本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及用于檢驗(yàn)臨床樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組及試劑盒。
背景技術(shù)：
：作為一種臨床常見的疾病，細(xì)菌感染的危害性極大，嚴(yán)重威脅人類健康，甚至產(chǎn)生致命危害。其中無(wú)菌體液(血液、腦脊液、胸腹水、關(guān)節(jié)液)的感染病引起的后果更加嚴(yán)重，往往導(dǎo)致急危重癥和多器官功能衰竭，如果不能快速診斷，并給予正確治療，病死率極高。目前臨床上多應(yīng)用培養(yǎng)技術(shù)來診斷細(xì)菌感染，此方法雖然特異性高，但存在如下不足：(1)苛養(yǎng)菌或培養(yǎng)條件特別的細(xì)菌臨床分離率低；(2)細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物或無(wú)法人工培養(yǎng)的微生物多培養(yǎng)陰性；(3)臨床標(biāo)本送檢之前使用廣譜抗菌藥物也容易導(dǎo)致培養(yǎng)陰性；(4)大部分細(xì)菌培養(yǎng)需要2-3天才有結(jié)果，而一些類似真菌等緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌則培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PCR(PolymeraseChainReaction)特異性擴(kuò)增病原體核酸的方法已經(jīng)越來越被人們所重視，然而，目前的PCR檢測(cè)方法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，出現(xiàn)這種結(jié)果有兩方面的原因：一方面是由于DNA分子本身具有穩(wěn)定性，當(dāng)細(xì)菌死亡裂解后DNA仍然可以長(zhǎng)期滯留在體內(nèi)，各種核酸擴(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)標(biāo)本時(shí)均難以將活菌跟死菌區(qū)分開，只有活的微生物所反映出來的信息才有意義，因此當(dāng)利用分子生物技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和分析時(shí)，檢測(cè)和分析的主體是這些活的微生物；另一方面是檢測(cè)試劑，TaqDNAPolymerase是從克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化的，由此造成的DNA污染始終都無(wú)法避免。另外，沒有內(nèi)部質(zhì)控易造成假陰性，這些都不利于臨床診斷。相關(guān)報(bào)道使用PCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本中的細(xì)菌感染，比如中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01310068046.2的發(fā)明專利提供了一種從臨床標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌感染的熒光定量PCR方法，該方法對(duì)每種細(xì)菌都設(shè)計(jì)一種特異性引物，而臨床病原體來源復(fù)雜，針對(duì)不同病原菌需要設(shè)計(jì)不同特異引物，限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。如文獻(xiàn)“建立16srRNA的PCR-SBT法細(xì)菌鑒定及在敗血癥中的應(yīng)用”(中華醫(yī)院感染學(xué)雜志2015年第25卷第10期)公開了一種利用16srRNA快速鑒定敗血癥患者體內(nèi)的細(xì)菌的PCR方法，該方法采用的是普通PCR方法，敏感度比熒光定量低，且無(wú)內(nèi)部質(zhì)控，無(wú)法有效判定陰性結(jié)果是否為假陰性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的細(xì)菌感染檢測(cè)方法中存在的缺陷，提供一種快速檢驗(yàn)臨床無(wú)菌體液中活菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了用于檢驗(yàn)樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探針。優(yōu)選的，所述熒光PCR引物探針組還包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探針。