除歐文氏菌屬中的少數(shù)種外，均還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；DNA(脫氧 核糖核酸）中的G+C(鳥嘌呤和胞嘧啶）克分子含量為39~59 %。
[0004] 而阪崎腸桿菌，屬于腸桿菌科，是寄生在人和動物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌，無芽 孢，周生鞭毛，能運(yùn)動，其包括埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏 菌屬、變形桿菌屬、耶爾森氏菌屬等屬的菌體。阪崎腸桿菌可導(dǎo)致嬰兒及早產(chǎn)兒腦膜炎、敗 血癥和壞死性結(jié)腸炎，死亡率高達(dá)50%，已引起世界多國相關(guān)部門的重視。國家食源性疾病 監(jiān)測網(wǎng)自2007年起把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方食品重點監(jiān)測病原菌。
[0005] 目前大多數(shù)中國企業(yè)采用培養(yǎng)基篩選法檢測嬰兒配方食品中的阪崎腸桿菌，具體 操作參照國標(biāo)478940-2010,操作步驟如下：
[0006] (1)前增菌和增菌
[0007] 取檢樣100g(mL)加入已預(yù)熱至44°C裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手 緩緩地?fù)u動至充分溶解，36°C±1°C培養(yǎng)18h±2h。移取ImL轉(zhuǎn)種于IOmLmLST-Vm肉湯， 44°C±0. 5°C培養(yǎng) 24h±2h。
[0008] (2)分離
[0009] 2. 1輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個阪 崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36°C±1°C培養(yǎng)24h±2h。
[0010] 2. 2挑取1個~5個可疑菌落，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA)平板。 25°C±1°C培養(yǎng) 48h±4h。
[0011] ⑶鑒定
[0012] 自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定。可選擇生化鑒定試劑盒或 全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。
[0013] 上述培養(yǎng)基篩選法的缺點如下：
[0014] 1、總的檢測時間需5天左右，且需要接種大量不同的培養(yǎng)皿，費(fèi)時費(fèi)力。
[0015] 2、需要大量培養(yǎng)基原材料，耗材等。
[0016] 3、需要大量的空間放置這些培養(yǎng)皿以及需要大量的人力清洗培養(yǎng)皿。
[0017] 除培養(yǎng)基篩選法以外還有熒光PCR方法的檢測技術(shù)（中華人民共和國出入境檢驗 檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1632. 3-2005)。PCR全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用兩段（20-24個核苷 酸）寡核苷酸作為反應(yīng)的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列不發(fā)生互補(bǔ)作用。但它們可以 和成為模板的待測DNA兩條鏈上的位點分別發(fā)生互補(bǔ)。反應(yīng)液由包括含有鎂離子的反應(yīng)緩 沖液，DNA聚合酶，4種單核苷酸（dNTP)，模板DNA以及引物組成。通過溫度的變化（變性， 退火，延伸）合成兩個互補(bǔ)位點之間的DNA片段。這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使DNA片段得以擴(kuò) 增。經(jīng)30左右個循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106。
[0018] 而熒光PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的寡核苷酸熒光探針，該探針5'端 標(biāo)記了FAM熒光素，3'端標(biāo)記了TAMRA熒光素，此時FAM的熒光被TAMRA猝滅，儀器檢測不 到熒光。PCR延伸階段，DNA聚合酶發(fā)揮其5' -3'外切核酸酶功能，將探針切割，與此同時 標(biāo)記在探針上的FAM游離出來，其所發(fā)出的熒光不再被TAMRA所猝滅而被儀器檢測到。PCR 過程中，每對目的片段進(jìn)行一次有效的擴(kuò)增，同時對探針進(jìn)行了一次切割以及對FAM進(jìn)行 了一次檢測。儀器檢測到FAM的增量，可以間接的反映目的片段的擴(kuò)增量。具體操作步驟 如下：
[0019] (1)、取ImL增菌后的樣品加到I. 5mL無菌離心管中；
[0020] (2)、8000r/min離心5min，盡量去除上清液；
[0021 ] (3)、加50yLDNA提取液，充分混勻；
[0022] (4)、沸水浴 5min;
[0023] (5)、12000r/min離心5min。上清液即可作為模板DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；
[0024] (6)、反應(yīng)體系總體積為25yL。其中含：10倍緩沖液2. 5yL，引物對（10ymol/L) 各IyL，dNTP(lOmmol/L)IyL，DNA聚合酶（5U/yL) 0? 5yL，水 17yL，模板DNA2yL;
[0025](7)、反應(yīng)程序為：1. 37°C5min，95°C預(yù)變性 3min;2. 95°C變性 5s，60°C退火延伸 40s，40個循環(huán)，同時收集FAM熒光；
