本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種基因mRNA的m6A單堿基位點鑒定方法。
背景技術(shù)：
：m6A是指發(fā)生在堿基A第6位N原子上的甲基化修飾是一種最常見的轉(zhuǎn)錄后水平修飾，大約占全部RNA修飾的三分之二。在真核生物中，m6A大約占細胞mRNA全部腺苷含量的0.1％-0.4％。隨著二代測序技術(shù)的高速發(fā)展，各生物基因組庫逐步建立完整，利用測序來檢測基因的甲基化分布并篩選出甲基化差異基因已成為較好的研究基因甲基化的重要方式。本實驗室建立了mRNA甲基化高通量檢測方法，實現(xiàn)了多個樣本全轉(zhuǎn)錄組甲基化程度的比較，對mRNAm6A多樣性的生物學研究開辟了新的技術(shù)。但是m6A并不能影響其配對堿基的能力，且沒有化學試劑來改變或特異性標記這一修飾，現(xiàn)有技術(shù)無法精確確定m6A位點。本發(fā)明在高通量測序的基礎(chǔ)上，利用位點預(yù)測并結(jié)合分子生物學技術(shù)可以實現(xiàn)單個堿基的m6A位點準確鑒定，這為進一步研究m6A的功能提供了技術(shù)保障。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供一個基因mRNA的m6A單堿基位點鑒定方法，包括以下步驟：1)、根據(jù)《mRNA甲基化高通量檢測方法》建立的方法對樣品m6A高通量測序，根據(jù)測序結(jié)果找到靶基因，并確定其m6A峰大致位置；2)、利用在線工具SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp/)得到該基因的m6A峰區(qū)域序列中所有可能存在m6A位點；3)、將所有可能的m6A位點進行點突變，并將該基因的CDS序列和突變序列分別連入哺乳動物表達載體pSilencer4.1，構(gòu)建該基因的超表達載體和突變載體；4)、將步驟3)中得到的兩種載體分別轉(zhuǎn)染細胞，收集細胞提取RNA；將提取的RNA片段化，利用免疫沉淀反應(yīng)，得到富集的含有m6A的RNA片段；5)、將步驟4)得到的富集的含有m6A的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計各個突變位點區(qū)域的熒光定量引物；將超表達載體組和突變載體組的熒光定量結(jié)果比較，若某位點突變載體組表達量小于超表達載體組且P<0.05(t-test)，則判定該位點是m6A位點。作為本發(fā)明的基因mRNA的m6A單堿基位點鑒定方法的改進，靶基因為FAM134B基因，其突變(同義突變)為：位點1：GGACA→GGCCA位點2：TGACC→TGCCC位點3：GGACA→GGCCA；熒光定量PCR引物為：位點1：F5’-ACGGGACCTTCAACCTTTCA-3’R5’-AGTGCCTCTCTTTGCTTGGT-3’位點2：F5’-CCAAGCAAAGAGAGGCACTCA-3’R5’-CTAACTGGTCTTTGATGGCGG-3’位點3：F5’-CCGCCATCAAAGACCAGTTAG-3’R5’-TGGCCTCCGAGTAGATTTGA-3’。作為本發(fā)明的基因mRNA的m6A單堿基位點鑒定方法的進一步改進：所述步驟1)：按照2016103629813的發(fā)明《mRNA甲基化高通量檢測方法》進行高通量測序；根據(jù)測序結(jié)果挑選出靶基因，并確定其m6A峰大致位置。本發(fā)明提供了一種快速簡便的方法，檢測出單個基因所有可能的甲基化特征序列(RRACH)中m6A位點所在的具體位置。本發(fā)明首次利用簡單快速可靠的生物學技術(shù)方法，確定m6A單堿基位點；本發(fā)明可以為實現(xiàn)m6A單堿基位點的生物學功能研究提供重要技術(shù)支撐。附圖說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1：長白豬背部脂肪(C-LB)組織m6A測序所得FAM134B基因甲基化分布(m6A峰區(qū)域1250-1490bp)；圖2：FAM134B測序結(jié)果m6A峰區(qū)域中的m6A位點；圖3：為FAM134B的m6A峰區(qū)域序列(下劃線序列為可能含有m6A的密碼子)；圖4：FAM134B的m6A峰區(qū)域突變后序列(下劃線序列為突變后的密碼子)圖5：熒光定量結(jié)果顯示位點3為FAM134B基因的m6A位點。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：實施例1、1、按照2016103629813的發(fā)明《mRNA甲基化高通量檢測方法》進行高通量測序；根據(jù)測序結(jié)果挑選豬FAM134B為靶基因(如圖1所示)，并確定其m6A峰大致位置為區(qū)域1250-1490bp處。