專利名稱：：嗜冷蛋白酶和嗜冷細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在低溫度范圍內(nèi)具有高活性的蛋白酶，其用途以及產(chǎn)生該蛋白酶的嗜冷細(xì)菌。
背景技術(shù)：
：人們了解嗜冷細(xì)菌已有一段長的時間，這些細(xì)菌的存在可以在低溫環(huán)境中得到廣泛的證實?？梢詮脑S多低溫環(huán)境(如土壤、漁業(yè)產(chǎn)品、奶制品以及人工低溫度環(huán)境)分離到嗜冷細(xì)菌。已從食品微生物的需要出發(fā)對嗜冷細(xì)菌進(jìn)行了研究，但主要局限于有關(guān)微生物的種系發(fā)生研究。同時，人們期待從嗜冷細(xì)菌獲得的酶是在低溫范圍中具有具有最佳溫度的嗜冷酶。在低溫下有效發(fā)揮作用的嗜冷酶被認(rèn)為能夠摻入到例如即使在低溫水中也可以使用的去垢劑中。也被認(rèn)為可以用于存在室溫下易揮發(fā)的有機溶劑的化學(xué)反應(yīng)中，和用于在食品不腐敗的溫度下改善食品的質(zhì)量。此外，對來源于嗜冷細(xì)菌的酶的研究對揭示嗜冷細(xì)菌的生理功能和對低溫的適應(yīng)機制相當(dāng)有意義。發(fā)明概述現(xiàn)在我們已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新的嗜冷蛋白酶的新的細(xì)菌菌株。因此，本發(fā)明的目的是提供一種新的嗜冷蛋白酶。本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)生嗜冷蛋白酶的新的微生物。本發(fā)明的還一個目的是提供用所述的新微生物制備嗜冷蛋白酶的方法。按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶具有下列理化性質(zhì)。-特異性活性和底物特異性其作用于酪蛋白和二甲基酪蛋白并分解它們但不作用于核糖核酸酶；-最佳溫度其具有在約40℃的最佳作用溫度；和-溫度穩(wěn)定性在pH7貯存1小時的條件下，在溫度高達(dá)30℃時其幾乎不失活，但是在40℃時活性喪失約40％。在50℃時，其迅速失活以致活性在約15分鐘內(nèi)完全喪失。此外，按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的嗜冷蛋白酶也具有下列理化性質(zhì)-最佳pH其在pH7.5時具有最佳作用；和-穩(wěn)定的pH范圍在20℃貯存1小時的條件下，其在pH6.0-10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；-分子量約38kDa(SDS-PAGE和凝膠過濾法)；-等電點約4.5。而且，按照本發(fā)明的新微生物是具有以上所述的嗜冷蛋白酶產(chǎn)生能力的比目魚黃桿菌(Flavobacteriumbalustinum)。另外，制備發(fā)明的嗜冷蛋白酶的方法包括培養(yǎng)以上所述的比目魚黃桿菌，從培養(yǎng)物收集所說的嗜冷蛋白酶。附圖簡要描述圖1是說明實施例2的結(jié)果的圖表，或者顯示來源于菌株P(guān)104的蛋白酶和蛋白酶SubtilysinCarlsberg的溫度和活性之間的關(guān)系。圖2是說明實施例4(2)的結(jié)果的圖表，或者顯示初始pH對比目魚黃桿菌P104胞外蛋白酶的活性與產(chǎn)生的影響。圖3是說明實施例4(3)的結(jié)果的圖表，或者顯示培養(yǎng)溫度對比目魚黃桿菌P104胞外蛋白酶的活性與產(chǎn)生的影響。圖3(A)、(B)和(C)分別顯示在10℃、20℃和30℃時的結(jié)果。圖4是說明實施例5(2)(B)中凝膠過濾洗脫結(jié)果的圖表。圖5是說明實施例5(2)(C)中層析洗脫結(jié)果的圖表。圖6說明實施例6中測定分子量的SDS-PAGE的結(jié)果。圖7是實施例6中測定分子量的校準(zhǔn)曲線。圖8是實施例6中測定分子量的凝膠過濾的校準(zhǔn)曲線。圖9說明實施例7中等電點聚焦的結(jié)果。圖10是實施例7中等電點聚焦的校準(zhǔn)曲線。圖11是說明實施例8的結(jié)果的圖表，或者顯示pH對本發(fā)明的酶的酶反應(yīng)的影響。圖12是說明實施例9的結(jié)果的圖表，或者顯示本發(fā)明的酶對pH的穩(wěn)定性。圖13是說明實施例10的結(jié)果的圖表，或者顯示溫度對本發(fā)明的酶的酶反應(yīng)的影響。圖14是說明實施例11的結(jié)果的圖表，或者顯示本發(fā)明的酶對溫度的穩(wěn)定性。圖15是說明實施例13的結(jié)果的圖表，或者是說明蛋白質(zhì)修飾物SDS對本發(fā)明的酶的影響的圖表。圖16是說明實施例13的結(jié)果的圖表，或者是說明蛋白質(zhì)修飾物尿素對本發(fā)明的酶的影響的圖表。圖17是實施例16中檢驗的本發(fā)明的酶的Lineweaver-Burk方案。圖17(A)和(B)分別顯示在0到2.0范圍中和在0到0.2范圍中1/v值的改變。發(fā)明詳述新蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌按照本發(fā)明的新蛋白酶由屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)并且具有產(chǎn)生具有以上所述性質(zhì)的蛋白酶之能力的微生物產(chǎn)生。具有產(chǎn)生按照本發(fā)明的蛋白酶能力之微生物的特定的例子包括比目魚黃桿菌P104。這種菌株是從鮭內(nèi)部器官分離的微生物，已于1995年2月17日以保藏號FERM5006保藏在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機構(gòu)國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所。