專利名稱：底物的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠迅速且容易地對(duì)血液、尿液和果汁等試樣中所含的底物進(jìn)行高精度定量的方法。
以往，作為不需要稀釋和攪拌試液，就能夠簡(jiǎn)便地對(duì)試液中的特定成分進(jìn)行定量的方法有在電子傳遞體(又稱為電子接受體)的存在下，使特定成分和以該特定成分為底物的氧化還原酶進(jìn)行反應(yīng)，使還原的電子傳遞體進(jìn)行電化學(xué)氧化，由所得的氧化電流值進(jìn)行定量的方法。
該方法一般使用日本專利公開公報(bào)平3-202764號(hào)揭示的生物傳感器。
上述生物傳感器是利用網(wǎng)版印刷等方法在絕緣性基板上形成由工作電極和對(duì)應(yīng)電極組成的電極系，然后在該電極系上形成含有氧化還原酶和電子傳遞體的反應(yīng)層，再在絕緣性基板上加上封蓋和隔板而制得的。
上述生物傳感器通過使用各種氧化還原酶，能夠?qū)Ω鞣N特定成分進(jìn)行定量。
作為生物傳感器的一個(gè)例子，對(duì)葡萄糖傳感器進(jìn)行說明。
作為葡萄糖定量的方法，一般公知的是將葡萄糖氧化酶和氧電極或過氧化氫電極組合使用的方式(例如，鈴木周一編《生物傳感器》，講談社)。
葡萄糖氧化酶以反應(yīng)系的氧為電子傳遞體，選擇性地將作為底物的β-D-葡萄糖氧化為D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯。在該反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，氧被還原為過氧化氫。用氧電極測(cè)定此時(shí)的氧消耗量，或通過使用了鉑電極等的過氧化氫電極測(cè)定過氧化氫的生成量就可對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量。
但是，上述方法中，有的測(cè)定對(duì)象會(huì)受到溶解氧濃度的很大影響，而且，在沒有氧的條件下就不能夠進(jìn)行測(cè)定。
所以，開發(fā)了不以氧為電子傳遞體，而是以鐵氰化鉀、二茂鐵衍生物、醌類衍生物等有機(jī)化合物或金屬配合物為電子傳遞體的新型葡萄糖傳感器。
該類型的生物傳感器可使已知量的葡萄糖氧化酶和電子傳遞體以穩(wěn)定狀態(tài)附載在電極上，使電極系和反應(yīng)層以近乎干燥的狀態(tài)合為一體。
由于這種生物傳感器是一次性的，而且只要在插入于測(cè)定器的傳感器觸點(diǎn)中導(dǎo)入檢體試樣，就能夠很容易地對(duì)底物濃度進(jìn)行測(cè)定，所以，近年來倍受矚目。
如上所述，使通過一連串酶反應(yīng)而生成的電子傳遞體的還原體在電極上氧化，即可由所得的氧化電流值對(duì)試樣中的底物進(jìn)行定量。
使用工作電極和對(duì)應(yīng)電極，以二電極方式測(cè)定氧化電流值時(shí)，對(duì)應(yīng)電極上必須有被還原的電子傳遞體的氧化體。
底物濃度較低時(shí)，由于通過酶反應(yīng)而被還原的氧化體的量較少，所以沒有必要特別留意該電子傳遞體的氧化體的存在。
但是，底物濃度較高時(shí)，由于通過酶反應(yīng)大部分電子傳遞體的氧化體轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原體，所以，對(duì)應(yīng)電極上可還原的氧化體不足。其結(jié)果是，對(duì)應(yīng)電極上的還原反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))，從而對(duì)所得的電流測(cè)定值產(chǎn)生影響。
此外，試樣中有時(shí)含有易氧化的物質(zhì)，這些物質(zhì)在電子傳遞體的還原體在電極上進(jìn)行氧化的同時(shí)被氧化，生成氧化電流，使測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)正的誤差。而且，底物濃度較高時(shí)，氧化電流值的偏差較大。
本發(fā)明的目的是提供通過抑制對(duì)應(yīng)電極上電子傳遞體的氧化體不足而引起的對(duì)電流值的影響，并減少易氧化的干擾物質(zhì)引起的對(duì)電流值的影響，從而對(duì)較大濃度范圍內(nèi)，特別是高濃度范圍內(nèi)的底物進(jìn)行高精度定量的方法。
