專(zhuān)利名稱(chēng)：多核苷酸免疫原性劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一些可作為免疫原性劑的表達(dá)載體，它們編碼部分或完整長(zhǎng)度的erbB蛋白(EGF受體)，尤其是her2/erbB-2/neu受體。
更具體講，本發(fā)明涉及上述載體用于制備引起宿主細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已知有多種不同的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，如EGFR1，HER-2/neu，HER-3，HER-4等。尤其是HER-2/neu已經(jīng)被提出作為腫瘤治療的靶點(diǎn)(WO90/14357)。
原癌基因HER-2/neu編碼一種185kDa的膜受體蛋白(p185)(Schechter.A.等，1984，自然(Nature)312/513)。
HER-2/neu的功能目前尚不十分清楚，但似乎與酪氨酸激酶的活性增強(qiáng)有關(guān)(Di friore.P.等.1990分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)102749)。
已經(jīng)提出用不同配體與這一受體相結(jié)合，依據(jù)配體種類(lèi)與/或?qū)嶒?yàn)條件的不同，它們能介導(dǎo)興奮性及抑制性信號(hào)(Peles.E.等.1992細(xì)胞(Cell.)69205)。
HER-2/neu在胎盤(pán)形成及器官發(fā)生時(shí)期表達(dá)(Kokay.Y等.1987美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)848498；Knezevic V.等.1994 J.Anat.1985181)。在許多具上皮/腺體的成熟組織中可以檢測(cè)到少量該受體(Press.M.等.1990癌基因(Oncogenes.)5953)。
p185的突變或過(guò)量表達(dá)與腫瘤的致病機(jī)理有關(guān)。點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致原癌基因的激活(Bargmann.C.&Weimberg R.A.1988 EMBO J.72043)。在人類(lèi)中尚未發(fā)現(xiàn)這類(lèi)突變，但是已經(jīng)在腺體源性的癌癥中發(fā)現(xiàn)(如乳腺、卵巢、肺及腎臟的腺體癌)，腫瘤轉(zhuǎn)移活性與具有正常結(jié)構(gòu)的p185的擴(kuò)增或過(guò)量表達(dá)有關(guān)。
p185的擴(kuò)增與乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)(Yokota.J.等.1986 Lancet.I.765；Slamon.D.J.等.1987科學(xué)(Science)，2351772；Yonemura.Y.等，1991.癌癥研究(Cancer Research.)511034，Gustarson.B.A.等人.1992.歐洲癌癥雜志(Europ.J.Cancer.)28263)。
近來(lái)的研究還提出該受體過(guò)量表達(dá)與藥物抗性現(xiàn)象有關(guān)。
事實(shí)上過(guò)量表達(dá)HER-2/neu的癌癥對(duì)5-氟尿嘧啶治療不敏感(Paikj S.M.等.1991美國(guó)癌癥研究會(huì)進(jìn)展(Proc.Am.Assoc.Cancer Resear.)32，291)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)已證明了這一點(diǎn)，乳腺癌細(xì)胞系在導(dǎo)入HER-2/neu后對(duì)他莫昔芬和順鉑有了抗性(Benz C.C.等.1992乳腺癌的研究治療(BreastCancer Research Treat.)24，84)。
處于乳腺癌I期的患者，雖有良好的預(yù)后，但也有免疫化學(xué)方法可檢測(cè)到的HER-2/neu，這些患者化療之后又會(huì)復(fù)發(fā)(Alfred D.C.等.1992 J.Clin.Onc.10，599和Gusterson B.A.等.1992 J.Clin.Onc.10，1049)。而且，抗HER-2/neu的抗體可增加順鉑及腫瘤壞死因子(TNF)對(duì)乳房及卵巢癌的細(xì)胞毒性(Hancock M.C.等，1991，癌癥研究，51，4575和HudziacR.M.1989分子細(xì)胞生物學(xué)9，1165)。另一方面，在抗藥性細(xì)胞系中，EGFR數(shù)量增加(Meyers M.B.等.1986美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展83，5521)，針對(duì)上述受體的抗體增強(qiáng)了藥物的細(xì)胞毒性效果(Aboud-Pirak E.等.1988國(guó)家癌癥研究所雜志(J.Natl.Canc.Inst.)80，1605；Baselga J.等.1993國(guó)家癌癥研究所雜志85，1327)。