本發(fā)明還提供了一種樣本中活菌體的熒光PCR檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：(1)用PMA孵育待測(cè)樣本和熒光PCR試劑，提取待測(cè)樣本的總DNA，；(2)以總DNA為模板，并使用本發(fā)明所述的引物探針組和PMA孵育后的熒光PCR試劑進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)；(3)收集檢測(cè)通道熒光信號(hào)，得到檢測(cè)結(jié)果；在空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照成立的情況下，在熒光檢測(cè)通道中：a)若樣本有S型擴(kuò)增，且CT值小于35，則判定樣本為陽(yáng)性；b)若樣本有S型擴(kuò)增，且CT值小于40并大于等于35，則判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進(jìn)行復(fù)檢；若復(fù)檢的樣本仍有S型擴(kuò)增，且CT值小于40，則判定樣本為陽(yáng)性，否則為陰性；c)若樣本無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，但報(bào)告有CT值，則判定為非特異性擴(kuò)增。本發(fā)明還提供了一種熒光PCR檢測(cè)樣本中活菌體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的引物探針組。另一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的熒光PCR引物探針組在制備熒光PCR檢測(cè)樣本中活菌體的試劑盒中的用途。在本發(fā)明中，試劑盒利用PMA降解熒光PCR試劑和樣本中死菌殘留的DNA，避免了由試劑原因造成的假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。該試劑盒采用特異性的引物和探針，能有效提高敏感度，在診斷使用過抗菌藥物的患者標(biāo)本和苛養(yǎng)菌感染時(shí)仍能檢出細(xì)菌感染，有效避免假陰性。另外，試劑中添加了內(nèi)部質(zhì)控，可有效避免試劑失效或操作等造成的假陰性結(jié)果。本發(fā)明的有益效果在于：1、本發(fā)明的試劑盒可以用于臨床無(wú)菌體液活菌的通用檢測(cè)，在早期檢驗(yàn)中有較高的應(yīng)用價(jià)值，并且在診斷使用過抗菌藥物的患者標(biāo)本和苛養(yǎng)菌感染時(shí)，具有更好的優(yōu)越性。2、本發(fā)明的細(xì)菌快速檢驗(yàn)試劑盒靈敏度高，對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度為5.0×10cfu/mL。3、本發(fā)明采用的試劑經(jīng)過PMA處理，完全排除了受試劑影響造成的假陽(yáng)性。4、體系中加入陽(yáng)性內(nèi)質(zhì)控，在一個(gè)反應(yīng)體系中完成內(nèi)部質(zhì)量控制。5、完全簡(jiǎn)化了反應(yīng)體系的配制，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。本公開的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了用于檢驗(yàn)樣本中活菌體的熒光PCR引物探針組，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探針。其中，探針的5’有FAM；3’端有BHQ-1。其中，優(yōu)選地，還包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探針。其中，探針的5’有VIC；3’端有BHQ-1。SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列為以pET28a質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)的一對(duì)引物及探針，作為檢測(cè)的陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(IAC)。本發(fā)明還提供了一種樣本中活菌體的熒光PCR檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：(1)用PMA孵育待測(cè)樣本和熒光PCR試劑，提取待測(cè)樣本的總DNA；(2)以總DNA為模板，并使用本發(fā)明所述的引物探針組和PMA孵育后的熒光PCR試劑進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)；(3)收集檢測(cè)通道熒光信號(hào)，得到檢測(cè)結(jié)果；在空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照成立的情況下，在熒光檢測(cè)通道中：a)若樣本有S型擴(kuò)增，且CT值小于35，則判定樣本為陽(yáng)性；b)若樣本有S型擴(kuò)增，且CT值小于40并大于等于35，則判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進(jìn)行復(fù)檢；若復(fù)檢的樣本仍有S型擴(kuò)增，且CT值小于40，則判定樣本為陽(yáng)性，否則為陰性；c)若樣本無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，但報(bào)告有CT值，則判定為非特異性擴(kuò)增。其中，每條引物的最終使用濃度各自為0.2-0.6μM，每條探針的最終使用濃度各自為0.1-0.3μM。