本發(fā)明提供的底物的定量方法包括以下2個(gè)步驟1．在電子傳遞體的氧化體的存在下，使試樣中的底物和能與前述底物進(jìn)行特異性反應(yīng)的氧化還原酶反應(yīng)；2．使步驟1中沒有被還原的前述電子傳遞體的氧化體進(jìn)行電化學(xué)還原，獲得還原電流值。
易氧化的干擾物質(zhì)包括血液中含有的抗壞血酸和尿酸等。由于這些易氧化的干擾物質(zhì)難以被電化學(xué)還原，所以，不會(huì)產(chǎn)生還原電流。
因此，通過在一連串酶反應(yīng)中沒有被還原的電子傳遞體的氧化體的還原，由所得的還原電流值對(duì)底物進(jìn)行定量的方法，能夠減少易氧化的干擾物質(zhì)的影響，以更高的精度進(jìn)行定量。
以二電極式測(cè)定還原電流值時(shí)，在底物濃度較低的范圍內(nèi)，由于酶反應(yīng)生成的電子傳遞體的還原體的量較少，所以，在電極上的氧化還原反應(yīng)中，還原體的氧化反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))，還原電流值隨著底物濃度增加而增加。
由于電子傳遞體的氧化體隨著底物濃度的增加而減少，所以，從某一底物濃度起氧化體變得不足。因此，在電極上的氧化還原反應(yīng)中，電子傳遞體的氧化體的還原反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))，還原電流值開始減少。
由于此時(shí)的還原電流值直接反映未在酶反應(yīng)中被還原的電子傳遞體的氧化體的量，所以對(duì)底物濃度具有良好的應(yīng)答特性。
此外，即使在底物濃度較低的范圍內(nèi)，為使電子傳遞體的氧化體的還原反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))，較好的是還使電子傳遞體的還原體存在于在電子傳遞體的氧化體存在下進(jìn)行酶反應(yīng)的反應(yīng)系中。通過使電子傳遞體的還原體存在于反應(yīng)系中，就能夠?qū)Ω鼜V濃度范圍內(nèi)的底物進(jìn)行高精度定量。
作為還原電流的測(cè)定方法，包括上述僅有工作電極和對(duì)應(yīng)電極的二電極式和再加上參比電極的三電極式，其中三電極式更加準(zhǔn)確，并能對(duì)高濃度的底物進(jìn)行定量。
如果將本發(fā)明的底物定量法應(yīng)用于具備形成于絕緣性基板上的至少具有工作電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系，以及在電極系上形成的至少包含氧化還原酶的反應(yīng)層的生物傳感器，就能夠?qū)Π谏矬w試樣中的特定成分進(jìn)行高精度定量，因而是較理想的。
而且，如果使反應(yīng)層包含親水性高分子，就能夠防止淀粉等吸附在電極系表面，因而是較理想的。
此外，如果用含脂質(zhì)的層覆蓋反應(yīng)層表面，就能夠順利地將試樣傳遞到反應(yīng)層，所以，能夠根據(jù)不同用途加以使用。
為了提高反應(yīng)層中的酶活性，所以，反應(yīng)層中還可含有pH緩沖劑。
作為氧化還原酶，可使用葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、尿酸酶、果糖脫氫酶、醇氧化酶、膽固醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶和氨基酸氧化酶等。
還可將數(shù)個(gè)氧化還原酶，如葡萄糖氧化酶和蔗糖酶、葡萄糖氧化酶和蔗糖酶及變旋酶(タロタ-ゼ)、果糖脫氫酶和蔗糖酶等組合使用。
作為電子傳遞體，可使用鐵氰化鉀、對(duì)苯輥、N-甲基吩嗪(硫酸單甲酯)鹽、亞甲藍(lán)、二茂鐵衍生物等。此外，以氧作為電子傳遞體時(shí)也能夠獲得傳感器應(yīng)答。電子傳遞體可使用其中的1種或2種以上。
作為親水性高分子，可使用羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、明膠及其衍生物、丙烯酸或其鹽的聚合物、甲基丙烯酸或其鹽的聚合物、淀粉及其衍生物、馬來酸酐或其鹽的聚合物，還可使用羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素和羧甲基乙基纖維素等纖維素衍生物，聚賴氨酸等聚氨基酸以及聚苯乙烯磺酸。