類(lèi)似于抗體，EGF也可增加烷化劑如順鉑、電離射線、絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、阿霉素的細(xì)胞毒性效果(Christen R.D.1990臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Inv.)86，1632；Kowk T.T.等.1989國(guó)家癌癥研究所雜志81，1020；Amagase H.等.1990藥物動(dòng)力學(xué)雜志(J.Pharm.Dyn.)13，263；AmagaseH.等.XXX日本癌研究雜志(Jpn.J.Canc.Res.)80.670；Kowk T.T.等.1991 Int.J.Cancer 49，73)。
p185在正常上皮組織中少量表達(dá)，而在癌組織中大量表達(dá)，因此可推出在被動(dòng)免疫治療中，此受體可以作為靶抗原(例如可以用單克隆抗體來(lái)治療)。比如已經(jīng)知道某些抗p185的單克隆抗體在體外及裸鼠中都能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(Marx.J.1993科學(xué)259226)。
最近已經(jīng)證實(shí)，抗erbB-2單克隆抗體可以通過(guò)對(duì)受體本身進(jìn)行下調(diào)而具有抑制腫瘤細(xì)胞的效果(KatsumatuM.等，1985，自然醫(yī)學(xué)(NatureMedicine)1644-648)。
雖然已經(jīng)提出用主動(dòng)免疫(疫苗接種)來(lái)中和這種靶抗原，但這種方法的缺點(diǎn)是被引發(fā)的免疫反應(yīng)有可能對(duì)正常表達(dá)這種抗原的上皮組織有毒性。
另一方面，將體內(nèi)導(dǎo)入只表達(dá)neu原癌基因胞外部分的重組痘病毒，可以完全、特異地抑制表達(dá)這種抗原的腫瘤細(xì)胞而保護(hù)小鼠(Bernards R.等.1987美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展846854)。
由于在腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)因子及其受體作為自分泌及旁分泌調(diào)節(jié)循環(huán)起重要作用，因此基于這兩個(gè)發(fā)育過(guò)程的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)本發(fā)明的目的尤為重要。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及基本純的cDNA在制備用于腫瘤免疫治療的致免疫藥物中的應(yīng)用，這些cDNA編碼同源性源HER-2/neu，或其它EGF受體，或上述受體的部分序列。
本發(fā)明也涉及包含有一種上述cDNA的表達(dá)載體如質(zhì)粒。
本發(fā)明也涉及上述cDNA在分離篩選用于產(chǎn)生特異單克隆抗體的B-淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1 pCDneuNT構(gòu)建體圖2 pCDneuNT免疫對(duì)妊娠的影響Swiss(遠(yuǎn)交系)雌性小鼠(3至6只)用pCDneuNT免疫，最后一次加強(qiáng)給藥兩周后，與雄性小鼠交配一天。通過(guò)陰道涂片上精細(xì)胞的存在來(lái)分析交配情況(妊娠第一天)，報(bào)道的數(shù)據(jù)涉及懷孕過(guò)程中個(gè)體生長(zhǎng)速率。1、2號(hào)小鼠未經(jīng)免疫(對(duì)照)。發(fā)明的詳細(xì)描述按照本發(fā)明，通過(guò)體內(nèi)注入編碼EGFR、尤其是HER-2/neu的非感染性cDNA可引發(fā)用于抗腫瘤治療的免疫應(yīng)答。
事實(shí)上，這種治療方法能顯著減小腫瘤塊，并能抑制實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的同系腫瘤的生長(zhǎng)。
妊娠模型也證實(shí)了這種體內(nèi)免疫的效果，事實(shí)上，胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生具有某些相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)特點(diǎn)，至少在它們的起始階段是這樣。例如這一時(shí)期erbB-2/neu基因的表達(dá)量增加。