[0026] (8)、再次，雜交需要配備專用雜交爐，占用空間多，控制條件復(fù)雜，很難實現(xiàn)高通 量。
[0027] 上述熒光PCR法檢測技術(shù)的缺點如下：
[0028] 1、特異性較低：由于引物和探針設(shè)計的問題，對于食品中條件致病菌的檢測，幾乎 僅局限于檢驗一種致病菌，很少實現(xiàn)一步實驗的同時檢驗，不能完全包括阪崎腸桿菌和腸 桿菌的所有菌種。
[0029] 2、假陽性率高：死亡的阪崎腸桿菌是無害的，但仍能檢測出來。由于死細(xì)胞的累積 顯示出了失活的腸桿菌細(xì)胞的高本底，以及在實驗操作過程中游離的DNA片段形成的氣溶 膠都會導(dǎo)致實驗結(jié)果的假陽性，從而會因為繼續(xù)后續(xù)實驗而徒增工作量。
[0030] 3、假陰性率高：不能排除由于PCR抑制劑的存在而出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象。
[0031] 4、結(jié)果較難判定：單純以Ct值判定結(jié)果，不夠嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確。
[0032] 可見，現(xiàn)有常規(guī)的檢測方法對于腸桿菌科細(xì)菌尤其是阪崎腸桿菌的檢測均有其弊 端，亟需開發(fā)一種可以快速、準(zhǔn)確的特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌尤其是阪崎腸桿菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0033] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種可以特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的引物、 探針及其應(yīng)用，并進(jìn)一步公開了一種特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的方法；
[0034] 本發(fā)明解決的第二個技術(shù)問題在于提供一種可以同時檢測腸桿菌科細(xì)菌及阪崎 腸桿菌的引物、探針及其應(yīng)用，并進(jìn)一步公開了一種同時檢測腸桿菌科細(xì)菌及阪崎腸桿菌 的方法。
[0035] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的引物，所述引 物的序列結(jié)構(gòu)如下：
[0036] 腸桿菌科-F:5，-CTGAAAGCATCTAAGCACGAAACTTG-3，；
[0037] 腸桿菌科-R:5' -GTCGTCTTCAACGITCCTTCAGG-3';
[0038] 內(nèi)部陽性對照-F :5'-TGTGAAATACCGCACAGATG-3' ；
[0039] 內(nèi)部陽性對照（IAC)-R:5' -AGCTGGCGTAATAGCGAAG-3'。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種用于特異性檢測阪崎腸桿菌的探針，所述探針的序列結(jié)構(gòu)如 下：
[0041] 腸桿菌科細(xì)菌探針：
[0042] 5， -HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3';
[0043] 內(nèi)部陽性對照探針：
[0044] 5' -R0X-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3'。
[0045] 本發(fā)明還提供了一種用于特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的試劑盒，包括所述的引物及 所述的探針，以及光敏感性物質(zhì)。
[0046] 所述光敏感性物質(zhì)包括可與DNA的堿基形成共價鍵的溴化乙錠單疊氮溴（EMA)， 其濃度為125yg/mL。
[0047] 進(jìn)一步的，所述試劑盒還包括：
[0048] 內(nèi)部陽性對照物，所述內(nèi)部陽性對照物包括pUC19質(zhì)粒DNA;
[0049] DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；
[0050] 腸桿菌科細(xì)菌的DNA為陽性對照、PCR級水為陰性對照；
[0051] 緩沖蛋白胨水和DNA提取液；
[0052] 并選擇性的添加可視化的黃色染料。
[0053] 本發(fā)明還公開了一種特異性檢測腸桿菌科細(xì)菌的方法，即采用所述的試劑盒，該 檢測方法包括以下的步驟：
[0054] (I)DNA的提?。?br>[0055] 取待檢樣品進(jìn)行增殖培養(yǎng)、富集，向100y1富集液中加入300y1溴化乙錠單疊氮 溴，然后室溫暗室培養(yǎng)5min，之后在500W光下曝光5min，離心、除去上清液，再加入DNA提 取液，充分混勻、培養(yǎng)、離心，取上清液作為模板DNA;
[0056] (2)PCR反應(yīng)體系：
[0057] 25yL的反應(yīng)體系包括18yL所述引物和探針；IyL的所述DNA聚合酶和尿嘧 啶-DNA糖基化酶的混合物；IyL內(nèi)部陽性對照物；5yL模板DNA或陽性對照物或陰性對照 物；
[0058] (3)PCR反應(yīng)程序：
[0059] 在37°C下4min，95°C預(yù)變性5min;95°C變性10s，65°C退火延伸70s，40個循環(huán)，同 時收集FAM，HEX和ROX熒光信號；
[0060] (4)結(jié)合擴(kuò)增曲線圖判定實驗結(jié)果。
[0061] 本發(fā)明還提供了一種用于特異性檢測腸桿菌科及阪崎腸桿菌的試劑盒，包括：
[0062] 阪崎腸桿菌-F:5，-AGGGGATATTGTCCCCTGAAACAG-3，；
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