本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及雙泡狀熒光探針，還涉及雙泡狀熒光探針在基因定量分析、檢測單堿基變異或檢測高度同源性核酸靶分子中的應(yīng)用以及含有雙泡狀熒光探針的試劑盒。

背景技術(shù)：

基因表達異?；蚧蛲蛔兂３Ｅc疾病相關(guān)，如導(dǎo)致惡性腫瘤的癌基因突變，因此基因表達量或基因突變檢測對臨床疾病監(jiān)測具有重要意義。

現(xiàn)有的檢測技術(shù)方法眾多，主要為針對單堿基變異的熒光探針檢測技術(shù)，如水解探針(hydrolysis probes；亦叫TaqMan探針)、雜交探針(hybridization probes)、分子信標(biāo)(molecular beacons)等是最為常見，也是最為常用的檢測技術(shù)。但是，上述探針對單堿基變異檢測并不理想。一方面針對單堿基變異的上述探針設(shè)計難度大，針對同一種單堿基變異，通常需要設(shè)計幾種以上探針，以便最終篩選到一條特異性最好的探針；另一方面由于雜交動力學(xué)原因，探針對單堿基變異的識別能力有限，特異性不理想，由于不同基因型對應(yīng)的探針熔解溫度(melting temperature，Tm)極為接近，且探針的整體Tm值較高，上述探針主要依賴于Tm值的微弱差異來控制探針對模板雜交的特異性；因此，針對單堿基變異的熒光探針往往能夠與其它未變異的模板(或核酸分子)非特異性雜交，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。對于單堿基變異中的單核酸酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，由于野生型或突變型豐度均較高(通常至少達到50％比例)，因此，現(xiàn)有探針檢測技術(shù)對SNP檢測的非特異性對檢測結(jié)果并不存在太多干擾。但是，針對疾病相關(guān)的基因突變，如導(dǎo)致惡性腫瘤的癌基因突變，突變基因的豐度通常較低。隨著個體化治療的發(fā)展，對癌基因突變檢測的靈敏度提出了極高的要求，要求至少能夠檢測突變豐度僅有1％左右的突變基因，并且，對腫瘤患者外周血游離DNA的檢測靈敏度要求更高。由于存在非特異性雜交而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，現(xiàn)有探針技術(shù)并不適用于低豐度突變基因的檢測需要。因此，急需一種靈敏度更高的探針，能夠用于檢測突變豐度僅有1％左右的突變基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，為了解決現(xiàn)有探針檢測低豐度突變基因靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽性的問題，本發(fā)明首先提供在一種雙泡狀熒光探針，本發(fā)明的雙泡狀熒光探針設(shè)計簡單，適用范圍廣，能夠用于基因定量分析、單堿基變異檢測、DNA或RNA甲基化分析、高度同源性的核酸靶分子的檢測，具有高特異性識別能力，能夠完全抑制非特異性雜交。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種雙泡狀熒光探針(圖1)，所述熒光探針從5'-端至3'-端依次包括錨定序列區(qū)Ⅰ，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ、識別序列區(qū)、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ和錨定序列區(qū)Ⅱ，所述錨定序列區(qū)Ⅰ和錨定序列區(qū)Ⅱ特異結(jié)合靶序列，所述識別序列區(qū)與靶序列檢測位點雜交，所述泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ分 別標(biāo)記有相互作用性的熒光標(biāo)記系統(tǒng)，且與靶序列雜交形成泡狀結(jié)構(gòu)。探針的3’-末端可以連接有延伸阻斷基團，其功能是阻止雙泡狀熒光探針在核酸擴增體系中的延伸。其阻斷基團是在錨定序列區(qū)的3'-末端堿基位置修飾磷酸基團、氨基基團，或者在錨定序列區(qū)的3'-末端使用反轉(zhuǎn)堿基或雙脫氧核苷酸(dideoxynucleotide)。

本發(fā)明中，錨定序列區(qū)Ⅰ或錨定序列區(qū)Ⅱ的核苷酸(nucleotide,nt)長度無特殊要求，優(yōu)選長度為8～50nt，GC含量無具體要求，優(yōu)選25～75％，Tm值遠(yuǎn)高于識別序列區(qū)，通常大于65℃，甚至可高達85℃；泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ的核苷酸長度通常為1～12nt，識別序列區(qū)的核苷酸長度通常為1～3nt；泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ和識別序列區(qū)的GC含量無特殊要求，并且通常不考慮其熔解溫度(melting temperature，Tm)，但因其序列極短，其Tm值通常極低，通常小于30℃。

