基于微波超聲波技術(shù)的芝麻餅粕ace抑制肽的制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于微波超聲波技術(shù)的芝麻餅粕ACE抑制肽的制備方法及用途，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域。芝麻餅粕經(jīng)過粉碎加水溶解，然后微波（超聲波）預(yù)處理，再在所得芝麻餅粕溶液中加入堿性蛋白酶酶解，對酶解體系施加超聲波輔助酶解、最后滅酶，離心，超濾，濃縮噴霧干燥得到粉末狀產(chǎn)品。該方法可以提高芝麻餅粕中蛋白的水解效率，提高酶的利用率。利用該方法制備的芝麻餅粕ACE抑制肽的ACE抑制活性高，多肽純度高。本發(fā)明實現(xiàn)了芝麻餅粕的深加工和綜合利用，對于提高其附加值具有重要意義。
【專利說明】基于微波超聲波技術(shù)的芝麻餅粕ACE抑制肽的制備方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于ACE抑制肽制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基于超聲波技術(shù)的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法及用途。

【背景技術(shù)】
[0002]人體內(nèi)的血壓受許多因素調(diào)節(jié)，來源于食品蛋白的ACE抑制肽可以抑制ACE活性而達到降血壓的作用，且安全性高，毒副作用小，成為了近幾年的研究熱點之一。芝麻是我國四大食用油料作物的佼佼者，在芝麻油制備過程中產(chǎn)生大量的芝麻餅柏下腳料。芝麻餅柏中含有豐富的蛋白質(zhì)，多肽，氨基酸，礦物質(zhì)，維生素，芝麻素等，營養(yǎng)價值豐富，其主要的用途是作為生產(chǎn)飼料的原料。應(yīng)用單一。邵元龍等研究了芝麻多肽的水解工藝以及多肽的抗氧化活性。王連翠，唐張輝等利用酶法制備芝麻柏多肽研究得到了最佳水解工藝條件。然而，利用酶法制備芝麻餅柏ACE抑制肽，超濾得到分子量小于3kDa的小分子芝麻餅柏ACE抑制肽僅限于本課題組的報道。
[0003]超聲波技術(shù)，微波技術(shù)對于有效成分的提取，高分子的降解，酶解反應(yīng)等都有很好的促進作用。并且具有高效、廉價、無污染、操作簡單、技術(shù)易推廣應(yīng)用等特點。近年來，超聲波輔助原料酶解技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。微波技術(shù)的應(yīng)用較多集中在有效成分的提取、合成方面，而應(yīng)用到多肽制備及其功能特性的研究則較少。Sakaklbara等觀察到,在三種不同的超聲強度下蔗糖酶水解速度均高于對照。王猛等利用微波技術(shù)提取葡萄籽柏中的花青素，和常規(guī)工藝比，花青素的提取率高，提取時間短。然而利用超聲波或者微波對芝麻餅柏預(yù)處理，同時將超聲與芝麻餅柏的酶解過程相結(jié)合的研究僅限于本研究課題組的報生口 ο
[0004]基于該研究課題組的微波超聲波技術(shù)制備芝麻餅柏ACE抑制肽，可以提高蛋白水解效率，酶的利用率，降低生產(chǎn)成本。從而得到一種活性較高，純度高的ACE抑制肽。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明的目的是將微波(超聲波)技術(shù)預(yù)處理原料芝麻餅柏，并且將超聲波技術(shù)應(yīng)用到芝麻餅柏的酶解反應(yīng)中，制備具有抑制體內(nèi)ACE活性的芝麻餅柏ACE抑制肽的方法及用途。
[0006]本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的:先將芝麻餅柏粉碎，加微波(超聲波)處理溶解，然后用堿性蛋白酶進行ACE抑制肽的制備，同時在水解過程中施加超聲波，最后離心，超濾，濃縮并且噴霧干燥得到分子量小于3kDa的粉末產(chǎn)品。
[0007]基于超聲波技術(shù)的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，按照下述步驟進行:
(1)對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:5.5~1:50的質(zhì)量比加入水形成混懸液，采用頻率30MHz，功率為20~60W的微波處理2~8min ;或者是采用工作/間歇時間為2 s/4 s,頻率為20kHz，功率200~1000W，初始溫度30~70°C的超聲波處理5~30min。使其中蛋白溶解到水中形成水溶液；
(2)加入堿性蛋白酶進行酶解，酶的加入量為1000~5000u/g(酶活和底物質(zhì)量比)，酶解溫度為30~70°C，pH為7~11，在酶解開始后對酶解體系采用，頻率為20 kHz，功率20~80W的超聲波處理，酶解時間為O~150min，酶解結(jié)束，停止超聲波處理。酶解結(jié)束后，酶解液90°C水浴15min滅酶，在自然冷卻到室溫。
[0008](3)離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子質(zhì)量在3 kDa (截留分子量為IkDa的超濾膜可以使最大分子量為3kDa的物質(zhì)通過)以下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。
[0009]本發(fā)明采用微波預(yù)處理芝麻餅柏，超聲波輔助酶解，與經(jīng)過同樣的酶解過程但是不施加微波、超聲波、不超濾的對照試驗相比，可以使ACE抑制肽的得率顯著提高，ACE抑制率從30.95%提高到了 68.34%，IC50值從6.03 mg/mL降到了 2.62mg/ml ;采用超聲波預(yù)處理芝麻餅柏，超聲波輔助酶解，與經(jīng)過同樣的酶解過程但是不施加超聲波、不超濾的對照試驗相比，可以使ACE抑制肽的得率顯著提高的同時，ACE抑制率從30.95%提高到了 68.45%，IC50值從6.03 mg/mL降到了 2.75mg/ml。大大提高了酶解效率和產(chǎn)品活性。