以下列出了按照本發(fā)明的比目魚黃桿菌P104的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)(1)形態(tài)學(xué)性質(zhì)該菌株以具有0.4-0.5×1.7-1.9μm大小的短的桿菌形式存在。(2)在培養(yǎng)基上的性質(zhì)該菌株在瓊脂培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生黃色色素。(3)生長的最佳條件pH該菌株在5-9范圍的pH下生長，最佳生長pH值約為中性。溫度該菌株在10-30℃范圍的溫度下生長，生長的最佳溫度約為20℃。(4)需氧和非需氧菌之間的區(qū)別需氧菌。(5)革蘭氏染色陰性。(6)生物化學(xué)性質(zhì)比目魚黃桿菌P104具有以下表1所示的主要生物化學(xué)性質(zhì)表1試驗項目結(jié)果半乳糖苷酶-精氨酸二水解酶-賴氨酸脫羧酶-鳥氨酸脫羧酶-檸檬酸利用-硫化氫產(chǎn)生-脲酶+色氨酸脫氨基酶-吲哚產(chǎn)生+明膠酶+葡萄糖-D-甘露糖醇-肌醇-D-山梨醇-鼠李糖-蔗糖-D-蜜二糖-D-扁桃苷-L-arbinol-氧化酶-盡管從這些性質(zhì)似乎可以判斷該菌株為Flavobacteriumindolgenes，但通過將以下實施例3中描述的編碼16S核糖體RNA之DNA的堿基序列與已知微生物的堿基序列比較，判斷其更適于分類為比目魚黃桿菌。培養(yǎng)該菌株的培養(yǎng)基可以是液體或者固體培養(yǎng)基，但是通常采用以液體培養(yǎng)基進(jìn)行的振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基可以是任何適于生長并可以產(chǎn)生蛋白酶的培養(yǎng)基。具體地說，碳源的例子包括葡萄糖、海藻糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和麥芽寡-糖化物。氯源的例子包括酵母膏、麥芽提取物、牛肉提取物、大豆粉、棉籽粉、玉米漿、各種氨基酸和它們的鹽和硝酸鹽。也可以利用包含適當(dāng)?shù)臒o機鹽如鎂、鈣、鈉、鉀、鐵和maganese磷酸鹽和其它必需營養(yǎng)物的合成培養(yǎng)基或者天然培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件如pH和溫度可以在產(chǎn)生蛋白酶的范圍內(nèi)確定，液體振蕩培養(yǎng)或者通氣攪拌培養(yǎng)在pH約中性和溫度約20℃下進(jìn)行。本發(fā)明的蛋白酶在細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁中、在細(xì)胞之內(nèi)、在培養(yǎng)液上清液中產(chǎn)生，并且可以是細(xì)菌細(xì)胞、粗酶(從細(xì)菌細(xì)胞或者培養(yǎng)液上清液獲得的)或提取的和純化的酶形式。酶的收集為了從培養(yǎng)液收集和純化按照本發(fā)明的蛋白酶，可以單獨或組合使用眾所周知的方法。按照本發(fā)明的蛋白酶主要被分泌到細(xì)胞外，即分泌到培養(yǎng)液中，因此可以用例如過濾或離心容易地除去細(xì)菌細(xì)胞來獲得粗酶溶液。用已知方法可以進(jìn)一步純化粗酶溶液。所述方法優(yōu)選地包括用鹽(如硫酸銨)進(jìn)行的鹽析；用有機溶劑(如甲醇，乙醇或者丙酮)進(jìn)行的沉淀；未加工淀粉吸附法；超濾法；和各種層析法(如凝膠過濾層析或者離子交換層析)。優(yōu)選方法的特定例子在以下實施例中描述。蛋白酶的性質(zhì)測定了按照本發(fā)明的蛋白酶的性質(zhì)，結(jié)果如下(1)活性和底物特異性本發(fā)明的酶很好地分解大分子蛋白質(zhì)如酪蛋白或二甲基酪蛋白或者變性蛋白質(zhì)。它也分解明膠(與酪蛋白比較膠原比例為約50％的變性蛋白質(zhì))。然而，其對其它天然蛋白質(zhì)有很小的作用，它根本不作用于核糖核酸酶。工業(yè)上使用的蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶可以具有非底物特異性，幾乎作用于所有蛋白質(zhì)。相反，本發(fā)明的酶僅僅作用于大分子蛋白質(zhì)或者酶相對容易接近的變性蛋白質(zhì)。一種類似本發(fā)明的、來源于嗜冷細(xì)菌熒光假單胞菌的蛋白酶已成功地分解了大分子蛋白質(zhì)如酪蛋白或二甲基酪蛋白或者變性蛋白質(zhì)。然而，該酶不同于本發(fā)明的酶它也分解天然球狀蛋白如血紅蛋白和牛血清白蛋白(與二甲基酪蛋白相比，以約40％的比例)。這樣，本發(fā)明的酶很可能具有比已知的酶更高的底物特異性。(2)最佳溫度和穩(wěn)定溫度本發(fā)明的酶在約40℃下發(fā)揮作用。在pH7貯存1小時的條件下，在溫度高達(dá)30℃時其幾乎不失活，但是在40℃時活性喪失約40％。在50℃時，該蛋白酶迅速失活以致活性在約15分鐘內(nèi)完全喪失。因此，本發(fā)明的酶被稱為嗜冷酶，其在低溫下顯示出有效的催化作用。(3)最佳pH和穩(wěn)定pH范圍本發(fā)明的酶具有7.5的最佳pH。此外，在20℃貯存1小時的條件下，其在pH6.0-10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。由此，該酶是中性蛋白酶，其在極端酸性或者堿性范圍中將不起作用。并且在極端酸性或者堿性范圍下貯存時其會失活。(4)分子量在用SDS-PAGE和凝膠過濾法測定時，本發(fā)明的酶具有約38kDa的分子量。(5)等電點用等電點聚焦測定時，本發(fā)明的酶具有約4.5的等電點。(6)活性的抑制所述酶的蛋白酶活性不受苯甲基磺酰氟或碘乙酰胺抑制，但明顯地受乙二胺四乙酸、2，2-二吡啶基、檸檬酸或者草酸抑制。由此看出蛋白酶活性依賴于金屬離子，這表明本發(fā)明的酶是金屬蛋白酶。從蛋白酶活性受檸檬酸和草酸兩者之一抑制可認(rèn)為所述的活性依賴于鈣。此外，酶的活性明顯地受金屬離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Fe2+抑制，特別是明顯地受Ag+抑制。然而，它不受Mg2+或者Ca2+抑制。