專利名稱：包含熱敏性轉(zhuǎn)基因的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該技術(shù)涉及來源于嗜冷細菌的基因，用于熱敏性疫苗的開發(fā)。在一個實例中，所述技術(shù)涉及含有冷紅科爾韋爾氏菌(Colwellia psychrerythraea)、河豚毒素假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)和冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)的熱敏性基因IigA以及冷紅科爾韋爾氏菌的基因ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt和dnaK的重組病原體。
背景技術(shù)：
抗細菌和病毒疾病的疫苗在減少人的傳染病中已經(jīng)起到了重要作用；然而，仍然存在對用于減少目前全世界的傳染病負擔的新型疫苗的需要。適冷病毒已被用作抗人病毒疾病的疫苗達數(shù)十年。這類疫苗的最廣為人知的實例是Sabin脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗。另一實例是名為FIulVIist* (Medimmune LLC, Gaithersburg, MD, USA)的適冷流感疫苗,其在2003年引入美國,,F丨uMist 已被證明在某些人口統(tǒng)計組中比實施使用滅活病毒來刺激免疫反應的更常見免疫接種策略的流感疫苗有效得多。通常，已經(jīng)通過在低溫下將病毒在卵中或細胞培養(yǎng)物中反復傳代然后測試其后代能否在高于約37°C (通常被認為“正常”人體溫度)下生長而開發(fā)出適冷的或“溫度敏感性”(TS)病毒株。“正?！比梭w溫度的概念考慮解剖學位點、個體差異、性別、生理條件和環(huán)境溫度。盡管存在若干變量，然而人體僅可在一個非常窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)揮功能，其通常為約36° C-39° C。如果人體內(nèi)部溫度下降到約35°C，那么必須使身體暖和，否則會造成死亡。不管環(huán)境溫度和穿著衣物如何，皮膚溫度總是低于身體體核(body core)的溫度。在適宜溫度下(例如21°C)，皮膚的溫度為約32° C-35° C。本領(lǐng)域技術(shù)人員認為，細菌通常具有一組約100到150個對維持細菌生活力絕對必需的基因，稱為“必需基因”。由于必需基因的性質(zhì)，鑒定必需基因是困難的，因為敲除這些基因會導致生物體的死亡。必需基因編碼蛋白，所述蛋白由在幾乎全部細菌種屬之間高度保守的氨基酸序列構(gòu)成。這種保守性很可能反映了在不同種間這些蛋白的共同功能和結(jié)構(gòu)。選定數(shù)量的必需基因已被證明能夠置換另一細菌種中的同源物，在某些情況下這些置換來自關(guān)系較遠的細菌種。氨基酸序列的保守性在細菌中廣泛存在，嗜冷生物和嗜熱生物的必需基因的推定氨基酸序列顯示出與其嗜溫對應物的高度同一性。微生物學家通常使用條件致死突變(例如TS突變)來鑒定必需基因。許多細菌種在傳染病的全世界負擔中起到重要作用。然而，結(jié)核病的致病因素可能是由細菌傳染病引起的人發(fā)病率和致死率的最顯著因素。盡管幾十年來一直使用卡介苗(BCG)來預防結(jié)核病，然而其低的效能已不能將結(jié)核病的發(fā)生率降低至可接受的水平。

發(fā)明內(nèi)容
本公開提供了用于改造、生產(chǎn)和使用熱敏性宿主微生物細胞的方法。在一個實例中，重組病原體含有例如使用同源重組插入的熱敏性必需基因。“嗜冷生物”是適用于這樣的生物的術(shù)語，即所述生物在低溫例如<20°C下機能最佳。在冰冷海水特別是北極和南極海域中生活的細菌是嗜冷細菌的實例。嗜冷細菌中的酶和其他蛋白在冰冷環(huán)境中的機能好于其在嗜溫細菌中的同源對應物。許多來自嗜冷細菌的酶易于變性的溫度比影響所述酶的嗜溫對應物的溫度低得多。據(jù)推測，嗜冷酶的溫度敏感模式可擴展至必需基因的產(chǎn)物。本發(fā)明提供了鑒定和操作具有所需TS特性的嗜冷必需基因的方法。可使用體外和體內(nèi)重組技術(shù)。土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)是動物傳染病土拉菌病的病原體。其可通過多種途徑感染多種動物，并通常感染網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)器官中的來源于單核細胞的細胞并在其中生長。一種密切相關(guān)的細菌一新兇手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)——具有土拉弗朗西斯菌的許多特性，并且，除此之外，還非常適于許多遺傳操 作包括基因置換。新兇手弗朗西斯菌的病理生理學和遺傳特性使其適合研究基因置換對病原菌的作用。新兇手弗朗西斯菌是最大生長溫度為約45°C的嗜溫生物。本公開內(nèi)容還提供了用于確定兩種細菌株的最大生長溫度及其在限制溫度下的生長特性的方法。所測試的重組細菌株會在低于所述限制溫度的溫度下生長，但不會在高于所述限制溫度的溫度下生長。當將編碼必需基因的嗜冷必需等位基因插入到溫度低于人體體核溫度的哺乳動物身體區(qū)域(例如皮膚)中后，所述重組病原細菌將具有快速生長從而誘發(fā)免疫反應的能力。當所述病原性重組細菌遷移到溫度更高的人體體核的器官中時，它們會死亡并且不能傷害宿主。本公開內(nèi)容提供了從嗜冷細菌分離的溫度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子與示于 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、22、23 或 24 中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。在某些實例中，所述嗜冷細菌在約-10°C到約30°C的溫度下是能行使功能(operable)的，但是在高于約30°C的溫度下是不能行使功能(operable)的。本公開內(nèi)容還提供了包含這類來自嗜冷細菌的溫度敏感性必需核酸分子的載體和重組宿主細胞(例如重組細菌宿主細胞)。還公開了包含這類重組宿主細菌(例如活細胞或被殺死的細胞)的免疫原性組合物。本公開內(nèi)容還提供了由所公開的分離的溫度敏感性必需核酸分子編碼的分離蛋白，例如與示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、27或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的蛋白。本公開內(nèi)容提供了制備溫度敏感性微生物宿主細胞(例如重組宿主細胞)的方法。在一個實例中，所述方法包括將核酸構(gòu)建體引入嗜溫細菌株的基因組中(例如通過插入、置換或替換)，其中所述核酸構(gòu)建體包含來自嗜冷細菌株的溫度敏感性必需核酸分子以及與所述溫度敏感性必需核酸分子可操作地連接的一個或多個控制序列，其中由所引入的溫度敏感性必需核酸分子編碼的溫度敏感性必需肽在低于約30°C的溫度下是能行使功能的(例如有功能的)，在高于約30°C的溫度下是不能行使功能的(例如無功能的)。在某些實例中，所述方法還包括在其中所述溫度敏感性必需肽能行使功能的溫度下培養(yǎng)所述溫度敏感性微生物宿主細胞,藉此所述微生物宿主細胞產(chǎn)生多種肽；將培養(yǎng)溫度升高至所述溫度敏感性肽不能行使功能的溫度；維持所述培養(yǎng)一段足夠長的時間以殺死所述溫度敏感性微生物宿主細胞；以及收獲所述被殺死的溫度敏感性微生物宿主細胞。本公開內(nèi)容提供了用于使用所公開的核酸分子、蛋白和重組宿主細胞在受試者中產(chǎn)生對細菌的免疫反應的方法。在一個實例中，所述方法包括給予所述受試者治療有效量的溫度敏感性細菌，其中所述溫度敏感性細菌表達來自嗜冷細菌株的溫度敏感性必需核酸分子，藉此誘發(fā)對所述細菌的免疫反應。所述方法可用于預防或治療細菌感染(例如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、沙門氏菌(Salmonella)或弗朗西斯菌(Francisella)感染)。根據(jù)以下參照附圖進行的對幾個實施方案的詳細描述，本公開內(nèi)容的上述和其他特征會變得更加明了。


