專利名稱：HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中目的基因的分子生物學檢測方法，特別是涉及 HLA-B^l502基因的STOR Green I檢測方法及其專用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
藥物不良反應(yīng)(ADR)指正常劑量的藥物用于預(yù)防、診斷、治療疾病或調(diào)節(jié)生理機能時出現(xiàn)的有害的和與用藥目的無關(guān)的反應(yīng)。部分ADR較輕微，但有些ADR可導致延長住院期、終生殘疾甚至死亡?？拱d癇藥物是引起皮膚型不良反應(yīng)的常見因素。皮膚型不良反應(yīng)包括輕度的斑丘疹及危及生命的嚴重不良反應(yīng)如史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens Johnson syndrome, SJS)和中毒性表皮壞死溶解癥(toxic印idermal necrolysis, TEN)等?？R西平是一種臨床上廣泛使用的治療癲癇、躁狂抑郁癥及神經(jīng)病理性疼痛(如牙疼、偏頭痛、 帶狀皰疹等)的藥物，也是臨床上常見的引起嚴重皮膚不良反應(yīng)的因素。2007年12月12 日，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布了關(guān)于卡馬西平的安全性信息，信息稱，服用卡馬西平(carbamaz印ine)可引起嚴重的皮膚不良反應(yīng)(即SJS和TEN，這兩種病癥是嚴重的皮膚和粘膜反應(yīng)，可導致永久性殘疾甚至致命)而這種過敏反應(yīng)在含人白細胞抗原等位基因HLA-B*1502的患者中更容易發(fā)生。根據(jù)國內(nèi)外研究結(jié)果及統(tǒng)計分析顯示，HLA-B^l502 等位基因與卡馬西平敏感引起的嚴重皮膚不良反應(yīng)具有很強的關(guān)聯(lián)性。服用卡馬西平者， 如具有HLA-B*1502基因，其產(chǎn)生史蒂芬強森癥候群毒性表皮溶解(SJS/TEN)的風險是無 HLA-B*1502基因患者的800倍以上。HLA_B*1502基因幾乎僅見于亞裔血統(tǒng)中(包括南亞的印度人)。在中國、泰國、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓和臺灣部分地區(qū)人群中，有10-15% 攜帶HLA-B*1502基因，而歐洲人群中，概率僅為_2%。因此，在服用卡馬西平等抗癲癇藥物的亞裔人群中，開展HLA-B*1502基因的檢測，對預(yù)防可能發(fā)生的嚴重皮膚過敏反應(yīng)具有十分重要的臨床意義。人白細胞抗原等位基因HLA_B*1502位于人類第六條染色體上，屬于人類白細胞抗原HLA中的一型。目前，檢測HLA-B*1502基因的方法主要有流式細胞儀檢測法和SSP法。 流式細胞儀檢測法主要檢測的是細胞表面抗原的表達，通過抗原表達的百分比，來確定是否具有該基因的表型。這種方法的缺陷在于結(jié)果的穩(wěn)定性上。因為在進行流式細胞儀檢測前，需對檢測樣本進行預(yù)處理。預(yù)處理的方法及預(yù)處理的時間上的不同，有時候會影響細胞表面抗原的表達，從而影響最終的結(jié)果判斷，導致檢測結(jié)果上的差異，容易造成漏檢或其它情況。SSP法檢測的是基因型，而不是看該基因的表達，所以從結(jié)果上來說，確定性和唯一性會比流式細胞檢測的方法要好，即只要存在該基因，通過設(shè)計好的特異性引物，即可結(jié)合引物的擴增情況，判讀最終結(jié)果。SSP方法的缺點主要在于結(jié)果檢測起來不夠簡便，擴增后的產(chǎn)物需要進行電泳，費時費力，而且在需要檢驗人員在目的條帶的判讀上具有一定的經(jīng)驗。SSP方法的另一個缺點在于通常需要幾管引物才能區(qū)分出HLA-B*1502的基因，引物的設(shè)計上也要多方面的考量，保證擴增片段的特異性。申請?zhí)枮?00810026919. 2的專利公開了一種檢測HLA-B*1502的方法，該方法需要6管引物才能做一人份檢測，該方法也可算作是通過SSP的方法檢測基因型，但在引物設(shè)計上還有可改良的地方?？傮w而言，流式細胞儀的方法操作起來較為簡便，但由于該方法是檢測抗原的表達，所以結(jié)果有可能因為實驗操作或其它因素導致偏差；而SSP法檢測的是基因型，結(jié)果唯一準確，但通常需要多管引物， 并且需要電泳來檢測結(jié)果，操作而且起來較煩瑣，不太適用于臨床檢驗。此外，由于B*1502 基因只有少數(shù)幾個堿基位點存在特異性(與其它序列高度相似的罕見型基因如B*1505、 B*1588、B*1531和B*1555的區(qū)別堿基)，在設(shè)計特異性引物后再無其它特異位點用以另行設(shè)計探針，因而也就不能應(yīng)用TaqMan探針的熒光法進行B*1502基因的檢測。因次，市場上迫切需要一種特異性高、靈敏度高、省時省力的檢測HLA_B*1502基因的方法及其試劑盒。SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。