(7)酶反應(yīng)動力學(xué)對底物(如酪蛋白)濃度，本發(fā)明的酶顯示出Michaelis-Menten型反應(yīng)速率。隨著溫度的增加，Km值降低，Vmax值增加。此外，在10到40℃的范圍中，酶的Kcat值非常高。在過量底物存在下，酶通常受到抑制。然而，在本發(fā)明的酶的情況下，當(dāng)系統(tǒng)接近最佳作用溫度時Kcat值增加。因此，就不能觀察到可覺察的由分解產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制作用而言，所述的酶是有利的。從Lineweaver-Burk圖也可以相信，由溫度引起的抑制作用是一種復(fù)合形式的，即，溫度的影響是非競爭性抑制的，分解產(chǎn)物的影響是競爭性抑制的。酶的用途按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶在低溫范圍內(nèi)具有最佳溫度。這樣，對于本發(fā)明的嗜冷蛋白酶而言，在低溫下分解蛋白質(zhì)是可能的。例如，通過把本發(fā)明的蛋白酶摻入進(jìn)去垢劑組合物制備即使在低溫水中也可以使用的去垢劑。除了摻入本發(fā)明的嗜冷蛋白酶外，這種去垢劑組合物可以按照常規(guī)方法制備。簡言之，可以通過把本發(fā)明的蛋白酶與普通去垢劑組分，如去垢劑的表面活性劑、漂白劑或者助洗劑組合來制備。此外，按照本發(fā)明的嗜冷蛋白酶的酶反應(yīng)可以在低溫下進(jìn)行。這樣，即使反應(yīng)系統(tǒng)包括室溫下易揮發(fā)的有機溶劑，反應(yīng)也可以在所述有機溶劑不易揮發(fā)的低溫下進(jìn)行。而且，當(dāng)意欲通過按照本發(fā)明的蛋白酶改善食品質(zhì)量時，使用本發(fā)明的蛋白酶是有利的，因為在低溫下進(jìn)行可以有效地防止食品分解。此外，由于提供了按照本發(fā)明的蛋白酶，有希望在嗜冷細(xì)菌的生理機制和它們的應(yīng)用機制的研究上取得進(jìn)展。以下參照特定實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不受到這些實施例的限制。在這一部分中，除非有其它說明，用蛋白質(zhì)染色法和Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法定量測定蛋白質(zhì)，通過在280nm時的紫外范圍中的吸收測定層析過程中洗脫物的蛋白組份。此外，蛋白酶的活性按如下所述測定(a)用偶氮酪蛋白獲得的蛋白質(zhì)分解活性將一份0.05ml樣品酶溶液添加到0.3ml包含1％(W/V)偶氮酪蛋白(azocasein)的0.067M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，混合物在30℃下保持30分鐘。然后以6％三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在15分鐘之后，將反應(yīng)混合物在室溫14,000rpm下離心5分鐘。測定上清液在340nm的吸收率。酶活性以ACU(偶氮酪蛋白消化單位，指在340nm下每分鐘吸光率增加0.001)為基礎(chǔ)確定。(b)用改進(jìn)的Anson法獲得的蛋白質(zhì)分解活性將一份0.05ml樣品酶溶液添加到0.3ml包含1％(W/V)偶氮酪蛋白(azocasein)的0.067M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，混合物在30℃下保持30分鐘。然后以7.5％三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在30分鐘之后，將反應(yīng)混合物在室溫和14,000rpm下離心5分鐘。測定上清液在280nm的吸收率。酶活性以AU(改進(jìn)的Anson單位，指每分鐘產(chǎn)生1μmol量的酪氨酸)為基礎(chǔ)確定。實施例1(1)篩選新的細(xì)菌菌株在瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行新細(xì)菌菌株的分離。將鮭內(nèi)器官的分離樣品懸浮在生理鹽水中，將上清液用作貯存溶液。從貯存溶液制成102稀釋度。將貯存溶液和102稀釋液各0.2ml噴布在篩選瓊脂平板培養(yǎng)基上(3克/升聚蛋白胨(polypeptone)、10克/升酵母膏、10克/升酪蛋白鈉、0.2克/升MgSO4·7H2O、2.0克/升瓊脂，在9cm培養(yǎng)皿上)，于10℃培養(yǎng)3天。在已在瓊脂平板上生長的菌落中選擇生長良好的菌落，繼代培養(yǎng)并接種到瓊脂平板上供貯存。在瓊脂平板培養(yǎng)基上測定胞外酶活性。將分離的細(xì)菌菌株經(jīng)劃線接種到以上所述的篩選瓊脂平板培養(yǎng)基上，于10℃培養(yǎng)3天。然后將10％三氯乙酸溶液噴布到瓊脂平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長，通過清晰噬斑的存在確定蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌。(2)培養(yǎng)分離的細(xì)菌菌株和產(chǎn)生酶將從貯存培養(yǎng)基分離細(xì)菌接種到25ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(10克/升聚蛋白胨、10克/升內(nèi)提取物(endoextract)、0.2克/升MgSO4·7H2O、pH7.0，在100ml錐形瓶中)上，為了穩(wěn)定細(xì)菌的生長活性，在TAITECNR-80中在10℃和150rpm下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)48小時。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，將0.25ml預(yù)培養(yǎng)溶液接種到25ml產(chǎn)生酶的培養(yǎng)基(5克/升聚蛋白胨、2.5克/升酵母膏、5克/升酪蛋白鈉、0.2克/升MgSO4·7H2O，pH7.0，在100ml錐形瓶中)上。