疊氮溴化丙錠(PMA)是一類對(duì)DNA具有高度親和力光敏DNA染料，經(jīng)PMA前處理后樣本暴露于強(qiáng)光下時(shí)，PMA與DNA分子共價(jià)結(jié)合，阻斷DNA分子PCR擴(kuò)增。利用PMA特性，能夠選擇性去除試劑中死菌DNA擴(kuò)增，有效避免假陽(yáng)性。PMA的質(zhì)量濃度是影響試驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素。質(zhì)量濃度過低不能全部去除試劑中死菌DNA的干擾，出現(xiàn)“假陽(yáng)性”結(jié)果。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以通過以下方法進(jìn)行PMA孵育：將PMA溶解于DMSO溶液中，制備成儲(chǔ)備液，低溫避光保存。使用時(shí)，將PMA儲(chǔ)備液稀釋為PMA工作液。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述DMSO溶液中DMSO的濃度可以為20％。樣本孵育用PMA儲(chǔ)備液中PMA濃度為500-1000μg/ml，試劑孵育用PMA儲(chǔ)備液中PMA濃度為5-20μg/ml。將待測(cè)樣本與樣本孵育用PMA溶液接觸混合，其中所述樣本孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的條件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5-10min。孵育結(jié)束后，提取樣本的總DNA作為熒光PCR模板。進(jìn)行樣本孵育的體系中PMA的工作濃度為10-20μg/ml。將熒光PCR試劑與試劑孵育用PMA溶液接觸混合，其中，試劑孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的條件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照1-3min。進(jìn)行試劑孵育的體系中PMA的工作濃度為0.5-10μg/ml。孵育結(jié)束后，加入10x引物探針混合液2.5μl；DNA模板5μl進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)。其中，優(yōu)選地，熒光PCR反應(yīng)的條件包括如下步驟：a：95℃4-6min；b：95℃15-30s，c：50-60℃15-60s，b-c循環(huán)40個(gè)反應(yīng)。在本發(fā)明所提供的方法中，閾值設(shè)定原則為以剛好超過正常陰性對(duì)照的熒光信號(hào)最高點(diǎn)為閾值線，或根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。其中，所述待測(cè)樣本可以包括但不限于血液、腦脊液、胸腹水和關(guān)節(jié)液中的至少一種。本發(fā)明的樣本中活菌體的熒光PCR檢測(cè)方法不用于診斷?；蛘哒f，檢測(cè)結(jié)果與疾病是否發(fā)生沒有一一對(duì)應(yīng)的相關(guān)性，不屬于診斷結(jié)果，但是檢測(cè)結(jié)果能夠作為中間信息，供臨床醫(yī)生參考。本發(fā)明還提供了一種熒光PCR檢測(cè)樣本中活菌體的試劑盒，其中，所述試劑盒包括本發(fā)明所述的引物探針組。其中，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括5×反應(yīng)體系緩沖液、DNA聚合酶、10×引物探針混合物、PMA、陽(yáng)性對(duì)照和超純水。在所述試劑盒中，可以將PMA溶解于DMSO溶液中，制成儲(chǔ)備液，所述DMSO溶液中DMSO的濃度可以為20％。樣本孵育用PMA儲(chǔ)備液中PMA濃度為500-1000μg/ml，試劑孵育用PMA儲(chǔ)備液中PMA濃度為5-20μg/ml。另一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的熒光PCR引物探針組在制備熒光PCR檢測(cè)樣本中活菌體的試劑盒中的用途。以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例11、引物和探針合成：按照表1所示的序列，進(jìn)行SEQIDNO.1-6的引物和探針合成。表1引物和探針序列表2、待測(cè)活菌和死菌懸液制備挑取E.coli單菌落接種于10ml的LB培養(yǎng)基中37℃，培養(yǎng)16h，高速離心(5000g，4℃，5min)收集菌體沉淀，經(jīng)0.85％滅菌生理鹽水洗滌2次后，重懸于生理鹽水中。稀釋使菌體細(xì)胞數(shù)為107cfu/ml后測(cè)定活菌數(shù)，再取部分活菌懸液95℃水浴10min，制成死菌懸液。另外，將死菌懸液在LB平板上劃線，于37℃培養(yǎng)48h，以驗(yàn)證滅活效果。3、快速檢驗(yàn)臨床無(wú)菌體液細(xì)菌感染的熒光定量PCR試劑盒的組建該試劑盒由2×PCRMasterMix、DNA聚合酶、PMA工作液A(將PMA溶于20％的DMSO溶液中獲得樣本孵育用PMA儲(chǔ)備液，其中PMA濃度為500μg/ml的溶液)、PMA工作液B(將PMA溶于20％的DMSO溶液中獲得試劑孵育用PMA儲(chǔ)備液，其中PMA濃度為6.75μg/ml的溶液)、10×引物探針混合液(引物及探針終濃度各自為400nM)、去離子水構(gòu)成。