[0010]

【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明測定芝麻餅柏水解肽的ACE抑制率，IC50值(IC5tl值指的是對ACE抑制率達到50%時的多肽水溶液的濃度，該值越小，則表示其對ACE的抑制活性就越高)來反映芝麻餅柏水解物對ACE的抑制活性。
[0012]實施例1
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為400W，超聲處理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質(zhì)量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，功率為50W，其他條件和預(yù)處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解,酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫，離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子質(zhì)量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。測定ACE抑制率，IC50值，具體測定方法如下:
用6 mLpH 8.3,0.1 mol/L硼酸緩沖液溶解3 mg酶解產(chǎn)物，25 μ L ACE (I u ACE溶于10 mL的pH 8.3,0.1 mol/L的硼酸緩沖液中，該緩沖液含0.3 mol/L NaCl)加入到含10μ L樣品的離心管中，37°C保溫5 min，隨后加入6.5 mmol/L的馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippury 1-L-histidyl-L-leucine, HHL) 40 μ L,在 37°C恒溫反應(yīng) 30 min,加入 85 “1^濃度為I mol/L的HCl終止反應(yīng)，同時用10 μ L的pH 8.3硼酸緩沖液作空白對照反應(yīng)，所得反應(yīng)液直接用于HPLC分析。
[0013]HPLC 條件=ZORBAX-C18 柱(4.6 X 150 mm,填料粒徑 5 μ m);檢測波長 228 nm ;進樣量8 μ L ;柱溫25°C ;流動相為超純水-乙腈(80:20，各含0.5%。三氟乙酸)；流速1.0 mL/min。計算公式如下:
R=(A-B)/A*100%
式中:R — ACE抑制率，% ；
A—空白對照組Hip的峰面積；
B—添加ACE抑制肽組Hip的峰面積。
[0014]稱取一定質(zhì)量樣品配成不同濃度的溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪成圓滑的曲線，從曲線中計算IC5tl值。
[0015]對照試驗:對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，不施加超聲，再按照上述相同酶解過程處理，但是不施加超聲，酶解結(jié)束后的滅酶，離心，取上清液噴霧干燥以及測定方法均按照上述方法處理。
[0016]經(jīng)過測定，對照組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為30.95%，IC50值為6.03mg/ml,實驗組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為72.5%，IC5tl值為3.82mg/ml。可見，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0017]實例2
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，功率為40W，微波處理5.5 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質(zhì)量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，10000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為40W，超聲處理24min其他條件和預(yù)處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解，酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫,離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm),選用截留分子質(zhì)量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。測定水解產(chǎn)物多肽得率和ACE抑制率，IC5tl值，具體測定方法參照實例I。
[0018]對照試驗:對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，不施加微波，再按照上述相同酶解過程處理，但是不施加超聲，酶解結(jié)束后的滅酶，離心，超濾以及測定方法均按照上述方法處理。