圖Ia是流程圖，示出了使用聚合酶鏈式反應(PCR)的示例性方法；圖Ib是示意圖，示出了顯示導致基因置換的DNA整合-切除事件的示例性方法。圖2a是示意圖，示出了野生型(wt)新兇手弗朗西斯菌IigA基因的正常存在于染色體中的序列；圖2b是示意圖，示出了依照本公開內(nèi)容的示例性方法進行的到所述新兇手弗朗西斯菌染色體中的IigAep基因置換；圖2c是示意圖，示出了依照本公開內(nèi)容的示例性方法進行的到所述新兇手弗朗西斯菌染色體中的IigAsf基因置換；圖2d是示意圖，示出了依照本公開內(nèi)容的示例性方法進行的到所述新兇手弗朗西斯菌染色體中的IigAph基因置換；圖2e是示意圖，示出了依照本公開內(nèi)容的示例性方法進行的到所述新兇手弗朗西斯菌染色體中的IigAph2基因置換。圖3a的曲線圖示出了在30° C下wt新兇手弗朗西斯菌以及用冷紅科爾韋爾氏菌IigAcp基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖313的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到33° C時，用冷紅科爾韋爾氏菌IigAep基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖3c的曲線圖示出了 3. 5小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到34° C時，用冷紅科爾韋爾氏菌IigAcp基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖3d的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到35° C時，用冷紅科爾韋爾氏菌IigAcp基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖3e的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到37° C時，用冷紅科爾韋爾氏菌IigAcp基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線。圖4a的曲線圖示出了在30° C下wt新兇手弗朗西斯菌以及用冷海希瓦氏菌IigAsf基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖仙的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到33° C時，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖4c的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到35° C時，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖4d的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到37° C時，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線。
圖5a的曲線圖示出了在30° C下wt新兇手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替單胞菌IigAph基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖5匕的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到33° C時，用河豚毒素假交替單胞菌IigAph基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖5c的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到35° C時，用河豚毒素假交替單胞菌IigAph基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖5d的曲線圖示出了 2小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到37° C時，用河豚毒素假交替單胞菌IigAph基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線。圖6a的曲線圖示出了在21° C下wt新兇手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替單胞菌IigAph2基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖6匕的曲線圖示出了 2小時后溫度從21°C轉(zhuǎn)換到26° C時，用河豚毒素假交替單胞菌IigAph2基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖6c的曲線圖示出了 2小時后溫度從21°C轉(zhuǎn)換到28° C時，用河豚毒素假交替單胞菌 IigAph2基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線；圖6d的曲線圖示出了 2小時后溫度從21°C轉(zhuǎn)換到30° C時，用河豚毒素假交替單胞菌IigAph2基因置換新兇手弗朗西斯菌中同源物的新兇手弗朗西斯菌和wt新兇手弗朗西斯菌的生長曲線。圖7的曲線圖示出了在33°C下生長至對數(shù)生長后期后，在37°C下野生型新兇手弗朗西斯菌和新兇手弗朗西斯菌-IigAep培養(yǎng)物的生活力下降。圖8是數(shù)字圖像,示出了鼠傷寒沙門氏菌(S. ser. Typhimurium)-ligACP在30°C下生長以及在37°C下不能生長。圖9a的曲線圖不出了在30°C下wt恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和恥垢分枝桿菌-IigAcp的生長曲線，圖9b的曲線圖示出了在4小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到35° C時，恥垢分枝桿菌-IigAep和wt恥垢分枝桿菌的生長曲線，圖9c的曲線圖示出了在4小時后溫度從30°C轉(zhuǎn)換到37° C時，恥垢分枝桿菌-IigAep和wt恥垢分枝桿菌的生長曲線。圖IOa-IOd是一系列曲線圖，顯示了由TS新兇手弗朗西斯菌株誘發(fā)的保護性免疫。圖11A-11L顯示了本文公開的序列，其中加下劃線的部分是新兇手弗朗西斯菌序列。序列表所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸的三字母代碼表示的。每個核酸序列只顯示一條鏈，但是應理解對所示鏈的任何提及包括其互補鏈。SEQ ID NO: I是IigAep雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO:2是推定的IigAcp雜合蛋白的689氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是IigAph雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO:4是推定的IigAph雜合蛋白的673氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是IigAph2雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO:6是推定的IigAph2雜合蛋白的673氨基酸序列。SEQ ID NO:7是IigAsf雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO:8是推定的IigAsf雜合蛋白的670氨基酸序列。SEQ ID NO:9是PyrGcp雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO: 10是推定的PyrGcp雜合蛋白的545氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是IiemCcp雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO: 12是推定的HemCcp雜合蛋白的317氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13是Antep雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO: 14是推定的Fmtcp雜合蛋白的327氨基酸序列。