專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生耐滲透性植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有新穎特性的植物的方法，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及產(chǎn)生耐鹽性和/或耐滲透性植物的方法，該植物高度地抗惡劣環(huán)境的影響。
防止全球變暖的一種有效方法是綠化未開(kāi)墾的土壤如沙漠或鹽積聚的土。為此，一種方法是開(kāi)發(fā)能抗惡劣環(huán)境的植物與如灌溉的工程方法結(jié)合，對(duì)于控制沙漠的侵蝕、促進(jìn)綠化和防止全球變暖起重要作用。
鹽積聚會(huì)引起以下?lián)p害作用(1)積聚的鹽降低土壤中的水位從而阻止植物汲取水分；(2)吸收入(滲透入)植物的鹽會(huì)干擾其代謝作用；(3)鹽抑制植物為生長(zhǎng)而對(duì)其它必需離子的吸收(Sato，F(xiàn).，PlantCell Engineering，Supplement，“Environmental Problems andPhytobiotechnology”，pp.33-39，1994)。尤其是抑制對(duì)水的吸收而導(dǎo)致植物損失膨脹壓并關(guān)閉氣孔。于是，光合作用受破壞且生長(zhǎng)嚴(yán)重受抑制。
植物逐漸形成各種機(jī)制以使自身適應(yīng)這類(lèi)環(huán)境。在一個(gè)簡(jiǎn)單的適應(yīng)模型中，植物細(xì)胞以某種方式維持細(xì)胞內(nèi)外的滲壓差，并通過(guò)吸收水來(lái)恢復(fù)膨壓。例如嗜鹽細(xì)菌(halobacteria)，雖然不是植物，但可通過(guò)存儲(chǔ)鹽來(lái)保持細(xì)胞內(nèi)外的滲壓平衡。不過(guò)此時(shí)，它難于使自身適應(yīng)環(huán)境(滲透壓的)變化，因?yàn)橐蟀麅?nèi)代謝酶本身就是耐鹽性的。
因此，更好的適應(yīng)機(jī)制是合成稱(chēng)為“相容性溶質(zhì)”的專(zhuān)一性化合物以保持如許多耐鹽性植物那樣依賴(lài)于外在滲透變化的胞內(nèi)滲透。
作為相容性溶質(zhì)，已知的有如甘氨酸甜菜堿(glycinebetaine)或脯氨酸的雙極性化合物和多元醇如蒎立醇、山梨醇或甘露醇。這些化合物的特征在于分子量低、水溶性高、代謝能力低、對(duì)代謝作用無(wú)影響等等，故適于滲透調(diào)節(jié)。
其中值得一提的是發(fā)現(xiàn)于植物和細(xì)菌中作為相容性溶質(zhì)的甘氨酸甜菜堿(此后文中稱(chēng)為甜菜堿)，這些植物和細(xì)菌可適應(yīng)鹽積聚和/或缺水的環(huán)境。甜菜堿被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)于如藜科、禾本科、茄科的高等植物中，以及藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、大腸桿菌(Escherichia coli)等等(例如參見(jiàn)Rhodes，D.and Hanson，A.D.，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.44357-3584，1993)中的相容性溶質(zhì)。甜菜堿是一種滲透防護(hù)性物質(zhì)，它能保持與環(huán)境的滲透平衡(Robinson，S.P.and Jones，G.P.，Aust.J.Plant Physiol.13659-668，1986)并防止可溶性酶因鹽濃度高而引起的離解(Gabbay-Azaria et al.，Arch.Biochem.Biophys，264333-339，1988)。此外，甜菜堿能通過(guò)穩(wěn)定光合釋氧復(fù)合體中的相鄰蛋白質(zhì)和錳聚簇而保護(hù)光系統(tǒng)II復(fù)合體以抗高的鹽濃度(例如，參見(jiàn)Murata etal.，F(xiàn)EBS Lett.296187-189，1992)。
在大腸桿菌和菠菜(Spinacia oleracea)中，甜菜堿是通過(guò)示于

圖1中的兩步氧化作用而從膽堿由生物合成的。大腸桿菌含兩種脫氫酶其一是膜結(jié)合的依賴(lài)于氧的膽堿脫氫酶，它將膽堿氧化成甜菜醛(Landfald，B.and Strom，A.，J.Bacteriol.165849-855，1986)；其二是可溶性、依賴(lài)于NAD的甜菜醛脫氫酶，它將甜菜醛氧化成甜菜堿(Falkenberg，P.and Strom，A.R.，Biochim.Biophys.Acta.1034253-259，1990)。據(jù)報(bào)道，在高等植物中，甜菜堿是通過(guò)類(lèi)似于大腸桿菌中的途徑而合成于葉綠體中。在菠菜(Spinacia oleracea)中，氧化作用的第一步受依賴(lài)于鐵氧還蛋白的膽堿單加氧酶催化(Brouquisse，R.etal.，Plant Physiol.90322-329，1989)，且業(yè)已分離出催化該氧化作用的第二步、依賴(lài)于NAD的甜菜醛脫氫酶(Weretilnyk，E.A.etal.，Planta.178342-352，1989)。已發(fā)現(xiàn)這些植物可提高這兩種酶的活性，從而提高鹽作用(salt stress)下甜菜堿的量(例如參見(jiàn)Hanson，A.D.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.823678-3682，1985)。
另外，得自革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)的膽堿氧化酶能在一步氧化反應(yīng)中將膽堿氧化成甜菜堿(Ikuta，S.et al.，J.Biochem.821741-1749，1977)。
人們已試圖通過(guò)將發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌和高等植物中的這兩種基因或膽堿氧化酶基因整合到植物中使之穩(wěn)定表達(dá)這些基因而賦與植物耐鹽性(例如參見(jiàn)Nomura M.et al.，Plant Physiol，107703-708，1995)。然而，在通過(guò)將這類(lèi)基因整合到植物、尤其是高等植物中以穩(wěn)定地表達(dá)它們而獲得耐鹽性和/或耐滲透性植物方面，迄今尚未取得成功。
膽堿氧化酶可商購(gòu)，但它的氨基酸序列尚未被測(cè)定。因此，強(qiáng)烈需要測(cè)定編碼可有效地將膽堿轉(zhuǎn)變成甜菜堿的膽堿氧化酶的基因序列，并將它整合到植物中以使之穩(wěn)定地表達(dá)所述序列，從而產(chǎn)生可耐環(huán)境(滲透性)變化如高的鹽濃度的植物。
在深入研究該如何解決上述問(wèn)題之后，本發(fā)明人成功地分離出一種編碼膽堿氧化酶的新型基因(The Japanese Society of PlantPhysiologist，Annual meeting of 1994，the 34th Symposium held March28-30，1994)，并將其整合入藍(lán)細(xì)菌，芥屬(brassicaceous)植物和禾本科植物以獲得耐鹽性和/或耐滲透性植物。
因此，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生耐鹽性和/或耐滲透性植物的方法，它包括用攜帶編碼膽堿氧化酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物的步驟，還提供依所述方法獲得的耐鹽性和/或耐滲透性植物。
對(duì)圖的簡(jiǎn)要描述圖1表示從膽堿至甜菜堿的氧化過(guò)程。
圖2A表示轉(zhuǎn)化聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus)PCC7942用的構(gòu)建體。PAM是指用pAM1044轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942，而PAM COD是指用攜帶cod A基因的pAM1044轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942。虛劃箭頭指示用于PCR的引物。三角形表示conII啟動(dòng)子。箭頭指示基因的取向。
圖2B表示SDS-PAGE(電泳照片)，它示出染色體被耐壯觀(guān)霉素的基因和聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的DNA中的cod A基因徹底置換。a欄λ-HindIII/φx174-HaeIII片段；b欄聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的野生型菌株；c欄菌株P(guān)AM；d欄和e欄菌株P(guān)AMCOD(b、c和d欄示出應(yīng)用引物1和2的PCR結(jié)果，而e欄顯示應(yīng)用引物1和3的PCR結(jié)果)。