于10℃和150rpm下在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)-振蕩培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)基事先已在1.2kgf/cm2刻度(gauge)(121℃)下蒸汽滅菌15分鐘。將分離的細(xì)菌菌株貯存在瓊脂平板培養(yǎng)基中以便在10℃貯存。在2周到1個月之后繼代培養(yǎng)。(3)測定蛋白酶活性用離心(17,000×g，4℃，15分鐘)澄清以上步驟(2)獲得的培養(yǎng)液。把上清液用作粗酶溶液。通過偶氮酪蛋白的分解測定蛋白酶活性。將一份0.05ml的粗酶溶液添加到0.3ml包含1％(W/V)偶氮酪蛋白(pH7.0)的0.067M磷酸鹽溶液中，混合物在20℃下保持30分鐘。然后以6％三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，在15分鐘之后，在室溫和14,000rpm下離心反應(yīng)混合物5分鐘。用分光光度計(BeekmanDU640)測量上清液在340nm的吸收率。酶活性以ACU(偶氮酪蛋白消化單位，指在340nm下每分鐘吸收率增加0.001)為基礎(chǔ)確定。作為步驟(1)-(3)的結(jié)果，分離到具有蛋白酶活性的細(xì)菌菌株P(guān)104。該細(xì)菌菌株具有下表所示的蛋白酶活性。在表中，通過與分開的黃噬纖維菌菌株(Cytophagaxantha)IFO14972的生長相比較獲得所述菌株的生長速率。表2具有蛋白酶活性的細(xì)菌菌株實施例2P104的蛋白酶活性在0-60℃溫度范圍中用蛋白酶產(chǎn)生菌株P(guān)104測定溫度對酶活性的影響。也以相同的方式用SubtilisinCarlsberg(西格馬)(市售的得自地衣芽孢桿菌的蛋白酶)測定酶活性的溫度依賴性。結(jié)果在圖1中顯示，在圖1中，菌株P(guān)104的酶比活性以□表示，SubtilisinCarlsberg的酶比活性以Δ表示。菌株P(guān)104胞外蛋白酶(exoprotease)和SubtilisinCarlsberg的最佳溫度分別是40℃和60℃或更高。在溫度約20℃時，菌株P(guān)104的胞外蛋白酶保持最佳溫度時活性的40％或更高的蛋白酶活性，SubtilisinCarlsberg僅保持最佳溫度時的蛋白酶活性的約10％。此外，在10至40℃范圍中計算了這些胞外蛋白酶反應(yīng)的活化能。結(jié)果示于下表中表3</tables>實施例3由編碼16S核糖體RNA之DNA的堿基序列鑒別菌株P(guān)104將實施例2獲得的培養(yǎng)液取樣到1.5ml微量離心管中，經(jīng)離心收集細(xì)胞。抽提基因組DNA，以便經(jīng)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增編碼16S核糖體RNA之DNA的堿基序列。用Sanger法與供鑒別的GenBank數(shù)據(jù)庫比較確定堿基序列。使用的引物列于以下，1F-Link和5R-Link用于PCR。引物1F-Link5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAGTITGATCATGGCTCAG-3’3R-Link5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGTCAATTCATTTGAGTT-3’3F-Link5′-TGTTAAACGACGGCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA-3’5R-Link5′-TGTAAAACGACGGCCAGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA-3’。與GenBank數(shù)據(jù)庫比較的結(jié)果在下列表中顯示。在該表中，詢問代表來源于菌株P(guān)104的16S核糖體RNA基因，對象代表比目魚黃桿菌S16核糖體RNA(FVBRR16SH)。結(jié)果細(xì)菌菌株被鑒別為比目魚黃桿菌。由此該菌株被稱為比目魚黃桿菌P104。(a)使用引物1F-Link等同性＝185/204(90％)，陽性＝185/204(90％)詢問1GATGAACGCTAGCGGGAGGC:::::::::::::::::::對象31GATNAACGCTAGCCGGAGGC詢問21CTAACACATGCAAGCCGAGC::::::::::::::::::::對象51CTAACACATGCAAGCCGAGC詢問41GGTATTTGTCTTTCGGGACA::::::::::::對象71GGTATAGATTCTTCGGAATC詢問61GAGAGAGCGGAGTACGGGTG對象91TAGAGAGCGGCGTACGGGTG詢問81CGGAACACGTGTGCAACCTA對象111CGGAACACGTGTGCAACCTA詢問101CCTTTATCAGGGGGATAGCC:::::::::::::::::::對象131CCNTTATCAGGGGGATAGCC詢問121TTTCGAAAGGAAGATTAATA::::::::::::::::::::對象151TTTCGAAAGGAAGATTAATA詢問141CCCCATAATATATTGATTGG::::::::::::::::::對象171CCCNATAATATATTGACTGG詢問161CATCAGTTACTATTGACAAC::::::::::::::::對象191CATCAGTCGATATTGAAAAC詢問181TCCGGTGGATAGAGATGGTC:::::::::::::::::::對象211TCCGGTGGATAGAGATGGGC詢問201ACGC::::對象231ACGC(b)使用引物3F-Link等同性＝208/330(63％)，陽性＝208/330