STOR Green I熒光PCR檢測的基本過程是1、開始反應(yīng)，當 SYBR Green I染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，STOR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，STOR Green I染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以在PCR結(jié)束后，還需要進行融解曲線的檢測，以確保雙鏈DNA產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明提供了一種HLA-B* 1502基因的STOR Green I檢測方法，以解決目前 HLA-B*1502基因檢測方法特異性和靈敏度不高、費時費力的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于對HLA_B*1502基因進行STOR Green I檢測的引物。本發(fā)明所提供的引物，是根據(jù)HLA_B*1502基因的的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計的，用以定性檢測待測樣品中的HLA-B*1502基因。具體來講，所述引物的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的第二個目的是提供一種特異性較高、靈敏度較高且省時省力的 HLA-B^l502基因的STOR Green I檢測方法。本發(fā)明所提供檢測方法，是以本發(fā)明的引物進行的STOR Green I檢測方法，具體方法包括以下步驟1)提取受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA ；2)以步驟1)提取的受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA為模板，在所述引物的引導下進行STOR Green I PCR擴增，同時用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和 SEQ ID NO :4所示的下游引物對模板中的beta-actin內(nèi)參基因進行SYBRGreen I PCR擴增；3)擴增結(jié)束后進行結(jié)果判讀1.出現(xiàn)熒光擴增曲線，且當內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35時，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為 HLA-B*1502陽性，若兩者的CT差值大于7，則結(jié)果為陰性；2.當內(nèi)參基因CT值小于或等于27時，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進行實驗。在上述HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測方法中，所述步驟2)中的25 μ IPCR 反應(yīng)體系為2*PCR Mix 12. 5ul(購自歐比特公司)，目的基因檢測mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或內(nèi)參基因檢測mix (上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ ul) 2. 5ul，樣品 DNA 2ul (50_100ng)，DEPC 水 8ul。所述步驟2)中的PCR反應(yīng)條件為先熱啟動95°C lOmin，1個循環(huán)；然后變性 95°C 15sec，退火 71°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后熔解 95 °C 15s, 60 °C lmin，95°C 30s， 60 °C 15s。為方便檢測，所述步驟幻中還包括用含有HLA_B*1502基因的陽性對照品和不含 HLA-B*1502基因的陰性對照品作為模板進行STOR Green I PCR擴增的步驟。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于對HLA_B*1502基因進行STOR Green I檢測的試劑盒。具體來講，本發(fā)明所提供的試劑盒包含2*PCR Mix,目的基因檢測mix(包含引物)，beta-actin內(nèi)參基因檢測mix (包含引物)和DEPC水。所述試劑盒中還可添加含有HLA_B*1502基因的陽性對照品。本發(fā)明提供了一種HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測方法及其專用引物。 該方法是以待檢樣品中HLA-B*1502基因為檢測對象，用本發(fā)明的引物可特異性的擴增出 HLA-B*1502基因的特異片段，該方法的特異性、準確度及穩(wěn)定性均較好。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、首次建立了 HLA_B*1502基因的SYBR Green I檢測方法，利用此檢測方法可以快速地在1個半小時內(nèi)完成對待測樣本中的HLA-B*1502基因的檢測，利用STORGreen I熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的其它優(yōu)點是無需另外設(shè)計熒光探針，降低了實驗成本，且適用性廣，對儀器的要求低，易于該方法的普遍推廣。2、本檢測方法通過特異性的引物設(shè)計，提高了擴增片段的特異性，可以把B*1502 基因與其它序列高度相似的罕見型分開，如B*1505、B*1588、B*1531和B*1555等。