其中，較好的是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素。也可使用聚賴氨酸等聚氨基酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸等。
脂質(zhì)可使用卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等磷脂，較好的是使用既親油又親水的脂質(zhì)。
pH緩沖劑可使用磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鉀、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸-檸檬酸三鉀、檸檬酸二氫鉀-氫氧化鈉、檸檬酸二氫鈉-氫氧化鈉、馬來酸氫鈉-氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉、琥珀酸-四硼酸鈉、馬來酸-三(羥甲基)氨基甲烷、三(羧甲基)氨基甲烷-三(羧甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、[N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸]-氫氧化鈉、[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸]-氫氧化鈉、[哌嗪-N,N′-雙(2-乙烷磺酸)]-氫氧化鈉等。
可將酶和電子傳遞體溶于試液中，也可通過將反應(yīng)層固定在基板等上而使酶和電子傳遞體不溶于試液中。將酶和電子傳遞體固定化時(shí)，反應(yīng)層中較好的是含有上述親水性高分子。


圖1表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中除去了反應(yīng)層的二電極式葡萄糖傳感器的分解斜視圖。
圖2表示本發(fā)明的另一實(shí)施例中除去了反應(yīng)層的三電極式葡萄糖傳感器的分解斜視圖。
圖3表示除去了隔板和封蓋的同一葡萄糖傳感器主要部分的縱剖面圖。
圖4表示實(shí)施例中二電極式葡萄糖傳感器對(duì)于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試液的應(yīng)答特性圖。
圖5表示另一實(shí)施例中二電極式葡萄糖傳感器對(duì)于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試液的應(yīng)答特性圖。
圖6表示另一實(shí)施例中三電極式葡萄糖傳感器對(duì)于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)試液的應(yīng)答特性圖。
以下，通過列舉具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明。
圖1表示除去了反應(yīng)層的二電極式葡萄糖傳感器的分解斜視圖。通過網(wǎng)版印刷法在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯制成的絕緣性基板1上涂布銀糊狀物，形成導(dǎo)電板2和3。然后，在基板1上印刷含樹脂粘合劑的導(dǎo)電性石墨糊狀物，形成工作電極4。該工作電極4與導(dǎo)電板2接觸。接著，在基板1上印刷絕緣性糊狀物，形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋在工作電極4的外圍部分，這樣就能夠使工作電極4的露出部分面積保持不變。然后，在基板1上印刷含樹脂粘合劑的導(dǎo)電性石墨糊狀物，使其與導(dǎo)電板3接觸，形成環(huán)狀對(duì)應(yīng)電極5。
按照?qǐng)D1中點(diǎn)劃線所示位置連接絕緣性基板1、具備空孔11的封蓋9和隔板10，制得生物傳感器。為了在基板和封蓋間形成試液供給通道，在隔板10上設(shè)置了狹縫13。12相當(dāng)于試液供給通道的開口部。
圖2為除去了反應(yīng)層的三電極式葡萄糖傳感器的分解斜視圖。在對(duì)應(yīng)電極5的外側(cè)設(shè)置了從絕緣層6中露出來的由石墨糊狀物形成的參比電極15，還形成了導(dǎo)電板14，其他構(gòu)成與圖1相同。
圖3表示本發(fā)明一實(shí)施例中使用的除去了隔板和封蓋的生物傳感器的主要部分的縱剖面圖。
如圖1所示，在形成了電極系的電絕緣性基板1上形成包含酶和電子傳遞體的反應(yīng)層7，在反應(yīng)層7上形成卵磷脂層8。
