一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)對(duì)P.macerans?strain?JFB05-01(CCTCC?NO:M208063)的CGTase的195位的酪氨酸(Tyr)替換為絲氨酸(Ser),260位的酪氨酸(Tyr)替換為精氨酸(Arg),265位的谷氨酰胺(Gln)替換為賴氨酸(Lys)，使AA-2G產(chǎn)量分別提高了23％，44％和40％。對(duì)以上突變株組合突變，獲得雙突變體Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K以及三點(diǎn)突變體Y195S/Y260R/Q265K。它們利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量分別提高了57％，49％，55％和59％。這些突變株比野生型CGTase更利于利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G。
【專利說(shuō)明】一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法
[0001]本申請(qǐng)是發(fā)明名稱為“一種麥芽糊精底物特異性提聞的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法”，申請(qǐng)?zhí)枮?01210527869.2， 申請(qǐng)日期:為2012年12月10日的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及制備方法，特別是一種麥芽糊精底物特異性提聞的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0003]L-抗壞血酸(L-AA，維生素C)是水溶性維生素，參與很多體內(nèi)的生理活動(dòng)，在保持和促進(jìn)人體健康中起到重要的作用，是人體無(wú)法自身合成的必需的營(yíng)養(yǎng)元素。但L-AA極不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發(fā)生不可逆裂解反應(yīng)，特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應(yīng)更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應(yīng)用上受到很大的限制。因此，如何增強(qiáng)L-AA的穩(wěn)定性是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點(diǎn)問題。
[0004]2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是將一個(gè)糖基以α -1, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發(fā)生氧化反應(yīng)，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且AA-2G沒有直接還原性，有效地保護(hù)了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定性和性能最佳的L-AA替代品。
[0005]目前，AA-2G主要通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環(huán)糊精或β _環(huán)糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到受體L-AA上。然而，若以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應(yīng)效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如麥芽糊精)將會(huì)大大減少AA-2G的生廣成本，提聞其利潤(rùn)。但是，由于目ill環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)對(duì)麥芽糊精的底物特異性(轉(zhuǎn)化率)較低，因此，通過(guò)分子改造CGTase技術(shù)提高其對(duì)麥芽糊精的底物特異性，將推動(dòng)與L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以Genbank AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或其組合。
[0007]所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。
[0008]所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的獲得方法為以Genbank AF047363.1公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將第195位的酪氨酸突變成絲氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K或?qū)⑵浣M合進(jìn)行雙突變或三突變。
[0009]產(chǎn)所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0010]本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
[0011]1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；
[0012]2)將步驟I)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；
[0013]3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到基因工程菌。
[0014]本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、1000rpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
[0015]軟化類芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO:M208063)，已在中國(guó)專利CN101294149公開，
【公開日】2008年10月29日。
[0016]來(lái)源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱CGTase)的三種突變體酶:Y195S，Y260R及Q265K，它們相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G時(shí)，產(chǎn)量分別提高23%，44%和40%。
[0017]Peanibacillus macerans JFB 05_01CGTase 的三種雙突變體酶 Y195S/Y260R, Y195S/Q265K和Y260R/Q265K，相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量分別提高了 57%，49%和55%。