其中，2×PCRMasterMix(TaqDNAPolymerase2U；Tris-HCl40mM(pH8.3)；KCl40mM；Tween-200.04％；(NH4)2SO410mM；MgCl28mM；dNTPs0.6mM)。4、試劑盒的操作和結(jié)果判斷(1)取樣本490μL，向待檢樣本中加入PMA工作液A10μL(使孵育體系中PMA的工作濃度為10μg/ml)，充分混勻后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5min；(2)核酸提取。分別對(duì)PMA孵育后的活菌懸液和死菌懸液進(jìn)行總DNA的提取，每種樣本提取得到的總DNA溶解于TE緩沖液中，濃度為1ng/μL。(3)PMA處理試劑。取12.5μl2×PCRMaster于1.5mL離心管中，加入PMA工作液B1μl(使孵育體系中PMA的工作濃度為0.5μg/ml)，充分混勻后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照3min。(4)反應(yīng)體系配制。PMA處理過的2×PCRMasterMix試劑13.5μl；10x引物探針混合液：2.5μl；DNA模板：2-5μl；超純水補(bǔ)至25μl。(5)PCR反應(yīng)。a：95℃5minb：95℃15sc：55-60℃30sb-c循環(huán)40個(gè)反應(yīng)。(6)結(jié)果分析與判定。調(diào)整閾值：閾值設(shè)定原則為以剛好超過正常陰性對(duì)照的熒光信號(hào)最高點(diǎn)為閾值線，或根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)量控制：空白對(duì)照成立，且陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照有擴(kuò)增(VIC)，表明所有PCR反應(yīng)均成立，排除假陰性的結(jié)果，否則視實(shí)驗(yàn)無(wú)效。結(jié)果判斷：a)若樣本有S型擴(kuò)增(FAM)，且CT值<35，則判定樣本為陽(yáng)性；b)若有S型擴(kuò)增(FAM)，且35≤CT值<40，判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進(jìn)行檢測(cè)；若復(fù)檢的樣本仍有S型擴(kuò)增，仍可以判定樣本陽(yáng)性。(7)試劑盒通用性試驗(yàn)及特異性實(shí)驗(yàn)選取臨床常見的感染細(xì)菌(均來自CMCC)進(jìn)行檢測(cè)。選擇蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核增生性李斯特氏菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、嗜水氣單胞菌、溶血葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形菌、液化沙雷菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、黑色消化球菌作為通用性評(píng)估用菌株，選擇人類基因組、念珠菌、隱球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒作為特異性評(píng)估用菌株。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)這些待檢細(xì)菌，陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照均為陽(yáng)性，證明檢測(cè)系統(tǒng)成立；空白僅有IAC的擴(kuò)增；以人類基因組、念珠菌、隱球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒組成的混合模板無(wú)FAM通道擴(kuò)增；各細(xì)菌均有FAM通道特異性擴(kuò)增曲線。本實(shí)施例中以多種DNA為模板，進(jìn)行了試劑盒的通用性及特異性試驗(yàn)，全部為有效擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物克隆后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，各PCR檢測(cè)到的序列與已知各細(xì)菌序列一致，表明該方法具有較好的通用性及特異性。(8)試劑盒的最低檢出限試驗(yàn)評(píng)估用檢測(cè)樣本：選擇大腸桿菌作為特定檢測(cè)的菌株，模板梯度稀釋成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，5.0×10CFU/mL，10CFU/mL的檢測(cè)樣本，進(jìn)行操作和結(jié)果判斷，試劑盒檢測(cè)(不含IAC)的最低檢出限試驗(yàn)結(jié)果(每個(gè)濃度做三個(gè)重復(fù))如下表2所示：表2試劑盒最低檢出限試驗(yàn)結(jié)果模板濃度105CFU/mL104CFU/mL103CFU/mL102CFU/mL5.0×10CFU/mL10CFU/mL實(shí)驗(yàn)結(jié)果+/+/++/+/++/+/++/+/++/+/+-/-/-本實(shí)施例中以大腸桿菌DNA做模板，進(jìn)行了試劑盒的最低檢出限試驗(yàn)，檢測(cè)最高稀釋度為5.0×10CFU/mL，表明該方法具有較高的敏感性。