[0019]經(jīng)過測定，對照組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為28.25%，IC50值為5.73mg/ml,實驗組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為66.0%，IC5tl值為3.85mg/ml?？梢?，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0020]實例3
對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為800W，超聲處理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活2500 u/g(酶活和底物質(zhì)量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，100000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，功率為40W，其他條件和預(yù)處理的超聲波一樣，超聲處理30min后停止酶解,酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫，離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm)，選用截留分子質(zhì)量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。測定水解產(chǎn)物多肽得率和ACE抑制率，IC50值。具體測定方法參照實例I。
[0021]空白試驗參照實例I。
[0022]經(jīng)過測定，對照組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為31.25%，IC50值為5.93mg/ml,實驗組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為66.70%，IC5tl值為3.80mg/ml。可見，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
[0023]實例4對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:11.9的比例加入水中形成混懸液，在機械攪拌的條件下，功率為40W，微波處理5min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻餅柏蛋白水溶液；以酶活1700 u/g (酶活和底物質(zhì)量比)加入堿性蛋白酶(無錫杰能科生物工程有限公司，10000u/g)，溫度為46°C，pH值為8.88，采用工作/間歇時間定為2 s/4 S、功率為50W，超聲處理30min其他條件和預(yù)處理的超聲波一樣，超聲處理24min后停止酶解，酶解液90°C水浴15min滅酶。自然冷卻至室溫,離心取上清液真空抽濾(Φ9 cm),選用截留分子質(zhì)量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子量在3 kDa下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。測定水解產(chǎn)物多肽得率和ACE抑制率，IC5tl值，具體測定方法參照實例I。
[0024]空白試驗參照實例2。
[0025]經(jīng)過測定，對照組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為32.02%, IC50值為6.73mg/ml,實驗組的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率為67.20%，IC5tl值為2.67mg/ml?？梢?，在同等過程條件下，伴隨著多肽的純度的提高，采用超聲波的酶解產(chǎn)物多肽的ACE抑制率顯著提高了，IC5tl值明顯降低了。
【權(quán)利要求】
1.基于超聲波技術(shù)的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)對粉碎后的芝麻餅柏以與水1:5.5~1:50的質(zhì)量比加入水形成混懸液，采用頻率30MHz，功率為20~60W的微波處理2~8min ;使其中蛋白溶解到水中形成水溶液； (2)加入堿性蛋白酶進行酶解，在酶解開始后對酶解體系采用，頻率為20kHz，功率20~80W的超聲波處理，酶解時間為O~150min，酶解結(jié)束，停止超聲波處理； 酶解結(jié)束后，酶解液90°C水浴15min滅酶，在自然冷卻到室溫； (3)離心取上清液真空抽濾(Φ9cm)，選用截留分子量為I kDa的平板膜，超濾分離得到分子質(zhì)量在3 kDa以下的產(chǎn)物，收集濃縮后噴霧干燥得到芝麻餅柏ACE抑制肽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于超聲波技術(shù)的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于步驟(1)中或者是采用工作/間歇時間為2 s/4 s，頻率為20kHz，功率200~1000W，初始溫度30~70°C的超聲波處理5~30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于超聲波技術(shù)的芝麻餅柏的ACE抑制肽的制備方法，其特征在于步驟(2)中酶的加 入量為1000~5000u/g，酶解溫度為30~70°C，pH為7~11。
【文檔編號】C12P21/06GK104131056SQ201410271440
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】王振斌, 梁秋芳, 馬海樂, 王林, 王世清 申請人:江蘇大學(xué)