實(shí)際上已證實(shí)妊娠小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答選擇性地抑制了這種抗原，從而阻礙了胚胎發(fā)育。但是對(duì)已分化的成熟上皮組織則沒(méi)有或只有極微弱的細(xì)胞毒性。依據(jù)這一特異性細(xì)胞毒性效果，上述選擇性與抗p185抗體的產(chǎn)生有關(guān)(這些抗體識(shí)別受體胞外結(jié)構(gòu)域上的抗原決定簇)，而且還表現(xiàn)出對(duì)甲醛異乎尋常的抗性。這種選擇性通過(guò)下列實(shí)驗(yàn)也得到進(jìn)一步證實(shí)抗體能與pCDneuNT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的NHI-3T3成纖細(xì)胞以及過(guò)量表達(dá)c-erbB-2的乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR3進(jìn)行反應(yīng)，人乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及neu轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)狀乳腺癌樣品進(jìn)行的組織學(xué)染色也可證明這一點(diǎn)。
由于在腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育這兩個(gè)過(guò)程中，免疫反應(yīng)引起的抑制作用令人驚異地僅局限于正在發(fā)育組織中過(guò)量表達(dá)erbB-2/neu的結(jié)構(gòu)，而對(duì)已分化的組織無(wú)效，因此可認(rèn)為用編碼EGFR的序列進(jìn)行DNA疫苗接種能作為一種特異而有效的抗腫瘤療法。
與已知免疫療法相比，本發(fā)明有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如與被動(dòng)注入單克隆抗體相比，導(dǎo)入多核苷酸不僅可以引發(fā)抗體的產(chǎn)生，還能夠引起具有細(xì)胞毒性的CD8+MHCI型T-淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和擴(kuò)散。
另一種免疫療法是導(dǎo)入某些含特異序列的肽，這些序列是引起免疫應(yīng)答的蛋白的抗原決定簇。甚至與這種療法相比，本發(fā)明也具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，即它不局限于特定的同種異型，因?yàn)獒槍?duì)隱性亞優(yōu)勢(shì)抗原決定簇的潛在T細(xì)胞可被同源性外源抗原激活，以在各主體中獲得根據(jù)其自身的同種異型自動(dòng)選擇的Th免疫應(yīng)答。
而且由于抗原濃度低時(shí)傳統(tǒng)免疫能產(chǎn)生高度親和性的抗體，因此正如在多核苷酸免疫實(shí)驗(yàn)中所觀察到的，低濃度抗原的表達(dá)能使免疫起始階段就產(chǎn)生高親和性抗體。
與使用病毒載體進(jìn)行免疫相比，用裸DNA進(jìn)行操作更為安全。因?yàn)?)DNA無(wú)傳染性，2)抗原性DNA不會(huì)整合到宿主染色體中(表達(dá)載體以游離體形式存在約一周)。
病毒免疫產(chǎn)生的細(xì)胞毒性會(huì)減少表達(dá)病毒抗原的宿主細(xì)胞數(shù)量。
更不利的是很多病毒對(duì)宿主的轉(zhuǎn)錄因子有負(fù)調(diào)控作用，這一方面會(huì)減少細(xì)胞表面MHCI型分子的表達(dá)量，另一方面妨礙胞內(nèi)蛋白的正常加工，同樣也會(huì)減少M(fèi)HC分子上抗原決定簇的數(shù)目。因而本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原DNA序列更易于獲得和控制。
按照本發(fā)明，可用已知方法制備這種免疫原性劑。由于EGFR或HER-2/neu的DNA序列已知，因此可用傳統(tǒng)的PCR、重組DNA等方法制備。也可選擇使用嵌合結(jié)構(gòu)或基因的部分序列，只要其表達(dá)產(chǎn)物具有合適的免疫原性就行。例如可以把EGFR DNA與一段或幾段調(diào)控序列(啟動(dòng)子及復(fù)制起始區(qū))相連接，使之能在動(dòng)物組織或用于該制備方法的微生物中得到表達(dá)。上述調(diào)控序列可以從質(zhì)?；虿《精@得，如SV40或巨細(xì)胞病毒(CMV)或Rons肉瘤病毒(1994年9月29日的WO94/21707)。
該制劑可按已知方法給藥(Donnelly J.J.等.1994，The immunologist2∶1)DNA肌肉注射被認(rèn)為是治療傳染性疾病的一種新的免疫接種方法，除此方法，其它DNA導(dǎo)入途徑也是可行的，如非腸道的及粘膜途徑(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展1986 83，9551；1990年10月4日的WO90/11092)。DNA也可以吸附于微金顆粒上，通過(guò)發(fā)射裝置透皮給藥(Johnston，1992自然356，152)。