本發(fā)明中，所述泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ或泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ含有至少一個錯配堿基或核苷酸衍生物，錯配堿基的錯配優(yōu)選方案一是GA、CT、TT錯配，錯配優(yōu)選方案二是CC錯配，錯配優(yōu)選方案三AA和GG錯配，錯配優(yōu)選方案四CA和GT錯配。上述四種錯配優(yōu)選方案中，錯配識別能力大小依次是錯配優(yōu)選方案一至四。核苷酸衍生物可以為脫氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7-去氮-2’-脫氧肌苷(7-deaza-2’-deoxyinosine)、2-氮雜-2’-脫氧肌苷(2-aza-2’-deoxyinosine)、2’-甲氧基肌苷(2’-OMe inosine)、2’-F肌苷(2’-F inosine)、脫氧3-硝基吡咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基吡咯(3-nitropyrrole)、2’-甲氧基3-硝基吡咯(2’-OMe3-nitropyrrole)、2’-F3-硝基吡咯(2’-F 3-nitropyrrole)、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脫氧5-硝基吡咯(deoxy5-nitroindole)、5-硝基吲哚(5-nitroindole)、2’-甲氧基5-硝基吲哚(2’-OMe5-nitroindole)、2’-F5-硝基吲哚(2’-F 5-nitroindole)、脫氧4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)、4-硝基苯并咪唑(4-nitrobenzimidazole)、脫氧4-氨基苯并咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4-氨基苯并咪唑(4-aminobenzimidazole)、脫氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2’-F水粉蕈素(2’-F nebularine)、2’-F 4-硝基苯并咪唑(2’-F4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-5-硝基吲哚(PNA-5-nitroindole)、肽核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸-4-硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-3-硝基吡咯(PNA-3-nitropyrrole)、嗎啉基-5硝基吲哚(morpholino-5-nitroindole)、嗎啉基-水粉蕈素(morpholino-nebularine)、嗎啉基-肌苷(morpholino-inosine)、嗎啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)、嗎啉基-3-硝基吡咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基磷酸酯-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑 (phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’-0-甲氧基乙基肌苷(2’-0-methoxyethylinosine)、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素(2’0-methoxyethyl nebularine)、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚(2’-0-methoxyethyl 5-nitroindole)、2’-0-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑(2’-0-methoxyethyl 4-nitro-benzimidazole)和2’-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯(2’-0-methoxyethyl 3-nitropyrrole)一種或幾種；由于錯配堿基或核苷酸衍生物的存在，在錨定序列區(qū)Ⅰ、錨定序列區(qū)Ⅱ和識別序列區(qū)與靶分子互補的情況下，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ無法與靶分子互補，形成“雙泡”狀結(jié)構(gòu)，這也是本發(fā)明所述探針被命名為雙泡狀熒光探針的原因所在。本發(fā)明引入錯配堿基的目的是當(dāng)泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ或泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ所對應(yīng)的靶序列不含有T堿基的G、C、A富含核酸時，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ或泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ無法獨立標(biāo)記有相互作用性的熒光標(biāo)記系統(tǒng)(即：無法同時標(biāo)記熒光報告基團和淬滅基團)，可在泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ或泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ使用錯配堿基標(biāo)記相互作用性的熒光標(biāo)記系統(tǒng)外，可以不引入核苷酸衍生物，僅引入常用的堿基即可，大大降低了探針合成的成本。

本發(fā)明中，相互作用性的熒光標(biāo)記系統(tǒng)由熒光報告基團或淬滅基團組成。相互作用性的熒光標(biāo)記系統(tǒng)是在泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ標(biāo)記熒光報告基團，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ標(biāo)記淬滅基團(圖1)，或在泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ標(biāo)記淬滅基團，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ標(biāo)記熒光報告基團。

本發(fā)明所述熒光報告基團無具體要求，優(yōu)選方案包括羧基熒光素(6-FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)、JOE、VIC、異硫氰酸熒光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA和ROX，以及其它熒光分子或發(fā)光基團；熒光淬滅基團無具體要求，優(yōu)選方案熒光類淬滅劑(如：TAMRA、ROX)和非熒光類淬滅劑(如：DABCYL，BHQ1，BHQ2，BHQ3)。