圖3表示W(wǎng)estern印跡分析(電泳照片)，示出在聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM和PAMCOD中表達(dá)膽堿氧化酶。a欄得自菌株P(guān)AMCOD的蛋白質(zhì)提取物；b欄得自菌株P(guān)AM的蛋白質(zhì)提取物；c欄純化了的膽堿氧化酶。
圖4示出NaCl對(duì)生長(zhǎng)的影響，它顯示了在0.4M NaCl的存在下，聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(○)和PAMCOD(●)的生長(zhǎng)情況。為了對(duì)比，還給出了在不含NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(Δ)和PAMCOD(▲)的生長(zhǎng)情況。
圖5示出山梨醇對(duì)生長(zhǎng)的影響，它顯示了在0.8M山梨醇的存在下，聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(○)和PAMCOD(●)的生長(zhǎng)情況。為了對(duì)比，還給出了在不含山梨醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(Δ)和PAMCOD(▲)的生長(zhǎng)情況。
圖6示出NaCl對(duì)葉綠素含量的影響，它顯示了在0.4M NaCl的存在下，聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(○)和PAMCOD(●)的葉綠素含量。
圖7示出山梨醇對(duì)葉綠素含量的影響，它顯示了在0.8M山梨醇的存在下，聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(○)和PAMCOD(●)的葉綠素含量。
圖8示出NaCl對(duì)光合活性的影響，它顯示了在0.4M NaCl的存在下，從聚球藍(lán)細(xì)菌菌株P(guān)AM(○)和PAMCOD(●)放出的氧量。
圖9示出codA基因的限制酶圖的示意圖。
圖10示出用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬的雙元載體質(zhì)粒pGAH/cod A的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖11示出對(duì)于擬南芥屬的野生型和轉(zhuǎn)化體植物的可溶性部分中膽堿氧化酶的Western印跡分析(電泳照片)。1欄得自商品化球形節(jié)桿菌的膽堿氧化酶(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，USA)；2欄野生型植物的可溶性部分；3欄轉(zhuǎn)化體植物的可溶性部分。
圖12示出NaCl對(duì)擬南芥屬生長(zhǎng)的影響。它顯示在60mM NaCl存在下的野生型(A)和轉(zhuǎn)化體C1-0(B)植物(顯示有機(jī)體形態(tài)的照片)。
圖13示出山梨醇對(duì)擬南芥屬生長(zhǎng)的影響。它顯示在100、200和400mM山梨醇存在下的野生型(W)和轉(zhuǎn)化體(T)植物(顯示有機(jī)體形態(tài)的照片)。
圖14示出鹽作用對(duì)野生型和轉(zhuǎn)化體植物(擬南芥屬)葉子中光合作用系統(tǒng)II的影響?！鹪诠饬翖l件下溫育的野生型植物；●在光亮條件下溫育的轉(zhuǎn)化體植物；Δ在暗處溫育的野生型植物；▲在暗處溫育的轉(zhuǎn)化體植物。每組數(shù)據(jù)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差為±5％的三次試驗(yàn)的平均值。
圖15示出用于轉(zhuǎn)化稻的兩種嵌合codA基因即35SINTPcodA和35SINcodA的結(jié)構(gòu)。
圖16示出的NMR譜圖表示甜菜堿在野生型株、不表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體(A)和表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體(B)的稻類(lèi)植物中的積累。圖中GB和Ch分別表示相應(yīng)于甜菜堿和膽堿的峰。
圖17示出鹽作用對(duì)野生型和轉(zhuǎn)化體稻類(lèi)植物的光合系統(tǒng)II活性的影響。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案本發(fā)明中所用編碼膽堿氧化酶的基因是這種基因它編碼能在一步反應(yīng)中將膽堿轉(zhuǎn)化成甜菜堿的蛋白質(zhì)，它可得自革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌節(jié)桿菌屬。例如，它可優(yōu)選得自球形節(jié)桿菌和滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacterpascens)，特別是球形節(jié)桿菌。
本發(fā)明人成功地克隆化得自球形節(jié)桿菌、編碼膽堿氧化酶的codA基因并測(cè)定了它的核苷酸序列。該codA基因含有1641bp的開(kāi)放讀框，它編碼547個(gè)氨基酸。codA基因的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
植物可用這種與合適的載體結(jié)合的膽堿氧化酶-編碼基因轉(zhuǎn)化。于是，通過(guò)在這些載體中引入合適的啟動(dòng)子或表達(dá)特性的序列，可在植物中表達(dá)該基因。
具有由編碼序列表中SEQ ID No.1的氨基酸的核苷酸序列的添加、缺失或取代而產(chǎn)生的核苷酸序列的任意基因或其一部分可用作本發(fā)明的基因，只要它能編碼顯示膽堿氧化酶活性的多肽。
依本發(fā)明的方法，可賦與從藍(lán)細(xì)菌至高等植物的大量植物以耐鹽性和/或耐滲透性。藍(lán)細(xì)菌被廣泛地用作高等植物的有機(jī)體模型，因?yàn)樗鼈兣c高等植物具有大致相同的光合機(jī)制，且它們易于在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化而給出結(jié)果。一些轉(zhuǎn)化體型藍(lán)細(xì)菌容易在其細(xì)胞中整合外源DNA而引起有效的重組。這類(lèi)藍(lán)細(xì)菌包括聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942、聚球藍(lán)細(xì)菌PCC6301(ATCC27144)和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803(ATCC27184)(Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Vol.35，No.14，pp.2542-2551，1991；Crit.Rev.Microbiol.Vol.13，No.1，pp.111-132，1985)。
高等植物包括雙子葉植物和單子葉植物。下述實(shí)施例中，高度耐鹽性和/或耐滲透性植物可得自作為雙子葉植物的芥屬植物，但它不是限制性的，也可以用其它科和屬的雙子葉植物。本發(fā)明的方法也適合于單子葉植物。已發(fā)現(xiàn)原來(lái)缺乏甜菜堿合成能力的單子葉植物稻類(lèi)可獲得這種能力，于是用依本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化后可獲得耐鹽性。
可根據(jù)待轉(zhuǎn)化的植物性質(zhì)來(lái)恰當(dāng)?shù)剡x擇有待與編碼膽堿氧化酶的基因結(jié)合的載體和轉(zhuǎn)化方法，以及選擇轉(zhuǎn)化體植物原料。
例如，如pUC303的質(zhì)?？捎糜谒{(lán)細(xì)菌。這樣，可通過(guò)插入這些質(zhì)粒的抗生素抗性基因來(lái)選擇具有所需性能的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明通過(guò)用得自球形節(jié)桿菌的編碼膽堿氧化酶的codA基因來(lái)轉(zhuǎn)化藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942，從而成功地獲得可穩(wěn)定地顯示耐鹽性和/或耐滲透性的植物。