而且如同前面所討論的，這一免疫方法在制備具有體內(nèi)生物活性的單克隆抗體方面有顯著優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，用含有上述癌基因或相關(guān)原癌基因(neuNT，neu)的DNA對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫后，可以直接從其脾中分離到淋巴細(xì)胞系以用于制備單克隆抗體。與之相似，所述疫苗可用于從人外周血分離淋巴細(xì)胞系以制備單克隆抗體，在被動(dòng)免疫中作為佐劑，可與有細(xì)胞毒性的分子進(jìn)行結(jié)合。
實(shí)施例1.1pCDneuNT表達(dá)載體的克隆所有的DNA酶切操作、重組體的克隆及鑒定均嚴(yán)格按照Maniatis的方法(《基因克隆》)。質(zhì)粒pSV2neuNT含有編碼全部neuNT產(chǎn)物蛋白的cDNA(ref，Weinberg)，用HindIII，SalI及EcoRI酶切這一質(zhì)粒。EcoRI酶切后可產(chǎn)生原質(zhì)粒(PSV2neo)的兩個(gè)片段，HindIII/SalI雙酶切則產(chǎn)生完整長(zhǎng)度的cDNA(約4600bp)，再將這一HindIII/SalI雙酶切片段克隆進(jìn)預(yù)先經(jīng)HindIII/SalI雙酶切的中間載體pSP64。如前所述再對(duì)重組質(zhì)粒pSP64neuNT(Amersham)進(jìn)行克隆及鑒定。pSP64neuNT經(jīng)HindIII/EcoRI雙酶切產(chǎn)生兩個(gè)片段1)3000bp片段(pSP64)，2)約4600bp片段(neuNT)，將片段2再克隆到預(yù)先制備并經(jīng)HindIII/SalI雙酶切的pCDNAneo中，最后得到了可應(yīng)用于免疫過(guò)程的重組載體。1.2小鼠及大鼠的免疫將幾種小鼠(雌性遠(yuǎn)交系Swiss，CDl，Balb-c，近交系FVBN，Balb-cH2D)按0.3ml/100g體重的劑量用戊巴比妥-Equithesinain麻醉后，用胰島素注射器(1ml)注射100μl溶有DNA的鹽溶液(1mg/ml)，免疫注射共分三次進(jìn)行，每次間隔兩周。Wister大鼠也用同樣的方法免疫。1.3抗原的體內(nèi)表達(dá)為證明pCDneuNT質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)了neuNT抗原，注射完畢后48小時(shí)殺死動(dòng)物，完整取出其四頭股肌，加入蛋白抑制劑和非離子去垢劑勻漿。提出總蛋白，按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，用單特異性兔多克隆抗neuIgG抗體(K15)SC-07(Santa Kruz Biotecnology，USA)來(lái)檢測(cè)p185抗原(斑點(diǎn)雜交及所有下述其它免疫化學(xué)技術(shù)的操作都引自《抗體實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)》1988，冷泉港實(shí)驗(yàn)室Ed.Harlow/Darid Lane)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有從注射pCDneuNT的動(dòng)物肌肉中提取的蛋白才能與抗p185抗體結(jié)合，而注射對(duì)照質(zhì)粒則不行。因此，pCDneuNT質(zhì)粒能夠指導(dǎo)肌肉纖維中p185分子的合成。1.4宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)性i)小鼠已知與外源抗原反應(yīng)的能力很大程度上依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種系。關(guān)于大鼠neu在小鼠體內(nèi)的免疫原性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(BernardsR.等1987.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展896854-6858)，用病毒疫苗免疫后，能針對(duì)原癌基因胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)產(chǎn)生抗體的僅限于屬于雜合種群的宿主。因此有必要在以這一基因進(jìn)行免疫后，檢測(cè)不同種系動(dòng)物的抗p185的免疫反應(yīng)性。