(63％)詢問1GATATTACTTAGAACACCAA::::::::::::::::::::對象695GATATTACTTAGAACACCAA詢問21TTGCGAGGGANGTTCACTAT::::::::::::::::對象715TTGCGAAGGCAGGTCACTAT詢問41GTNTNACCTGATGCNGATGN::::::::::::::對象735GTTTTAACTGACGCTGATGG詢問61CCGAAAGTGNGNTGAGTGAA::::::::::::::對象755ACGAAAGCGTGGGGAGCGAA詢問81CAGGATTAGTTNCCATGGTC::::::::::::::::對象775CAGGATTAGATACCCTGGTA詢問101GNCCACGNCGTNCACNATNT::::::::::::對象795GTCCACGCCGTAAACGATGC詢問121TATCTCGNTTNTGGGATTAN::::::::::::::對象815TAACTCGTTTTTGGGCTTTA詢問141NAGTNCAGCGAGTAACANAG:::::::::::對象835GGGTTCAGAGACTAAGCGAA詢問161AGTNGTATGNNAGNCACCNG::::::::::::對象845AGTGATAAGTTAGCNACCTG詢問181NCGNGTCNGTTCGCAGGTTT::::::::::::對象865GGGAGTACGTTCGCAAGAAT詢問201CGAANTCAGCNTCCTGGCGG::::::::對象885GAAACTCAAAGGAATTGACG詢問201NTGGCCNNTACACNCTGTGN:::::::::對象905GGNNCCNGCACAAGCGGTGG詢問221TTTATATNGTNTAANGCGTT::::::::::::對象925ATTATGTGGTTTAATTCGAT詢問241NATNCNAGAGGGTCCTNACC:::::::::::::對象945GATACGCGAGGAACCTTACC詢問261ANGNTTNNTTNGGGTCNTCC:::::::對象965AAGGCTTAAATGGGAATTGA詢問281CAGCCTTCGTCTNTACTTGT::::::::對象985CAGGTTTAGAAATAGACTTT詢問301GNTTCGGACA::::::::對象1005TCTTCGGACA(c)使用引物3R-Link等同性＝128/162(79％)，陽性＝128/162(79％)詢問162TTNTTGGGNATAANAGGGNC:::::::::::::對象552TTTATTGGGTTTAAAGGGTC詢問142CNTCNGCGGACCTGTAAATC::::::::::::::::對象572CGTAGGCGGATCTGTAAGTC詢問122ATTGGTGATATCTCAGAGCC::::::::::::::::對象592AGTGGTGAAATCTCATAGCT詢問102TGTCTATGGGACTACCATTG:::::::::::::::對象612TAACTATGAAACTGCCATTG詢問82ATGCTCCAGGTCATGAGTCT:::::::::::::::對象632ATACTGCAGGTCTTGAGTAA詢問62AGCAGGAGTGGCTGGAATAA::::::::::::::::::對象652AGTAGAAGTGGCTGGAATAA詢問42GTACTGTAACGGTGTAATGC:::::::::::::::::對象672GTAGTGTAGCGGTGAAATGC詢問22ATAGATATTACTCAGAACCC::::::::::::::::::對象692ATAGATATTACTTAGAACAC詢問2CA::對象712CA(d)使用引物5R-Link等同性＝237/273(86％)，陽性＝237/273(86％)詢問273CCGGTACNCCTTGGGCCACA:::::::::::::::::對象1193CCCTTACGCCTTGGGCCACA詢問253CACGTAATACAATGNCAAGN:::::::::::::::::對象1213CACGTAATACAATGGCCAGT詢問233ACAGAGNGTAGCNACCAGNC:::::::::::::::::對象1233ACAGAGGGCAGCTACCAGGC詢問213GNCTGGATGCGAATCTCGAA:::::::::::::::::::對象1253GACTGGATGCGAATCTCGAA詢問193ANCTGCNCTCAGANCGGANT:::::::::::::::對象1273AGCTNGNCTCAGTTCGGATT詢問173GGAGTCTGCAACTCGACTCT::::::::::::::::::::對象1293GGAGTCTGCAACTCGACTCT詢問153ATGAAACTGGATNCGCTAGT:::::::::::::::::對象1313ATGAAGCTGGAATCGCTAGT詢問133AATCGCATATCAGNCATGAT:::::::::::::::::::對象1333AATCGCATATCAGCCATGAT詢問113NCGGTGAANACGTTGCCNGG::::::::::::::::對象1353GCGGTGAATACGTTCCCNGG詢問63CCTTGNAAACACCGCCCGTC:::::::::::::::::對象1373CCTTGTACACACCGCNCGTC詢問73AACCCATGGAAGTTTGGGGT:::::::::::::::::::對象1393AAGCCATGGAAGTTTGGGGT詢問53ACCTGNAGTCGGTGACCGTA:::::::::::::::::::對象1413ACCTGAAGTCGGTGACCGTA詢問33ACNGGACCTNCCTAGGGTAN::::::::::::::::對象1433ACAGGAGCTGCCTAGGGTAA詢問13NACAAGTAACTAG::::::::::::對象1453AACAAGTAACTAG實施例4培養(yǎng)比目魚黃桿菌P104(1)測定細(xì)菌細(xì)胞的密度用生理鹽水稀釋實施例2獲得的培養(yǎng)液，以使在細(xì)胞計數(shù)池中包含0-5個細(xì)胞。