專利名稱：魏氏梭菌高壓脈沖電場滅活方法及檢驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對細(xì)菌進行滅活處理的方法及滅菌處理后的檢測方法，確 切講本發(fā)明涉及魏氏梭菌滅活方法及檢驗方法。
背景技術(shù)：
魏氏梭菌(cllwelchii )為產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium per fringens )，屬于革蘭 氏陽性菌，是引起人和家畜腸道疾病的重要病因，廣泛分布于土壤、污水、飼 料、食物、人畜糞便及腸道中。該菌群屬典型的條件致病菌，可以引起地區(qū)性 流行，也有散發(fā)性報道，每年都有大量的動物因不同的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染時死亡。
根據(jù)魏氏梭菌所分泌的腸毒素(a、 (31、卩2、 s、 i、 enterotoxin)性質(zhì)不同可 分為A E五型，其中對人致病的主要是A、 C兩型，B、 C、 D三型與動物 的感染密切相關(guān)。A型菌主要引起人的氣性壞疽和食物中毒，也可引起動物的 氣性壞疽，還可引起牛、羔羊、新生駱駝、野山羊、馴鹿、仔豬、家兔等的腸 毒血癥；B型菌主要引起羔羊痢疾，還可引起駒、犢牛、羔羊、綿羊和山羊的 腸毒血癥或壞死性腸炎；C型菌主要是綿羊猝狙的病原，也能引起羔羊、犢牛、 仔豬、綿羊的腸毒血癥和壞死性腸炎以及人的壞死性腸炎；D型菌引起羔羊、 綿羊、山羊、牛以及灰鼠的腸毒血癥；E型菌可致犢牛、羔羊腸毒ffll癥，但很少 發(fā)生。該病發(fā)病率和死亡率高，是影響動物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疫病，給我國的經(jīng) 濟帶來的嚴(yán)重的損失。
眾所周知，疫苗是預(yù)防魏氏梭菌病最有效的方法之一，然而，截止目前， 國內(nèi)外將更多的目光轉(zhuǎn)向毒素蛋白重組疫苗的研制，國內(nèi)使用較多的三聯(lián)氫氧 化鋁滅活苗、四聯(lián)濃縮滅活疫苗和蜂膠滅活疫苗都是通過加入0.5%-0.8%不等的 化學(xué)試劑甲醛來殺滅細(xì)菌、抑制細(xì)菌生長的，而甲醛在動物體內(nèi)的殘留可直接 影響到了人類的飲食安全和身體健康。甲醛除可殺滅細(xì)菌外，同時具有強烈的 致癌和促癌作用，長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻咽癌、 結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連及抑制DNA損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥，引起新生兒染色體異常、白血
病，引起青少年記憶力和智力下降。因此尋找一種能替代甲醛并能有效殺滅細(xì)
菌新方法是十分必耍的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，用高壓脈沖電場對魏氏梭菌滅活方 法及檢驗方法。
本發(fā)明的滅活方法是先將魏氏梭菌接種于培養(yǎng)液中進行擴菌培養(yǎng)，魏氏
梭菌的濃度為1.9 2.3xl(^個/ml后過濾得到菌液，取菌液200mL，在電場強度 為32 50KV/cm、脈沖頻率為500Hz~2000 Hz、溫度在30 55。C、進行高壓脈沖 電場處理，收集處理完畢的菌液，得到滅活的菌液。實際上菌液濃度低于前述 值時對本發(fā)明的實現(xiàn)并無影響。
本發(fā)明的魏氏梭菌高壓脈沖電場滅活優(yōu)選方法是所用脈沖頻率為1008Hz、 菌液的流速為10 50ml/min、電導(dǎo)率為330 680jam/cm、溫度在42 5(TC，進行 高壓脈沖電場處理，處理時間為6 8min，收集處理完畢的菌液，得到滅活的菌 液。
用本發(fā)明的方法進行滅活處理后可將經(jīng)滅活的菌液接種于厭氧肝湯屮，培 養(yǎng)10天，顯微鏡檢查無細(xì)菌的繁殖和單個菌落的生長；也可將經(jīng)滅活的菌液接 種于新鮮血平皿培養(yǎng)24-72h，肉眼觀察無單個菌落的生長及溶血環(huán)的產(chǎn)生。通 過前述檢測可以確定火活的效果
脈沖電場滅活處理是一門新興的生物物理技術(shù)，與其它現(xiàn)有的細(xì)菌滅活工 藝，如加熱、超聲、電磁場相比，該方法電場傳遞迅速，處理時間短，處理后 溫度-般控制在5(TC以下，耗能低；與化學(xué)滅活相比，這種方法無其他化學(xué)試 劑的參與，具有簡便、易操作、效率高、無污染等優(yōu)點。近年來在基因工程、 生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域中已有初步的應(yīng)用。但用這種方法處理魏氏梭菌尚末見報 道。
具體實施方式
1.菌種制備
1.1本發(fā)明的相關(guān)試驗中采用標(biāo)準(zhǔn)魏氏梭菌菌種，即A型C57-l、B型C58-2、C型C59-1、 D型C60-2
1.2菌種鑒定
a) 將1.1中所述的菌種分別接種于斜面、普通肉湯和厭氧肝湯37'C培養(yǎng) 4 28h，應(yīng)不在前面兩種培養(yǎng)基上生長，而僅在第三種培養(yǎng)基中迅速生長；
