Ctnnb1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針包括檢測(cè)引物探針組A、檢測(cè)引物探針組B和檢測(cè)引物探針組C；檢測(cè)引物探針組A包括檢測(cè)32密碼子GAC>CAC突變、33密碼子TCT>TGT突變、33密碼子TCT>GCT突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；檢測(cè)引物探針組B包括檢測(cè)34密碼子GGA>GAA突變、34密碼子GGA>GTA突變、35密碼子ATC>AGC突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；檢測(cè)引物探針組C包括檢測(cè)37密碼子TCT>TAT突變、37密碼子TCT>TTT突變、45密碼子TCT>CCT突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；本發(fā)明還涉及一種采用上述引物探針的試劑盒。本發(fā)明的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針及其試劑盒使用便捷，靈敏度高，準(zhǔn)確率高。
【專利說(shuō)明】
CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測(cè)引物和檢測(cè)體系， 屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] β-Catenin是介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)雙重活性的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性蛋白，基因 CTNNB1位于3p22,全長(zhǎng)23.2kb，CTNNBl基因（β連環(huán)蛋白的編碼基因）在WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路的 重要的角色。CTNNB1基因編碼序列由三個(gè)轉(zhuǎn)錄本，CTNNB1基因第三外顯子發(fā)生突變，與細(xì)胞 核內(nèi)的TCF/LEF蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，這種蛋白復(fù)合物能夠與DNA結(jié)合，啟動(dòng)其他與腫 瘤相關(guān)的基因（如c_myc、cyclin D1)的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致一系列的連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂加 速。CTNNB1基因調(diào)控上皮細(xì)胞的生成和維持，W在腫瘤的進(jìn)展中起重要作用，高表達(dá)與0S的 降低密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因的突變是子宮內(nèi)膜癌、肝癌、髓母細(xì)胞瘤(MDB)、等腫瘤 的原因。
[0003] 美國(guó)MD Anderson癌癥中心的研究人員發(fā)現(xiàn)，對(duì)于患有典型的低級(jí)別早期子宮內(nèi) 膜癌女性患者，CTNNB1基因外顯子3突變的預(yù)后較差，（J Natl Cancer Inst.2014,106: dju245)。臨床上早已發(fā)現(xiàn)，部分子宮內(nèi)膜癌患者在初次手術(shù)治療后容易復(fù)發(fā)并因此死亡。 過(guò)去臨床上辨識(shí)這些患者，現(xiàn)在就可以通過(guò)檢測(cè)CTNNB1基因突變來(lái)篩選這些預(yù)后較差的患 者。一旦低級(jí)別、早期子宮內(nèi)膜癌患者被檢測(cè)出具有CTNNB1基因突變，婦瘤科醫(yī)生可采取除 傳統(tǒng)子宮切除外更激進(jìn)的治療策略。
[0004] 肝細(xì)胞癌(HCC)是男性五分之四最常見(jiàn)的癌癥和癌癥相關(guān)死亡世界第二最常見(jiàn)的 原因，一些研究表明β連環(huán)蛋白突變的肝癌具有關(guān)鍵作用，CTNNB1突變可以與增加谷氨酰胺 合成的水平，與腫瘤的增大存在相關(guān)性，并且在肝癌患的不同腫瘤區(qū)域發(fā)現(xiàn)不同突變狀態(tài) CTNNBUCieply.B發(fā)現(xiàn)肝癌患者CTNNB1突變主要發(fā)生在該基因的第三外顯子內(nèi)，第三外顯 子編碼的蛋白一般是磷酸化的氨基酸序列，發(fā)生CTNNB1基因的第三外顯子突變患者的β連 環(huán)蛋白的表達(dá)水平表達(dá)較高。（B.Cieply,Hepatology ,49(2009)，ρρ· 821-831)
[0005] 髓母細(xì)胞瘤是惡性小兒腦腫瘤的最常見(jiàn)的類型，Wnt信號(hào)通路在這個(gè)類型的腫瘤 被激活，Si 1 va Rd對(duì)髓母細(xì)胞瘤病例進(jìn)行了分析β連環(huán)蛋白基因（CTNNB1)的突變分析，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)六分之一的患者CTNNB1基因第三外顯子發(fā)生了突變，這些突變改變糖原合酶激酶3β磷 酸化位點(diǎn)，隨后在細(xì)胞核積累，促纖維增生和結(jié)節(jié)神經(jīng)管細(xì)胞瘤的變體（Clinics(Sao Paulo).2013;68(2):167-72)。
[0006] 目前CTNNB1基因突變檢測(cè)主要是測(cè)序法，對(duì)于臨床工作者來(lái)說(shuō)耗時(shí)、易污染、程序 繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)快速方便，靈敏度高，準(zhǔn)確率高的CTNNB1第三外顯子突變 檢測(cè)試劑盒，以及其檢測(cè)引物探針。
[0008] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種CTNNB1第三外顯子突變 檢測(cè)引物探針，包括檢測(cè)引物探針組A、檢測(cè)引物探針組B和檢測(cè)引物探針組C;
[0009] 所述檢測(cè)引物探針組A包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突 變的上游引物a和探針a，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引 物b和探針b，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c， 以及通用下游引物；