SEQ ID NO: 15是HiurGcp雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO: 16是推定的MurGcp雜合蛋白的387氨基酸序列。SEQ ID NO: 17是對結(jié)核分枝桿菌優(yōu)化的密碼子優(yōu)化的IigAep的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO: 18是推定的密碼子優(yōu)化的LigAep雜合蛋白的689氨基酸編碼序列，其中前4個密碼子變?yōu)榻Y(jié)核分枝桿菌形式。SEQ ID NO: 19是(InaKep雜合基因的全長核酸編碼序列。SEQ ID NO:20是推定的DnaKep雜合蛋白的638氨基酸序列。SEQ ID NO: 21和22分別是來自冷紅科爾韋爾氏菌的必需基因tyrS的全長核酸編碼序列(正常字體，大寫)以及相應的氨基酸序列。SEQ ID NO:23和24分別是來自冷紅科爾韋爾氏菌的必需基因cmk的全長核酸編碼序列(正常字體，大寫)以及相應的氨基酸序列。如圖IlJ所示，新兇手弗朗西斯菌序列加下劃線示出。在核酸和氨基酸序列中加下劃線的部分均對應新兇手弗朗西斯菌序列?！拔醇酉聞澗€的”是冷紅科爾韋爾氏菌序列。在氨基酸序列中，在末端沒有加下劃線的氨基酸，因為新兇手弗朗西斯菌序列起始自終止密碼子。SEQ ID NO: 25和26分別是來自冷海希瓦氏菌的必需基因dnaKsf的全長核酸編碼序列(正常字體，大寫)以及相應的氨基酸序列。如圖IlK所示，新兇手弗朗西斯菌序列加下劃線示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下劃線的部分均對應新兇手弗朗西斯菌序列。“未加下劃線的”顯示了冷海希瓦氏菌序列。希瓦氏菌和弗朗西斯菌的起始處的氨基酸序列(MGK)是相同的，因此加雙下劃線示出。氨基酸序列末端處的單下劃線對應新兇手弗朗西斯菌序列。SEQ ID NO:27和28分別是來自冷紅科爾韋爾氏菌的必需基因ftsZ的全長核酸編碼序列(正常字體，大寫)以及相應的氨基酸序列。如圖IlL所示，新兇手弗朗西斯菌序列加下劃線示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下劃線的部分均對應新兇手弗朗西斯菌序列。“未加下劃線的”部分是冷紅科爾韋爾氏菌序列。5’ -末端(N-末端)處有延伸的新兇手弗朗西斯菌區(qū)。
具體實施例方式提供以下對術(shù)語和方法的解釋以更好地描述本公開內(nèi)容。除非上下文另外清楚地指出，否則單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”均指一個或多于一個。例如，術(shù)語“包含核酸分子”包括單個或多個核酸分子并被認為等同于短語“包含至少一個核酸分子”。除非上下文另外清楚地指出，否則術(shù)語“或”是指所稱可替代要素的單個要素或者兩個或多個要素的組合。本文所用的“包括”是指“包含”。因此，“包括A或B”是指“包含A、B或者A和B”，而不排除額外的要素。下面描述用于實施和/或測試本公開內(nèi)容的實施方案的合適的方法和材料。所述方法和材料僅為示例而非意圖進行限制。可使用與本文所述的那些類似或等同的其他方法和材料。例如，所公開的發(fā)明所屬領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法記載于多篇一般性和更具體的參考文獻中，包括例如 Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrook et al.，MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Press,2001 ；Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates,1992 (and Supplements to 2000) ；Ausubel et al., Short Protocols inMolecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, 4th ed. , Wiley &Sons,1999 ；Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 ；以及 Harlow and Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。本文引用的參考文獻以引用的方式納入本文。為方便對本公開內(nèi)容的各個實施方案的閱讀，提供了以下對具體術(shù)語的解釋。除非另外指出，否則技術(shù)術(shù)語依照本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)用法使用。佐劑用于增強抗原性——例如含有本文公開的TS必需嗜冷細菌序列的重組宿主細菌的抗原性——的溶劑(vehicle)。佐劑包括上面吸附有抗原的礦物質(zhì)(例如茂、氫氧化鋁或磷酸鹽)的懸浮液；或抗原溶液在礦物油中被乳化的油包水乳液(弗氏不完全佐齊U);有些時候還包含被殺死的分枝桿菌(弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬細胞的流入)。免疫刺激寡核苷酸(例如包含CpG基序的那些)也可用作佐劑(例如參見美國專利 No. 6，194，388 ；No. 6，207，646 ；No. 6，214，806 ；No. 6，218，371 ；No. 6，239，116 ；No. 6，339，068 ；No. 6，406，705 和 No. 6，429，199)。佐劑包括生物分子(“生物佐劑”)，例如共刺激分子。示例性佐劑包括IL-2、RANTES, GM-CSF, TNF- a、IFN- y、G-CSF,LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 4IBBL。給藥通過所選途徑將組合物(例如免疫原性組合物)引入受試者(例如哺乳動物，例如人)。給藥的示例性途徑包括但不限于局部、注射(如皮下、肌肉、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)和靜脈注射)、口服、舌下、直腸、透皮、鼻內(nèi)、陰道和吸入途徑。緩解疾病和病理狀態(tài)(例如細菌感染)由于所述治療的作用的改善。有益效果可由例如以下表現(xiàn)證明在疑似受試者中的疾病臨床癥狀的延遲發(fā)作，所述疾病的某些或全部臨床癥狀的嚴重程度的減輕，所述疾病發(fā)展的減慢，受試者的整體健康或康樂的改善，或者對具體疾病特異性的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他參數(shù)。動物一類包括哺乳動物和鳥類的活的多細胞脊椎動物生物。術(shù)語“哺乳動物”包括人和非人哺乳動物。類似地，術(shù)語“受試者”包括人和畜受試者(例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、馬和牛)。
抗體包含至少一個輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體，所述可變區(qū)特異性地識別并結(jié)合抗原表位?？贵w由重鏈和輕鏈構(gòu)成，各自均具有可變區(qū)，稱為重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(\)。所述VHg和八區(qū)一起負責結(jié)合被抗體識別的抗原?？贵w包括完整的免疫球蛋白，以及本領(lǐng)域中公知的抗體的變體和部分,例如Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過接頭結(jié)合的融合蛋白，而在dsFv中,所述鏈已被變異以引入二硫鍵來穩(wěn)定所述鏈的締合。通常，天然存在的免疫球蛋白具有通過二硫鍵相互連接的重(H)鏈和輕(L )鏈。存在兩種類型的輕鏈，lambda ( A )和kappa ( k )。決定抗體分子功能活性的重鏈主要有5類(或同種型)IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE?！疤禺愋越Y(jié)合”是指個體的抗體——相對于與無關(guān)蛋白(例如非細菌蛋白)的結(jié)合——與抗原(例如細菌抗原)發(fā)生特異性免疫反應的能力。所述結(jié)合是抗體分子與T細胞表面分子的抗原決定簇之間的非隨機結(jié)合反應。所需的結(jié)合特異性通常是由所述抗體差別結(jié)合T細胞表面分子和無關(guān)抗原并因此區(qū)分兩種不同的抗原(特別是當所述兩種抗原具有獨特的表位時)的能力的參考點決定。