用光學(xué)顯微鏡計數(shù)細(xì)胞。在660nm經(jīng)光譜法測定培養(yǎng)稀釋液的濃度以獲得細(xì)胞和濃度之間的關(guān)系。以下方程式代表濁度和比目魚黃桿菌P104細(xì)菌細(xì)胞濃度之間的關(guān)系(細(xì)胞/ml)＝1.13×109×Abs.660nm其中1.13×109是從校準(zhǔn)曲線獲得的因子。(2)pH的影響在5至9范圍內(nèi)的蛋白酶產(chǎn)生培養(yǎng)基的各種pH下培養(yǎng)細(xì)菌菌株，以確定起始pH對胞外蛋白酶活性和其產(chǎn)生的影響。結(jié)果在圖2中顯示。在堿性pH中，增殖明顯降低，蛋白酶活性也降低。然而，在酸性pH范圍中觀察到增殖或蛋白酶活性的明顯不同。在中性pH范圍中細(xì)菌菌株增殖良好，并且蛋白酶活性保持在最高水平上。(3)培養(yǎng)溫度的影響在10-30℃范圍內(nèi)的各種溫度下培養(yǎng)比目魚黃桿菌P104，以測定隨著培養(yǎng)的進(jìn)行胞外蛋白酶活性和增殖的增減。結(jié)果在圖3中顯示。雖然在10℃和20℃的溫度下細(xì)菌菌株生長良好，但在30℃的增殖速率是在10℃或20℃穩(wěn)定期的約一半。在20℃時，菌株表現(xiàn)出最高的增殖速率，所以培養(yǎng)的最佳溫度被認(rèn)為是約20℃。實施例5純化得自比目魚黃桿菌P104的蛋白酶(1)培養(yǎng)細(xì)菌菌株將從以下貯存細(xì)胞培養(yǎng)基獲得的分離的細(xì)菌菌株接種到25ml以下預(yù)培養(yǎng)基(在100ml錐形瓶中)中，于10℃TAITECNR-80中150rpm下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)48小時。通過接種0.25ml預(yù)培養(yǎng)液到在10ml錐形瓶中的以下常規(guī)培養(yǎng)基中，于10℃在150rpm下旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)溶液72小時。貯存培養(yǎng)基聚蛋白胨3g/l，酶提取物2.5g/l，酪蛋白鈉20g/l，MgSO4·7H2O0.2g/l，瓊脂20g/l，pH7.0預(yù)培養(yǎng)基聚蛋白胨3g/l，酶提取物2.5g/l，酪蛋白鈉1g/l，MgSO4·7H2O0.2g/l，pH7.0常規(guī)培養(yǎng)基聚蛋白胨3g/l，酶提取物2.5g/l，酪蛋白鈉5g/l，KH2PO4·7H2O3g/lMgSO4·7H2O0.2g/l，pH7.0在1.2kgf/cm2刻度(120℃)下，用高壓蒸汽高壓滅菌材料(例如培養(yǎng)基)15分鐘。將比目魚黃桿菌P104接種到瓊脂平板上，于10℃貯存，繼代培養(yǎng)2周至1個月。(2)純化蛋白酶(a)用硫酸銨鹽析經(jīng)離心(17,000×g15分鐘)使以上步驟(1)獲得的培養(yǎng)液澄清。將上清液用作酶溶液。將硫酸銨添加到粗酶溶液中，以使溶液含有飽和濃度50％的硫酸銨。緩慢攪拌1小時后，離心(17,000×g15分鐘)沉降溶液，給出0-50％飽和組份。25℃飽和濃度時，硫酸銨的添加量用作添加的硫酸銨的量。(b)凝膠過濾接著在HiLoad16/60Superdex200制備分級(prepgrade)柱上進(jìn)行凝膠過濾。所有柱層析中的操作都于4℃下用HiLoad系統(tǒng)50(FarmaciaBiotecCo.)作為層析系統(tǒng)進(jìn)行。通過在約60cm/小時的線速度下以至少3(400ml)到凝膠體積的比例流過20mMBis-Tris緩沖液(pH6.0)平衡HiLoad16/60Superdex200制備分級柱。將已用硫酸銨鹽析的樣品酶溶液的5ml組份裝載到具有Superloop的柱上。用20mMBis-Tris緩沖液(pH6.0)為洗脫液，以約60cm/小時的線速度洗脫柱，收集5ml組份。洗脫曲線在圖4中顯示。作為排阻極限，洗脫一種包含在培養(yǎng)液中的具有高分子量的透明黃色蛋白質(zhì)。作為具有280nm紫外吸收的后續(xù)組份，洗脫一種無色透明組份。附著在蛋白酶上的片段似乎被除去，因為在這一組份中存在蛋白酶活性。(c)柱層析接著用Q瓊脂糖凝膠HP柱進(jìn)行離子交換層析，由5個系列連接的HiTrapQ(1ml)柱組成的φ0.7×12.5cm柱用作層析柱。通過在約35cm/小時的線速度下以至少5(25ml)到凝膠體積的比例流過20mMBis-Tris緩沖液(pH6.0)平衡柱。將進(jìn)凝膠過濾洗脫的組份和具有蛋白酶活性的樣品酶溶液以約17.5cm/小時線性速度裝載到具有Superloop的柱上。用80ml具有添加到其中的1MNaCl的20mMBis-Tris緩沖液通過線性離子強度增加梯度(0-150mM)以約35cm/小時的線性速度洗脫柱，收集2ml組份。洗脫曲線在圖5中顯示。此外，以上描述的純化方法總結(jié)在下表中。表4蛋白酶純化總結(jié)實施例6蛋白酶純度和分子量測定(1)電泳(a)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用具有1mm厚度的10％聚丙烯酰胺凝膠。將20mA電流施用到凝膠上進(jìn)行電泳，直到溴酚藍(lán)(BPB)達(dá)到最下端。用具有溶解于其中的0.02％考馬斯亮藍(lán)R250的30％甲醇和10％乙酸的含水混合物染色凝膠板1小時，然后，用脫色劑(30％甲醇和10％乙酸)脫色過夜。用具有作為標(biāo)記的磷酸化酶、白蛋白、卵白蛋白、碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑和α-乳清蛋白經(jīng)SDS-PAGE測定所述蛋白酶分子量。SDS-PAGE的結(jié)果和校準(zhǔn)曲線在圖6和7中顯示出。所述酶顯示出單一帶，由此可認(rèn)為是單一的蛋白質(zhì)，而不是亞單位結(jié)構(gòu)。(b)凝膠過濾用Hiprep16/60聚丙烯酰胺葡聚糖S-100HR經(jīng)凝膠過濾法測定分子量。