[0018]Peanibacillus macerans JFB05-01 CGTase 的一種三點(diǎn)突變體酶 Y195S/Y260R/Q265K，其特征是:將雙突變體酶Y195S/Y260R基因中第265位的谷氨酰胺Gln突變成了精氨酸賴氨酸Lys，命名為Y195S/Y260R/Q265K。相比于野生型CGTase利用麥芽糊精為糖基供體生產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量提高了 59%。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明構(gòu)建了 7個(gè)有意義的突變體，均實(shí)現(xiàn)了環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)麥芽糊精的底物特異性的提高，以此為糖基供體所產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
:
[0020]圖1不同反應(yīng)時(shí)間下野生型CGTase和突變型酶生成AA-2G的產(chǎn)量。
[0021]1:野生型 CGTase ；.:Y260R ； ▲:Q265K ； ▼:Y195S ； O:Y260R/Q265K ； Δ:Y260R/Y195S ;?:Q265K/Y195S ;?:Y260R/Q265K/Y195S。

【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶
[0023]本發(fā)明的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶是在GenBank AF047363.1公布的基因序列基礎(chǔ)上，對(duì)其3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸進(jìn)行單突變或組合突變獲得，具體獲得了 7種突變體，分別為Y260R ；Q265K ；Y195S ；Y260R/Q265K ；Y260R/Y195S ；Q265K/Y195S ;Y260R/Q265K/Y195S。
[0024]可以通過(guò)化學(xué)全合成或定點(diǎn)突變的方式將其成熟區(qū)的3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的取代。
[0025]實(shí)施例2:底物特異性提高的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法
[0026]本例以PCR方法為例進(jìn)行說(shuō)明，但被發(fā)明的保護(hù)并不限于僅通過(guò)PCR方法獲得突變的方法。突變體酶 Y195S，Y260R, Q265K, Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和Y195S/Y260R/Q265K的制備方法如下:
[0027]I)定點(diǎn)突變
[0028]單突變體酶Y195S，Y260R及Q265K 的定點(diǎn)突變，利用快速突變?cè)噭┖蠱utanBEST kit,以表達(dá)載體 cgt/pET_20b (+)1 (1.Li, Ζ.，B.Li, Z.Gu, G.Du, J.ffu, andj.Chen.2010.Extracellular express1n and b1chemical characterizat1n ofalpha-cyclodextrin glycosyItransferase from Paenibacillus macerans.CarbohydrRes 345:886-892.)為模板，
[0029]引入Y195S密碼子的頂點(diǎn)突變引物為:
[0030]正向引物:5’-TACAAGAACCTCTCTGACCTGGC-3’，下劃線為突變堿基；
[0031 ]反向引物:5’ -AATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATC-3’ ；
[0032]引入Y260R密碼子的頂點(diǎn)突變引物為:
[0033]正向引物:5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’，下劃線為突變堿基；
[0034]反向引物:5’-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3’；
[0035]引入Q265K密碼子的頂點(diǎn)突變引物為:
[0036]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3，，下劃線為突變堿基；
[0037]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。
[0038]雙突變體酶Y195S/Y260R，Y195S/Q265K及Y260R/Q265K的定點(diǎn)突變:利用快速突變?cè)噭┖蠱utanBEST kit，分別以單突變體酶Y195S基因?yàn)槟０澹?br> [0039]引入Y260R密碼子的定點(diǎn)突變引物為:
[0040]正向引物:5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’，下劃線為突變堿基；
[0041 ]反向引物:5’ -GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3’ ；
[0042]引入Q265K密碼子的定點(diǎn)突變引物為:
[0043]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3，，下劃線為突變堿基；
[0044]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’；
[0045]以單突變體酶Y260R基因?yàn)槟０?，引入Q265K密碼子的定點(diǎn)突變引物為:
[0046]正向引物:5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3，，下劃線為突變堿基；
[0047]反向引物:5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。
[0048]PCR 反應(yīng)體系均為:5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, 2.5mM dNTPs4μ L, 10 μ M 正向引物 I μ L，10 μ M 反向引物 I μ L，模板 DNAl μ L，2.5υ/μ L PrimeSTAR TaqHS 0.5 μ L，加入雙蒸水至50 μ L ;
[0049]PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條件均為:98°C預(yù)變性3min ;隨后進(jìn)行98°C 10s,62°C 15s，72°C6min30個(gè)循環(huán)；最后72°C保溫1min ；
[0050]PCR產(chǎn)物經(jīng)MutanBEST kit處理，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受:態(tài)細(xì)胞，所有質(zhì)粒均測(cè)序正確；
[0051]2)突變體表達(dá)與純化:
[0052]挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)8~1h,按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨節(jié)青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、1000rpm離心20min除菌體，收集上清液。