進一步，所述熒光報告分子及淬滅分子為熒光物質(zhì)，均可利用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中公知的任何物質(zhì)，包括：Cy2^TM(506)、YO-PRO^TM-1(509)、YOYO^TM-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorX^TM(519)、Alexa^TM(520)、Rhodamine110(520)、Oregon Green^TM 500(522)、Oregon Green^TM488(524)、RiboGreen^TM(525)、RhodamineGreen^TM(527)、Rhodamine 123(529)、MagnesiumGreen^TM(531)、CalciumGreen^TM(533)、TO-PRO^TM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPYTMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、Alexa^TM546(570)、TRITC(572)、Magnesium Orange^TM(575)、Phycoerythrin R&B(575)、RhodaminePhalloidin(575)、Calcium Orange^TM(576)、Pyronin Y(580)、Rhodamine B(580)、TAMRA(582)、RhodamineRedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、Calcium Crimson^TM(615)、AlexaTM 594(615)、Texas Red(615)、Nile Red(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PRO^TM-3(660)、TOTO3(660)、DiDDilC(5)(665)、Cy5^TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)、 Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、CAL Fluor Gold 540(544)、CAL Fluor Orange 560(559)、CALFluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red 635(637)、FAM(520)、Fluorescein(520)、Fluorescein-C3(520)、Pulsar650(566)、Quasar 570(667)，Quasar670(705)及Quasar 705(610)。括號的數(shù)字為以納米單位表示的最大發(fā)光波長。

進一步，所述淬滅分子是利用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中公知的能夠?qū)V范圍波長或特定波長的熒光進行淬滅的非熒光黑淬滅分子，包括黑洞淬滅劑(BHQ:black hole quencher；包括BHQ1、BHQ2、BHQ3)、4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸(DABCYL：4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid)。

本發(fā)明所述延伸阻斷劑基團無具體要求，本發(fā)明所述雙泡狀熒光探針的識別序列區(qū)和/或錨定序列區(qū)可進一步摻入提高其錯配識別能力和/或Tm值的衍生核苷酸，優(yōu)選方案包括鎖核酸(locked nucleic acids，LNA)和肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，所述雙泡狀熒光探針在制備基因定量分析或單堿基突變的試劑中的應(yīng)用。

基因定量分析檢測原理如下(圖2):錨定序列區(qū)Ⅰ和錨定序列區(qū)Ⅱ不具備序列選擇性，分別識別核酸靶序列識別區(qū)的5'-側(cè)翼區(qū)域和3'-側(cè)翼區(qū)域，由于其較高的Tm值，該序列能夠在較廣的溫度范圍內(nèi)與核酸靶分子互補雜交；識別序列區(qū)極短，Tm值較低，只有在錨定序列區(qū)Ⅰ和錨定序列區(qū)Ⅱ與核酸靶分子互補雜交后，才能在雜交熱動力學(xué)的作用下與其核酸靶分子互補雜交，此時，識別序列區(qū)、錨定序列區(qū)Ⅰ和錨定序列區(qū)Ⅱ與核酸靶分子互補雜交，在此條件下，由于泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ的Tm值極低，不能與靶序列完全互補，所以在雙泡狀熒光探針?biāo)幍碾s交溫度條件下與核酸靶分子無法形成互補雜交雙鏈，從而在識別序列區(qū)兩端形成“雙泡狀結(jié)構(gòu)”。在PCR擴增循環(huán)中，錨定序列區(qū)Ⅰ、錨定序列區(qū)Ⅱ和識別序列區(qū)與核酸靶分子形成互補雜交雙鏈，在雙泡狀熒光探針5'-側(cè)翼區(qū)域的引物延伸過程中，當(dāng)引物的延伸產(chǎn)物延伸至泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ的5'-端時，在DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶的作用下，識別序列區(qū)的核苷酸按照5'→3'方向被依次水解成單個核苷酸，標(biāo)記于泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ的熒光報告基團(或：熒光淬滅基團)與和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ的淬滅基團(或：熒光報告基團)之間的熒光能量共轉(zhuǎn)移作用(FRET)被消除，熒光報告基團釋放熒光。根據(jù)釋放的熒光強度可以分析目標(biāo)基因的表達量。