[0010] 所述檢測(cè)引物探針組B包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突 變的上游引物d和探針d，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引 物e和探針e，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f， 以及通用下游引物；
[0011] 所述檢測(cè)引物探針組C包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突 變的上游引物g和探針g，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引 物h和探針h，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCT>CCT突變的上游引物i和探針i， 以及通用下游引物；
[0012] 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探針b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0013] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述所述探針d、 探針e和探針f的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述探針g、探針h和探針i的5'端設(shè)有 相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和 探針i的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0014] 各上游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應(yīng)中的終濃度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.27μΜ/1。
[0015] 上述相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。
[0016] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種采用上述的引物探針的 CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)產(chǎn)品。
[0017] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種CTNNB1第三外顯子突變 檢測(cè)試劑盒，包括突變檢測(cè)液A、突變檢測(cè)液B和突變檢測(cè)液C;
[0018] 所述突變檢測(cè)液A中包括檢測(cè)引物探針組A，所述突變檢測(cè)液B中包括檢測(cè)引物探 針組B，所述突變檢測(cè)液C中包括檢測(cè)引物探針組C;
[0019] 所述檢測(cè)引物探針組A包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突 變的上游引物a和探針a，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引 物b和探針b，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c， 以及通用下游引物；
[0020] 所述檢測(cè)引物探針組B包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突 變的上游引物d和探針d，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引 物e和探針e，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f， 以及通用下游引物；
[0021] 所述檢測(cè)引物探針組C包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突 變的上游引物g和探針g，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引 物h和探針h，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCT>CCT突變的上游引物i和探針i， 以及通用下游引物；
[0022]所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探針b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0023] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述所述探針d、 探針e和探針f的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述探針g、探針h和探針i的5'端設(shè)有 相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和 探針i的3 '端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。
[0024] 各上游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應(yīng)中的終濃度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.27μΜ/1。
[0025] 上述相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。
[0026] 各突變檢測(cè)液中還包括內(nèi)標(biāo)引物探針混合液、10 XPCR緩沖液、dNTPs混合液和滅 菌超純水;所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2;所述dNTPs試 劑包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP;