八周齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(遠(yuǎn)交系Balb-c，CD1，Swiss，近交系Balb-cH2D或FVBN小鼠)按前面所述步驟注入100ug對(duì)照質(zhì)?；虻攘康膒CDneuNT質(zhì)粒。對(duì)照質(zhì)粒來(lái)源于從相同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取出的免疫前血清。
用Western雜交檢測(cè)抗p185抗體的產(chǎn)生及其特異性，以pCDneuNT轉(zhuǎn)化的3T3細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為抗原來(lái)源(BernardsR.等1987.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展846854-6858)。結(jié)果表明，純種及雜種小鼠均能識(shí)別pCDneuNT免疫產(chǎn)生的大鼠蛋白。
通過(guò)對(duì)過(guò)量產(chǎn)生受體的轉(zhuǎn)基因MMTV、neuN小鼠的乳腺瘤進(jìn)行免疫化學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)了抗原抗體復(fù)合物的形成(C.T.Guy等.1992 PNAS 8910578-582)。
用前面所述方法制備MMTV、neuN轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺瘤組織切片(3-5u)，并加入用pCDneuNT或?qū)φ召|(zhì)粒免疫后的抗血清孵育(稀釋度1/30)，而后加入與過(guò)氧化物酶(1/100稀釋)結(jié)合的羊抗小鼠抗體，結(jié)果只有pCDneuNT抗血清才能在腫瘤細(xì)胞膜上形成清楚的著色區(qū)。ii)大鼠pCDneuNT免疫小鼠是一種典型的異源免疫反應(yīng)，因?yàn)樗且环N動(dòng)物(大鼠)的免疫原性蛋白在另一種動(dòng)物(小鼠)宿主中引起反應(yīng)。為證實(shí)基因在完全同源的系統(tǒng)中是否可以引起抗p185免疫反應(yīng)，按照與小鼠免疫相同的方法，把pCDneuNT質(zhì)粒注入大鼠(遠(yuǎn)交系)。結(jié)果表明，既使將導(dǎo)入質(zhì)粒的量增至0.8mg也沒(méi)出現(xiàn)抗p185血清陽(yáng)性。這一結(jié)果與報(bào)道相一致(BernardsR.等.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展846854-6858 1987)，并進(jìn)一步證實(shí)鼠模型對(duì)自身抗原具有更強(qiáng)的耐受性(相對(duì)于人)(Floughton A.N.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1801-4(1994))。如果用同樣或其它方法同時(shí)注射載體與藥物，仍有可能減少或消除針對(duì)自身p185的耐受現(xiàn)象。1.5抗體特異性i)抗大鼠p185IgG作為自身抗體如果注入大鼠pCDneuNT能引起抗大鼠受體的抗體產(chǎn)生(抗neuNT反應(yīng))，那么單從系統(tǒng)原因考慮，同樣可認(rèn)為小鼠抗體應(yīng)該能識(shí)別小鼠自身的受體(自身抗原)，也能識(shí)別同源的人的erbB-2，組織化學(xué)方法已經(jīng)證實(shí)了小鼠抗p185循環(huán)抗體與自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
如同成年大鼠一樣，小鼠中neu原癌基因在上皮/內(nèi)分泌組織如肺、肝、腎、腸及表皮細(xì)胞底層中是生理上正常表達(dá)的(KnerewikV.等.1994J.Anat.1811985)。在實(shí)驗(yàn)中，用過(guò)量醚蒸氣處死動(dòng)物。按照Carnoix的方法，用其組成型表達(dá)erbB-2/neu的組織(如腎)來(lái)制備組織切片(3-5μ)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)分析。樣品加入抗p185抗血清或?qū)φ昭?1∶60稀釋度)孵育，然后加入與堿性磷酸酶(1/100稀釋)結(jié)合的羊抗小鼠抗體，結(jié)果清楚表明a)p185循環(huán)抗體能針對(duì)同種動(dòng)物腎細(xì)胞反應(yīng)，b)對(duì)照質(zhì)粒pCDNA-3免疫產(chǎn)生的抗體不能識(shí)別同種細(xì)胞。將小鼠腎勻漿抽提物與上述免疫小鼠血清或兔抗neuK15 SC-07抗體混合孵育，進(jìn)行Western雜交，證實(shí)了鼠p185可作為靶抗原的特性。ii)抗大鼠p185IgG與人受體的交叉反應(yīng)對(duì)過(guò)量表達(dá)p185erbB-2的人乳腺瘤細(xì)胞系衍生的SKBR3細(xì)胞(106受體分子/細(xì)胞，KrausM.H.等.1987 EMBO J.6606-610)進(jìn)行免疫熒光顯微檢測(cè)，證明經(jīng)pCDneuNT免疫的小鼠產(chǎn)生的抗p185抗體可以識(shí)別人的與p185同源的erbB-2蛋白。