單堿基突變檢測原理如下(圖3)：當(dāng)識別序列區(qū)對應(yīng)的核酸靶分子互補時，原理與基因定量分析相同；當(dāng)識別序列區(qū)對應(yīng)的核酸靶分子雜交區(qū)域存在單堿基變異所導(dǎo)致的單堿基錯配時，單堿基錯配會導(dǎo)致識別序列區(qū)無法與核酸靶分子形成互補雜交雙鏈，在此條件下，只有錨定序列區(qū)Ⅰ和錨定序列區(qū)Ⅱ與靶核酸分子形成互補雜交雙鏈，泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ和識別序列區(qū)處于游離單鏈狀態(tài)，形成一個“大泡狀”。因此，在PCR擴增循環(huán)中，由于核酸靶分子單堿基變異所導(dǎo)致的識別序列區(qū)與核酸靶分子的單堿基錯配，并且該單堿基錯配導(dǎo)致識別序列區(qū)與核酸靶分子無法形成互補雜交雙鏈時，識別序列區(qū)與泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ均處于游離單鏈狀態(tài)，僅錨定序列區(qū)與靶核酸分子形成互補雜交雙鏈，在此條件下，在雙 泡狀熒光探針5'-側(cè)翼區(qū)域的引物會直接順利延伸至錨定序列區(qū)Ⅰ的5'-末端，隨后，DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶的作用下，在泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ與錨定序列區(qū)Ⅰ的接合堿基處，識別序列區(qū)與泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ被消解成一個完整的片段，隨后，錨定序列區(qū)Ⅱ的核苷酸按照5'→3'方向被依次水解成單個核苷酸，在此條件下，由于識別序列區(qū)、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ的完整性，熒光報告基團和淬滅基團之間仍然有FRET作用，因此，探針不發(fā)生熒光。由上可見，只有當(dāng)識別序列區(qū)與核酸靶分子形成互補雜交雙鏈后，識別序列區(qū)才會在DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶作用水解，并釋放雙泡狀熒光探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光信號。但是，當(dāng)識別序列區(qū)與核酸靶分子無法形成互補雜交雙鏈時，識別序列區(qū)、泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ和泡狀結(jié)構(gòu)Ⅱ會保持完整形，雙泡狀熒光探針不釋放熒光。由于識別序列區(qū)的Tm值極低，當(dāng)其與核酸靶分子僅僅存在任意一種單堿基錯配時，識別序列區(qū)均不能與核酸靶分子形成互補雜交雙鏈，從而使雙泡狀熒光探針無法釋放熒光信號?？梢?，雙泡狀熒光探針的特殊結(jié)構(gòu)，以及識別序列區(qū)識別單堿基變異的能力與釋放熒光信號的方式使雙泡狀熒光探針能夠有效識別單堿基變異。

在本發(fā)明所述雙泡狀熒光探針檢測單堿基變異或基因定量分析的應(yīng)用中，可采用實時熒光定量PCR方法實時檢測核酸靶分子。檢測單堿基突變時，當(dāng)靶向不同單堿基變異核酸靶分子的雙泡狀熒光探針分別標(biāo)記了不同種類的熒光報告基團時，就可在單個反應(yīng)管中通過熒光信號的種類檢測不同單堿基變異的核酸靶分子，實現(xiàn)不同核酸靶分子的定性檢測。同時，由于熒光信號的強度與核酸靶分子的初始濃度相關(guān)，因此，可根據(jù)熒光信號的強度，或者擴增體系的循環(huán)閾值(cycle threshold,CT；是指每個反應(yīng)管中的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))判斷不同核酸靶分子的初始濃度，實現(xiàn)不同核酸靶分子的定量檢測。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，所述雙泡狀熒光探針在制備檢測高度同源性核酸靶分子的試劑中的應(yīng)用。例如，在各種感染性病原體種屬或亞型，以及其耐藥基因檢測中的應(yīng)用。通過識別序列區(qū)針對不同種屬或亞型，以及其耐藥基因的特異性核酸序列，檢測病原體種屬或亞型、以及耐藥基因，其檢測原理與檢測單堿基變異相同。在此條件下，只有當(dāng)識別序列區(qū)與核酸靶分子的特異性核酸序列完全互補時，雙泡狀熒光探針才釋放熒光信號。當(dāng)不同種屬或亞型或不同耐藥基因的雙泡狀熒光探針分別標(biāo)記上不同種類熒光時，就可在同一個反應(yīng)管中通過熒光信號的種類和強度(或：CT值)實現(xiàn)上述核酸靶分子的定性和定量檢測。

上述所指的單堿基變異為單堿基缺失、突變、插入或SNP，所指的高度同源性序列是指待檢測區(qū)域核酸靶分子特異性序列相差一個或一個以上堿基的不同核酸靶分子，如同一種屬的不同亞型的感染性病原體核酸靶分子。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，所述雙泡狀熒光探針在制備DNA或RNA甲基化分析試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，所述雙泡狀熒光探針在制備數(shù)字PCR檢測探針中的應(yīng)用，采用微流控或微滴化方法，將反應(yīng)混合物分散至包括微滴或微反應(yīng)孔在內(nèi)的若干個微反應(yīng)器中， 每個微反應(yīng)器中的每種靶分子數(shù)少于或等于1個。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，含有所述雙泡狀熒光探針的試劑盒。