[0027]所述內(nèi)標(biāo)引物探針混合液包括內(nèi)標(biāo)基因上游引物、內(nèi)標(biāo)基因下游引物和內(nèi)標(biāo)基因 探針；
[0028] 所述內(nèi)標(biāo)基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述內(nèi)標(biāo)基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述內(nèi)標(biāo)基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.24所 不。
[0029] 上述CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒還包括質(zhì)控檢測(cè)試劑、熱啟動(dòng)taq酶、陽(yáng)性 對(duì)照液和陰性對(duì)照液；
[0030] 所述質(zhì)控檢測(cè)試劑包括質(zhì)控基因上游引物、質(zhì)控基因下游引物和質(zhì)控基因探針；
[0031] 所述質(zhì)控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述質(zhì)控基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述質(zhì)控基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.25所 不。
[0032]上述CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中包括十倍濃度的PCR 緩沖液1體積，2.5mM的dNTPs混合液1體積，0.5υ/μ1的熱啟動(dòng)taq酶1體積，檢測(cè)引物探針組1 體積，內(nèi)標(biāo)引物探針混合液1體積，滅菌超純水4體積，DNA模板1體積;所述DNA模板的使用濃 度為 10~50ng/yl。
[0033]本發(fā)明具有積極的效果:本發(fā)明的CTNNB1基因第三外顯子突變檢測(cè)產(chǎn)品是一個(gè)便 利而直接的工具，利用擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System， ARMS)衍生的系列技術(shù)，采用三組三重PCR反應(yīng)檢測(cè)CTNNB1基因9個(gè)突變熱點(diǎn)。具有高通量、 低成本的特點(diǎn)，可用于組織、血樣中微量突變檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，適合大規(guī)模的 臨床應(yīng)用。CTNNB1基因突變與人腫瘤的發(fā)生有重要意義，對(duì)于CTNNB1突變的檢測(cè)可準(zhǔn)確預(yù) 測(cè)對(duì)應(yīng)靶向藥物治療的有效性，便于臨床用藥的選擇，顯著性提高治療效果，是患者最大程 度收益，同時(shí)還可以避免不合理地用藥造成病人醫(yī)藥費(fèi)復(fù)旦及社會(huì)醫(yī)療資源浪費(fèi)，減少不 必要的實(shí)效損失以及經(jīng)濟(jì)損失。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的32密碼子GAOCAC的擴(kuò)增曲線；
[0035]圖2是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的33密碼子TCT>TGT的擴(kuò)增曲線；
[0036]圖3是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的33密碼子TCT>GCT的擴(kuò)增曲線；
[0037]圖4是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的34密碼子GGA>GAA的擴(kuò)增曲線；
[0038] 圖5是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的34密碼子GGA>GTA的擴(kuò)增曲線；
[0039] 圖6是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的35密碼子ATOAGC的擴(kuò)增曲線；
[0040] 圖7是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的37密碼子TCT>TTT的擴(kuò)增曲線；
[00411圖8是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的37密碼子TCT>TAT的擴(kuò)增曲線；
[0042]圖9是采用實(shí)施例1的試劑盒檢測(cè)樣本1的45密碼子TCT>CCT的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》一書(shū)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] -、試劑盒的組成。
[0046] 本實(shí)施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒是針對(duì)CTNNB1第三外顯子如表1所 示的9種突變類型設(shè)計(jì)的。
[0047] 表1CTNNB1第三外顯子檢測(cè)位點(diǎn)
[0049] 其中，CTNNB1的第33密碼子、第34密碼子、第37密碼子均有兩種突變情況。
[0050]本實(shí)施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒包括:檢測(cè)引物探針組A、檢測(cè)引物 探針組B、檢測(cè)引物探針組C、10XPCR緩沖液、dNTPs混合液、質(zhì)控檢測(cè)試劑、內(nèi)標(biāo)引物探針混 合液、陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、熱啟動(dòng)taq酶和滅菌超純水。其中，各檢測(cè)引物探針組 分別與內(nèi)標(biāo)引物探針混合液、10 X PCR緩沖液、dNTPs混合液和滅菌超純水分裝在一起，成為 對(duì)應(yīng)的突變檢測(cè)試劑。
[0051]各試劑的成分如表2所示。
[0052]表2試劑盒的組成
[0054] 各個(gè)試劑原料的來(lái)源如表3所示。
[0055] 表3試劑原料來(lái)源
[0057] 上述表中試劑盒說(shuō)明如下：
