專利名稱：催化大分子底物反應(yīng)的交聯(lián)酶聚集體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備無載體固定化酶的方法，特別是-種催化大分子底物反應(yīng)的交聯(lián)酶聚集 體及其制備，它是一種多孔化修飾的交聯(lián)酶聚集體的制備方法。
背景技術(shù)：
交聯(lián)酶聚集體(Cross - linked Enzyme Aggregates, CLEAs)是一種無載體固定化酶技術(shù)，在 制備過程中首先利用沉淀劑使溶解態(tài)的酶分子沉淀聚集，隨后對酶沉淀聚體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。 該方法無惰性載體引入，單位質(zhì)量固定化酶的載酶量高，具有較寬的最適pH和最適溫度范 圍；在高溫、有機(jī)溶劑和強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定性強(qiáng)，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦凸潭ɑ阜?法。但是，由于在交聯(lián)酶聚集體制備過程中大量酶分子被包裹在沉淀聚體的集簇內(nèi)部，且這 一結(jié)構(gòu)被隨后的共價(jià)交聯(lián)所固定，因此限制了集簇內(nèi)部酶分子與底物的自由結(jié)合。特別是當(dāng) 底物為大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、高分子聚合物等時(shí)，由于空間位阻的影響，底物分子 無法進(jìn)入交聯(lián)酶聚集體集簇內(nèi)部，而只能與表面酶分子發(fā)生反應(yīng)，大大降低了該類固定化酶 的催化效率。至今，國內(nèi)外未見有適于催化大分子底物反應(yīng)的交聯(lián)酶聚集體制備方法的文獻(xiàn) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種催化大分子底物反應(yīng)的交聯(lián)酶聚集體及其制備方法，可以克服 現(xiàn)有交聯(lián)酶聚集體技術(shù)的上述缺點(diǎn)，是在酶溶液屮加入淀粉作為致孔劑，隨后令酶與淀粉共 聚沉交聯(lián)，最后將oc-淀粉酶解去除。
本發(fā)明提供的催化大分子底物反應(yīng)的多孔化交聯(lián)酶聚集體是以蛋白酶和淀粉為原料，按 照下述的質(zhì)量配比制成，蛋白酶淀粉=0.015 0.75: 1;具體制備方法是將含淀粉的pH=7
的緩沖溶液與蛋白酶混合均勻，然后加入有機(jī)溶劑或硫酸銨溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚體的
懸濁液加入戊二醛交聯(lián)，沉淀物洗滌，加入a-淀粉酶反應(yīng)，去除淀粉，沉淀物洗滌，再分散 于緩沖液中保存。
本發(fā)明提供的催化大分子底物反應(yīng)的多孔化交聯(lián)酶聚集體的制備方法包括的歩驟
1) 糊化淀粉的制備
按計(jì)量淀粉溶于pH=7的緩沖液中配制成質(zhì)量百分濃度為1 4%的淀粉液，于80 100 'C水浴中攪拌3 10分鐘，得到糊化淀粉。
2) 酶-淀粉混合液的共沉淀
上述糊化淀粉液，加入蛋白酶，于4 3CTC攪拌均勻，加入有機(jī)溶劑(乙醇或甲醇或丙 酮或聚乙二醇)或飽和硫酸銨溶液(76.7%)，全部加入后攪拌30分鐘，得到酶-淀粉共沉淀 聚體的懸濁液。
3) 酶-淀粉共沉淀聚體的共價(jià)交聯(lián)向酶-淀粉共沉淀聚體懸濁液中加入戊二醛，令最終戊二醛的質(zhì)量百分濃度為1 5%，于 4 30'C攪拌4 16小時(shí)。 4)酶解去除淀粉
向共價(jià)交聯(lián)后的混合體系中加入緩沖液，pH7.0，離心取沉淀物，用緩沖液反復(fù)洗滌離心 沉淀物，重復(fù)3-5次以去除戊二醛殘留。將沉淀物分散于緩沖液中，向此混合液中加入質(zhì)量 濃度為1 10。/。的cx-淀粉酶，于室溫下攪拌反應(yīng)12 24小時(shí)，再次離心取沉淀物，用緩沖液 反復(fù)洗滌沉淀物，最終將沉淀物分散于緩沖液中，于4'C下保存。
所述的淀粉是玉米淀粉或木薯淀粉或馬鈴薯淀粉或小麥淀粉；所述的蛋白酶是胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶。
所述的緩沖液是磷酸緩沖液；所述的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮或聚乙二醇。
本發(fā)明提供的催化大分子底物反應(yīng)的多孔化交聯(lián)酶聚集體，用于水解卵清白蛋白及牛血 清白蛋白等大分子底物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同條件下，未經(jīng)多孔化處理的交聯(lián)酶聚集體的 催化效率僅為游離態(tài)酶催化效率的9 12%，而多孔化交聯(lián)酶聚集體的催化效率為游離態(tài)酶催 化效率的80 100。/。。本發(fā)明可以應(yīng)用于蛋白酶類、聚糖酶類等的固定化。


圖1木瓜蛋白酶CLEAs造孔前后孔徑形貌的掃描電鏡圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