如果將用codA基因轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942置于補(bǔ)充氯化膽堿的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則發(fā)現(xiàn)聚球藍(lán)細(xì)菌吸收了外源性供給的膽堿并將其轉(zhuǎn)化為甜菜堿。鑒于該報(bào)道，即在數(shù)種耐鹽性細(xì)菌中由鹽作用引起膽堿遷移，導(dǎo)致積累更高含量的甜菜堿(Kaenjak，A.et al.，J.Bacteriol.1752400-2406，1993)，通過(guò)用不同濃度的NaCl處理由本發(fā)明產(chǎn)生的聚球藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，測(cè)定鹽作用對(duì)甜菜堿積聚的影響。但是，并未明顯觀(guān)察到NaCl濃度對(duì)甜菜堿積聚的影響，表明聚球藍(lán)細(xì)菌中吸收膽堿用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并非專(zhuān)一性地由鹽作用引起的。
據(jù)報(bào)道，甜菜堿不但起滲透防護(hù)劑作用，還在光自養(yǎng)生物中起重要的保護(hù)光合機(jī)制作用(Murata，N.et al，F(xiàn)EBS Lett.296187-189，1992)。將依本發(fā)明轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌在高濃度NaCl或山梨醇的存在下培養(yǎng)以檢驗(yàn)其生長(zhǎng)情況、葉綠素含量和光合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高濃度的鹽或山梨醇存在下，聚球藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)良好，葉綠素含量和光合活性也顯示類(lèi)似的結(jié)果，而對(duì)照物非轉(zhuǎn)化體中的生長(zhǎng)情況、葉綠素含量和光合活性均受到抑制。這些結(jié)果說(shuō)明，依本發(fā)明的方法用編碼膽堿氧化酶的基因轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌被賦與良好的耐鹽性和耐滲透性。
雙子葉植物可通過(guò)引入基因的技術(shù)用原生質(zhì)體或組織的一部分進(jìn)行轉(zhuǎn)化。至于應(yīng)用組織片段的基因引入，可采用得自土壤桿菌屬(Agrobacterium)的Ti質(zhì)粒?？梢杂脦г|(zhì)體的土壤桿菌來(lái)感染有愈傷組織的植物組織片段，其中的原生質(zhì)體中整合有編碼膽堿氧化酶的基因；通過(guò)對(duì)抗生素如卡那霉素的抗性進(jìn)行選擇，然后在莖干中分化而得轉(zhuǎn)化體植物。
在本發(fā)明中，如下所示通過(guò)用編碼膽堿氧化酶的基因來(lái)轉(zhuǎn)化芥屬植物擬南芥而得到耐鹽性和/或耐滲透性植物。
制備攜帶codA基因的雙元載體質(zhì)粒pGAH-codA，并整合到攜帶Ti質(zhì)粒的復(fù)盆子土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA101中。用所得整合有codA基因的土壤桿菌EHA101(pGAH/codA)感染擬南芥的下胚軸愈傷組織，然后形成枝，通過(guò)對(duì)卡那霉素和潮霉素的抗性進(jìn)行選擇，以產(chǎn)生根并形成籽。將得自所述雜合T2籽的植物進(jìn)行自花受精而得純合的T3個(gè)體，將其播種后形成轉(zhuǎn)化體植物。這些轉(zhuǎn)化體植物表明，膽堿氧化酶已被轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體。即使在高濃度的氯化鈉或山梨醇存在下，這種轉(zhuǎn)化體植物也生長(zhǎng)良好。
可用在質(zhì)粒pUC119上制備的兩種嵌合codA基因轉(zhuǎn)化單子葉植物稻(稻屬sativa L.cv.Nippon bare)，這些基因在花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下翻譯后被定位于胞質(zhì)溶膠或質(zhì)體上。這兩種嵌合基因在5′非翻譯序列中包含得自稻的內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。
可用如下方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體稻，即可這樣獲得轉(zhuǎn)化體植物用基因槍裝置將所述嵌合codA基因與選擇標(biāo)記即潮霉素抗性基因一起引入得自稻籽盾片愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，然后基于對(duì)抗生素的抗性選擇已轉(zhuǎn)化的愈傷組織，并將它們?cè)俜只芍参铩?br> 雖然野生型稻缺乏合成甜菜堿的能力，但用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化過(guò)的稻獲得了合成甜菜堿的能力。表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體稻與未轉(zhuǎn)化的植物生長(zhǎng)得同樣好，在耕作和溶液培養(yǎng)這兩種條件下未顯示任何異常。由此可見(jiàn)，在甜菜堿的合成中形成的產(chǎn)物過(guò)氧化氫已于細(xì)胞中被有效地解毒。
此外，培養(yǎng)于含NaCl的水中的轉(zhuǎn)化體的耐鹽性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化體中光合活性的抑制比在野生型中觀(guān)測(cè)到的慢。這是首例通過(guò)基因工程方法使稻獲得合成甜菜堿的能力。
這些結(jié)果表明，用攜帶編碼膽堿氧化酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化的各種植物具有極好的耐鹽性。
依本發(fā)明，可獲得高度耐惡劣環(huán)境的耐鹽性和/或耐滲透性轉(zhuǎn)化體植物。可依本發(fā)明的方法賦與耐鹽性和/或耐滲透性的植物范圍很廣，可以從藍(lán)細(xì)菌到高等植物。特別是，本發(fā)明系首例從包括大部分主要作物在內(nèi)的單子葉植物而得到耐鹽性和/或耐滲透性植物，并有望在很廣的范圍內(nèi)應(yīng)用。
下述實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明，但并不是要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1用codA基因轉(zhuǎn)化藍(lán)細(xì)菌聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942(1)codA基因的克隆化依the Abstracts of Oral Reports in the abstracts，the 34th annualmeeting of the Japanese Society of Plant Physiologists，1994中描述的方法從球形節(jié)桿菌分離膽堿氧化酶基因。簡(jiǎn)言之，1)用溴化氰分裂膽堿氧化酶，2)測(cè)定合適的片段的N端氨基酸序列，3)從所述部分氨基酸序列中選擇合適的部分來(lái)合成其對(duì)應(yīng)的寡核苷酸，4)利用這些寡核苷酸作引物通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增膽堿氧化酶基因的部分序列，5)將膽堿氧化酶基因已擴(kuò)增的部分序列用作探針來(lái)篩選球形節(jié)桿菌的基因組DNA文庫(kù)。
將如此得到的陽(yáng)性克隆亞克隆至質(zhì)粒pBluescript(SK+)(Stratagene)以分離陽(yáng)性克隆，再對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行Southern印跡分析。把一個(gè)與所述探針雜交的3.6kbp XbaI-XhoI片段亞克隆至pBluescript中并用限制酶作圖。測(cè)定從第一個(gè)SalI位點(diǎn)至XhoI位點(diǎn)的區(qū)域(約2.5kbp)的核苷酸序列。
結(jié)果表明，膽堿氧化酶基因含有編碼547個(gè)氨基酸殘基的多肽的1641bp開(kāi)放讀框。編碼膽堿氧化酶的基因的氨基酸序列和核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