實(shí)施例1將葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4，以下略稱為GOD)和鐵氰化鉀的混合水溶液滴在圖1的基板1的電極系上，干燥后形成反應(yīng)層。然后，將卵磷脂的甲苯溶液滴在反應(yīng)層上，干燥后形成卵磷脂層。
按照?qǐng)D1中點(diǎn)劃線所示位置連接基板1、封蓋9和隔板10，制得葡萄糖傳感器。
所用的試液是各種濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。通過試液供給通道的開口部12提供3μl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液。試液到達(dá)空孔11部分，使電極系上的反應(yīng)層7溶解。反應(yīng)層7溶解后，試液中的葡萄糖被GOD氧化為葡糖酸內(nèi)酯。通過該酶反應(yīng)將鐵氰化物離子還原為亞鐵氰化物離子。
導(dǎo)入試液一定時(shí)間后，以對(duì)應(yīng)電極5為基準(zhǔn)對(duì)工作電極4施加-1.0V的電壓。由于施加該電壓，工作電極上的鐵氰化鉀就發(fā)生了還原反應(yīng)，而對(duì)應(yīng)電極上的亞鐵氰化鉀發(fā)生了氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生電流，所以，在施加電壓5秒鐘后測(cè)定電流值。
圖4是傳感器對(duì)于各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答，將葡萄糖濃度約為700mg/dl時(shí)的電流值定為100％。
葡萄糖濃度在0～700mg/dl的范圍時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加傳感器應(yīng)答直線增加。這就提示了由于酶反應(yīng)生成的亞鐵氰化物離子的量較少，所以，在對(duì)應(yīng)電極的亞鐵氰化鉀的氧化反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))。
在葡萄糖濃度超過700mg/dl的范圍時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，傳感器應(yīng)答減少。這表明由于酶反應(yīng)生成的亞鐵氰化物離子非常多，在工作電極的鐵氰化物離子的還原反應(yīng)成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))。
如圖4所示，不論底物濃度在何種范圍，都能夠獲得良好的應(yīng)答特性。
實(shí)施例2將羧甲基纖維素(以下略稱為CMC)的水溶液滴在圖1的基板1的電極系上，使其干燥，形成CMC層。然后，與實(shí)施例1同樣，形成反應(yīng)層和卵磷脂層。通過形成CMC層，減小了淀粉等在電極表面的吸附而造成的影響。
接著，與實(shí)施例1同樣，制得葡萄糖傳感器，測(cè)定其對(duì)于實(shí)施例1中配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答。結(jié)果是，偏差更小，獲得了與實(shí)施例1相同的應(yīng)答特性。
實(shí)施例3將CMC水溶液滴在圖1的基板1的電極系上，干燥后形成CMC層。然后將GOD和鐵氰化鉀及亞鐵氰化鉀的混合水溶液滴在CMC層上，干燥后形成反應(yīng)層。接著，與實(shí)施例1同樣，制得葡萄糖傳感器。測(cè)定其對(duì)于實(shí)施例1中配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答。
圖5是傳感器對(duì)于各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答，將葡萄糖濃度為0mg/dl時(shí)獲得的應(yīng)答電流值定為100％。
如圖5所示，隨著葡萄糖濃度的增加傳感器應(yīng)答減少。這是由于反應(yīng)層中預(yù)先含有亞鐵氰化鉀，所以在對(duì)應(yīng)電極被氧化的亞鐵氰化物離子總是很充分，即使在底物濃度較低的情況下，工作電極的鐵氰化物離子的還原反應(yīng)也成為制約總反應(yīng)速度的反應(yīng)(限速反應(yīng))的緣故。
此外，不論底物濃度在何種范圍內(nèi)，都能夠獲得良好的應(yīng)答特性。