b) 對厭氧肉肝湯中的培養(yǎng)物巾涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陽性大桿菌， 單個生長，菌端較平；
c) 新鮮血平皿厭氧培養(yǎng)18-24h，形成突起、半透明、灰色、表面光滑、邊緣 整齊、l-3mm大的圓形菌落，菌落周圍有溶血環(huán)。
根據(jù)上述的培養(yǎng)特性、顯微鏡檢查、及血平皿的培養(yǎng)特點，培養(yǎng)的細(xì)菌為
魏氏梭菌。
2.抗原制造
2.1 1L營養(yǎng)肉湯配方
蛋白胨 10g
葡萄糖 10g
酵母粉 5g
氯化鈉 5g K2HP04 lg
牛肉膏 3-5g
2.2 1L厭氧肝湯配方
營養(yǎng)肉湯(PH=7.4) 1L 肝塊 100g 液體石蠟 500ML 2.3新鮮血平皿的制備 在100ML的營養(yǎng)肉湯中加入2g瓊脂粉，121"C高壓20min，待冷至45 50°C 時，以無菌操作加入無菌脫纖羊血或抗凝血IOML。立即輕輕震蕩混勻，倒入事 先準(zhǔn)備好的滅菌平皿，每個平皿倒入20ML，待凝固后4t:冰箱保存。
2.4接種培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度降到37"C以下，將各型菌按1: 4的 比例接到1L的厭氧肝湯中37。C孵箱培養(yǎng)，從接種計算，A、B、 C三型培養(yǎng)18h,D型菌培養(yǎng)20h結(jié)束培養(yǎng)，每瓶進行血平皿細(xì)菌計數(shù)，魏氏梭菌的濃度在 1.9xl06 2.3xl()7個/ml范圍之內(nèi)，實測菌液的電導(dǎo)率為330 680|im/cm。
3. 魏氏梭菌高壓脈沖電場滅活
3.1魏氏梭菌滅活將細(xì)菌濃度為10、10"個/mL的菌液用雙層紗布過濾后 去除肝塊，并用移液器吸走上層的石蠟油。以200mL/次進行高壓脈沖電場處理， 處理電場強度為32-50KV/cm，脈沖頻率為1008Hz，流速為30mL/min的條件下， 循環(huán)14min收集齒液，處理后的溫度保持在50°C以下。
4. 滅活效果檢驗
4.1收集的菌液進行滅活效果檢查
取滅活后的菌液在試管厭氧肝湯接種后培養(yǎng)IO天后用顯微鏡進行檢驗，顯 微鏡放大倍率為IOOO倍，同時在新鮮血平皿接種后培養(yǎng)24-72h，用肉眼進行觀 察無單個菌落及溶血環(huán)的產(chǎn)生。經(jīng)檢驗釆用前述高壓脈沖電場進行火活后的菌
液無細(xì)菌的繁殖和單個菌落的生長，證明本發(fā)明的滅活效果是可靠的。本發(fā)明 的這種方法不使用其它的化學(xué)藥物，因此經(jīng)本發(fā)明處理后的產(chǎn)物及處理人員接 觸整個滅活處理過程中均不存在任何如現(xiàn)有技術(shù)的甲醛處理后所可能產(chǎn)生的負(fù) 作用。
權(quán)利要求
1、魏氏梭菌高壓脈沖電場滅活方法，其特征是將魏氏梭菌接種于培養(yǎng)液中進行擴菌培養(yǎng)，魏氏梭菌的濃度為1.9×106～2.3×107個/ml后過濾得到菌液，取菌液200mL，在電場強度為32～50KV/cm、脈沖頻率范圍為500Hz～2000Hz、溫度在30～55℃、進行高壓脈沖電場處理，收集處理完畢的菌液，得到滅活的菌液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的魏氏梭菌高壓脈沖電場滅活方法，其特征是所用 脈沖頻率為1008Hz、菌液的流速為10~50ml/min、電導(dǎo)率為330~680|am/cm、溫 度為42 5(TC，進行高壓脈沖電場處理，處理時間為6 8min，收集處理完畢的 菌液，得到滅活的菌液。
3、 根據(jù)權(quán)利1和2的所述方法滅活處理后的檢驗方法，其特征是將經(jīng)滅活 的菌液接種于厭氧肝湯中，培養(yǎng)10天，用顯微鏡檢查無魏氏梭菌的生長繁殖。
4、 根據(jù)權(quán)利1和2的所述方法滅活處理后的檢驗方法，其特征是將經(jīng)滅活 的菌液接種于新鮮血平皿培養(yǎng)24-72h，肉眼觀察無單個菌落的生長及溶血環(huán)的 產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對魏氏梭菌滅活方法及檢驗方法。本發(fā)明的滅活方法是用電場強度為32～50KV/cm、脈沖頻率為500Hz～2000Hz的脈沖電場對菌液進行處理，處理的溫度在30～55℃，收集處理完畢的菌液，得到滅活的菌液。本發(fā)明的檢測方法是將滅活后的菌液接種于厭氧肝湯或新鮮血平皿中進行培養(yǎng)，再進行鏡檢。經(jīng)本發(fā)明處理后的產(chǎn)物及處理人員接觸整個的滅活處理過程中不存在任何如現(xiàn)有技術(shù)的甲醛處理后所可能產(chǎn)生的副作用。
文檔編號C12N13/00GK101481684SQ20091000570
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月24日
發(fā)明者周繼章, 宮曉煒, 曹小安, 藺國珍, 邱昌慶, 鄭福英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所