(2)用codA基因轉(zhuǎn)化聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942將攜帶codA基因的質(zhì)粒pBluescript用BstEII(離翻譯起始的位置為-40)限制酶和SmaI(終止密碼子的下游)限制酶進(jìn)行消化。用Klenow片段(Takara，Tokyo，Japan)補(bǔ)平BstEII粘端。把含codA基因的編碼區(qū)和推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的平端片段插入質(zhì)粒pAM1044的SmaI位點(diǎn)。由限制酶切分析確證基因的正確取向，認(rèn)為是在pAM1044的conII啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的。conII啟動(dòng)子是大腸桿菌的啟動(dòng)子的共有序列，它含有堿基序列TTGGACA(-35)和TATAAT(-10)。
采用Elhai et al.的方法，用質(zhì)粒pAM1044和含codA基因的質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942。將所得轉(zhuǎn)化體稱(chēng)為PAMCOD株。只用pAM1044轉(zhuǎn)化的聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942用作對(duì)照物并被稱(chēng)為PAM株。
在含30μg/ml壯觀(guān)霉素的BG11瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化體。將單個(gè)菌落接種到含壯觀(guān)霉素的新鮮BG11板上數(shù)次之后，用圖2A中指示的引物通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))確證壯觀(guān)霉素抗性基因和codA基因已完全插入所有染色體拷貝中。用引物1和2的組合通過(guò)PCR證實(shí)壯觀(guān)霉素抗性基因和codA基因已完全插入聚球藍(lán)細(xì)菌的染色體中。
實(shí)施例2對(duì)插入轉(zhuǎn)化體中的基因的確證將得自聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942的野生型株、PAM株和PAMCOD株的DNAs用作PCR的模板，并用SDS-PAGE分析擴(kuò)增后的產(chǎn)物，結(jié)果如圖2B中所示。
對(duì)得自野生型株的DNA進(jìn)行的PCR顯示約400bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2B，b欄)。得自PAM株的DNA用作模板時(shí)，則出現(xiàn)約2.4kb的條帶，表示pAM1044插入染色體中。發(fā)現(xiàn)野生型株缺少約400bp的條帶，證實(shí)天然染色體全部被PAM株內(nèi)的突變?nèi)旧w置換了。
得自PAMCOD株的DNA用作模板時(shí)，未觀(guān)察到相應(yīng)于野生型染色體的條帶(圖2B，c欄)。但是，約4.1kb的預(yù)期條帶也未被擴(kuò)增，可能是由于插入片段體積大和codA序列中的GC含量高的緣故。因此，將相當(dāng)于codA基因的編碼區(qū)的引物3(圖2A)與引物1組合應(yīng)用。約2.6kb的預(yù)期條帶被擴(kuò)增了(圖2B，d欄)，表明PAMCOD株的染色體內(nèi)存在codA基因。
實(shí)施例3在聚球藍(lán)細(xì)菌PAMCOD株內(nèi)表達(dá)codA基因通過(guò)Western印跡分析檢驗(yàn)實(shí)施例1中所得PAMCOD株內(nèi)codA基因的表達(dá)，其中應(yīng)用抗純化后膽堿氧化酶的多克隆抗血清。結(jié)果示于圖3。在位置60kDa處檢出得自PAMCOD株(a欄)和純化后的膽堿氧化酶(c欄)的蛋白質(zhì)提取物中有信號(hào)。而在得自PAM株(b欄)的蛋白質(zhì)提取物中未檢出這種信號(hào)。結(jié)果證實(shí)，在聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942內(nèi)，于conII啟動(dòng)子的控制下表達(dá)了codA基因。
實(shí)施例4細(xì)胞內(nèi)甜菜堿濃度的分析轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞生長(zhǎng)于添加5mM氯化膽堿的一升BG11培養(yǎng)基中。加入不同濃度的NaCl構(gòu)成鹽作用。在25℃下用1M H2SO4處理收獲的細(xì)胞達(dá)20小時(shí)，并利用高碘酸鹽沉淀技術(shù)(Wall，J.S.etal.，Analyt.Chem.32870-874，1960)從混合物中回收甜菜堿。將甜菜堿高碘酸鹽溶于1ml甲醇-d4(Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)，其中含有作內(nèi)標(biāo)的2mM 2-甲基-2-丙醇(Wako PureChemical Industries)。該溶液被轉(zhuǎn)入NMR管，并用Bruker AMX360Wb測(cè)定1H-NMR光譜。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較積分峰來(lái)定量甜菜堿。
基于從負(fù)染細(xì)胞的電子顯微照片估測(cè)的細(xì)胞體積，測(cè)定PAMCOD株細(xì)胞內(nèi)的甜菜堿濃度。單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為圓柱形，它長(zhǎng)2.14μm、直徑為0.82μm，且估測(cè)的細(xì)胞體積約為1.13μm3。
下列表1示出隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的增大，細(xì)胞中甜菜堿濃度的變化情況。在沒(méi)有codA基因的PAM株內(nèi)未檢測(cè)出甚至微量的甜菜堿。PAMCOD株細(xì)胞內(nèi)的甜菜堿濃度范圍為60-90mM。NaCl濃度未顯著影響PAMCOD株細(xì)胞內(nèi)甜菜堿的積聚。
表1NaCl(M) PAM(mM) PAMCOD(mM)00 67±30.2 0 73±40.3 0 86±2實(shí)施例5聚球藍(lán)細(xì)菌PAMCOD株對(duì)鹽作用和滲透作用的耐受性通過(guò)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況、葉綠素含量和光合活性來(lái)估測(cè)細(xì)胞對(duì)鹽作用和滲透作用的耐受性。聚球藍(lán)細(xì)胞PAM株和PAMCOD株的細(xì)胞預(yù)先在添加有1mM氯化膽堿的BG11培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)3天，然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入添加有1mM氯化膽堿、其中含0.4M NaCl或0.8M山梨醇的BG11培養(yǎng)基。利用730nm處的光密度監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。用Arnon et al.描述的方法(Biochim.Biophys，Acta.357231-245，1974)測(cè)定葉綠素含量。用Clark型氧電極、以1mM1，4-苯醌和1mM K3Fe(CN)6為電子受體通過(guò)監(jiān)測(cè)氧濃度而測(cè)定光合的氧放出量。以在不含NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的同樣細(xì)胞為對(duì)照物。
在NaCl存在下細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示，而在山梨醇存在下細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果示于圖5。PAM株的生長(zhǎng)受到高的鹽作用和滲透作用的抑制，但PAMCOD株卻能在這些條件下生長(zhǎng)。
在NaCl存在下葉綠素含量測(cè)試結(jié)果示于圖6，而在山梨醇存在下葉綠素含量測(cè)試結(jié)果如圖7所示。這些測(cè)試結(jié)果類(lèi)似于細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)的結(jié)果。用高濃度的鹽處理后的PAM株內(nèi)葉綠素含量逐漸降低，而用0.8M山梨醇處理過(guò)的PAM株內(nèi)葉綠素的含量迅速降低；反之，即使用鹽或山梨醇處理后，PAMCOD株也能繼續(xù)生長(zhǎng)。
在NaCl存在下光合活性的測(cè)試結(jié)果如圖8中所示。PAM株的光合活性嚴(yán)重地受鹽作用的抑制。反之，PAMCOD株細(xì)胞的光合活性在鹽處理的初始階段暫時(shí)受抑制，但隨后恢復(fù)并繼續(xù)升高。在山梨醇存在下測(cè)得類(lèi)似的光合活性結(jié)果。有趣的是，用0.8M山梨醇處理PAMCOD株細(xì)胞時(shí)，未觀(guān)察到光合活性的暫時(shí)降低。