通過在約30cm/小時的線速度下以至少3(400ml)到凝膠體積的比例流過具有添加到其中的0.15MNaCl的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡柱。將1ml的樣品酶溶液裝載到柱上，用如上的相同的緩沖液以約3030cm/小時的線性速率洗脫，收集2ml組份。用白蛋白(67kDa)、卵白蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)，核糖核酸酶A(13.7kDa)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測定藍(lán)葡聚糖(BlueDextran)2000的排出體積。結(jié)果示于表8中。此外，記載各蛋白質(zhì)在280nm的紫外吸收值和酶活性。蛋白質(zhì)的紫外吸收曲線也顯示出在278nm的最大吸收(無可見吸收)。從這些觀察結(jié)果可以認(rèn)為所述蛋白質(zhì)具有測定其性質(zhì)合乎需要的純度。實施例7等電點聚焦用Phast系統(tǒng)(Farmacia-Biotec公司)進(jìn)行等電點聚焦。使用IEF3-9凝膠，將樣品裝載在距陽極3cm的點上。于15℃和410Vh時在2,000V，2.5mA的條件下進(jìn)行電泳。于20℃經(jīng)用20％TCA溶液固定染色凝膠平板5分鐘，用沖洗和脫色溶液(30％甲醇和10％乙酸)洗滌2分鐘。最終于50℃用具有溶解于其中的0.02％考馬斯亮藍(lán)R250的溶液沖洗和脫色10分鐘。BroadpICalibration試劑盒(Farmacia-Biotec公司)用作標(biāo)記。等電點聚焦的結(jié)果和校準(zhǔn)曲線顯示在圖9和圖10中。所述酶基本上被染色為具有pH4.5的等電點的單一帶。實施例8pH對酶反應(yīng)的影響在各種pH下用酶分解偶氮酪蛋白(azocasein)。反應(yīng)混合物中的緩沖液具有67mM的濃度，并且分別包括乙酸鹽緩沖液(pH4-4.5)、KH2PO4-NaH2PO4(pH6.0-8.0)、NaB4O7-HCl(pH8.0-9.0)、NaB4O7-NaOH(pH9.5-10)和Na2HPO4-NaOH(pH10.5-12.0)。結(jié)果示于圖11中。在最佳pH的pH7.5下的酶的相對反應(yīng)性在6.0到10.0的pH范圍內(nèi)被保持在約80％的水平上。由此發(fā)現(xiàn)所述酶在以中性pH為中心的相當(dāng)寬的范圍內(nèi)起作用。然而，在pH5.5或更低或者10.5或更高的范圍中所述酶的作用不令人滿意，在pH12時其被滅活，喪失蛋白酶活性。實施例9蛋白酶的pH穩(wěn)定性在具有含Econo-Pac(BioradCo.)的各種pH下測定酶。使用的緩沖溶液具有67mM的濃度，并且分別包括乙酸鹽緩沖液(pH4-5)、KH2PO4-NaH2PO4(pH6-8)、甘氨酸-NaOH(pH9-10)和Na2HPO4-NaOH(pH11-12)。結(jié)果示于圖12中。發(fā)現(xiàn)在20℃1小時的條件下，所述酶在6.0到10.0的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定。實施例10穩(wěn)定對酶反應(yīng)的影響在0到70℃的反應(yīng)溫度和各種pH下用酶分解偶氮酪蛋白。用市售的酶進(jìn)行類似的反應(yīng)，所述酶例如SubtilisinCarlsberg、V8蛋白酶(其是來源于StaphylococcusaurcubV8的蛋白酶)、Sabinase(Novonordisc)和Alkalase(Novonordisc)。由Kcat表示的結(jié)果(假定存在過量底物，因而酶都以酶-底物復(fù)合物的形式存在)在圖13中給出。在圖13中，□代表所述酶，◆代表V8蛋白酶，○代表SubtilisinCarlsberg，△代表Sabinase，代表Alkalase。發(fā)現(xiàn)所述酶具有在40℃的最佳溫度，在超過最佳溫度的酶反應(yīng)溫度下迅速失活。并且發(fā)現(xiàn)所有的市售蛋白酶具有50℃或更高的最佳溫度，在10到40℃的范圍內(nèi)，本發(fā)明的酶的Kcat值高于任何比較蛋白酶的。實施例11蛋白酶的溫度穩(wěn)定性在20到50℃的溫度范圍內(nèi)保持本發(fā)明的酶?；钚噪S時間的變化示于圖14中，其中□代表20℃的變化，◆代表30℃的變化，○代表40℃的變化，△代表50℃的變化。在20℃或者30℃酶幾乎不失活，但在40℃1小時后逐漸失活至20℃或30℃酶活性的約60％，在50℃約15分鐘迅速完全失活。本發(fā)明的酶被認(rèn)為對熱不穩(wěn)定，因為以上溫度低于在以前的實驗中使用的比較蛋白酶的最佳溫度。實施例12抑制劑的影響對絲氨酸蛋白酶起作用的苯甲基磺酰氟(PMSF)、對半胱氨酸蛋白酶起作用的碘乙酰胺(IAA)、對金屬蛋白酶起作用的乙二胺四乙酸(EDTA)、O-菲咯啉、2，2-二吡啶基，和特異性地作用于鈣的檸檬酸鹽與草酸鹽用作抑制劑。在各種濃度的抑制劑添加到酶反應(yīng)系統(tǒng)中后，在20℃保持1小時以檢測幸存的蛋白酶活性。結(jié)果在下表中顯示。表5抑制劑的影響</tables>所述酶的蛋白酶活性不被PMSF或者LA-A抑制，但是明顯地被EDTA，2，2-二吡啶基、檸檬酸鹽或者草酸鹽抑制。從這些觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述的蛋白酶活性是金屬離子依賴性的。由此，本發(fā)明的酶是金屬蛋白酶。從被檸檬酸鹽或草酸鹽抑制也可以認(rèn)為所述的蛋白酶活性依賴于鈣。實施例13蛋白質(zhì)變性劑的影響SDS和尿素用作蛋白質(zhì)變性劑。在添加各種濃度的蛋白質(zhì)變性劑后，將酶反應(yīng)系統(tǒng)在20℃保持1小時以檢測剩余的蛋白酶活性。有關(guān)SDS和尿素的結(jié)果分別顯示在圖15和16中。即使在相當(dāng)?shù)偷臐舛认拢龅鞍酌敢彩躍DS抑制，在0.25％SDS時被完全滅活。