[0058]將引物濃度做倍比連續(xù)稀釋，驗(yàn)證的引物(除通用下游引物)最佳使用濃度是1.9μ Μ/1，在反應(yīng)體系中的最終濃度是0.19μΜ/1;通用下游引物最佳使用濃度是2.7μΜ/1，在反應(yīng) 體系中的最終濃度是〇.27μΜ/1;探針倍比連續(xù)稀釋，驗(yàn)證的探針最佳濃度是1.6μΜ/1，在反 應(yīng)體系中的最終濃度是〇. 16μΜ/1。
[0059] 突變檢測(cè)試劑Α中包括檢測(cè)32密碼子GAOCAC突變的特異性上游引物a和探針a、檢 測(cè)33密碼子TCT>TGT突變的特異性上游引物b和探針b、檢測(cè)33密碼子TCT>GCT突變的特異性 上游引物c和探針c、通用下游引物、內(nèi)標(biāo)基因引物對(duì)、內(nèi)標(biāo)基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0060] 突變檢測(cè)試劑B中包括檢測(cè)34密碼子GGA>GAA突變的特異性上游引物d和探針d、檢 測(cè)34密碼子GGA>GTA突變的特異性上游引物e和探針e、檢測(cè)35密碼子ATOAGC突變的特異性 上游引物f和探針f、通用下游引物、內(nèi)標(biāo)基因引物對(duì)、內(nèi)標(biāo)基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0061 ]突變檢測(cè)試劑C中包括檢測(cè)37密碼子TCT>TAT突變的特異性上游引物g和探針g、檢 測(cè)37密碼子TCT>TTT突變的特異性上游引物h和探針h、檢測(cè)45密碼子TCT>CCT突變的特異性 上游引物i和探針i、通用下游引物、內(nèi)標(biāo)基因引物對(duì)、內(nèi)標(biāo)基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0062] 10XPCR緩沖液包括 100mM的Tris-HCl、500mM的KC1 和 15mM的MgCl2,用于配置PCR 緩沖液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8.3。(1階？8混合液包括(^了？、(^?、(1(^和(11^，在反應(yīng) 體系中終濃度各為0.25mM。
[0063] 熱啟動(dòng)taq酶由Takara公司提供的Hot Start taq酶稀釋而成，稀釋后的濃度為 0 · 5UAU。10 X PCR緩沖液、熱啟動(dòng)taq酶和dNTPs均來(lái)自Takara(貨號(hào):R007A)。
[0064]質(zhì)控檢測(cè)試劑包括檢測(cè)CTNNB1第三外顯子保守序列的質(zhì)控基因引物、質(zhì)控基因探 針、內(nèi)標(biāo)基因引物、內(nèi)標(biāo)基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混合液、滅菌超純水。質(zhì)控基因引物使 用濃度為〇. 19μΜ/1;質(zhì)控基因探針使用濃度為0.16μΜ/1，內(nèi)標(biāo)基因引物使用濃度為0.19μΜ/ 1，內(nèi)標(biāo)基因探針使用濃度為0.16μΜ/1。
[0065] 體積為10μ1的突變檢測(cè)反應(yīng)體系包括ΙμL的10 X緩沖液、ΙμL的熱啟動(dòng)taq酶 (0.5υ/μ1)、ΙμL的dNTPs混合液(2.5mM)、ΙμL的檢測(cè)引物探針混合液、ΙμL的內(nèi)標(biāo)引物探針混 合液、4μ1的滅菌超純水、ΙμL的DNA模板。
[0066] 體積為10μ1的質(zhì)控檢測(cè)反應(yīng)體系包括ΙμL的10 X緩沖液、ΙμL的熱啟動(dòng)taq酶 (0.5UAU)、ΙμL的dNTPs反應(yīng)液(2.5mM)、ΙμL的質(zhì)控引物探針混合液、ΙμL內(nèi)標(biāo)引物探針混合 液、4μ1的滅菌超純水、ΙμL的DNA模板。10 X緩沖液、dNTPs混合液、質(zhì)控引物探針混合液、內(nèi) 標(biāo)引物探針混合液和滅菌超純水分裝在一起成為質(zhì)控檢測(cè)試劑。
[0067]陽(yáng)性對(duì)照樣品是分別存在以上CTNNB1基因第三外顯子9種突變類型、內(nèi)標(biāo)基因、質(zhì) 控基因的重組基因組質(zhì)粒載體，質(zhì)粒載體的空載體為PMD19-T載體。突變型質(zhì)粒的獲取常規(guī) 構(gòu)建步驟:用上述的特異性引物與通用下游引物配對(duì)，擴(kuò)增含相應(yīng)突變點(diǎn)樣本的目的片段 產(chǎn)物，構(gòu)建入pMD 19-T載體;質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)基因質(zhì)粒用上述的質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增出所需目的 片段，將目的片段克隆到PMD19-T載體中?？寺〉妮d體寄給上海邁浦生物科技有限公司，由 該公司提供重組質(zhì)粒載體。
[0068] 陰性對(duì)照相應(yīng)含有CTNNB1基因9個(gè)突變位點(diǎn)野生型目的片段序列的重組質(zhì)粒載體 稀釋而成，稀釋液是滅菌超純水。
[0069] 各探針和引物序列均由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成，引物和探針均用滅菌 超純水溶解，并稀釋成工作液。各探針和引物的特征如表4所示。
[0070] 表4探針引物特征表
[0073]針對(duì)各突變檢測(cè)位點(diǎn)的特異性上游引物序列如SEQ NO. 1~SEQ N0.9所示。特異性 ARMS上游引物分別在3'末端堿基與待檢測(cè)突變型的突變堿基匹配，同時(shí)在其3'末端倒數(shù)第 2~3位增加一個(gè)或者兩個(gè)堿基錯(cuò)配，增加突變檢測(cè)的特異性。
[0074] 通用下游引物序列如SEQ N0.10所示，通用下游引物可用于所有突變檢測(cè)的下游 引物。
[0075] 特異性探針TaqMan探針序列如SEQN0.15~SEQN0.23所示，為避免假陽(yáng)性，特異 性探針3'末端堿基與待檢測(cè)突變型的突變堿基互補(bǔ)，而且特異性探針與特異性引物相互重 疊，且重疊堿基長(zhǎng)度為3~5bp，且為了減少反應(yīng)管數(shù)，節(jié)約樣本。同一管檢測(cè)試劑中的三個(gè) 探針的5 '端分別標(biāo)記了 FAM、HEX、R0X不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，3 '端則都標(biāo)記了 BHQ1熒光淬滅 基團(tuán)；