實(shí)施例6制備攜帶codA基因的雙元載體質(zhì)粒用5′CTGTCTAGATGTAATTAACAATGGCT3′和5′CCACATATGCATGCATTGCACTCT3′作引物，通過(guò)PCR對(duì)得自煙草(Nicotiana sylvestris)的rbcS(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基)轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)XbaI-NdeI片段(約200bp)進(jìn)行擴(kuò)增以引入XbaI位點(diǎn)和NdeI位點(diǎn)。
然后，用5′AACCATATGCACATCGACAACATC3′和5′GCTCCATCCAGCGGTCCAGC3′作引物，通過(guò)PCR對(duì)codA基因的N端-BamHI片段(約100bp)進(jìn)行擴(kuò)增以引入NdeI位點(diǎn)。用限制酶制備codA基因的BamHI-SmaI片段(約1.6kbp)。進(jìn)一步地，用5′GAAACAGTCCTGCTTCCACAC3′和5′GCG AG C TCTGCCTACACCGCCAT3′作引物通過(guò)PCR對(duì)codA基因的SmaI-C端片段(約80bp)進(jìn)行擴(kuò)增以引入SacI位點(diǎn)。
用這些片段置換雙元載體質(zhì)粒pBI221中的GUS(β-葡糖醛酸酶)基因。
codA基因的限制酶圖示于圖9。
將含35S啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒的NOS(胭脂氨酸合酶(nopalin synthase))終止子的HindIII-EcoRI片段引入雙元載體質(zhì)粒pGAH以制備質(zhì)粒pGAH/codA(圖10)。該質(zhì)粒含抗卡那霉素和潮霉素的基因。
實(shí)施例7將雙元載體質(zhì)粒引入土壤桿菌將攜帶Ti質(zhì)粒的復(fù)盆子土壤桿菌EHA101與實(shí)施例6中制得的雙元載體質(zhì)粒pGAH/codA混合，然后冷凍并融化，在含有四環(huán)素和卡那霉素的LB板上篩選。將所得其中整合了codA基因的土壤桿菌稱(chēng)為EHA101(pGAH/codA)。
實(shí)施例8擬南芥的轉(zhuǎn)化讓擬南芥WS株發(fā)芽以制備下胚軸片段。將該下胚軸用B5培養(yǎng)基(ICN Biochemicals)(pH5.7)，該培養(yǎng)基中含0.05mg/l的細(xì)胞分裂素(Wako Pure Chemical Industries)和0.5mg/l的2，4-D(Wako Pure Chemical Industries)進(jìn)行愈傷組織化，以形成下胚軸愈傷組織。
然后，用實(shí)施例7中制備的含codA的土壤桿菌EHA101(pGAH/codA)感染該愈傷組織并共培養(yǎng)。用含250mg/l萬(wàn)古霉素、500mg/l羧芐青霉素和200mg/l頭孢氨噻的B5培養(yǎng)基對(duì)土壤桿菌解毒之后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(含25mg/l卡那霉素和15mg/l潮霉素的B5培養(yǎng)基)以形成分枝。然后，選擇抗卡那霉素和潮霉素的枝以引入根并形成籽。只對(duì)所得T2籽的染色體之一進(jìn)行雜合的轉(zhuǎn)化。
然后，使得自T2籽的植物自花受精并通過(guò)卡那霉素和潮霉素選擇而得純合的T3籽。
讓野生型株和轉(zhuǎn)化體株的植物于22℃下在含0.1％HYPONEX(Hyponex Corporation，Marysville，OH，USA)的培養(yǎng)基(pH5.2)中生長(zhǎng)30天，培養(yǎng)基基于水或由蛭石和珍珠巖組成的土壤，除非另有說(shuō)明，一天的16小時(shí)照明度為75μmol·m-2·S-1而其余8小時(shí)是在暗室中；然后用于實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例9對(duì)已表達(dá)的膽堿氧化酶的免疫研究依本發(fā)明人在文獻(xiàn)中描述過(guò)的方法(Deshniumn，P.etal.，Plant Mol.Biol.29897-907，1995)產(chǎn)生抗膽堿氧化酶的抗體。
將擬南芥的野生型和轉(zhuǎn)化體株20天齡植物葉在0℃下置于微量離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)摩擦，勻漿物在10,000xg下離心10分鐘以制備可溶性級(jí)分。用SDS-PAGE分離上清液的可溶性蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)入尼龍膜(Immobilon PVDF；Millipore，Bedford，MA，USA)。將膜與抗膽堿氧化酶的抗體一起溫育，再用由生物素化次級(jí)抗體、親和素和生物素化辣根過(guò)氧化物酶(ABC Kit；Vectastain，Burlingane，CA，USA)組成的系統(tǒng)檢測(cè)。
Western印跡分析結(jié)果示于圖11。驗(yàn)明存在相應(yīng)于膽堿氧化酶的64kDa免疫應(yīng)答蛋白。還觀(guān)察到少量相應(yīng)于膽堿氧化酶前體的70kDa蛋白質(zhì)和rbcS轉(zhuǎn)運(yùn)肽。這些結(jié)果表明，codA基因在染色體中已被正確地整合和表達(dá)，且已表達(dá)的前體被加工成成熟蛋白質(zhì)。
然后，依文獻(xiàn)中所述方法(Mustardy，L.et al.，Plant Physiol.94334-340，1990)用抗膽堿氧化酶的抗體檢測(cè)了已在植物中表達(dá)的膽堿氧化酶的定位。用1％戊二醛的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.2)固定植物的小片嫩葉達(dá)1小時(shí)。用相同的緩沖液漂洗后，樣品用乙醇脫水，置于Lowicryl K4M樹(shù)脂(TAAB LaboratoriesEquipment Ltd.Berkshire，U.K.)內(nèi)。按文獻(xiàn)中所述方法(Mustardy et al.，supra)進(jìn)行免疫金標(biāo)記。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已表達(dá)的膽堿氧化酶被定位于葉綠體的基質(zhì)內(nèi)，表明膽堿氧化酶已被轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體中。
實(shí)施例10轉(zhuǎn)化體植物中甜菜堿和葉綠素含量的測(cè)定通過(guò)測(cè)定季銨化合物的NMR譜(Wall，J.et al.，Analyt.Chem.32870-874，1960)而計(jì)算植物葉中甜菜堿的含量。在液氮中用陶瓷磨機(jī)(motor)將5g野生型株和轉(zhuǎn)化體植物的葉子磨成粉，使粉末懸浮于25ml 1.0M H2SO4并在25℃下保溫2小時(shí)。除去不溶性物質(zhì)后，在1000xg下離心10分鐘以回收上清液。將上清液與10ml KI-I2溶液混合并在0℃下保溫2小時(shí)。在1000xg下離心30分鐘回收甜菜堿和膽堿的高碘化物加合物，再溶于0.5mlCD4OH(Wako Pure Chemical Industries)(含有作內(nèi)標(biāo)的0.5mM 2-甲基-2-丙醇(Wako Pure Chemical Industries))而測(cè)定1HNMR譜。觀(guān)測(cè)到對(duì)應(yīng)于甜菜堿和膽堿的兩個(gè)主要峰，其中的甜菜堿積分峰用于測(cè)定其濃度。
通過(guò)下列方法測(cè)定葉內(nèi)葉綠素的含量在液氮中用陶瓷磨機(jī)將葉(1g)磨成粉，讓粉末懸浮于10ml丙酮∶水(4∶1，v/v)。保溫30分鐘后，除去不溶性物質(zhì)，對(duì)上清液進(jìn)行分光光度測(cè)定(Arnon，D.I.Plant Physiol.241-15，1949)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化體植物中含甜菜堿和膽堿，而野生型株內(nèi)只測(cè)出膽堿。甜菜堿含量為1.0μmol/g鮮葉，葉綠素含量為0.3μmol/g鮮葉。
實(shí)施例11擬南芥轉(zhuǎn)化體對(duì)鹽作用和滲透作用的耐受性(1)對(duì)鹽作用的耐受性將得自實(shí)施例8的T3籽接種于用0.5％gellan gum凝膠化的Murashige & Skoog′s培養(yǎng)基上，比較子葉的發(fā)芽、生根和生長(zhǎng)。在不含NaCl的培養(yǎng)基上，野生型株和轉(zhuǎn)化體植物之間未發(fā)現(xiàn)任何差異。但是，在含60mM氯化鈉的培養(yǎng)基上，與長(zhǎng)勢(shì)較差的野生型株相比，轉(zhuǎn)化體植物之一C1-0相對(duì)地長(zhǎng)勢(shì)良好而顯示出耐鹽性(圖12)。