SKBR3細(xì)胞經(jīng)蓋片培養(yǎng)后，用冷甲醇/丙酮混合物(1∶1 V/V)固定(滲透細(xì)胞)，或用2％多聚甲醛固定(非滲透細(xì)胞)，制成載片，然后把細(xì)胞樣品與抗p185抗血清(1/30終稀釋度)混合孵育，用與熒光素FITG(Boehringer)(1∶60)結(jié)合的綿羊抗小鼠IgG抗體可證實(shí)抗原抗體反應(yīng)的發(fā)生。載片置于激光同焦顯微鏡上檢查(BioRad MRC800K)(三重氬氣激光，60×油浸物鏡)。
經(jīng)檢查，非滲透細(xì)胞的反應(yīng)中，熒光較強(qiáng)并以分散方式分布于質(zhì)膜的細(xì)胞外側(cè)部分；滲透細(xì)胞的反應(yīng)中，熒光只分布于核周區(qū)域。這說(shuō)明抗p185抗體是由能分別識(shí)別抗原胞內(nèi)及胞外結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白組成的混合物。
把SKBR3，T23.1(反轉(zhuǎn)錄病毒erbB-2DNA轉(zhuǎn)染的3T3NIH成纖維細(xì)胞)及對(duì)照3T3細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行Western雜交，證實(shí)鼠抗p185抗體能識(shí)別人的同源抗原。用與辣根過(guò)氧化物酶-鏈霉親和素(1∶200)結(jié)合物相反應(yīng)的生物素化羊抗小鼠IgG抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc)來(lái)檢測(cè)，結(jié)果證明，在pCDneuNT免疫的小鼠血清中有抗p185抗體。
抗p185抗體能與人erbB-2反應(yīng)，還可識(shí)別這一蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(即使經(jīng)歷強(qiáng)烈的固定過(guò)程)。由這一結(jié)果可推出下列可能性即利用這些抗體來(lái)檢測(cè)一些人乳腺癌中erbB-2/neu的過(guò)量表達(dá)。
21例導(dǎo)管浸潤(rùn)性腫瘤經(jīng)外科切除后得到其病變組織樣品(來(lái)源于Macerata的Ospedale Civile的病理解剖部)，將樣品按與鼠組織同樣步驟進(jìn)行固定，用石蠟塊包埋，制成切片后進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)。
這21份樣品以絕對(duì)成熟的方法加入商品抗體進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，都呈erbB-2陽(yáng)性結(jié)果，當(dāng)用pCDneuNT免疫的雌性小鼠的血清進(jìn)行免疫反應(yīng)時(shí)，有8例呈現(xiàn)抗p185的免疫反應(yīng)陽(yáng)性。
為證實(shí)小鼠抗erbB-2/neu抗體能否與EGFR家族的其它成員反應(yīng)(如EGFR-1)，將小鼠抗體與細(xì)胞表面高表達(dá)EGFR-1受體分子(2-3×106個(gè)/細(xì)胞)的人A431表皮癌細(xì)胞系混合孵育。通過(guò)熒光激光細(xì)胞分類(lèi)掃描(FACSscann)對(duì)抗p185neu抗體與p170ECFR-1的免疫反應(yīng)進(jìn)行熒光免疫分析。分別制備抗原及抗體的對(duì)照，以淋巴細(xì)胞CEM(從一個(gè)急性淋巴細(xì)胞白血病人中分離衍生而來(lái)，不表達(dá)EGFR-1)作為陰性對(duì)照，以對(duì)erbB-2/neu的胞外結(jié)構(gòu)域?qū)Ｒ磺也慌cEGFR-1抗原交叉反應(yīng)的單克隆抗體W600作為陽(yáng)性對(duì)照(Dr.P.G.Natali，Istituto di ricerca sperimentale Regina Elena，Roma)。細(xì)胞樣品與二次免疫的與熒光素異硫氰酸(FIT)結(jié)合的抗小鼠抗體混合孵育后，用Bekton Dickinson FACS進(jìn)行檢測(cè)(氬激發(fā)激光488nm，發(fā)射光在525nm)，結(jié)果清楚地表明，免疫小鼠抗血清中的抗p185抗體與W600單克隆抗體呈同樣的反應(yīng)性質(zhì)，亦即它們都不與p170ECFR-1發(fā)生反應(yīng)。