本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試劑盒還包括擴增所述雙泡狀熒光探針靶序列結(jié)合區(qū)的引物對。還可以包括實時熒光定量PCR的常用試劑，如具有5'→3'核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶、dNTP、離子成分和緩沖體系。檢測時通過將雙泡狀熒光探針、引物、PCR擴增需反應(yīng)成分(包括但并不限于：具有5'→3'核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶、dNTP、適宜離子成分與緩沖體系)、核酸靶分子置于同一個反應(yīng)管內(nèi)；采用實時熒光定量PCR，經(jīng)高溫變性、適溫退火與延伸等多個循環(huán)擴增核酸靶分子，并在每一個循環(huán)或循環(huán)終點檢測熒光信號種類及其強度(或：CT值)；根據(jù)熒光信號的種類、強度(或：CT值)實現(xiàn)核酸靶分子的定性和定量檢測。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案，所述的試劑盒在實時熒光定量PCR基因定量分析、檢測單堿基變異或檢測高度同源性核酸靶分子中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開雙泡狀熒光探針設(shè)計簡單，通過在泡狀結(jié)構(gòu)Ⅰ與錨定序列區(qū)Ⅰ引入錯配堿基或核苷酸衍生物能提高探針的靈敏度，并提高識別單堿基變異的能力，且檢測靈敏度高，可達到1％或更高靈敏度，不僅可避免常見單堿基變異(如：SNP、基因突變)檢測中的假陽性，而且適用于低豐度基因突變檢測(如：腫瘤組織或外周血中的癌基因突變)，也可以用于同源性較高的感染性病原體種屬或亞型及其耐藥基因鑒定，還可以用于DNA或RNA甲基化分析。因此，本發(fā)明擴寬了探針的應(yīng)用范圍，對于疾病診斷具有重要意義。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1為雙泡狀熒光探針的典型結(jié)構(gòu)示例圖。

圖2為雙泡狀熒光探針用于基因定量分析的原理示意圖。

圖3為雙泡狀熒光探針單管檢測單堿基變異原理示意圖。

圖4為MTHFR 677C>T檢測體系的特異性。

圖5為MTHFR 677C>T檢測體系的線性范圍。

圖6為MTHFR 677C>T檢測體系的靈敏度。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1MTHFR 677C>T基因型的檢測

1、雙泡狀熒光探針引物的設(shè)計與合成

根據(jù)MTHFR(dbSNP ID:rs1801133；677C>T)基因型核酸序列特征，設(shè)計擴增該SNP 位點所在片段的上游引物SEQ ID No.1和下游引物SEQ ID No.2，同時，設(shè)計野生型和突變型所對應(yīng)常規(guī)TaqMan探針(野生型：SEQ IDNo.3；突變型：SEQ IDNo.4)和雙泡狀熒光探針(野生型：SEQ IDNo.5；突變型：SEQ IDNo.6)，二者的野生型和突變型探針均分別是FAM和VIC熒光標(biāo)記探針，序列中加粗堿基代表野生型或突變型對應(yīng)的單堿基變異序列。雙泡狀熒光探針的3'-末端修飾磷酸基團(PO₄)，下劃線堿基是與靶序列錯配的堿基，熒光基因及其所對應(yīng)的淬滅基團均分別標(biāo)記于上述錯配堿基。所有引物和探針均由上海生工公司合成。

上游引物：5’-atccctcgccttgaacagg-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物：5’-acaaagcggaagaatgtgtcag-3’(SEQ ID No.2)；