[0076]內(nèi)標(biāo)基因上游引物序列如SEQ N0.11所示，內(nèi)標(biāo)基因下游引物序列如SEQ N0.12所 不，內(nèi)標(biāo)基因探針序列如SEQ N0.24所不。內(nèi)標(biāo)基因探針的5端標(biāo)記了VIC9?光報(bào)告基團(tuán)，內(nèi) 標(biāo)基因探針的3 '端標(biāo)記了 BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。內(nèi)標(biāo)基因是區(qū)別于CTNNB1的看家基因 ACTB， 通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增(VIC通道），可分析待測(cè)DNA是否被正常擴(kuò)增，從而排除漏加試劑 或者樣本含有PCR抑制劑等原因造成的PCR檢測(cè)失敗。
[0077]質(zhì)控基因是CTNNB1基因，質(zhì)控基因上游引物序列如SEQ N0.13所示，質(zhì)控基因下游 引物序列如SEQ N0.14所示，質(zhì)控基因探針序列如SEQ N0.25所示。質(zhì)控基因探針的5'端標(biāo) 記了FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，質(zhì)控基因探針的3'端則標(biāo)記了BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。質(zhì)控基因的引物 設(shè)計(jì)是排除CTNNB1基因第三外顯子的序列的CTNNB1基因其他位置保守區(qū)域，質(zhì)控引物探針 不享受突變檢測(cè)位點(diǎn)引物和引物結(jié)合位點(diǎn)，在保守區(qū)域不同區(qū)段設(shè)計(jì)三條探針，分別標(biāo)記 不同的熒光信號(hào)，質(zhì)控序列擴(kuò)增可校正諸如DNA含量、標(biāo)本內(nèi)PCR聚合酶抑制物，不同反應(yīng)管 間擴(kuò)增效率的差異，通過(guò)比較突變檢測(cè)試劑和質(zhì)控檢測(cè)試劑的擴(kuò)增情況確定樣本是否發(fā)生 突變。
[0078]二、試劑盒的使用方法。
[0079]本實(shí)施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒的具體檢測(cè)步驟如下：
[0080] 1、樣本DNA提?。?br>[0081 ]米用試劑盒(Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取腫瘤樣本的 DNA作為樣本DNA，具體的操作參見(jiàn)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
[0082] 2、樣本DNA質(zhì)量檢測(cè)：
[0083] 獲得樣本DNA后，通過(guò)Thermo-Fisher核酸蛋白定量?jī)x(NanoDrop 2000)測(cè)定濃度 和純度，控制樣本質(zhì)量，最終加入反應(yīng)體系中的樣本。0D260/0D280的比值在1.8~2.0之間 的可獲得最優(yōu)反應(yīng)結(jié)果，濃度稀釋為10~50ngAU。
[0084] 3、PCR 反應(yīng)：
[0085] 采用本實(shí)施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以樣本反應(yīng)體系的 體積為1〇μ1，試劑盒各組分的使用濃度及在反應(yīng)體系中的終濃度詳見(jiàn)表3(反應(yīng)體系的體積 還可以是20μ1，在配制時(shí)將10μ1反應(yīng)體系中的組分翻倍即可）。
[0086] 1)配制10μ 1的質(zhì)控PCR反應(yīng)體系和10μ 1的檢測(cè)PCR反應(yīng)體系：
[0087] 取8μ1的質(zhì)控檢測(cè)試劑和ΙμL熱啟動(dòng)taq酶稀釋液于PCR管中，加入DNA模板lyl(DNA 模板的使用濃度為1 〇~50ng/y 1)。
[0088] 分別取8μ1的突變檢測(cè)試劑A或B或C和ΙμL的熱啟動(dòng)taq酶稀釋液于PCR管中，加入 DNA模板1 μ 1 (DNA模板的使用濃度為10~50ngAi 1)。
[0089]反應(yīng)體系中的DNA模板分別指對(duì)應(yīng)的樣本DNA，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照。
[0090] 2)PCR反應(yīng)程序。
[0091]各反應(yīng)體系在安捷倫實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(MxPro)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)， 最優(yōu)反應(yīng)程序如表5所示。
[0092] 表5 PCR反應(yīng)程序
[0094] 4、PCR結(jié)果判定。
[0095] 1)試劑盒有效性的判定。
[0096]陽(yáng)性對(duì)照有效：陽(yáng)性對(duì)照FAM、HEX、R0X信號(hào)通道所有的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增 長(zhǎng)期，且Ct陽(yáng)性<30。
[0097]陰性對(duì)照有效：陰性對(duì)照FAM、HEX、R0X信號(hào)通道所有的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增 長(zhǎng)期，或Ct陰性多38。
[0098]內(nèi)標(biāo)基因有效:除陰性對(duì)照外，所有的反應(yīng)孔VIC信號(hào)通道均有擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增 曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，CT值<22。
[0099] 2)檢測(cè)樣本有效性的判定。
[0100] 根據(jù)質(zhì)控FAM通道的CT值進(jìn)行判定：
[0101] 若Ct質(zhì)控<20,則樣本基因組加入過(guò)量，建議稀釋后重新檢測(cè)；