特異性結(jié)合具體表位的抗體稱為“特異性抗體”。在某些實例中，抗體與標靶(例如細菌蛋白)以較對樣本或受試者中其他分子的結(jié)合常數(shù)大至少IO3M-1UO4M-1或IO5M4的結(jié)合常數(shù)特異性結(jié)合。在某些實例中，抗體或其片段具有InM或更小的平衡常數(shù)(Kd)。例如，抗體與靶標(例如細菌蛋白)以至少約0. Ix1(T8M、至少約 0. 3x 1(T8M、至少約 0. 5x 1(T8M、至少約 0. 75x 1(T8M、至少約 I. Ox 1(T8M、至少約1.3x 10_8M、至少約1.5x IO-8M或至少約2. Ox KT8M的結(jié)合親和力結(jié)合。Kd值可例如通過競爭性ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)或使用表面等離子共振裝置例如Biacore TlOO (其可從 Biacore, Inc. , Piscataway, NJ 獲得)確定?？乖纱碳游镏械目贵w產(chǎn)生或T細胞反應的化合物、組合物或物質(zhì)，包括注射到或吸附到動物中的組合物?？乖膳c特異性體液或細胞免疫的產(chǎn)物(包括由異種免疫原誘發(fā)的那些)反應。術(shù)語“抗原”包括全部有關(guān)的抗原表位?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”是指抗原上B和/或T細胞對其產(chǎn)生響應的位點。在一個實施方案中，當表位以與MHC分子連接的形式存在時，T細胞對所述表位產(chǎn)生響應。表位由連續(xù)氨基酸或通過蛋白的三級折疊并置的非連續(xù)氨基酸構(gòu)成。通常，T細胞識別連續(xù)氨基酸的表位。由連續(xù)氨基酸構(gòu)成的表位通常在暴露于變性溶劑后得以保留，而由三級折疊構(gòu)成的表位通常會在用變性溶劑處理后喪失。表位通常包括以獨特的空間構(gòu)象存在的至少3個，更通常至少5個，約9個或約8-10個氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括例如X射線結(jié)晶學和2維核磁共振?？乖膶嵗ǖ幌抻陔摹⒅|(zhì)、多糖和含有抗原決定簇的核酸，例如為免疫細胞識別的那些?？乖蔀榻M織特異性抗原，或者疾病特異性抗原。這些術(shù)語不是排他性的，因為組織特異性抗原也可為疾病特異性抗原。組織特異性抗原在有限數(shù)量的組織例如單一組織中表達。組織特異性抗原可由一種以上相關(guān)類型的組織(例如肺泡和支氣管組織)表達。疾病特異性抗原伴隨疾病過程同時表達。疾病特異性抗原的特異性非限制實例是其表達與細菌感染相關(guān)或預示細菌感染(例如結(jié)核病)的抗原。疾病特異性抗原可被T細胞或B細胞識別。⑶4 :分化因子4的簇，一種T細胞表面蛋白，其介導與MHC II類分子的相互作用。⑶4還作為HIV感染過程中T細胞上的HIV主要受體位點。表達⑶4的細胞通常是輔助T細胞。⑶8 :分化因子8的簇，一種T細胞表面蛋白，介導與MHC I類分子的相互作用。表達⑶8的細胞通常是細胞毒性T細胞。“⑶8+T細胞介導的免疫性”是通過將抗原呈遞至⑶8+T細胞而實現(xiàn)的免疫反應。接觸在另一種試劑存在的情況下孵育一種試劑的過程。因此，當細胞與試劑(例如免疫原性組合物)接觸時，用所述試劑將細胞孵育一段足以使所述試劑與細胞相互作用的時間。身體的溫度較低部位人和其他哺乳動物身體的部位，所述部位的溫度通常比身體其他部位低。正常人(或其他哺乳動)體溫的概念因解剖學位點、性別、生理和環(huán)境溫度而變動。盡管有很多變量，但人(或其他哺乳動)身體僅可在一個非常窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)揮 功能，因此，例如人體體核維持在約36°C -39°C。身體的溫度較低部位包括皮膚、嘴和直腸。例如，皮膚溫度為約32° C-35°C。因此，在某些實例中，身體的溫度較低部位比身體其他部位(例如體核)低至少1°C、低至少2°C、低至少3°C、低至少4°C、低至少4°C或低至少6°C，例如低 1°C -8°C、低 1°C -6°C、低 2°C _6°C或低 2°C _4°C。細胞因子由細胞產(chǎn)生的影響其他細胞(如淋巴細胞)行為的蛋白。在一個實施方案中，細胞因子是趨化因子，一種影響細胞運輸?shù)姆肿印＜毎蜃拥木唧w的非限制性實例包括白細胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21 等)和 IFN- y。簡并變體編碼TS必需嗜冷細菌蛋白的TS必需嗜冷細菌核酸序列，包括因遺傳密碼造成的簡并核酸序列。存在20種天然氨基酸，其大部分由多于一種密碼子指定。因此，本公開內(nèi)容中包括所有簡并核苷酸序列，只要由所述核苷酸編碼的TS必需嗜冷細菌肽的氨基酸序列不變。EmS紅霉素抗性。必需基因在所有培養(yǎng)條件下對生物(例如嗜溫細菌)的生長均必需的基因。表達控制序列調(diào)控與之可操作地連接的異源核酸序列表達的核酸序列。當表達控制序列控制并調(diào)控核酸序列的轉(zhuǎn)錄以及(在適當?shù)那闆r下)核酸序列的翻譯時，所述表達控制序列就與所述核酸序列可操作地連接。因此，表達控制序列可包括合適的啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前的起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子剪接信號、維持該基因的正確閱讀框以使mRNA可正確翻譯以及終止密碼子。術(shù)語“控制序列”在最小意義上意圖包括其存在可影響表達的組件，并還可包括其存在有利的額外組件，例如前導序列和融合伴侶序列。表達控制序列可包括啟動子。啟動子是足以指導轉(zhuǎn)錄的最小序列。還包括那些足以使啟動子依賴的基因表達可受細胞類型特異性、組織特異性的外部信號或試劑控制或者可由外部信號或試劑誘導的啟動子元件；這些元件可位于所述基因的5’或3’區(qū)。包括組成型和誘導型的啟動子(參見例如Bitter et al. , Methods in Enzymology 153:516-544，1987)。例如，當克隆到細菌系統(tǒng)中時，可使用誘導型啟動子，例如曬菌體lambda的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac雜合啟動子)等。在一個實施方案中，當克隆到哺乳動物細胞系統(tǒng)中時，可使用來源于哺乳動物細胞的基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源于哺乳動物病毒的啟動子(例如反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列；腺病毒后期啟動子；牛痘病毒7. 5K啟動子)。由重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子也可用于提供所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄。在一個實施方案中，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子。熱敏感性在高于約28°C的溫度下不能行使必需的生物功能。類似地，術(shù)語“熱敏感性蛋白或多肽”是指由熱誘導的滅活導致的無功能成熟蛋白。這種蛋白的一個實例是在高于約28°C的溫度下不足以有效催化其已知反應以支持所述生物的生長、發(fā)育或生命的酶。熱敏感等位基因包含編碼熱敏感性蛋白的基因的等位基因。類似地，術(shù)語“熱敏感性基因”是指由編碼熱敏感性蛋白的基因。宿主細胞已引入異源核酸分子的細胞。例如，這些細胞可包括可增殖并且其DNA可被表達的核酸載體。所述細胞可為原核細胞或真核細胞。所述細胞可為原核細胞，例如細菌細胞。該術(shù)語還包括目的宿主細胞的任何后代。應理解所有細胞均可不同于親代細胞，因為在復制過程中可能存在突變。然而，當使用“宿主細胞”時，包括這些后代。 免疫反應免疫系統(tǒng)的細胞(例如B細胞、T細胞或單核細胞)對刺激物的反應。在一個實施方案中，所述反應對特定抗原或特定TS重組微生物細胞(例如含有本文提供的嗜冷必需核酸分子的嗜溫細菌)是特異性的。在一個實施方案中，免疫反應是T細胞反應，例如CD4+反應或CD8+反應。在另一個實施方案中，所述反應是B細胞反應，并導致特異性抗體的產(chǎn)生。給予含有嗜冷TS必需核酸分子的嗜溫細菌后，免疫反應的形成可使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法測量，例如通過測量作為保護性免疫反應指征的細胞因子產(chǎn)生。