實(shí)施例4將CMC水溶液滴在圖2的絕緣性基板1的除去了參比電極15的電極系上，干燥后形成CMC層。然后，將GOD和鐵氰化鉀的混合水溶液滴在該CMC層上，干燥后形成反應(yīng)層。在反應(yīng)層上滴加卵磷脂的甲苯溶液，干燥后形成卵磷脂層。
按照?qǐng)D2中點(diǎn)劃線所示位置在基板1上連接封蓋9和隔板10，制得葡萄糖傳感器。
從試液供給通道的開口部12導(dǎo)入3μl實(shí)施例1配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液。在導(dǎo)入試液一定時(shí)間后，以參比電極15為基準(zhǔn)，在工作電極5施加-0.8V的電壓，5秒鐘后測(cè)定工作電極15和對(duì)應(yīng)電極8間的電流值。
圖6是傳感器對(duì)于各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液的應(yīng)答，將葡萄糖濃度為0mg/dl時(shí)所得的應(yīng)答電流值定為100％。
如圖6所示，傳感器的應(yīng)答特性在較大的底物濃度范圍內(nèi)均良好，能定量的底物濃度可達(dá)6000mg/dl。
實(shí)施例5與實(shí)施例4同樣操作，制得葡萄糖傳感器。
除了用含有已知量的抗壞血酸的試液代替實(shí)施例1配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)水溶液之外，其他操作與實(shí)施例4相同，測(cè)定傳感器的應(yīng)答。
其結(jié)果是，不論抗壞血酸是否存在，傳感器的應(yīng)答都與實(shí)施例4大致相同，顯示了良好的應(yīng)答特性。
此外，上述實(shí)施例中列舉了石墨、絕緣糊狀物的印刷圖案的幾個(gè)例子，但本發(fā)明并不僅限于這些圖案。
如上所述，利用本發(fā)明能夠?qū)^大濃度范圍內(nèi)，特別是高濃度范圍內(nèi)的底物進(jìn)行高精度定量。
權(quán)利要求
1．底物的定量方法，其特征在于，包括以下2個(gè)步驟(1)在電子傳遞體的氧化體的存在下，使試樣中的底物和能與前述底物進(jìn)行特異性反應(yīng)的氧化還原酶反應(yīng)；(2)使前述步驟(1)中沒有被還原的前述電子傳遞體的氧化體電化學(xué)還原，獲得還原電流值。
2．如權(quán)利要求1所述的底物的定量方法，其特征還在于，前述步驟(1)的反應(yīng)系中還存在電子傳遞體的還原體。
3．如權(quán)利要求1或2所述的底物的定量方法，其特征還在于，使用具備電絕緣性基板、形成于前述基板上的至少包含工作電極和對(duì)應(yīng)電極的電極系，以及配置在前述電極系上的含有氧化還原酶和電子傳遞體的反應(yīng)層的生物傳感器。
4．如權(quán)利要求1或2所述的底物的定量方法，其特征還在于，使用具備電絕緣性基板、形成于前述基板上的至少包含工作電極、對(duì)應(yīng)電極和參比電極的電極系，以及配置在前述電極系上的含有氧化還原酶和電子傳遞體的反應(yīng)層的生物傳感器。
5．如權(quán)利要求3或4所述的底物的定量方法，其特征還在于，前述反應(yīng)層還含有親水性高分子。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種使通過酶反應(yīng)被還原的電子傳遞體電化學(xué)氧化,由氧化電流值對(duì)底物進(jìn)行定量的方法,該方法能夠減小易氧化的干擾物質(zhì)的影響,對(duì)底物進(jìn)行高精度定量。該定量方法包括以下2個(gè)步驟:(1)在電子傳遞體的氧化體的存在下,使試樣中的底物和能與前述底物進(jìn)行特異性反應(yīng)的氧化還原酶反應(yīng);(2)使前述步驟(1)中沒有被還原的前述電子傳遞體的氧化體電化學(xué)還原,獲得還原電流值。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1224159SQ9811684
公開日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1998年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月29日
發(fā)明者池田信, 吉岡俊彥, 南海史郎 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社