[0102]若20<Ct質(zhì)控<26,樣本加入量適中，適合進(jìn)行結(jié)果判定；
[0103]若Ct質(zhì)控>26,則樣本基因組加入量低，不能穩(wěn)定的進(jìn)行突變結(jié)果判定。
[0104] 3)突變結(jié)果的判定。
[0105] 通過(guò)以上步驟，確定檢測(cè)樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)基因檢測(cè)均有效的前提 下，再對(duì)樣本的結(jié)果進(jìn)行判定。樣本判斷結(jié)果如表6所示
[0106] 表6突變情況判斷表
[0108]根據(jù)公式Act值=ct(樣板(姐)-(^(廚飯)姐)，計(jì)算有效檢測(cè)樣本的Act值。按照以下 步驟對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀，確定樣本是否存在突變。
[0109] A·陰性情況
[0110] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本32密碼子GAOCAC位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtCAC> CAC(FAM通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32，但是ACt > 8.6，則該樣本32密碼子GAOCAC位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0111] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本33密碼子TCT>TGT位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtTCT> TGT(HEX通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本33密碼子TCT>TGT位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0112] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本33密碼子TCT>GCT位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32，但是ACt > 10，則該樣本33密碼子TCT>GCT位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0113] 4)若CtGGA>GM(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本34密碼子GGA>GAA位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtCCA>CAA(FAM通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且<32,但是ACt>9,則該樣本34密碼子GGA>GAA位點(diǎn)也為陰 性(野生型）。
[0114] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本34密碼子GGA>GTA位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是ACt>9,則該樣本34密碼子GGA>GTA位點(diǎn)也為陰 性(野生型）。
[0115] 6)若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本35密碼子ATOAGC位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtATC>AGC(ROX通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32，但是ACt > 8.6，則該樣本35密碼子ATOAGC位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0116] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本37密碼子TCT>TTT位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtTCT>TTT(FAM通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本37密碼子TCT>TTT位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0117] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本37密碼子TCT>TAT位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本37密碼子TCT>TAT位點(diǎn)也為 陰性(野生型）。
[0118] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期(無(wú) Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本45密碼子TCT>CCT位點(diǎn)為陰性(野生型）；若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴(kuò) 增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且<32，但是ACt >9，則該樣本45密碼子TCTXXT位點(diǎn)也為陰 性(野生型）。
[0119] B.陽(yáng)性情況