免疫原性組合物包含含有嗜冷TS必需核酸分子的重組嗜溫細菌的組合物,所述嗜冷TS必需核酸分子誘發(fā)可測量的對重組嗜溫細菌蛋白的CTL反應，或者誘發(fā)可測量的對重組嗜溫細菌蛋白的B細胞反應(例如產(chǎn)生特異性結(jié)合重組嗜溫細菌-特異性蛋白的抗體)。例如，所述免疫原性多肽或編碼所述免疫原性多肽的核酸可存在于使用本文提供的方法產(chǎn)生的熱敏性嗜溫細菌中，其中所述細菌是免疫組合物的一部分，所述免疫組合物還可包含可藥用的載體和/或其他治療劑。免疫原性組合物可任選地包括佐劑、PD-I拮抗劑、共刺激分子或編碼共刺激分子的核酸。通過本領(lǐng)域中公認的測定法可容易地測試免疫原性組合物誘發(fā)CTL的能力。免疫原性肽包含等位基因-特異性基序或其他序列的肽，所述基序或序列使得所述肽結(jié)合MHC分子并誘發(fā)對來源自所述免疫原性肽的抗原的細胞毒性T淋巴細胞(“CTL”)反應或者B細胞反應(例如抗體產(chǎn)生)。免疫原性肽還可在存在MHC蛋白的情況下通過測量其與特異性MHC蛋白的結(jié)合以及由其刺激CD4和/或CD8的能力來鑒定。通常，免疫原性多肽可用于誘發(fā)受試者中的免疫反應，例如B細胞反應或T細胞反應。在一個實施例中，免疫原性多肽在結(jié)合于MHCI類分子時活化抗所述多肽的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。使用合成肽誘發(fā)CTL以及CTL細胞毒性測定是本領(lǐng)域中已知的，參見美國專利5，662，907。在一個實例中，免疫原性肽包含等位基因-特異性基序或其他序列，從而使得所述肽結(jié)合MHC分子并誘發(fā)抗從其中產(chǎn)生所述免疫原性肽的抗原的細胞毒性T淋巴細胞(“CTL”)反應。免疫原性反應條件允許對特定表位特異的抗體結(jié)合于所述表位的條件，所述結(jié)合的程度比與基本上所有其他表位的結(jié)合更大，并且/或者基本排除與基本上所有其他表位的結(jié)合。這些條件依賴于所述抗體結(jié)合反應的形式，通常是那些用于免疫測定方案的條件或者那些體內(nèi)存在的條件。用于所公開方法的免疫原性反應條件是這樣的“生理條件”，即所述條件包括活的哺乳動物或哺乳動物細胞內(nèi)部常見的條件(例如溫度、克分子滲透壓濃度、pH)。盡管知曉某些器官處于極端條件下，然而器官內(nèi)和細胞內(nèi)環(huán)境通常為約pH7(例如pH 6. O到pH8. O或pH 6. 5到pH 7. 5，例如pH 7. 2)，含有水作為主要溶劑，并處于高于(TC且低于50°C的溫度下。克分子滲透壓濃度處于可支持細胞生活力和繁殖的范圍內(nèi)。這些條件為這些領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。干擾素Y (IFN-Y) =IFN-Y是具有146個氨基酸的亞基的二聚體蛋白。所述蛋白在兩個位點上被糖基化，并且Pl為8. 3-8. 5。IFN- y以包含23個氨基酸的分泌信號序列的166個氨基酸的前體蛋白的形式合成。已公開了 20和25kDa的兩種分子形式的生物活性蛋白。所述兩種形式在第25位上均被糖基化。25kDa形式還在第97位上被糖基化。天然IFN-Y在分子量和電荷方面中觀測到的不同是由于不同的糖基化模式。在非變性條件下觀察到的 40-60kDa形式是IFN-Y的二聚體和四聚體。人的該基因具有約6kb的長度。其含有4個外顯子，并作譜于染色體12q24. I。 IFN-Y可通過靈敏的免疫測定法檢測，例如可檢測產(chǎn)生IFN-Y的個體細胞的ELISP0T測試。微量的IFN-Y可通過測量IFN誘導的蛋白(例如Mx蛋白)而間接檢測。對IP-10的合成的誘導也已用于測量IFN-Y濃度。此外，可使用生物測定法來檢測IFN-Y，例如利用誘導2D9細胞中吲哚胺2，3- 二氧化酶活性的測定法。IFN- y的產(chǎn)生可用于評估T細胞活化，例如細菌抗原對T細胞的活化。分離的生物組分(例如核酸分子、蛋白或細胞器)，其已被從其天然所在的生物體細胞中的其他生物組分(例如其他染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白和細胞器)中基本分離或純化。已“分離的”核酸分子和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白。在另一實施方案中，“分離的”是指通過宿主細胞中的重組表達制備的核酸分子和蛋白，以及化學方法合成的核酸。IigA :在嗜溫細菌(例如新兇手弗朗西斯菌、恥垢分枝桿菌或大腸桿菌)中發(fā)現(xiàn)的編碼MD-依賴的DNA連接酶的基因的wt等位基因。此外，帶有下標的IigA (例如ligACp、IigAsf或IigAph)是指在嗜冷細菌中發(fā)現(xiàn)的編碼MD-依賴的DNA連接酶的基因的wt等位基因。例如，IigAcp是指在最大生長溫度低于18°C的北極細菌冷紅科爾韋爾氏菌株34H中發(fā)現(xiàn)的IigA的wt等位基因?？蓪⑹壤浼毦腎igA序列引入嗜溫細菌中，以賦予所述嗜溫細菌溫度敏感性。嗜溫生物在約20° C到50°C的溫度下的環(huán)境中天然存在的生物。嗜溫細菌是指通常與哺乳動物有關(guān)并因此通常在約32°C到45°C的溫度下發(fā)揮功能的細菌。嗜冷細菌在永久低于20°C，經(jīng)常永久低于10°C并有時低于0°C的環(huán)境中天然存在的生物。所述永久低溫的環(huán)境包括大多數(shù)海洋環(huán)境、永凍土、北級和南極環(huán)境。這些領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解“嗜冷生物”和“嗜冷性”通常用于描述在低溫環(huán)境中生長的細菌。嗜冷的嗜冷生物的特征。例如，“嗜冷酶”是從嗜冷生物中分離的酶。肽修飾可用于本文提供的方法和組合物的蛋白的類似物(非肽有機分子)、衍生物(用所公開的肽序列起始獲得的化學上有功能的肽分子)和變體(同源物)。肽由氨基酸構(gòu)成，所述氨基酸可為天然以及非天然的L-和/或D-氨基酸。所述肽可通過多種化學技術(shù)進行修飾以產(chǎn)生具有與未修飾的蛋白基本相同的活性并任選地具有其他所需特性的衍生物。修飾為這些領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知?？伤幱幂d體可用于本公開內(nèi)容的可藥用載體(溶劑)是常規(guī)的。E. ff. Martin, MackPublishing Co. , Easton, PA, 19th Edition (1995)的 Remington’s PharmaceuticalSciences描述了適于一種或多種治療組合物(例如免疫原性組合物)的藥物遞送的組合物和制劑。所公開的純化的活性組合物可單獨給藥或者與可用載體結(jié)合給藥。制劑可含有一種類型的治療分子，或可由數(shù)種類型的治療分子的組合構(gòu)成。所述載體的性質(zhì)取決于所用的具體給藥模式。通常，載體的性質(zhì)取決于所用的具體給藥模式。例如，腸胃外制劑通常包含可注射流體作為載體，所述可注射流體包括藥學和生理學上可接受的流體例如水、生理鹽水、平衡的鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。對于固體組合物(例如粉末、丸劑、片劑或膠囊劑形式)，常規(guī)的無毒固體載體可包括例如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物學上中 性的載體以外，待給予的藥物組合物還可含有少量無毒輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨醇單月桂酸酯。預防或治療疾病“預防”疾病是指抑制疾病的完全形成，例如在已知具有被結(jié)核分枝桿菌或麻風分枝桿菌(M. leprae)感染的風險的人中。已知易患病的人的實例是與被診斷患有結(jié)核病的人一起生活的人、職業(yè)醫(yī)護人員或者其他已知已暴露于結(jié)核分枝桿菌的人?！爸委煛笔侵冈诩膊』虿±頎顟B(tài)(例如結(jié)核病)已經(jīng)開始形成后改善其體征或癥狀的治療介入。純化的術(shù)語純化的不要求絕對純凈；而是作為一個相對術(shù)語。因此，例如，純化的蛋白制劑是這樣的蛋白即所述蛋白較細胞內(nèi)其來源環(huán)境的蛋白更純。蛋白制劑通常進行純化，從而使得所述蛋白占所述制劑的總蛋白含量的至少50%。然而，某些應用可能需要更高度純化的制劑。例如，對于這些應用，可使用其中所述蛋白占總蛋白含量的至少75%或至少90%的制劑。重組具有非天然存在的序列或通過人工組合序列的兩個天然分離的片段形成的序列的核酸分子。這種人工組合通常通過化學合成，通過對分離的核酸片段的人工操作或者通過遺傳工程技術(shù)來實現(xiàn)。也指已引入非天然核酸分子的細胞?？垢腥镜呐c無抗性動物相比，感染癥狀出現(xiàn)減輕的動物(例如哺乳動物)。對感染的抗性的表現(xiàn)可為例如致死率下降，暴露于感染原后測得的壽命延長，強烈生理癥狀減少或減輕(例如損傷減少)，或者所述感染原的細胞或組織濃度降低。在一個實施方案中，對感染的抗性被免疫反應的增強所證實。限制溫度生物不能生長的最低溫度。例如，表I中的“限制溫度”具體是指整合有嗜冷基因的新兇手弗朗西斯菌株不能在瓊脂糖培養(yǎng)基上形成分離的菌落的最低溫度。由于培養(yǎng)箱溫度的差異，這些溫度解釋為約±l°c。sacB盒編碼枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)的果聚糖鹿糖酶的模塊DNA序列。此基因的表達在蔗糖存在的情況下對許多細菌來說是致死性的，并可因此用作幫助選擇基因序列丟失的反向選擇劑。選擇性雜交在排除無關(guān)核苷酸序列的中度或高度嚴格的條件下的雜交，所述雜交的技術(shù)為這些領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。