在含100mM氯化鈉的培養(yǎng)基上，野生型株在發(fā)芽10天后便停止生長(zhǎng)，且它的葉子變白。然而，轉(zhuǎn)化體植物繼續(xù)生長(zhǎng)同時(shí)保持綠色。尤其是轉(zhuǎn)化體植物的根長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于野生型株的根。在不含100mM氯化鈉的對(duì)照試驗(yàn)中，野生型株和轉(zhuǎn)化體株植物的長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，證實(shí)轉(zhuǎn)化體植物已獲得在鹽作用條件下生長(zhǎng)的能力。
(2)對(duì)滲透作用的耐受性對(duì)野生型株和轉(zhuǎn)化體植物的籽滅菌后接種于含100、200和400mM山梨醇的半固態(tài)培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物置于22℃下的恒溫箱中，一天中的16小時(shí)保持75μmol/m2/秒的照明度，而其余8小時(shí)是在暗室中；并定期觀(guān)察。第15天的狀態(tài)示于圖13(左邊的W表示野生型株而右邊的T表示轉(zhuǎn)化體植物)。當(dāng)山梨醇濃度為100mM時(shí)，一些野生型株未發(fā)芽，或者即使它們發(fā)芽了，其葉子也變白。然而，轉(zhuǎn)化體植物繼續(xù)生長(zhǎng)并保持綠色。在200mM的濃度下，兩種株的生長(zhǎng)均受抑制，但轉(zhuǎn)化體植物的受抑制程度低于野生型株，尤其是轉(zhuǎn)化體植物根的長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于野生型株。在400mM的濃度下，野生型株不發(fā)芽，而轉(zhuǎn)化體植物也未發(fā)芽，或者即使它們發(fā)芽了，也極少生長(zhǎng)。
實(shí)施例12在鹽作用下轉(zhuǎn)化體植物的光合活性通過(guò)監(jiān)測(cè)葉綠素的熒光來(lái)測(cè)定鹽作用對(duì)成熟葉子光合系統(tǒng)II活性的影響。
將生長(zhǎng)于對(duì)照培養(yǎng)基上的野生型株和轉(zhuǎn)化體株植物轉(zhuǎn)至含400mM氯化鈉的HYPONEX培養(yǎng)基，并在上述光亮或黑暗條件下溫育。在一定的時(shí)間后，從植物上摘下葉子，采用脈沖強(qiáng)度調(diào)制熒光計(jì)(PAM-2000；Walts，Effeltrich，Germany)測(cè)定光合系統(tǒng)II的效率并以葉綠素?zé)晒庾兞颗c葉綠素?zé)晒鈽O大值的比(Fv/Fm)表示(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42313-349.1991)。
結(jié)果示于圖14。在光亮條件下溫育2天后，野生型株幾乎喪失光合系統(tǒng)II活性，而轉(zhuǎn)化體植物維持其光合系統(tǒng)II活性初始值的50％。在黑暗條件下，鹽作用引起的失活作用要緩和得多，但轉(zhuǎn)化體植物的光合系統(tǒng)II活性對(duì)鹽作用的耐受性比野生型株更高。當(dāng)植物被轉(zhuǎn)至含200mM氯化鈉的培養(yǎng)基時(shí)，光合系統(tǒng)II活性的降低比在含400mM氯化鈉的培養(yǎng)基上時(shí)所觀(guān)察到的要緩和得多，但轉(zhuǎn)化體植物對(duì)鹽作用的耐受性也比野生型株更高。
實(shí)施例13用于轉(zhuǎn)化稻的嵌合codA基因的制備按實(shí)施例6中所述方法，在花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下翻譯得自球形節(jié)桿菌的膽堿氧化酶基因(codA)之后，于質(zhì)粒pUC119上制得分別定位于胞質(zhì)溶膠和質(zhì)體上的兩種嵌合codA基因(分別稱(chēng)為35SIN cod A和35SINTPcodA)(參見(jiàn)圖15)?？紤]到要求存在內(nèi)含子以高表達(dá)稻內(nèi)基因(例如參見(jiàn)Tanaka，A.et.al.Nucleic Acids Res.186767-6770，1990)，將稻的超氧化物歧化酶基因中5′非翻譯序列內(nèi)的內(nèi)含子(SodCc2Sakamoto，A.et al.，F(xiàn)EBS Lett.35862-66，1995)引入這二種嵌合基因。進(jìn)一步地，將得自豌豆rbc S轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列(Coruzz，G.et al.，EMBO J 31671-1679，1984)加入35SINTPcodA，以將codA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入葉綠體。
實(shí)施例14稻的轉(zhuǎn)化將實(shí)施例13中制備的兩種嵌合codA基因中的每種和潮霉素抗性基因這種選擇標(biāo)記一起用基因槍裝置引入得自稻籽的盾片愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞?；趯?duì)抗生素的抗性選擇已轉(zhuǎn)化的愈傷組織并再分化成植物。對(duì)已轉(zhuǎn)化的愈傷組織或顯示潮霉素抗性的已轉(zhuǎn)化/再分化了的個(gè)體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用Northern印跡技術(shù)估測(cè)該codA基因整合和轉(zhuǎn)錄入核基因組的情況，并對(duì)每個(gè)codA基因選擇80-100或更多個(gè)轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例15codA基因在轉(zhuǎn)化體稻內(nèi)的表達(dá)分析利用Western印跡技術(shù)篩選實(shí)施例14中獲得的轉(zhuǎn)化體而得在蛋白質(zhì)水平表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體稻(本代)，最終包括6個(gè)攜帶質(zhì)體定位化基因的個(gè)體和10個(gè)攜帶胞質(zhì)溶膠定位化基因的個(gè)體。
稻缺乏內(nèi)在膽堿氧化酶活性，但從轉(zhuǎn)化體的葉或根制得的可溶性部分顯示出膽堿氧化酶活性。與預(yù)料的相反，盡管是用相同的表達(dá)啟動(dòng)子，但發(fā)現(xiàn)所有的質(zhì)體型轉(zhuǎn)化體個(gè)體表達(dá)膽堿氧化酶蛋白質(zhì)的量比胞質(zhì)溶膠型更少。
當(dāng)進(jìn)一步用Northern印跡技術(shù)檢驗(yàn)codA基因的表達(dá)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的兩種基因的量有什么明顯差別。在用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢驗(yàn)內(nèi)含子的加工時(shí)，從轉(zhuǎn)錄自質(zhì)體型基因的mRNA檢測(cè)出大量含不同的3′-接受位點(diǎn)的剪接變體，它不可能正常翻譯成蛋白質(zhì)。這啟示，用質(zhì)體型基因轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)的蛋白質(zhì)量少可能是由于mRNA前體異常加工所致。此現(xiàn)象可能與下列事實(shí)有關(guān)，即編碼用于膽堿氧化酶的質(zhì)體導(dǎo)向的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列是得自雙子葉植物(豌豆rbcS基因)。因此，易于預(yù)測(cè)如果編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列得自如稻rbcS的單子葉植物，則稻葉綠體內(nèi)codA的表達(dá)會(huì)更為有效，且所得轉(zhuǎn)化體稻將會(huì)更能耐鹽作用。
實(shí)施例16在轉(zhuǎn)化體稻內(nèi)生物合成甜菜堿用質(zhì)子NMR檢測(cè)表達(dá)膽堿氧化酶的轉(zhuǎn)化體組織內(nèi)甜菜堿的積聚。圖16示出野生型株、不表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體(圖16A)和表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體(圖16B)三者的NMR結(jié)果。