[0120] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，則該樣本32密碼子GAOCAC位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0121] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct彡10,則該樣本33密碼子TCT>TGT位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0122] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct< 10，則該樣本33密碼子TCT>GCT位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0123] 4)若CtGGA>GAA(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct<9，則該樣本34密碼子GGA>GAA位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0124] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct彡9，則該樣本34密碼子GGA>GTA位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0125] 6);若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，則該樣本35密碼子ATOAGC位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0126] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct< 10，則該樣本37密碼子TCT>TTT位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0127] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct彡10,則該樣本37密碼子TCT>TAT位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0128] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，且彡32,但是Λ Ct<9,則該樣本45密碼子TCT>CCT位點(diǎn)為陽(yáng)性(突變型）。
[0129] 三、試劑盒的特性。
[0130] 特異性和靈敏度:檢測(cè)分別含10%、5%、1%的CTNNB1基因9個(gè)突變位點(diǎn)的突變基 因組DNA(突變百分比=突變型/野生型X 100%)，敏感度達(dá)到1 %，與臨床檢測(cè)突變"金標(biāo) 準(zhǔn)"Sanger測(cè)序法的結(jié)果符合率彡96.2%，批內(nèi)CV和批間CV均小于3%。
[0131] 四、應(yīng)用示例
[0132] 構(gòu)建含有CTNNB1第三外顯子32密碼子GAC>CAC突變、33密碼子TCT>TGT突變、34密 碼子GGA>GAA突變、35密碼子ATOAGC突變、37密碼子TCT>TAT突變、45密碼子TCTXXT突變6 種突變類型的重組基因組質(zhì)粒載體作為樣本1。采用本實(shí)施例的CTNNB1第三外顯子突變檢 測(cè)試劑盒對(duì)樣本1進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果如圖1至9所示?？梢?jiàn)，32密碼子GAOCAC突變、33密碼 子TCT>TGT突變、34密碼子GGA>GAA突變、35密碼子ATOAGC突變、37密碼子TCT>TAT突變、45 密碼子TCTXXT突變的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，33密碼子TCT>GCT、34密碼子34密碼子、37密碼子 TCT>TTT檢測(cè)結(jié)果為陰性。證明了試劑盒的有效性。
[0133] 顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的 實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其 它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā) 明的精神所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針，其特征在于：包括檢測(cè)引物探針組A、檢 測(cè)引物探針組B和檢測(cè)引物探針組C; 所述檢測(cè)引物探針組A包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突變的 上游引物a和探針a，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引物b和 探針b，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c，以及 通用下游引物； 所述檢測(cè)引物探針組B包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突變的 上游引物d和探針d，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引物e和 探針e，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f，以及 通用下游引物； 所述檢測(cè)引物探針組C包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突變的 上游引物g和探針g，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引物h和 探針h，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCTXXT突變的上游引物i和探針i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述所述探針d、探針 e和探針f的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán);所述探針g、探針h和探針i的5'端設(shè)有相互 區(qū)別的報(bào)告焚光基團(tuán);所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和探針i 的3'端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針，其特征在于:各上游引 物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.16μΜ/1，所述通用 下游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.27μΜ/1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)引物探針，其特征在于:所述相互 區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或 ROX;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。