2、在NCBI上搜索并得到該區(qū)域的序列。進入SRAMP網(wǎng)站(http://www.cuilab.cn/sramp/)，選擇prediction，在右側(cè)的MaturemRNAmode框中將序列輸入，選擇submit，得到豬FAM134B基因1250-1490bp處所有的m6A預(yù)測位點。3、將3處可能的m6A位點進行點突變，分別為：位點1：GGACA→GGCCA位點2：TGACC→TGCCC位點3：GGACA→GGCCA將3處突變的CDS序列合成并連接到哺乳動物表達載體pSilencer4.1上，構(gòu)建FAM134B突變載體。另外，將FAM134B的原始CDS序列并連接到哺乳動物表達載體pSilencer4.1上，構(gòu)建成FAM134B超表達載體作為對照。4、培養(yǎng)人源胚胎腎細胞系(293T)，待6個10cm平皿的細胞均長到80-90％密度時，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine3000進行載體的轉(zhuǎn)染，超表達載體和突變載體各轉(zhuǎn)染3個平皿，具體步驟如下：1)、按照轉(zhuǎn)染時密度為80-90％左右的要求，轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)基替換為無抗培養(yǎng)基。備注說明：培養(yǎng)293T細胞所用培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEMBasic培養(yǎng)基。所替換的無抗培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEMBasic培養(yǎng)基。胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司，青鏈霉素與DMEMBasic培養(yǎng)基購自Gibco公司。2)、每個皿細胞均進行如下操作：使用DMEMBasic或OPTI-MEM培養(yǎng)基0.5ml分別稀釋10ugFAM134B超表達載體/突變載體和25uLlipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，37℃放置5min混勻，室溫保存15min后，將復(fù)合物逐滴加入皿中。lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑可購自life生物有限公司。3)、輕輕搖晃細胞后，放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h(37攝氏度恒溫，5％CO2)；更換無抗完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24h后，收集細胞。5、細胞甲基化mRNA提取將步驟4所得的細胞用Trizol法提取樣品的總RNA，具體方法為：①將細胞置于RNase-free的1.5mleppendorf管中；②加入1mlTrizol劇烈搖晃至均一溶液；③加入200ul氯仿后，劇烈搖晃至均一溶液，4C，12000g離心15min；④取上清到另一個RNase-free的1.5mleppendorf管中，加入相同體積異丙醇，輕輕混勻，室溫孵育10min，4C，12000g離心10min；⑤去掉上清，用1ml75％乙醇洗滌沉淀，4C，7500g離心5min⑥用20-50ulRNase-freeH2O溶解。將上步所得的總RNA用GenelutemRNAminiprepKits(Sigma)提取mRNA，具體方法為：①將totalRNA體積擴大到250ul，加入250ulbindingsolution，混勻；②加入15ulbeads，劇烈搖晃至均一溶液，置于70C孵育3min后，置于室溫10min；③最大速度離心2min，棄掉上清；④用500ulwashbuffer重懸beads，并轉(zhuǎn)移至spinfilter；⑤離心1-2min，棄掉flowthrough；⑥重復(fù)步驟④、⑤；⑦加入預(yù)先加熱至70C的ElutionBuffer50ul，70C孵育2-5min；⑧離心產(chǎn)物即是mRNA；⑨將所得mRNA利用真空濃縮至9ul。6、將總mRNA經(jīng)過超聲斷裂或者金屬離子(如Zn2+、Ca2+、Fe2+等)斷裂成100～200nt的mRNA片段，具體方法入下：RNA片段化體系溫度、孵育時間為：70℃、15min，加入EDTA終止反應(yīng)。片段化緩沖液(10X)為：800μLRNase-free水，100μL1MTris-HCl(pH＝7.0)，100μL1MZnCl2溶液。