具有高β-環(huán)化活力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有高β-環(huán)化活力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程 和酶工程領域。
【背景技術】
[0002] 環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖通過α -1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，其中以6、 7和8個葡萄糖單元所構成的α-、β_和γ-環(huán)糊精最為常見。由于其呈中空圓筒狀結構， 具有外部親水、內(nèi)部疏水的特性，環(huán)糊精能與許多疏水客體分子形成包合物，從而改變客體 分子的理化性質(zhì)，因此，在食品、醫(yī)藥等工業(yè)領域中有著廣泛的應用。
[0003] 環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法工藝，即在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGT酶）催化 作用下通過環(huán)化反應轉(zhuǎn)化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精的環(huán)化活力較 低、特異性較差，使得環(huán)糊精的工業(yè)生產(chǎn)成本較高。
[0004] 本發(fā)明中所使用的來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans) STBOl的β-CGT 酶總的環(huán)化活力約為302U/mg，進一步提高該酶的環(huán)化活力，將更加有利于環(huán)糊精的工業(yè)化 生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種環(huán)化活力提高的環(huán)糊精葡萄糖 基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶的第89位的酪氨酸分別突變?yōu)楦拾彼?、天冬氨酸和天冬酰胺，所得單突變體依次命名為 Y89G、Y89D、Y89N。
[0006] 所述突變體還可以在單突變體的基礎上，將第577位天冬氨酸突變?yōu)榫彼幔?到雙突變體，所得雙突變體依次命名為Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R。
[0007] 編碼所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，來源于環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)STBOl〇
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種獲得所述突變體Y89G、Y89D、Y89N、 Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 的方法。根據(jù) B. circulans STB01CGT 酶的基因序 列，分別設計并合成引入Gly89、Asp89、Asn89密碼子單突變的引物和引入Asp577/Gly89、 Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密碼子雙突變的引物，對基因進行定點突變，測定DNA序列， 分別鑒別出編碼 Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 突變體的基因， 并在枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)WB 600中進行表達。
[0009] 所述方法還進一步包括突變體的表達與純化：挑取攜帶編碼突變體的質(zhì)粒的表 達宿主B.subtilis WB 600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8~12h， 以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、 1000 Orpm離心20min以除去菌體，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和強陰離子交換Q-HP 柱相結合的方法，分別純化得到突變體Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/ D577R酶制品。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：構建了 6個有意義的突變體Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、 Y89D/D577R和Y89N/D577R，均實現(xiàn)了重組CGT酶β -環(huán)化活力的提高，比野生型CGT酶更 適用于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0011] 圖1野生型CGT酶及其突變體在pH 6. 5、50°C下作用于5% (濕基，w/v)麥芽糊 精生產(chǎn)環(huán)糊精情況；A，野生CGT酶；B，突變體Y89G ;C，突變體Y89D ;D，突變體Y89N ;E，突變 體 Y89G/D577R ;F，突變體 Y89D/D577R ;G，突變體 Y89N/D577R ; ，α -環(huán)糊精；#，β -環(huán)糊 精；▲，γ-環(huán)糊精。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1突變位點的確定
[0013] 鈣離子結合位點廣泛存在于α -淀粉酶家族中，作為α -淀粉酶家族（家族13)的 一員，CGT酶也具有相似的媽離子結合位點。來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans) STBOl的CGT酶第577位氨基酸殘基天冬氨酸（Asp)位于鈣離子結合位點CaIII處，將 Asp577突變?yōu)榫彼幔ˋrg)后，與野生型β-CGT酶相比，突變體D577R的β-環(huán)化活力提 高了 30. 7%，但是產(chǎn)物特異性沒有發(fā)生改變。為了進一步提高來源于Β. circulars STBOl 的β-CGT酶的β-環(huán)化活力，我們考慮設計雙突變以期得到酶活力高、β-環(huán)糊精特異性 高的突變體。而氨基酸殘基89是定位于亞位點-3附近的主要殘基之一，我們構建并得到 了雙突變體重組酶Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R，同時也構建了單突變體Y89G、 Y89D和Υ89Ν作為對照。
[0014] 實施例 2 突變體 Y89G、Y89D、Υ89Ν、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 的制 備
[0015] (1)定點突變
[0016] 根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的野生CGT酶基因序列，分別設計并合成引入Gly89、 Asp89、Asn89密碼子單突變的引物；根據(jù)SEQ ID NO. 15所示的突變體D577R基因序列，分 別設計并合成了引入Asp577/Gly89、Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密碼子雙突變的引物。 單突變體是將第89位的Tyr分別突變?yōu)镚ly、Asp和Asn，雙突變體是在將第577位Asp突 變?yōu)锳rg的基礎上，將第89位的Tyr分別突變?yōu)镚ly、Asp和Asn。所得6種突變體依次命 名為：Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R
[0017] 利用快速PCR技術，以含野生CGT酶基因的表達載體cgt/pST為模板進行定點突 變，所用引物分別是：
[0018] 引入Tyr89Gly突變的引物：
[0019] 正向引物：5' -CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0020] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基；
[0021] 引入Tyr89Asp突變的引物：
[0022] 正向引物：5' -CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0023] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基；
[0024] 引入Tyr89Asn突變的引物：
[0025] 正向引物：5' -CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0026] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基；
[0027] 以含突變體D577R基因的表達載體cgt/pST_D577R為模板進行定點突變，所用引 物分別是：
[0028] 引入Tyr89Gly突變的引物：
[0029] 正向引物：5' -CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0030] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基；
[0031] 引入Tyr89Asp突變的引物：
[0032] 正向引物：5' -CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0033] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基；
[0034] 引入Tyr89Asn突變的引物：
[0035] 正向引物：5' -CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3'，下劃線為突變堿基，
[0036] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3'，下劃線為突變堿基。
[0037] PCR 反應體系均為：5 XPrimeSTARBuffer (Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L， 正向引物（10 μ Μ) 1 μ L，反向引物（10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2· 5U/ μ L) 0· 5 μ L，加入雙蒸水 32. 5 μ L0
[0038] PCR反應擴增條件均為：PCR擴增條件均為：98 °C預變性4min ;隨后98 °C 10s， 55°C 15s，72°C 8min 進行 35 個循環(huán)；最后 72°C保溫 lOmin。
[0039] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)過Dp