在高達(dá)2M濃度時，所述蛋白酶也不受尿素抑制，但被3M尿素抑制至約40％，被4M尿素完全滅活。實施例14金屬離子的影響AgNO3，CuSO4，ZnSO4，CoSO4，F(xiàn)eSO4，MnSO4，CaCl2和MgSO4用作金屬來源。在添加金屬鹽以保證最終濃度為1mM后，將酶反應(yīng)系統(tǒng)在20℃保持1小時以檢測剩余的蛋白酶活性。結(jié)果在下列表中顯示。表6金屬離子的影響<>本發(fā)明的酶被Ag2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Fe2+深度抑制。當(dāng)被Ag2+抑制時，以上僅10％的蛋白酶活性被保留。本發(fā)明的酶一點也不被Mg2+或Ca2+抑制。實施例15底物特異性酪蛋白(Hammarsten)、二甲基酪蛋白、明膠、血紅蛋白、牛血清白蛋白和核糖核酸酶用作底物蛋白質(zhì)，以便經(jīng)改進(jìn)的Anson方法測定蛋白酶解活性。偶氮酪蛋白和偶氮白蛋白用作偶氮蛋白修飾蛋白質(zhì)。結(jié)果在下表中顯示。表7底物特異性</tables>本發(fā)明的酶很好地分解高分子蛋白質(zhì)和變性蛋白質(zhì)如酪蛋白和二甲基酪蛋白，也分解作為膠原變性蛋白質(zhì)的明膠(以酪蛋白為基礎(chǔ)的約50％)。酶幾乎不作用于其它的天然蛋白質(zhì)，特別是它不作用于核糖核酸酶上。實施例16與酪蛋白的酶反應(yīng)動力學(xué)用包含0.05-1％酪蛋白(作為底物)的溶液獲得在5到40℃的各種溫度下的Lineweaver-Burk圖。該圖示于圖17中，其中上圖(A)說明在0到2.0的范圍中1/v值的改變，下圖(B)說明在0到0.2的范圍中1/v值的改變。在該圖中，□代表5℃的曲線，◇代表10℃的曲線，○代表20℃的曲線，△代表30℃的曲線，代表40℃的曲線。酶反應(yīng)動力常數(shù)從Lineweaver-Burk圖獲得，如下表所示。表8底物特異性從上表可以明顯看出，所述酶對酪蛋白濃度表現(xiàn)出Michaelis-Mentne型反應(yīng)速率。隨著溫度的增加，Km值降低，Vmax值增加。在5℃和10℃時，在高濃度酪蛋白中，酶活性被抑制。一般來說，在過量底物濃度中酶傾向于受到抑制。然而，在增加的反應(yīng)溫度下，在1％酪蛋白中，所述酶不被抑制。這被認(rèn)為是由于Kcat值增加至接近最佳溫度和酪蛋白分解產(chǎn)物小的抑制作用。從Lineveaver-Burk圖也可以認(rèn)為溫度的抑制方式是混合型的。即，認(rèn)為溫度的影響是非競爭性的或者非競爭性抑制，酪蛋白分解產(chǎn)物的影響是競爭性抑制。權(quán)利要求1.一種嗜冷蛋白酶，該蛋白酶具有下列理化性質(zhì)-特異性活性和底物特異性其作用于酪蛋白和二甲基酪蛋白并分解它們但不作用于核糖核酸酶；-最佳溫度其具有在約40℃的最佳作用溫度；和-溫度穩(wěn)定性在pH7貯存1小時的條件下，在溫度最高達(dá)到30℃時其幾乎不失活，但是在40℃時活性喪失約40％。在50℃時，其迅速失活以致活性在約15分鐘內(nèi)完全喪失。2.如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶，該蛋白酶還具有下列理化性質(zhì)-最佳pH其在pH7.5時具有最佳作用；和-穩(wěn)定的pH范圍在20℃貯存1小時的條件下，其在pH6.0-10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。3.如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶，其中所說的蛋白酶在用SDS-PAGE和凝膠過濾法測定時具有約38kDa的分子量。4.如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶，其中所說的蛋白酶在用等電點聚焦測定時具有約4.5的等電點。5.一種屬于比目魚黃桿菌(Flavobacteriumbalustinum)的分離的微生物，該微生物能夠產(chǎn)生如權(quán)利要求1至4之任一所要求的蛋白酶。6.如權(quán)利要求5所要求的屬于比目魚黃桿菌的分離的微生物，其中所說的微生物優(yōu)選地在10至20℃的范圍內(nèi)生長。7.如權(quán)利要求5所要求的屬于比目魚黃桿菌的分離的微生物，該微生物是比目魚黃桿菌P104(FERMBP-5006)。8.一種制備嗜冷蛋白酶的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求5所要求的比目魚黃桿菌，和從培養(yǎng)物中收集如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶。9.一種制備嗜冷蛋白酶的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求6所要求的比目魚黃桿菌，和從培養(yǎng)物中收集如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶。10.一種制備嗜冷蛋白酶的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求7所要求的比目魚黃桿菌，和從培養(yǎng)物中收集如權(quán)利要求1所要求的嗜冷蛋白酶。全文摘要本文公開了新的嗜冷蛋白酶和具有嗜冷蛋白酶產(chǎn)生能力的微生物。作用于并分解酪蛋白和二甲基酪蛋白但不作用于核糖核酸酶的所述蛋白酶具有約40℃的最佳溫度。在pH7貯存1小時的條件下,在溫度高達(dá)30℃時其幾乎不失活,但是在40℃時活性喪失約40%。在50℃時,該蛋白酶迅速失活以致活性在約15分鐘內(nèi)完全喪失。本文也公開了具有該蛋白酶產(chǎn)生能力的比目魚黃桿菌。文檔編號C12N1/20GK1181108SQ96193145公開日1998年5月6日申請日期1996年2月16日優(yōu)先權(quán)日1995年2月17日發(fā)明者民谷榮一申請人:普羅格特-甘布爾公司