專利名稱：抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制作方法。
背景技術(shù)：
魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是
動(dòng)物腸道正常菌群之一，也是引起魏氏梭菌病的原兇。其發(fā)病機(jī)理是在飼養(yǎng)環(huán)境和飼料 突然改變等誘因下，腸道內(nèi)魏氏梭菌大量繁殖，產(chǎn)生的毒素經(jīng)消化道吸收，導(dǎo)致動(dòng)物出 現(xiàn)腸毒血癥，壞死性腸炎，綿羊軟腎病，仔豬紅痢、羔羊痢疾、兔出血性下痢，創(chuàng)傷性 氣性壞疽，動(dòng)物猝死癥等。根據(jù)菌體分泌外毒素不同，將魏氏梭菌分為五個(gè)血清型，即 A、B、C、D、E型(見(jiàn)表1)。外毒素是魏氏梭菌的毒力因子，目前已發(fā)現(xiàn)有15種之 多，但致死性因子只有4種，S卩α、β、ε和t，其中最根本、最重要的致病因子—— α毒素(C.perfringens alpha toxin, CPA)是A E型所共有的毒力因子。α毒素具有磷 脂酶C (PhospholipaseC，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，能水解卵磷脂和鞘 磷脂使細(xì)胞膜破裂，因而具有溶血性、細(xì)胞毒性、致死性和皮膚壞死等特性。表1各型魏氏梭菌及其主要分泌毒素
權(quán)利要求
1.一種抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是該方法包括(1)以含編碼魏氏梭菌α毒素的質(zhì)?；虿×蠟槟０?，利用PCR或RT-PCR擴(kuò)增獲得 魏氏梭菌α毒素基因，將獲得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，回收目 的基因和植物表達(dá)載體片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組Ti進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒 定，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，篩選、PCR鑒定獲得陽(yáng)性重組根瘤農(nóng)桿菌ρΑ:已于 2010年6月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO: Μ 2010130。(2)植物種子經(jīng)春化、萌發(fā)、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農(nóng)桿菌 ρΑ分別侵染外植體，通過(guò)篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng) 性植株，提取轉(zhuǎn)基因植物基因組或蛋白進(jìn)行Southern blot、Northern blot或Western blot鑒 定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和 /或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質(zhì)粒也可以采用Ri質(zhì)粒，同時(shí) 所述的根瘤農(nóng)桿菌采用發(fā)根農(nóng)桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是 步驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農(nóng)作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農(nóng)作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的 模式植物包括煙草。
4.一種利用權(quán)利要求1-3的方法制作的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗，其特征是 所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗為直接口服疫苗，或者將植物表達(dá)的蛋白抗原經(jīng)提 取、加工成口服或注射制劑使用。
5.—種抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是該方法包括(1)以含黏膜佐劑大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位(LT-B)的質(zhì)?；虿×蠟槟０?， 利用PCR或RT-PCR擴(kuò)增獲得黏膜佐劑LT-B基因，以含編碼魏氏梭菌α毒素的質(zhì)粒 或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴(kuò)增獲得魏氏梭菌α毒素基因，將所述的黏膜佐 劑LT-B基因與所述的魏氏梭菌α毒素基因融合獲得融合基因，將獲得融合基因和Ti質(zhì) 粒分別進(jìn)行酶切，回收目的基因和植物表達(dá)載體片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組Ti 質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，篩選、PCR鑒定獲得陽(yáng) 性重組根瘤農(nóng)桿菌pLA:已于2010年6月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào) 為CCTCCNO M 2010131。(2)植物種子經(jīng)春化、萌發(fā)、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的根瘤農(nóng)桿菌 pLA分別侵染外植體，通過(guò)篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選鑒定轉(zhuǎn)基因 陽(yáng)性植株，提取轉(zhuǎn)基因植物基因組或蛋白進(jìn)行Southern blot、Northern blot或Western blot 鑒定，證明魏氏梭菌毒素在植物中得到表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 驟(1)中所述的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位(LT-B)或者采用霍亂毒素B亞基 (CT-B)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 驟(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti質(zhì)?；蛘卟捎肦i質(zhì)粒，同時(shí)所 述的根瘤農(nóng)桿菌采用發(fā)根農(nóng)桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 驟(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或農(nóng)作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括馬鈴薯，所述的農(nóng)作物包括玉米，所述的水果包括西紅柿，所述的 模式植物包括煙草。
9.一種利用權(quán)利要求5-8方法制作的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗，其特征是所 述的抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗為直接口服，還為將植物表達(dá)的蛋白抗原經(jīng)提取、加 工成口服或注射制劑使用。
全文摘要
抗魏氏梭菌病轉(zhuǎn)基因植物疫苗及其制作方法。目前免疫接種抗魏氏梭菌病的疫苗保護(hù)率較低。本發(fā)明包括(1)以含編碼魏氏梭菌毒素的質(zhì)粒或病料為模板，利用PCR或RT-PCR擴(kuò)增獲得魏氏梭菌毒素基因，將獲得的魏氏梭菌毒素基因和Ti或Ri質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，回收目的基因和植物表達(dá)載體片段，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組Ti或Ri質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌，篩選、鑒定陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌；(2)植物種子經(jīng)春化、萌發(fā)、剪接，獲得外植體，用步驟(1)中重組的農(nóng)桿菌分別侵染外植體，通過(guò)篩選、繼代、生根、移栽，獲得轉(zhuǎn)化植株，篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102008720SQ20101023114
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者劉松梅, 朱延明, 李一經(jīng), 葛俊偉 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)