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明處理試劑時(shí)PMA的使用濃度。利用實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測(cè)，區(qū)別僅在于，在用PMA孵育熒光PCR試劑時(shí)，分別加入PMA工作液至PMA工作濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、1、5、10μg/ml。選擇大腸埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)作為對(duì)照組模板，結(jié)果顯示，當(dāng)PMA工作濃度≥0.5μg/ml時(shí)，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增且對(duì)照組有擴(kuò)增，可以排除試劑中死菌DNA的干擾。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明處理試劑時(shí)的曝光時(shí)間。利用實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測(cè)，區(qū)別僅在于，PMA孵育熒光PCR試劑的光照時(shí)間分別為1、2、3、4、5、7.5、10min?？瞻讓?duì)照模板為水，對(duì)照組模板為大腸埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)。結(jié)果顯示，曝光時(shí)間超過3min后，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值變化不明顯，說明光照3min，可使加入PMA分子全部分解，3min為最佳曝光時(shí)間。實(shí)施例4本實(shí)施例用于說明處理樣本時(shí)PMA使用濃度。(1)抑制死菌PCR反應(yīng)最小PMA濃度確定按照實(shí)施例1制備大腸埃希氏菌死菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經(jīng)PMA處理后，曝光10min，孵育體系中PMA工作濃度分別為0、1、2.5、5、10、15、20μg/ml。(2)不抑制活菌PCR反應(yīng)最大PMA濃度確定按照實(shí)施例1制備大腸埃希氏菌活菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經(jīng)PMA處理后，曝光10min，孵育體系中PMA工作濃度分別為0、10、15、20、30、40、50μg/ml。利用實(shí)施例1的方法提取DNA，PCR擴(kuò)增，分析結(jié)果。PMA工作濃度≤1μg/mlPMA對(duì)Ct值沒有明顯影響，當(dāng)PMA工作濃度達(dá)到10μg/ml時(shí)，死菌細(xì)胞的PCR擴(kuò)增完全被抑制。當(dāng)PMA工作濃度≤20μg/ml時(shí)，對(duì)活細(xì)胞DNAPCR擴(kuò)增的Ct值沒有明顯影響；當(dāng)PMA工作濃度>20μg/ml時(shí)，擴(kuò)增受到抑制。因此，當(dāng)PMA工作濃度10μg/ml時(shí)，不僅有效抑制死菌擴(kuò)增還遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可以抑制活細(xì)胞擴(kuò)增的PMA工作濃度(20μg/ml)。實(shí)施例5本實(shí)施例用于說明處理樣本時(shí)的曝光時(shí)間。光照時(shí)間對(duì)活菌檢測(cè)準(zhǔn)確率具有重要影響，光照時(shí)間不足，PMA不能完全分解，在后續(xù)提取過程中會(huì)與裂解活菌DNA分子結(jié)合，使PCR反應(yīng)受到影響。按照實(shí)施例1制備大腸埃希死菌菌懸液(105cfu/ml)取500μL，分別經(jīng)PMA(終濃度10μL/ml)處理后，分別曝光1、2、3、4、5、7.5、10min。結(jié)果顯示，曝光時(shí)間超過5min后，隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值變化不明顯，說明光照5min，可使加的入PMA分子全部分解，5min為最佳曝光時(shí)間。以上詳細(xì)描述了本公開的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本公開并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本公開的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本公開的保護(hù)范圍。、另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合、為了避免不必要的重復(fù)，本公開對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本公開所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3