野生型TaqMan探針：5’-(FAM)gtgtctgcgggagccgatttcatcatc(BHQ1)-3’(SEQ ID No.3)；

突變型TaqMan探針：5’-(VIC)gtgtctgcgggagtcgatttcatcatc(BHQ1)-3’(SEQ ID No.4)；

野生型雙泡狀熒光探針：5’-gtgtctgcggt(FAM)agccgt(BHQ1)tttcatcatc(PO₄)-3’(SEQ ID No.5)；

突變型雙泡狀熒光探針：5’-gtgtctgcggt(VIC)agccgt(BHQ1)tttcatcatc(PO₄)(SEQ ID No.6)；

2、實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系共計20μl，該體系中包括以下組分：1×Premix Ex Taq master mix(Perfect Real Time；TaKaRa公司)；0.6μM上游和下游引物(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)；0.2μM野生型和突變型常規(guī)TaqMan熒光探針(野生型：SEQ ID No.3；突變型：SEQ ID No.4)，或者，0.2μM野生型和突變型雙泡狀熒光探針(野生型：SEQ ID No.5；突變型：SEQ ID No.6)；系列終濃度(1×10¹to 1×10⁵copies)的野生型質(zhì)控(wild-type quality control，WT-QC)質(zhì)粒和突變型質(zhì)控質(zhì)粒，或者，20～100ng人類全血基因組DNA。實時熒光PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性30秒，55℃、57℃、59℃條件下復(fù)性與延伸60秒(并同時采集熒光)。所用設(shè)備為Exicycler^TM96Real-time Quantitative Thermal Block(Bioneer,Daejeon,Korea)，熒光信號采集與分析軟件為Exicycler^TM96Software(Bioneer)。

3、結(jié)果與分析

3.1特異性：對于常規(guī)TaqMan探針(野生型：SEQ ID No.3；突變型：SEQ ID No.4)，當(dāng)反應(yīng)體系中只存在野生型模板或突變型模板時，野生型(SEQ ID No.3)和突變型探針(SEQ ID No.4)均能釋放熒光信號，提示突變型探針能夠與野生型模板非特異性雜交，而野生型探針(SEQ ID No.3)則能夠與突變型模板非特異性雜交，說明常規(guī)的TaqMan探針識別基因型的特異性差。但是，當(dāng)使用本發(fā)明所述的雙泡狀熒光探針時(野生型：SEQ ID No.5；突變型：SEQ ID No.6)，當(dāng)反應(yīng)體系中只存在野生型模板(圖4中A)或突變型模板(圖4中B)時，均只有基因型對應(yīng)的探針釋放熒光信號，即：野生型模板體系中只有野生型探針(SEQ ID No.5)釋放熒光信號(圖4中A)，突變型模板體系中只有突變型探針(SEQ ID No.6)釋放熒光信號(圖4中B)。而對于同時具有野生型和突變型模板的雜合性樣本，野生型和突變型雙泡狀熒光探針同時釋放熒光信號(圖4中C)。

3.2線性范圍：系列終濃度(1×10¹to 1×10⁵copies)的野生型質(zhì)控質(zhì)粒和突變型質(zhì)控質(zhì)粒(圖5)均只產(chǎn)生其基因型對應(yīng)的雙泡狀熒光探針的熒光信號，無任何非特異性擴增信號。在此線性范圍內(nèi)，野生型和突變型基因型的擴增效率分別是96.59％(R²＝0.999)和99.11％(R²＝0.998)，雜合型模板中的野生型和突變型基因型的擴增效率分別是95.07％(R²＝0.998)和98.27％(R²＝0.999)。該結(jié)果進一步說明野生型和突變型在本發(fā)明方法中具有等效擴增。

3.3靈敏度：當(dāng)系列濃度(1×10⁶copies～1×10⁵copies)的野生型質(zhì)粒與系列濃度(1×10¹copies～1×10⁵copies)的突變型質(zhì)粒共同存在時，本發(fā)明所述方法對突變型的檢測靈敏度達到1％(圖6)。

3.4臨床驗證：采用3.2所述反應(yīng)體系共計檢測了324例人類外周血全血基因組DNA的基因型，其中，野生型占62.3％，雜合型占32.5％，突變型占5.2％，檢測結(jié)果與核酸測序完全一致，并且，在檢測過程中平行檢測的質(zhì)控質(zhì)粒的基因型結(jié)果完全正確，說明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

實施例2檢測MTHFR 677C>T基因型的不同特性雙泡狀熒光探針

1.雙泡狀熒光探針的設(shè)計與合成

根據(jù)MTHFR(dbSNP ID：rs1801133；677C>T)基因型核酸序列特征，設(shè)計擴增該SNP位點所在片段的上游引物SEQ ID No.1和下游引物SEQ ID No.2，同時，設(shè)計野生型和突變型所對應(yīng)雙泡狀熒光探針(野生型：SEQ ID No.7到11；突變型：SEQ ID No.12到16)，野生型和突變型探針均分別是FAM和VIC熒光標(biāo)記探針，序列中加粗堿基代表野生型或突變型對應(yīng)的單堿基變異序列。雙泡狀熒光探針的3'-末端修飾氨基(NH₄)，下劃線堿基是與靶序列錯配的堿基，熒光基因及其所對應(yīng)的淬滅基團均分別標(biāo)記于上述錯配堿基。所有引物和探針均由上海生工公司合成。