1.6p185抗血清的體外活性抗p185血清對(duì)SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用以103細(xì)胞/平皿的濃度將SKBR3細(xì)胞加入35mm培養(yǎng)皿，加入30μl(約300μg總IgG)抗p185抗血清及對(duì)照血清(第零天)，一周后取出平皿中細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。結(jié)果表明pCDneuNT免疫小鼠中提出的IgG同型免疫球蛋白能抑制SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)。1.7免疫接種的生物學(xué)效果i)免疫療法的毒性用以高濃度牛胸腺雙螺旋DNA作抗原的商品ELISA試劑盒(INOVDiasgnostics Inc；San Diego.CA)，證明進(jìn)行DNA疫苗免疫后，不產(chǎn)生抗DNA循環(huán)抗體。沒(méi)有觀察到IgM與IgG含量的特別變化。
對(duì)血色素、VES白細(xì)胞系列，蛋白血等血液學(xué)及血清學(xué)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。ii)組織病理學(xué)檢測(cè)由于免疫過(guò)的動(dòng)物具有能與自身組織neu受體反應(yīng)的循環(huán)抗體，因此有可能發(fā)生自身免疫病。介導(dǎo)這一過(guò)程的可以是補(bǔ)體系統(tǒng)(補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性CDC)與/或天然殺傷細(xì)胞(抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性ADCC)(Stribling等.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院雜志8911277-11281(1992))。
為證實(shí)這一假說(shuō)，用過(guò)量醚蒸氣處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出組成型表達(dá)erbB-2/neu的組織(腎、腸、卵巢、胎盤(pán)、乳腺)，用傳統(tǒng)方法固定，包埋入石蠟塊，按上述標(biāo)準(zhǔn)步驟制成切片(3-5μ)，脫蠟，然后用蘇木精及伊紅染色。
對(duì)pcDNAneuNT免疫的動(dòng)物重復(fù)進(jìn)行了組織學(xué)檢測(cè)，結(jié)果在免疫小鼠中均未發(fā)現(xiàn)即使是最微小的病變(如壞死區(qū)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)或其它)，因而可以說(shuō)DNA免疫不會(huì)產(chǎn)生明顯的系統(tǒng)或組織水平的毒性。雖然動(dòng)物的確有自身受體的抗體，但未觀察到系統(tǒng)或器官特異的自身免疫病現(xiàn)象。
現(xiàn)概括如下i)免疫治療后一年動(dòng)物仍可正常進(jìn)食，ii)動(dòng)物毛皮質(zhì)量?jī)?yōu)良，個(gè)體及社會(huì)行為無(wú)改變，iii)幾種血液學(xué)參數(shù)均正常，iv)組織學(xué)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)表達(dá)neu的組織有病變，v)免疫療法未產(chǎn)生可以檢測(cè)到的抗DNA的循環(huán)抗體IgM及/或IgG的增加。iii)pCDneuNT免疫接種對(duì)小鼠妊娠的影響83％的免疫雌性Swiss小鼠(n＝16)產(chǎn)生抗p185循環(huán)抗體。將10只血清陽(yáng)性雌鼠與雄鼠同籠進(jìn)行交配，此后(妊娠第一天后)通過(guò)陰道涂片上的精細(xì)胞來(lái)確定交配。孕鼠體重每?jī)商煊涗浺淮?，其中七只表現(xiàn)出每胎子代數(shù)量的減少(5±2只，對(duì)照組為13±3只)，而其余三只切除子宮檢查后發(fā)現(xiàn)胚胎全部被重吸收。
更為重要的是上述免疫療法對(duì)近交系小鼠如Balb/cH2D的影響，免疫后的動(dòng)物都表現(xiàn)出抗p185抗體的明顯增加。19只免疫雌鼠中有14只根本來(lái)產(chǎn)下幼鼠，而其余5只僅產(chǎn)下數(shù)目很少的子代(1-2只)，而對(duì)照組15只鼠均產(chǎn)下18±3只后代。