序列同一性兩個或多個核酸序列之間的同一性/相似性，或兩個或多個氨基酸序列之間的同一性/類似性,表示為所述序列之間的同一性或類似性。序列同一性可以以同一性百分比的形式度量；百分比越高，所述序列同一性越高。序列相似性可以以相似性百分比(其考慮了保守性氨基酸置換)的形式度量；百分比越高，所述序列相似性越高。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域中公知的。多種程序和比對算法記載于Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2 : 482, 1981; Needleman & ffunsch, J. Mol.Biol. 48 : 443，1970 ; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444, 1988 ；Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988 ；Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-3,1989 ；Corpet et al. , Nuc. Acids Res. 16:10881-90，1988;Huang et al. Computer Appls. inthe Biosciences 8,155-65，1992 ;以及Pearson et al.，Meth. Mol. Bio. 24:307-31，1994。Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-10，1990給出了對序列比對方法和同源性計算的詳細注意點。NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)可從數(shù)個來源獲得，包括 National Center forBiological Information(NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room8N805, Bethesda, MD 20894)和互聯(lián)網(wǎng)，連同序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其他信息可見NCBI網(wǎng)站。BLASTN可用于比較核酸序列，而BLASTP用于比較氨基酸序列。如果所述兩個比較序列享有同源性，那么指定的輸出文件會將那些同源性區(qū)域顯示為對齊的序列。如果所述兩個比較序列不享有同源性，那么指定的輸出文件不會顯示對齊的序列。一旦比對上，就通過對這樣的位置的數(shù)目計數(shù)來確定匹配的數(shù)目，即在所述位置上兩個序列中存在相同的核苷酸或氨基酸殘基。序列同一性百分比通過以下方法確定用匹配的數(shù)目除以識別序列中給出的序列的長度或除以聯(lián)結(jié)的長度(articulated length)(例如識別序列中給出的序列的100個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基)，然后將所得結(jié)果乘以100。例如，當與具有1154個核苷酸的測試序列比對時具有1166個匹配的核酸序列與所述測試序列具有75. 0%的同一性(1166 + 1554*100=75. 0)。所述序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75. 11,75. 12,75. 13和75. 14向下近似為75. 1，而75. 15、75. 16,75. 17,75. 18和75. 19向上近似為75. 2。所述長度值總是為整數(shù)。在另一個實例中，與下文中識別序列的20個連續(xù)核苷酸比對的含有15個核苷酸區(qū)域的靶序列含有與該識別序列享有75%序列同一性(S卩15 + 20*100=75)的區(qū)域。為比較大于約30個氨基酸的氨基酸序列，使用設定為缺省參數(shù)(空位存在分值為11，每個殘基空位分值為I)的缺省BL0SUM62矩陣應用Blast 2 sequence的功能。同源物通常特征在于，使用NCBI Basic Blast 2. 0, gapped blastp (使用例如nr或swisspro數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫)，對于與氨基酸序列的全長比對計算出具有至少30%或更高的序列同一性。以 blastn 程序搜索的查詢用 DUST 過濾(Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appl.Biosci. 10:67-70)。其他程序使用SEG。此外，也可進行人工比對。當通過此方法測定時，具有甚至更大相似性的蛋白會顯示更高的同一性百分比，例如與本文公開的蛋白的至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一個實例中，可用于所公開的方法和組合物中的蛋白與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留
賦予嗜溫細菌TS (例如熱敏感性)的能力。兩個核酸分子密切相關(guān)的一個指征是兩個核酸分子在嚴格條件下相互雜交，如上所述。然而，由于遺傳密碼的簡并性，未顯示高度同一性的核酸序列也可編碼相同或相似的(保守性的)氨基酸序列?？墒褂眠@種簡并性改變核酸序列以產(chǎn)生均編碼基本相同蛋白的多個核酸分子。用此方法測定時，所述同源性核酸序列可例如與所公開的核酸序列具有至少約60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一個實例中，可用于所公開的方法和組合物的核酸序列與SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留編碼能夠賦予嗜溫細菌TS (例如熱敏感性)的蛋白的能力。兩個核酸序列基本相同的另一個(且不必須是累加的)指征是第一個核酸編碼的肽可與第二個核酸編碼的肽發(fā)生免疫交叉反應