表達(dá)膽堿氧化酶的轉(zhuǎn)化體生物合成甜菜堿，甜菜堿積聚的量與由Western印跡技術(shù)測(cè)定的膽堿氧化酶的量呈正比關(guān)系。葉內(nèi)積聚的甜菜堿多于根內(nèi)的測(cè)定值，且在高水平表達(dá)codA基因的個(gè)體內(nèi)達(dá)4μmol/g鮮葉。這是首例通過(guò)基因工程方法使稻獲得合成甜菜堿的能力。
實(shí)施例17估測(cè)轉(zhuǎn)化體稻的耐鹽性在耕作和溶液培養(yǎng)這兩種條件下，表達(dá)codA基因的轉(zhuǎn)化體稻與非轉(zhuǎn)化體(野生型)生長(zhǎng)得同樣好，未顯示什么明顯異常。這表明，甜菜堿生物合成中形成的副產(chǎn)物過(guò)氧化氫在細(xì)胞中已被有效地解毒。
然后，在含氯化鈉的溶液培養(yǎng)條件下，使可在蛋白質(zhì)水平表達(dá)codA基因、有酶活性和甜菜堿生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)。用葉綠素?zé)晒夥治龉罍y(cè)Na鹽對(duì)光合活性的影響并與非轉(zhuǎn)化體(野生型)的結(jié)果比較。將轉(zhuǎn)化體稻和非轉(zhuǎn)化體稻置于含100mM和10mM氯化鈉的HYPONEX水溶液之后，測(cè)定葉綠素?zé)晒怆S時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體中光合活性的抑制減慢了(圖17)。因此，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體更能耐鹽環(huán)境。〔序列表〕SEQ ID No1序列長(zhǎng)度2400序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型分子類(lèi)型DNA序列特征特征鍵纏結(jié)肽位置361..2002序列描述GGGAATATCC GTCGTCGTAG ACGAGCCCTT CGGCCCGTGT AAAGGTGGAG ACCTTCCACA 60CCGAGGACGA GGCCGTCGCG ACCGCCAACG ACACCAACTA CGGGCTGTCC GGCGCGGTCC 120TGGACCCAGG ACGCCGGCAA GACGCAGCGC GTGGCCGGCC GGCTGCGACA CGGCACCGTC 180TGGATCAACG ACTTCCACCC CTACCTCCCA CAGACCGAGT GGGGCGGCTT CGGCCAGTCC 240GGCGTCGGCC GCGAACTCGG CCCGACCGGC CTGGCCGAGT ACCAGGAGGC CAAGCACATC 300TACCAGAACA CCAGCCCGCA GGTCACCGGC TGGTTCGCTG ACCACGGCAA GGAGAACTAG 360ATG CAC ATC GAC AAC ATC GAG AAC CTG AGC GAC AGG GAG TTC GAC TAC 408Met His Ile Asp Asn Ile Glu Asn Leu Ser Asp Arg Glu Phe Asp Tyr1 5 10 15ATC GTC GTC GGC GGC GGG TCC GCC GGG GCC GCC GTC GCC GCC CGG CTG 456Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu20 25 30AGC GAG GAT CCC GCA GTG AGC GTG GCG CTG GTG GAG GCC GGC CCG GAT 504Ser Glu Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp
35 40 45GAC CGC GGC GTG CCC GAG GTG CTG CAG CTG GAC CGC TGG ATG GAG CTG 552Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu50 55 60CTG GAA TCG GGC TAC GAC TGG GAC TAC CCG ATC GAG CCG CAG GAG AAC 600Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro Ile Glu Pro Gln Glu Asn65 707580GGC AAC TCC TTC ATG CGC CAT GCC CGT GCC AAG GTC ATG GGC GGC TGC 648Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys Val Met Gly Gly Cys85 9095TCC AGC CAC AAC TCC TGC ATC GCC TTC TGG GCC CCG CGC GAG GAC CTG 696Ser Ser His Asn Ser Cys Ile Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu100 105 110GAC GAG TGG GAG GCC AAG TAC GGC GCC ACC GGC TGG AAC GCC GAG GCG 744Asp Glu Trp Glu Ala Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ala115 120125GCC TGG CCG CTG TAC AAG CGG CTG GAA ACC AAC GAG GAC GCG GGC CCG 792Ala Trp Pro Leu Tyr Lys Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro130 135140GAC GCG CCG CAC CAC GGG GAC TCC GGC CCC GTG CAC CTG ATG AAC GTG 840Asp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val145 150 155 160CCC CCG AAG GAC CCG ACC GGC GTC GCG CTC CTG GAC GCC TGC GAG CAG 888Pro Pro Lys Asp Pro Thr Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln165 170 175GCC GGC ATC CCG CGC GCG AAG TTC AAC ACC GGC ACC ACC GTG GTC AAC 936Ala Gly Ile Pro Arg Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val Val Asn180 185 190GGC GCC AAC TTC TTC CAG ATC AAC CGG CGC GCG GAC GGC ACC CGC TCC 984Gly Ala Asn Phe Phe Gln Ile Asn Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser195200 205TCC AGC TCG GTC TCC TAC ATC CAC CCG ATC GTC GAG CAG GAG AAC TTC 1032Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Pro Ile Val Glu Gln Glu Asn Phe210 215 220ACC CTG CTA ACC GGC CTG CGC GCC CGC CAG CTG GTG TTC GAC GCG GAC 1080Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp225 230 235 240AGG CGC TGC ACC GGC GTC GAC ATC GTG GAC TCC GCC TTC GGC CGC ACC 1128Arg Arg Cys Thr Gly Val Asp Ile Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr245 250 255CAT CGG CTG ACG GCG CGC AAT GAA GTC GTG CTC TCC ACC GGC GCG ATC 1176His Arg Leu Thr Ala Arg Asn Glu Val Val Leu Ser Thr Gly Ala Ile260 265 270GAT ACG CCG AAG CTG TTG ATG CTC TCC GGA ATC GGC CCC GCC GCC CAC 1224Asp Thr Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly Ile Gly Pro Ala Ala His275280 285CTC GCC GAG CAC GGC ATC GAG GTC CTT GGT GGA CTC CCC CGG CGT GGG 1272Leu Ala Glu His Gly Ile Glu Val Leu