上游引物：5’-atccctcgccttgaacagg-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物：5’-acaaagcggaagaatgtgtcag-3’(SEQ ID No.2)；

野生型雙泡狀熒光探針1：5’-gtgtctgcgggat(FAM)ct(BHQ1)gatttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.7)；

野生型雙泡狀熒光探針2：5’-gtgtctgcgggai(FAM)ct(BHQ1)gatttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.8)；

野生型雙泡狀熒光探針3：5’-gtgtctgcgggti(FAM)ccit(BHQ1)tttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.9)；

野生型雙泡狀熒光探針4：5’-gtgtctgcgggt(FAM)gcct(BHQ1)atttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.10)

野生型雙泡狀熒光探針5：5’-gtgtctgcii(FAM)iagccgii(BHQ1)ttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.11)；

突變型雙泡狀熒光探針1：5’-gtgtctgcgggat(FAM)tt(BHQ1)gatttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.12)；

突變型雙泡狀熒光探針2：5’-gtgtctgcgggai(FAM)tt(BHQ1)gatttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.13)；

突變型雙泡狀熒光探針3：5’-gtgtctgcgggti(FAM)tcit(BHQ1)tttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.14)；

突變型雙泡狀熒光探針4：5’-gtgtctgcgggt(FAM)gtct(BHQ1)atttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.15)；

突變型雙泡狀熒光探針5：5’-gtgtctgcii(FAM)iagtcgii(BHQ1)ttcatcatc(NH4)-3’(SEQ ID No.16)。

2.實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系共計20μl，該體系中包括以下組分：1×Premix Ex Taq master mix(Perfect Real Time；TaKaRa公司)；0.6μM上游和下游引物(SEQ ID No.1和2)；0.2μM野生型和突變型雙泡狀熒光探針(野生型：SEQ ID No.7到11中任意一種；突變型：SEQ ID No.12到16中任意一種)；1×10⁴拷貝的野生型質(zhì)控質(zhì)粒和突變型質(zhì)控質(zhì)粒，或者，20～100ng人類全血基因組DNA。實時熒光PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性30秒，55℃、57℃、59℃條件下復(fù)性與延伸60秒(并同時采集熒光)。所用設(shè)備為Exicycler^TM96Real-time Quantitative Thermal Block(Bioneer,Daejeon,Korea)，熒光信號采集與分析軟件為Exicycler^TM96Software(Bioneer)。

3.結(jié)果與分析

3.1特異性：使用本發(fā)明所述雙泡狀熒光探針時，當(dāng)反應(yīng)體系中只存在野生型模板或突變型模板時，均只有基因型對應(yīng)的探針釋放熒光信號，即：野生型模板體系中只有野生型探針釋放熒光信號，突變型模板體系中只有突變型探針釋放熒光信號。同時，對于同時具有野生型和突變型模板的雜合性樣本，野生型和突變型雙泡狀熒光探針同時釋放熒光信號。

3.2臨床驗證：共計檢測了324例人類外周血全血基因組DNA的基因型，其中，野生型占62.3％，雜合型占32.5％，突變型占5.2％，檢測結(jié)果與核酸測序完全一致，并且，在檢測過程中平行檢測的質(zhì)控質(zhì)粒的基因型結(jié)果完全正確，說明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

實施例3、雙泡狀熒光探針技術(shù)鑒別具有高度同源性的動物源性基因

臨床上常規(guī)使用的肝素抗凝劑通常來源于豬小腸提取的肝素粗制品。由于肝素是臨床常用藥，歐美國家等規(guī)定，上述肝素粗制品不得來源于包括牛羊在內(nèi)的反芻動物的小腸，主要原因在于防止反芻動物來源的肝素粗制品所導(dǎo)致的瘋牛病等動物疫源性疾病。因此，通常需要對肝素粗制品的來源做鑒定，主要是鑒定肝素粗制品中是否含有反芻動物的基因。由于反芻動物與豬基因具有高度同源性，同時，不同反芻動物的基因也具有高度同源性，常規(guī)的方法往往難以高特異性地鑒別反芻動物的種屬來源。本實施例采用本發(fā)明所述雙泡狀熒光探針檢測奶牛、山羊和綿羊等三種反芻動物基因。