7、免疫沉淀1)、將片段化的mRNA取出50ng左右作為Input(對照)，其余部分定義為IP(免疫沉淀)，首先利用免疫沉淀反應(yīng)，與m6A抗體在4℃低溫下孵育2小時，具體步驟如下：在4℃孵育2h。2)、封閉beads(ProteinA，Lifetechnologies,10002D)取40μlbeads置于磁力架上，棄去上清，用1ml的1*IPbuffer洗三次，重懸于1*IP封閉buffer1ml中，于4℃孵育2h。1*IP封閉buffer配制如下：5×IPbuffer200μlRNAaseinhibitor10μlBSA25μlRNAasefreewater765μlTotal1000μl孵育2h后，用1ml的1*IPbuffer洗三次，用100μl1*IPbuffer重懸。3)、beads與mRNA-抗體免疫沉淀：將上述1)和2)得到的樣品混合，4℃孵育2h。4)、洗脫I將步驟3)所得樣品置于磁力架上，棄上清，用500μl1*IPbuffer洗三次，重懸于洗脫buffer450ul，置于4℃孵育1h。洗脫buffer配制如下：5×IPbuffer90μlRNAaseinhibitor7μlM6A150μlRNAasefreewater203μlTotal450μl5)、洗脫II將4)所得樣品置于磁力架上，收集上清；然后在beads中再加入50ul洗脫buffer，置于4℃孵育30min，再次置于磁力架上，再次收集上清；6)、將步驟5)的2份上清進行合并，得到200ul洗脫液(RNA洗脫液)。7)、乙醇沉淀：將200ulRNA洗脫液+20ulNaAc(濃度為3M)+500ul乙醇(100％)+4ulglycogen(5mg/ml)，-80℃，過夜沉淀。8)、第二天在4℃，14000rpm離心30min，棄上清，加入1ml75％乙醇在4℃，14000rpm離心30min，棄上清，風干后，加入9ulRNase-free水，并測定濃度。從而獲得富集的含有m6A的RNA片段。8、引物設(shè)計將步驟7得到的富集的含有m6A的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計突變位點區(qū)域的熒光定量引物：根據(jù)NCBI上提供的突變位點區(qū)域序列，在涵蓋甲基化高度保守的RRACH(R＝G,A；H＝A,C,T)序列區(qū)域設(shè)計熒光定量PCR引物(為多對熒光定量PCR引物)，用于分析基因的m6A分布。各位點的引物：位點1：F5’-ACGGGACCTTCAACCTTTCA-3’R5’-AGTGCCTCTCTTTGCTTGGT-3’位點2：F5’-CCAAGCAAAGAGAGGCACTCA-3’R5’-CTAACTGGTCTTTGATGGCGG-3’位點3：F5’-CCGCCATCAAAGACCAGTTAG-3’R5’-TGGCCTCCGAGTAGATTTGA-3’9、實時熒光相對定量PCR將超表達載體組(FAM)和突變試驗組(mF)的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按常規(guī)熒光定量PCR步驟操作。以m6A-IP和Input的靶基因Ct差值作為參照，結(jié)果分析采用2-△△Ct的方法，其中△△Ct的計算公式如下：△△Ct＝(CtmF-CtCon)X1-(CtmF-CtCon)X2X1和X2表示待比較的任意兩個樣本，通過上述公式計算出X1相對于X2的靶基因甲基化相對水平。結(jié)果如圖5所示，得到以超表達載體組(FAM)的FAM134B表達量為“1”，突變試驗組(mF)的FAM134B表達量可變的柱狀圖。結(jié)果表明，位點3的FAM134b表達量突變組顯著低于超表達組，其他位點無顯著差異，由于突變試驗組(mF)轉(zhuǎn)染進入細胞的載體不會產(chǎn)生含有m6A的FAM134BRNA片段，因此步驟7中得到的突變試驗組(mF)富集m6A的RNA中不含F(xiàn)AM134B，導致熒光定量結(jié)果中該組的理論值會下降。結(jié)合m6A測序所得FAM134B基因甲基化分布圖，證明位點3(1356-1361)是長白豬FAM134B基因的甲基化位點。對比例1、將實施例1步驟8中的引物改成如下：位點1：F5’-ACCGCTCGATGAGTGATCCTTACC-3’R5’-AAACGGTAAGGATCACTCATCGAG-3’位點2：F5’-CCAGGCCTATGACGATGGAG-3’R5’-ACCGTCGCACGATATCACTC-3’位點3：F5’-AATCAAGGCTGTTGAACCCG-3’R5’-TCCTGTGAACACCTGCTGAT-3’其余內(nèi)容等同于實施例1。熒光定量結(jié)果中溶解曲線不正常，表明引物特異性不佳。此結(jié)果不可用。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3