在10mL磷酸緩沖液(O.IM， pH7.0)中加入玉米淀粉，配制成質(zhì)量百分比濃度為4%的 淀粉液，于IO(TC沸水浴中攪拌5分鐘，得到糊化玉米淀粉。待糊化淀粉液冷卻至室溫后加 入50mg的木瓜蛋白酶，于室溫下攪拌均勻，緩緩加入卯mL乙醇，全部加入后攪拌30分鐘， 得到酶-淀粉共沉淀聚體懸濁液。向酶-淀粉共沉淀聚體懸濁液中加入戊二醛進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)， 令最終戊二醛的質(zhì)量百分比濃度為4.5%,于室溫下攪拌12小時(shí)。向交聯(lián)后的酶-淀粉混合體 系中加入100mL磷酸緩沖液(O.IM， pH7.0)， 3000rpm離心3分鐘，取沉淀物。用50mL同 樣的磷酸緩沖液洗滌離心沉淀物，重復(fù)3次以去除戊二醛殘留。將沉淀物懸濁分散于20niL 磷酸緩沖液中，并向其中加入lmL質(zhì)量濃度為5。/。的oc-淀粉酶溶液，于室溫下攪拌反應(yīng)12小 時(shí)，再次離心，并用磷酸緩沖液反復(fù)洗滌沉淀物。最終將沉淀物分散于磷酸緩沖液中，于4 'C下保存，制得多孔化交聯(lián)木瓜蛋白酶聚集體。
將所制多孔化交聯(lián)木瓜蛋白酶聚集體應(yīng)用于卵清蛋白和牛血清白蛋白水解實(shí)驗(yàn)。于35'C 下水解質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05°/。的卵清蛋白和牛血清白蛋白磷酸緩沖液(O.IM， pH7.0)溶液，加入酶 量與蛋白質(zhì)量之比為1: 200，水解時(shí)間15min。實(shí)驗(yàn)證明，多孔化交聯(lián)酶聚集體催化卵清蛋 白和牛血清白蛋白水解效率分別是游離酶的96%和113%，而未經(jīng)多孔化處理的傳統(tǒng)交聯(lián)酶聚 集體的催化效率僅為游離酶的9.3%和11.3%。未造孔和淀粉造孔后的交聯(lián)酶聚集體形貌如圖 1電鏡圖所示。
權(quán)利要求
1、一種催化大分子底物反應(yīng)的多孔化交聯(lián)酶聚集體，其特征在于它是以蛋白酶和淀粉為原料，按照下述的質(zhì)量配比制成，蛋白酶∶淀粉＝0.015～0.75∶1；具體制備方法是將含淀粉的pH＝7的緩沖溶液與蛋白酶混合均勻，然后加入有機(jī)溶劑或硫酸銨溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚體的懸濁液加入戊二醛交聯(lián)，沉淀物洗滌，加入α-淀粉酶反應(yīng)，去除淀粉，沉淀物洗滌，再分散于緩沖液中保存。
2、 一種權(quán)利要求1所述的催化大分子底物反應(yīng)的多孔化交聯(lián)酶聚集體的制備方法，其特征在于包括的步驟1) 糊化淀粉的制備按計(jì)量淀粉溶于p1^7的緩沖液中配制成質(zhì)量百分濃度為1 4%的淀粉液，于80 100'C水浴中攪拌3 10分鐘，得到糊化淀粉；2) 酶-淀粉混合液的共沉淀上述糊化淀粉液，加入蛋白酶，于4 30'C攪拌均勻，加入有機(jī)溶劑或飽和硫酸銨溶液， 攪袢30分鐘，得到酶-淀粉共沉淀聚體的懸濁液；3) 酶-淀粉共沉淀聚體的共價(jià)交聯(lián)向酶-淀粉共沉淀聚體懸濁液中加入戊二醛，令最終戊二醛的質(zhì)量百分濃度為1 5%， 于4 3(TC攪拌4 16小時(shí)；4) 酶解去除淀粉向共價(jià)交聯(lián)后的混合體系中加入緩沖液，pH=7.0，離心取沉淀物，用緩沖液反復(fù)洗滌離 心沉淀物，重復(fù)3-5次以去除戊二醛殘留；將沉淀物分散于緩沖液中，向此混合液中加入質(zhì) 量濃度為1 10W的a-淀粉酶，于室溫下攪拌反應(yīng)12 24小時(shí)，再次離心取沉淀物，用緩沖 液反復(fù)洗滌沉淀物，最終將沉淀物分散于緩沖液中，于4'C下保存。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的所述的淀粉是玉米淀粉或木薯淀 粉或馬鈴薯淀粉或小麥淀粉。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的蛋白酶是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、 凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖液是磷酸緩沖液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮或 聚乙二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種催化大分子底物反應(yīng)的交聯(lián)酶聚集體及其制備方法。它是以蛋白酶和淀粉為原料，按照下述的質(zhì)量配比制成，蛋白酶∶淀粉＝0.015～0.75∶1。將含淀粉的pH＝7的緩沖溶液與蛋白酶混合均勻，然后加入有機(jī)溶劑或硫酸銨溶液，得到酶-淀粉共沉淀聚體的懸濁液加入戊二醛交聯(lián)，沉淀物洗滌，加入α-淀粉酶反應(yīng)，去除淀粉，沉淀物洗滌，再分散于緩沖液中保存。本發(fā)明用于水解卵清白蛋白及牛血清白蛋白等大分子底物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同條件下，未經(jīng)多孔化處理的交聯(lián)酶聚集體的催化效率僅為游離態(tài)酶催化效率的9～12％，而多孔化交聯(lián)酶聚集體的催化效率為游離態(tài)酶催化效率的80～100％。本發(fā)明可以應(yīng)用于蛋白酶類、聚糖酶類等的固定化。
文檔編號C12N11/00GK101629171SQ20091007016
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者何志敏, 王夢凡, 蘇榮欣, 崴 齊 申請人:天津大學(xué)