與上述結(jié)果相反的是，未免疫小鼠與經(jīng)對(duì)照質(zhì)粒免疫的小鼠或pCDneuNT免疫的大鼠(同源基因免疫)在受胎能力方面沒(méi)有明顯差異。iv)乳房組織及胎盤(pán)的組織病理學(xué)檢測(cè)7只p185血清陽(yáng)性孕鼠在妊娠第18天殺死，用于進(jìn)行胎盤(pán)及乳腺的組織學(xué)檢測(cè)。如前所述對(duì)富爾馬林固定組織的切片(3-5μ)進(jìn)行染色。所有標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)組織(病理學(xué))病變。v)對(duì)小鼠腫瘤的效果為證實(shí)針對(duì)erbB-2/neu的免疫接種對(duì)過(guò)量表達(dá)這種原癌基因的腫瘤的治療效果，按下述步驟誘發(fā)遠(yuǎn)交系小鼠的腫瘤Swiss CD1小鼠免疫周期結(jié)束兩周后，將CMVneuNT轉(zhuǎn)染的、細(xì)胞表面大量表達(dá)受體的NIH3T3成纖維細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)。注射部位瘤塊的生長(zhǎng)按標(biāo)準(zhǔn)方法隨時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。在未免疫小鼠或?qū)φ召|(zhì)粒免疫的小鼠中，腫瘤細(xì)胞保持持續(xù)生長(zhǎng)約三周(如表)，而用pCDneuNT免疫的小鼠注入轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞后，結(jié)果相反，注射部位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤塊的生長(zhǎng)。
以上結(jié)果均表明，將CMVneuNT質(zhì)粒以裸DNA的形式溶于注射用生理溶液中，用其進(jìn)行的免疫接種能夠有效、特異地抑制過(guò)量表達(dá)neu癌基因的腫瘤細(xì)胞的粘附與擴(kuò)散。
表腫瘤面積(mm2)1W 2W 3WA 150±60 380±50580±70B 150±60 410±65550±40Cnd nd nd對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制10周齡的Swiss CD1(Charles River)雌性小鼠(每組12只)用質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫，C組用編碼neuNT的質(zhì)粒，B組用編碼無(wú)關(guān)基因(p24-FIV)的質(zhì)粒，A組注射生理鹽水。兩周后將neuNT轉(zhuǎn)染的107個(gè)3T3NIH細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)。W注射后的周數(shù)，表內(nèi)數(shù)據(jù)為腫瘤的面積(±SD)。nd未發(fā)現(xiàn)腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸免疫原性劑，其包括編碼一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的cDNA，該cDNA與當(dāng)肌肉注射或其它方法給藥時(shí)能指導(dǎo)cDNA表達(dá)的調(diào)控序列功能連接。
2.如權(quán)利要求1中所述的免疫原性劑，其中cDNA編碼HER-2/erbB-2/neu癌基因。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的免疫原性劑，其中cDNA編碼EGFR家族中的原癌基因或癌基因。
4.如權(quán)利要求1、2或3中所述的免疫原性劑，用于腫瘤的預(yù)防或治療。
5.如權(quán)利要求4中所述的疫苗，用于乳腺及/或卵巢、肺和腎的腺癌以及其它表達(dá)上述癌基因的腫瘤的預(yù)防及治療。
6.如上述權(quán)利要求之一所述的免疫原性劑，其中調(diào)控序列來(lái)自于質(zhì)?；虿《尽?br> 7.如權(quán)利要求1、2、3、6中之一所述的免疫原性劑，用于從免疫原處理的動(dòng)物中提產(chǎn)生抗受體單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7中所述的免疫原性劑，用于制備人單克隆抗體，該單克隆抗體與細(xì)胞毒藥物(免疫毒素)混合或連接后用于免疫治療。
9.如權(quán)利要求1、2、3、4、5中所述的免疫原性劑，用于在腫瘤治療中增強(qiáng)輔助治療。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多核苷酸免疫原性劑,它能引起針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族成員的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1183806SQ96193756
公開(kāi)日1998年6月3日 申請(qǐng)日期1996年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月4日
發(fā)明者A·阿米西, A·康塞提, F·M·瓦南希 申請(qǐng)人:卡米利諾國(guó)立大學(xué)