Gly Gly Leu Pro Arg Arg Gly290295 300CGA GCA CCT GCA GGA CCA CCC GGA AGG CGT GGT GCA GTT CGA GGC CAA 1320Arg Ala Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Arg Gly Ala Val Arg Gly Gln305 310 315 320GCA GCC CAT GGT CGC CGA GTC CAC GCA GTG GTG GGA GAT CGG CAT CTT 1368Ala Ala His Gly Arg Arg Val His Ala Val Val Gly Asp Arg His Leu325 330 335CAC CCC CAC CGA GGA CGG CCT GGA CCG CCC CGA CCT GAT GAT GCA CTA 1416His Pro His Arg Gly Arg Pro Gly Pro Pro Arg Pro Asp Asp Ala Leu340 345350CGG CTC CGT GCC GTT CGA CAT GAA CAC CCT GCG GCA CGG CTA CCC CAC 1464Arg Leu Arg Ala Val Arg His Glu His Pro Ala Ala Arg Leu Pro His355 360 365CAC GGA GAA CGG GCT TCA GCC TCA CCC CGA ACG TCA CGC ACG CCC GCT 1512His Gly Glu Arg Ala Ser Ala Ser Pro Arg Thr Ser Arg Thr Pro Ala370 375 380CCC GCG GCA CTG TCC GGC TGC GCA GCC GCG ACT TCC GCG ATA AGC CCA 1560Pro Ala Ala Leu Ser Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ile Ser Pro385390 395 400TGG TCG ACC CGC GCT ACT TCA CCG ACC CAG AAG GGC CAT GAC ATG CGC 1608Trp Ser Thr Arg Ala Thr Ser Pro Thr Gln Lys Gly His Asp Met Arg405 410 415GTC ATG GTC GCC GGC ATC CGC AAG GCC CGC GAA ATC GCC GCC CAG CCC 1656Val Met Val Ala Gly Ile Arg Lys Ala Arg Glu Ile Ala Ala Gln Pro420 425 430GCC ATG GCG GAA TGG ACC GGC CGC GAG CTC TCC CCC GGC GTC GAG GCG 1704Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Val Glu Ala435 440 445CAG ACC GAC GAG GAG CTG CAG GAC TAC ATC CGC AAG ACG CAC AAC ACC 1752Gln Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Arg Lys Thr His Asn Thr450 455 460GTC TAC CAC CCC GTG GGC ACC GTG CGC ATG GCC GCG GTC GAG GAC GAG 1800Val Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Ala Val Glu Asp Glu465 470475 480ATG TCC CCG CTC GAC CCC GAG CTG CGG GTC AAG GGC GTC ACC GGT CTG 1848Met Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu
485 490 495CGC GTC GGC GAC GCC TCG GTC ATG CCC GAG CAC GTG ACC GTC AAC CCC1896Arg Val Gly Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro500 505 510AAC ATC ACC GTC ATG ATG ATC GGC GAG CGC TGC GCG GAC CTT ATC CGC1944Asn Ile Thr Val Met Met Ile Gly Glu Arg Cys Ala Asp Leu Ile Arg515520 525TCC GCC CGC GCC GGT GAA ACA ACG ACG GCG GAC GCC GAG CTG AGC GCG1992Ser Ala Arg Ala Gly Glu Thr Thr Thr Ala Asp Ala Glu Leu Ser Ala530 535 540GCC CTC GCC TAAGCGGGAG CGGCCAGCCG CGGGGCCTGT CCGGAACCAC CTGGCGGGCC 2051Ala Leu Ala545 547CCGCATGGGG CCGGACACAA TGCCGGTAAC TAAGGGTGCG GAAGCAGTCC TGCTTCCACA 2111CCCGCGTTTT GCACGCCCGG GCCGGCAACT GGCCCGGCCG GCTAAGCCGA AGGTCTTCCG 2171GGGGCGGGCC GGATCGCTGC GGGCAGTCCG TCGGCGAGCC GCTGCAGCGT GCCGGCGGTA 2231ATGGCGGTGT AGGCAGGGAT CGCGTCGGGG TAGATGTACT CGTTGCGGGC GTGCGCGCCG 2291TCGCCCACCG CGCCCAGGCC GCACAGGACC GGGATGCCGA GGGCGGAGAC GAAGTTGGCG 2351TCGCTGCCCC CGCCCACCGA GGCGGTTTCC AGCTCCCGGC CCTGCTCCA 2400
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生耐鹽性和/或耐滲透性植物的方法，它包括用攜帶編碼膽堿氧化酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中編碼膽堿氧化酶的基因得自土壤細(xì)菌節(jié)桿菌屬。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中編碼膽堿氧化酶的基因是編碼序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的堿基序列，或者是編碼SEQ ID No.1的修飾氨基酸序列的核苷酸序列，其中的修飾氨基酸序列是通過(guò)添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列和/或被其它氨基酸取代而產(chǎn)生的，只要該核苷酸序列能編碼具有膽堿氧化酶活性的蛋白質(zhì)即可。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中的耐鹽性和/或耐滲透性植物是藍(lán)細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中的耐鹽性和/或耐滲透性植物是高等植物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的高等植物是雙子葉植物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的雙子葉植物是芥屬植物。
8.權(quán)利要求5的方法，其中的高等植物是單子葉植物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的單子葉植物是禾本科植物。
10.依權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的耐鹽性和/或耐滲透性植物，或其具有相同特性的子代。
全文摘要
一種產(chǎn)生耐鹽性和/或耐滲透性植物的方法,它包括用攜帶編碼膽堿氧化酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化植物的步驟,以及用所述方法產(chǎn)生的耐鹽性和/或耐滲透性植物或其有相同特性的子代。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1182348SQ9619350
公開(kāi)日1998年5月20日 申請(qǐng)日期1996年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月27日
發(fā)明者村田紀(jì)夫 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社