4. 一種采用如權(quán)利要求1所述的引物探針的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)產(chǎn)品。5. -種CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括突變檢測(cè)液A、突變檢測(cè) 液B和突變檢測(cè)液C; 所述突變檢測(cè)液A中包括檢測(cè)引物探針組A，所述突變檢測(cè)液B中包括檢測(cè)引物探針組 B，所述突變檢測(cè)液C中包括檢測(cè)引物探針組C; 所述檢測(cè)引物探針組A包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突變的 上游引物a和探針a，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引物b和 探針b，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c，以及 通用下游引物； 所述檢測(cè)引物探針組B包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突變的 上游引物d和探針d，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引物e和 探針e，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f，以及 通用下游引物； 所述檢測(cè)引物探針組C包括用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突變的 上游引物g和探針g，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引物h和 探針h，用于檢測(cè)CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCTXXT突變的上游引物i和探針i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)；所述所述探針d、探針 e和探針f的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán);所述探針g、探針h和探針i的5'端設(shè)有相互 區(qū)別的報(bào)告焚光基團(tuán);所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和探針i 的3'端設(shè)有淬滅熒光基團(tuán)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于:各上游引物 在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.16 μΜ/l，所述通用下 游引物在PCR反應(yīng)中的終濃度是0.27μΜ/1。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述相互區(qū) 別的報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或 R0X;所述淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1或MGB。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在 于:各突變檢測(cè)液中還包括內(nèi)標(biāo)引物探針混合液、10 X PCR緩沖液、dNTPs混合液和滅菌超純 水;所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl 2;所述dNTPs試劑包括 dATP、dGTP、dCTP和dTTP; 所述內(nèi)標(biāo)引物探針混合液包括內(nèi)標(biāo)基因上游引物、內(nèi)標(biāo)基因下游引物和內(nèi)標(biāo)基因探 針； 所述內(nèi)標(biāo)基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述內(nèi)標(biāo)基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述內(nèi)標(biāo)基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。9. 根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在 于:還包括質(zhì)控檢測(cè)試劑、熱啟動(dòng)taq酶、陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液； 所述質(zhì)控檢測(cè)試劑包括質(zhì)控基因上游引物、質(zhì)控基因下游引物和質(zhì)控基因探針； 所述質(zhì)控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，所述質(zhì)控基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述質(zhì)控基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于:反應(yīng)時(shí)，反 應(yīng)體系中包括十倍濃度的PCR緩沖液1體積，2.5mM的dNTPs混合液1體積，0.5UAU的熱啟動(dòng) taq酶1體積，檢測(cè)引物探針組1體積，內(nèi)標(biāo)引物探針混合液1體積，滅菌超純水4體積，DNA模 板1體積;所述DNA模板的使用濃度為10~50ng/y 1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969908SQ201610608948
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】趙新泰, 王明
【申請(qǐng)人】上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司