1、靶向反芻動物種屬特異性線粒體序列的同側(cè)競爭性探針及其擴增引物的設(shè)計

根據(jù)反芻動物之間及其與豬線粒體核酸序列的比對結(jié)果設(shè)計雙泡狀熒光探針，種屬特異性探針的種屬特異性序列位于識別序列區(qū)，包括靶向奶牛種屬基因的SEQ ID No.17、靶向綿羊種屬基因的SEQ ID No.18、靶向山羊種屬基因的SEQ ID No.19，三者分別標(biāo)記上FAM、VIC和CY5熒光報告基團。根據(jù)上述雙泡狀熒光探針?biāo)诤怂嵝蛄形恢?，設(shè)計擴增引物SEQ ID No.20和SEQ ID No.21。

靶向反芻動物種屬特異性線粒體序列的同側(cè)競爭性探針及其擴增引物

靶向奶牛種屬基因雙泡狀熒光探針：

5’-aaactgtaaagit(FAM)ccatacct(BHQ1)iatagggttaaattctaac-3’(SEQ ID No.17)；

靶向綿羊種屬基因雙泡狀熒光探針：

5’-aaactgtaaagit(VIC)tcatactt(BHQ1)iatagagttaaattttaatt-3’(SEQ ID No.18)；

靶向山羊種屬基因雙泡狀熒光探針：

5’-aaactgtaaagit(CY5)ctacatct(BHQ2)iatagagttaaattctaat-3’(SEQ ID No.19)；

上游引物：5’-taacccaagctaacaggagt-3’(SEQ ID No.20)；

下游引物：5’-tgtagggtcactttcgtcat-3’(SEQ ID No.21)；

2、實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系共計20μl，該體系中包括以下組分：1×Premix Ex Taq master mix(Perfect Real Time；TaKaRa公司)，0.9μM正向引物和0.9μM反向引物，0.25μM奶牛種屬基因的SEQ ID No.17，0.25μM靶向綿羊種屬基因的SEQ ID No.18，0.25μM靶向山羊種屬基因的SEQ ID No.19，50ng反芻動物種屬特異性基因組DNA(包括：奶牛、綿羊和山羊)。

3、結(jié)果分析

當(dāng)反應(yīng)體系中分別只存在奶牛、綿羊和山羊基因組DNA時，均分別只能檢測到其雙泡狀熒光探針釋放的熒光信號，當(dāng)同時存在上述三種種屬特異性基因組DNA時，則能夠同時檢測到三種熒光信號。

實施例四、雙泡狀熒光探針技術(shù)鑒別感染性病原體種屬

本實施例采用本發(fā)明所述雙泡狀熒光探針檢測嗜肺軍團菌的達拉斯株和諾克斯維爾株兩種不同亞型。

1、靶向不同亞型的同側(cè)競爭性探針及其擴增引物的設(shè)計

根據(jù)嗜肺軍團菌的達拉斯株和諾克斯維爾株的亞型特異性序列，設(shè)計檢測不同亞型的雙泡狀雙泡狀熒光探針，種屬特異性探針的種屬特異性序列位于識別序列區(qū)，包括靶向達拉斯株的SEQ ID No.22、靶向諾克斯維爾株的SEQ ID No.23，上述探針對應(yīng)的擴增引物是SEQ ID No.24和SEQ ID No.25。

靶向達拉斯株雙泡狀熒光探針：

5’-ctaaaagattagcctgaatatii(FAM)itggatgaaagctii(BHQ1)igaccttcgggcctcgcg-3’(SEQ ID No.22)；

靶向諾克斯維爾株雙泡狀熒光探針：

5’-ctaaaagattagcctgii(VIC)igtctgaggacgaii(BHQ1)ictggggaccttcgggcctcgcg-3’(SEQ ID No.23)

檢測嗜肺軍團菌上游引物：5’-gggggacaacttggggaaact-3’(SEQ ID No.24)

檢測嗜肺軍團菌下游引物：5’-ccgatcgtcgccttggtaggc-3’(SEQ ID No.25)

2、實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系共計20μl，該體系中包括以下組分：1×Premix Ex Taq master mix(Perfect Real Time；TaKaRa公司)，0.9μM正向引物SEQ ID No.24和0.9μM反向引物SEQ ID No.25，0.25μM靶向達拉斯株的SEQ ID No.22，靶向諾克斯維爾株的SEQ ID No.23，10ng嗜肺軍團菌亞型特異性基因組DNA(包括：達拉斯株和諾克斯維爾株)。

3、結(jié)果分析

當(dāng)反應(yīng)體系中分別只存在達拉斯株和諾克斯維爾株基因組DNA時，均分別只能檢測到其對應(yīng)的雙泡狀熒光探針釋放的熒光信號，當(dāng)同時存在上述兩種亞型特異性基因組DNA時，則能夠同時檢測到兩種熒光信號。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。