“溫度敏感性(TS)”或“熱敏感性(HS)”:在最高約30°C時有活性且在通常見于人體的溫度(例如高于約30°C)下失活的細菌組分(例如蛋白)或細菌。測試菌株容易進行基因替換以使嗜冷必需置換測試菌株中天然存在的同源物的嗜溫細菌。治療有效量單獨給予或者與其他治療劑一起給予的組合物的量，所述量足以在被所述藥劑治療的受試者或細胞中實現(xiàn)所需效果。所述藥劑(例如本文提供的免疫原性組合物)的有效量可取決于數(shù)個因素，包括但不限于要治療的受試者或細胞、特定治療劑以及所述治療組合物的給藥方式。在一個實例中，治療有效量或濃度是足以預防疾病發(fā)展、推遲疾病進展或?qū)е录膊∠说牧浚蛘吣軌驕p輕由所述疾病(例如細菌感染(例如結(jié)核病))引起的癥狀的量。在一個實例中，所需的反應是減輕或抑制與細菌感染有關(guān)的一種或多種癥狀。所述組合物起作用并不表示必須完全消除一種或多種癥狀。被給予人或脊椎動物受試者的包括所公開的免疫組合物之一的藥劑的有效量會根據(jù)與所述受試者有關(guān)的若干因素(例如所述受試者的總體健康)而變化。藥劑的有效量可通過改變所述產(chǎn)品的劑量并測量引起的治療反應(例如預防細菌感染)來確定。有效量還可通過多種體外、體內(nèi)或原位免疫測定法來確定。所公開的藥劑可根據(jù)獲得所需反應的需要以單劑量或以多劑量給藥。在具體實例中，免疫原性組合物的治療有效劑量包括至少IO2菌落形成單位(CFU)，例如至少103、至少104、至少105、至少106、至少IO7或至少IO8CFU,例如IO2-IO8CFU0在一個實例中，以真皮內(nèi)或鼻內(nèi)途徑給予IO2-IO8CFU的活細菌。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，也可例如根據(jù)具體免疫原性組合物使用更高或更低的劑量。在具體實例中，這些每日劑量以一個或多個分開的劑量(例如2、3或4劑)或以單個制劑給藥。所公開的免疫原性組合物可單獨給藥，在可藥用載體存在的情況下給藥或者在其他治療藥劑存在的情況下給藥。治療在疾病或病理狀態(tài)形成后改善其體征或癥狀的治療介入。在一個實例中，本文公開的免疫原性組合物在給予哺乳動物后減輕細菌感染的一種或多種體征。載體被引入宿主細胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)化的宿主細胞——在本文中稱為重組細胞一的核酸分子。載體可包含使得其可在宿主細胞中復制的核酸分子序列，例如復制起點。載體還可包含一個或多個可選擇的標志基因以及本領(lǐng)域中已知的其他遺傳元件。載體包括質(zhì)粒載體，包括用于在格蘭氏陰性和格蘭氏陽性細菌細胞中表達的質(zhì)粒。示例性載體包括在大腸桿菌和沙門氏菌中表達的載體。載體還包括病毒載體例如但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、正痘病毒、禽痘病毒、雞痘病毒(fowlpox)、羊痘病毒、豬痘病毒、腺病毒、皰疫病毒、a病毒、桿狀病毒、辛德畢斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。來自嗜冷細菌的溫度敏感性必需基因本文公開了，數(shù)種核酸分子及其對應的肽可被引入細菌以賦予所述宿主細菌溫度敏感性(TS)，例如熱敏感性。所得到的細菌可用于誘導對溫度敏感性細菌的免疫反應例如T細胞反應。本文提供了具有所需溫度敏感性的示例性嗜冷必需基因及其對應的肽。例如，可用一個或多個嗜冷TS必需核酸分子轉(zhuǎn)化宿主嗜溫細菌，從而賦予所述嗜溫細菌TS。所得到的重組嗜溫細菌可制劑為免疫原性組合物，以治療或預防由嗜溫細菌引起的感染。例如，含有一個或多個嗜冷TS必需核酸分子的重組嗜溫結(jié)核分枝桿菌可用于治療或預防結(jié)核病。相同的方法可用于制備引起炭疽、布氏菌病(brucellosis)、類鼻疽、腦膜炎、牛結(jié)核病、傷寒、痢疾、多種類型的醫(yī)院內(nèi)感染、肺炎和鼠疫的TS形式的炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)。這樣,可使用這些TS細菌來治療或預防這些病癥。本文提供了來自嗜冷細菌的溫度敏感性必需蛋白，例如來自科爾韋爾氏菌屬種(Colwellia sp.)、假交替單胞菌屬種(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌屬種(Shewanella sp.)的所述蛋白。不例性蛋白包括 ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt 和dnaK。示例性序列以示于 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28 中的氨基酸序列的形式提供。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解也可使用變體序列。例如，序列與SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28 之一所示的氨基酸序列具有至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的肽為本公開內(nèi)容所涵蓋，并可用于本文提供的方法。變體序列保留了嗜冷細菌的天然溫度敏感性必需蛋白的生物活性，例如賦予形成細菌TS (例如熱敏感性)的能力——例如在-10°C至約30°C (例如(TC -30°C)的溫度下能行使功能，但在高于約30°C (例如4°C -30°C)例如高于35°C的溫度下不能行使功能。示例性序列可使用互聯(lián)網(wǎng)上容易獲得的計算機程序和本文示出的氨基酸序列獲得。在一個實例中，所述變體肽保留天然蛋白的功能，例如賦予細菌溫度敏感性的能力。變體蛋白的具體的非限制性實例為天然蛋白(例如SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28)的保守性變體。示于 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26和28中的氨基酸序列的置換可基于此表進行，只要所述病原嗜溫細菌被賦予TS并能夠引發(fā)對其病原性抗原的免疫反應。例如，蛋白序列可被改變而不改變其生物學性質(zhì)，例如通過引入一個或多個保守性氨基酸置換。因此，SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的任一個均可通過進行1-20個、1-15個、1-12個、1-10個或1-5個保守性氨基酸置換(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 50個保守性氨基酸置換)而被修飾，同時保留賦予嗜溫細菌溫度敏感性(TS)的能力。保守性置換的實例如下
權(quán)利要求
1.一種來自嗜冷細菌的分離的溫度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子包含與示于SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25 或 27 中的核苷酸序列具有至少 80%、至少90%或至少95%的序列同一性。
2.權(quán)利要求I的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷細菌在約-10°C到約30°C的溫度下能行使功能。
3.權(quán)利要求I的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷細菌在高于約30°C的溫度下不能行使功能。
4.權(quán)利要求I的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中所述核酸分子包含示于SEQIDNO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25 或 27 中的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求I的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷細菌為科爾韋爾氏菌屬種(Colwellia sp.)、假交替單胞菌屬種(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌屬種(Shewanella sp.)。
6.權(quán)利要求I的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子編碼的蛋白在高于約30°C的溫度下不能行使功能。
7.權(quán)利要求6的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子編碼的蛋白在選自約4°C到約30°C的溫度下能行使功能。
8.—種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1-7中任一項的分離的溫度敏感性必需核酸分子，其中所述必需核酸分子與一個或多個控制序列可操作地連接。
9.一種載體,包含權(quán)利要求1-8中任一項的分離的核酸分子。
10.權(quán)利要求9的載體，其中所述載體包含至少兩種選自SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25或 27 中的核酸序列。
11.一種重組宿主細胞，包含權(quán)利要求1-8中任一項的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求9或10的載體。
12.權(quán)利要求11的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞為嗜溫細菌。