[0053]上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過(guò)夜，4°C、10000rpm離心20min,取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過(guò)夜后，通過(guò)0.22 μ m膜過(guò)濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用A、含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH = 6)中透析過(guò)夜后，分別得到純化突變體酶Y195S，Y260R, Q265K，Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和 Y195S/Y260R/Q265K。
[0054]實(shí)施例3:本實(shí)施例說(shuō)明酶活分析及AA-2G的合成及檢測(cè)。
[0055]I)酶活測(cè)定方法:
[0056]甲基橙法測(cè)定α-環(huán)化活力的方法:取適當(dāng)稀釋的酶液0.lmL，加入裝有0.9mL預(yù)先用50mM磷酸緩沖液(pH6.5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40°C下反應(yīng)1min后，加入1.0mLl.0M的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0mL用50mM磷酸緩沖液配制的0.1mM甲基橙，在16°C下保溫20min，在505nm下測(cè)定吸光度。一個(gè)酶活單位定義在該條件下每分鐘生成
Iμ mol α -環(huán)糊精所需酶量。
[0057]淀粉水解活力測(cè)定方法:將適量的酶液加入到含I %可溶性淀粉的50mM磷酸緩沖液中(pH6.5)，50°C反應(yīng)lOmin，然后用DNS法測(cè)定還原糖濃度。一個(gè)酶活單位定義在該條件下每分鐘生成I μ mol還原糖所需酶量。
[0058]歧化反應(yīng)活力測(cè)定方法:將含有6mM供體底物4-硝基苯基-a-D-麥芽庚糖-4-6-0-亞乙基(EPS)和1mM受體底物麥芽糖的1mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)在50°C保溫1min中，然后加入適當(dāng)稀釋的酶液0.1mL反應(yīng)，每0.5min取100 μ L反應(yīng)樣品加入20 μ L1.2Μ HCl (4°C )，然后在 60°C保溫 1min 使 CGTase 失活。隨后，加入 20 μ L 1.2Μ NaOH 中和，將樣品加到磷酸緩沖液(ΡΗ7.0)，并加入60μL(?υ) α-糖苷酶于37°C反應(yīng)60min。加入ImL IM碳酸鈉使樣品pH升至8以上,在401nm波長(zhǎng)下側(cè)吸光值(ε 401 = 18.4mM-1)。I單位酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I μ mol的酶的量。
[0059]AA-2G的合成及檢測(cè)方法:將適量酶液加入含有麥芽糊精和L-AA (終濃度為5 % )的醋酸-醋酸鈉緩沖液中(PH5.5)，于避光避氧條件下37°C反應(yīng)24h，然后加入10U/mL糖化酶在65°C，pH5.5條件下反應(yīng)24h，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)AA-2G產(chǎn)量。
[0060]HPLC檢測(cè)AA-2G產(chǎn)量方法:酶反應(yīng)樣品通過(guò)0.22 μ m濾膜過(guò)濾，使用AmethystC18-H 柱(4.6X250mm, S印ax, America)檢測(cè)。檢測(cè)波長(zhǎng):238nm ;流動(dòng)相:0.05MKH2P04/H3PO4 (pH2.0);流速:0.6mL/min。在此條件下，在大約1min時(shí)會(huì)出現(xiàn)AA-2G的流出峰。AA-2G濃度通過(guò)峰面積計(jì)算而得。
[0061]2)酶活比較:實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表，將上述突變體表達(dá)獲得的突變體純酶制品與野生菌純酶制品相比，可以發(fā)現(xiàn):
[0062]

【權(quán)利要求】
1.一種麥芽糊精底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，以Genbank AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為出發(fā)序列，其特征在于第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，或同時(shí)將第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K進(jìn)行雙突變。
2.一種獲得權(quán)利要求1所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于以GenbankAF047363.1公布的基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將該基因編碼的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的第260位的酪氨酸突變成精氨酸Y260R，或同時(shí)將第265位的谷氨酰胺突變成精氨酸賴氨酸Q265K進(jìn)行雙突變。
3.產(chǎn)權(quán)利要求1所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求3所述產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼權(quán)利要求1所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因； 2)將步驟I)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體； 3)將步驟2)獲得的重組表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
5.權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為pET-20b(+)。
6.應(yīng)用權(quán)利要求3所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至OD600 = 0.6，加入0.0ImM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、1000rpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104073476SQ201410271634
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月10日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉龍, 李江華, 韓瑞枝 申請(qǐng)人:江南大學(xué)