13.權(quán)利要求12的重組宿主細胞，其中所述嗜溫細菌在約10°C到約50°C的溫度下能行使功能。
14.權(quán)利要求11-13中任一項的重組宿主細胞，其中所述嗜溫細菌在高于約30°C的溫度下失活。
15.一種分離的蛋白，由權(quán)利要求1-8中任一項的分離的溫度敏感性必需核酸分子編碼。
16.權(quán)利要求15的分離的蛋白，其中所述蛋白包含與示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求15的分離的蛋白，其中所述蛋白包含示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列。
18.一種免疫原性組合物，包含權(quán)利要求11-14中任一項的重組宿主細胞，其中所述重組宿主細胞大約在由所述溫度敏感性核酸分子編碼的蛋白不能行使功能的溫度下被殺死。
19.權(quán)利要求18的免疫原性組合物，其中由所述溫度敏感性必需核酸分子編碼的蛋白在高于約30°C的溫度下失活。
20.權(quán)利要求18或19的免疫原性組合物，其中所述重組宿主細胞是弗朗西斯菌屬種(Francisella sp.)、沙門氏菌屬種(Salmonella sp.)或分枝桿菌屬種(Mycobacteriumsp.)。
21.一種制備重組的溫度敏感性(TS)細菌的方法，包括 將核酸構(gòu)建體導入嗜溫細菌的基因組中以制備重組TS細菌，所述核酸構(gòu)建體包含來自嗜冷細菌的TS必需核酸分子以及與所述TS必需核酸分子可操作地連接的一個或多個控制序列，其中由所述TS必需多核苷酸編碼的蛋白在低于約30°C的溫度下能行使功能，并且在高于約30°C的溫度下不能行使功能。
22.權(quán)利要求21的方法，還包括從所述嗜冷細菌的基因組中分離所述TS必需核酸分子。
23.權(quán)利要求21或22的方法，還包括構(gòu)建包含所述TS必需核酸分子以及與所述TS必需核酸分子可操作地連接的一個或多個控制序列的核酸構(gòu)建體。
24.權(quán)利要求21-23中任一項的方法，其中所述嗜冷細菌在約-10°C到約30°C的溫度下能行使功能。
25.權(quán)利要求21-24中任一項的方法，其中所述嗜冷細菌在高于約30°C的溫度下不能行使功能。
26.權(quán)利要求21 - 2 5中任一項的方法，其中所述嗜冷細菌為科爾韋爾氏菌屬種(Colwellia sp.)、假交替單胞菌屬種(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌屬種(Shewanella sp.)。
27.權(quán)利要求21-26中任一項的方法，其中所述嗜溫細菌在選自約10°C到約50°C的溫度下能行使功能。
28.權(quán)利要求21-27中任一項的方法，其中所述嗜溫細菌是發(fā)酵微生物菌株或生物治療菌株。
29.權(quán)利要求21-28中任一項的方法，其中所述TS必需核酸分子包含與示于SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的核苷酸序列。
30.權(quán)利要求21-29中任一項的方法，其中在培養(yǎng)所述TS微生物宿主細胞的過程中所述TS必需核酸分子表達肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述肽包含與示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求21-31中任一項的方法，還包括 在由所述TS多核苷酸編碼的蛋白能行使功能的溫度下培養(yǎng)所述重組TS細菌，藉此所述重組TS細菌產(chǎn)生多種肽； 將所述培養(yǎng)溫度增加至由所述TS核酸分子編碼的蛋白不能行使功能的溫度； 將所述培養(yǎng)維持一段足以殺死所述重組TS細菌的時間；并且 收集被殺死的重組TS細菌。
33.一種制備包含必需肽的重組TS細菌的方法，包括 篩選嗜冷微生物基因組以檢測其中的編碼在高于約30°C的溫度下失活的蛋白的TS必需多核苷酸； 分離所述TS必需多核苷酸； 構(gòu)建核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含所述TS必需多核苷酸以及與所述TS多核苷酸可操作地連接的一個或多個控制序列； 將所述核酸構(gòu)建體插入到所選擇的嗜溫細菌宿主細胞的基因組中，從而在功能上置換在所述宿主細胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸編碼蛋白，所述蛋白在低于約30°C的溫度下能行使功能并在高于約30°C的溫度下不能行使功能并且可模擬原指定宿主細菌的溫度敏感性； 在低于約30°C的溫度下培養(yǎng)包含所述TS多核苷酸的嗜溫細菌宿主細胞，以確認所述嗜溫細菌宿主細胞的生存力； 在高于約30°C的溫度下再培養(yǎng)包含所述TS多核苷酸的嗜溫細菌宿主細胞，以確定所述嗜溫細菌宿主細胞是否被殺死；以及 如果所述嗜溫細菌宿主細胞被殺死，那么將所述核酸構(gòu)建體插入到所選擇的目的嗜溫細菌宿主細胞的基因組中，從而在功能上置換所述宿主細胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸編碼在低于約30°C的溫度下能行使功能并且在高于約30°C的溫度下不能行使功能并且可模擬原測試宿主細菌的溫度敏感性的蛋白，從而產(chǎn)生重組TS細菌。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述嗜溫細菌宿主細胞為新兇手弗朗西斯菌(Francisella novicida)細胞。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中所述目的嗜溫細菌宿主細胞為沙門氏菌屬種或結(jié)核桿菌屬種(Mycobacterium sp.)。
36.一種組合物，包含由權(quán)利要求21-35中任一項的方法制備的溫度敏感性細菌宿主細胞。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述組合物是免疫原性組合物或治療性組合物。
38.權(quán)利要求36或37的組合物用于在哺乳動物中激發(fā)免疫反應的用途。
39.一種用于在受試者體內(nèi)產(chǎn)生對細菌的免疫反應的方法，包括 給予所述受試者治療有效量的溫度敏感性細菌，其中所述溫度敏感性細菌表達權(quán)利要求14-17中任一項的分離的蛋白，藉此誘發(fā)對所述細菌的免疫反應。
40.一種用于在受試者體內(nèi)產(chǎn)生對細菌的免疫反應的方法，包括 給予所述受試者治療有效量的溫度敏感性細菌，其中所述溫度敏感性細菌包含權(quán)利要求1-8中任一項的分離的核酸或者權(quán)利要求9-10任一項的載體,從而誘發(fā)對所述細菌的免疫反應。
41.一種用于在受試者體內(nèi)產(chǎn)生對細菌的免疫反應的方法，包括 給予所述受試者治療有效量的溫度敏感性細菌，其中所述溫度敏感性細菌包含權(quán)利要求11-14中任一項的重組宿主細胞，從而誘發(fā)對所述細菌的免疫反應。
42.權(quán)利要求39-41中任一項的方法，還包括給予治療有效量的佐劑。
43.權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述免疫反應是保護性免疫反應。
44.權(quán)利要求39-41中任一項的方法，其中所述受試者患有細菌感染。
45.權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述受試者處于受到細菌感染的風險中。
46.權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述受試者患有潛伏性細菌感染。
47.權(quán)利要求44-46中任一項的方法，其中所述細菌感染為結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌或弗朗西斯菌感染。
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了來自嗜冷細菌的溫度敏感性必需核酸分子、由所述核酸分子編碼的蛋白以及其中已引入這類核酸分子的重組細胞。所公開的含有來自嗜冷細菌的一個或多個必需核酸分子的重組細胞從而變?yōu)闇囟让舾行缘?，并且可被給予哺乳動物以在所述哺乳動物中誘導免疫反應。
文檔編號C12N15/61GK102782138SQ201080055571
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月7日
發(fā)明者F·E·納諾 申請人:Uvic工業(yè)合伙公司