3、本檢測方法與HLA_B*1502基因的其它常規(guī)檢測方法，如流式細胞儀檢測法、 SSP法和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法相比，具有操作程序簡單易用的特點，并可進一步制成檢測試劑盒，操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。4、本檢測方法不僅能夠評價人是否具有HLA_B*1502基因，同時也為SJS/TEN的流行病學、致病機理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了依據(jù)。綜上所述，本發(fā)明能快速、準確地檢測出HLA_B*1502基因，對保障人類健康和卡馬西平類藥物的用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測方法及試劑盒可用于多種臨床樣本(骨髓、外周血或組織)中HLA-B*1502基因的核酸檢測，結(jié)果準確唯一，無繁瑣的檢測步驟，判讀結(jié)果簡單明了，并且試劑成本相對低廉，適應(yīng)市場推廣的需要，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為STOR-I和STOR-2引物擴增效果及特異性檢測結(jié)果的融解曲線
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圖2A為0. 3um和0. 5um引物濃度下HLA-B^l502基因的SYBR Green I擴增曲線圖2B為0. 3um引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測的熔解曲線圖2C為0. 5um引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測的熔解曲線圖2D為Ium引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測的熔解曲線圖 3 為 100ng、50ng、25ng、5ng 模板濃度下的 HLA-B^l502 基因的 SYBR GreenI 檢測的擴增曲線圖4A和圖4B為用本發(fā)明HLA_B*1502基因的STOR Green I法檢測10份臨床樣本的結(jié)果圖5為本發(fā)明HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測試劑盒及檢測方法的特異性檢測結(jié)果
具體實施例方式下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook J.等人所編《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。所用引物由上海英杰有限公司合成，所有序列測定工作均由上海英杰有限公司完成。實施例1、用于對HLA_B*1502基因進行STOR Green I檢測的引物的設(shè)計及篩選參照GenBank收錄的HLA_B*1502基因全序列，選擇HLA_B*1502基因的第2和第 3外顯子設(shè)計合成引物。引物設(shè)計中允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基。在引物的篩選過程中均需選擇在目的保守區(qū)中PCR擴增效率和STOR Green I染料結(jié)合效率較高的引物(所用PCR引物由上海英杰公司合成，引物要求PAGE純化。到貨時為引物干粉，用無菌水復(fù)溶后，對干粉進行含量測定，引物至0. 4um/ul貯存液后備用)。針對HLA-B*1502基因，共設(shè)計了 2組上、下游引物(STOR-1和STOR-2)，同時還設(shè)計了用于檢測beta-actin內(nèi)參基因的上、下游引物，序列如下SYBR-I上游弓丨物(SYBR-F' ) :5，_tggcaccgggagacacagatctccaa_3，；下游弓丨物(SYBR-R' ) :5，-gcagccgtacatgctctggag-3，。SYBR-2上游引物(STOR-F) 5，-accggaacacagatc tccaagaccaa-3，(序列表中 SEQ ID NO 1)；下游引物(SYBR-R):5，-tgccgtcgtaggcggactggtca-3，(序列表中 SEQ ID NO: 2)。beta-actin上游引物(beta-F):5，-ctgggacgacatggagaaaa-3‘(序列表中 SEQ ID NO:3)；下游引物(beta-R):5，-aaggaaggctggaagagtgc-3，(序列表中 SEQ ID NO :4)。SYBR-F'由洸個堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第250-275位堿基，STOR-R， 由21個堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第356-376位堿基，擴增片段長度為368bp ； SYBR-F由沈個堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第256-281位堿基，SYBR-R由23個堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第411-433位堿基，擴增片段長度為420bp ；beta-F由20個堿基組成，為beta-actin基因自5，端第305-3M位堿基，beta-R由20個堿基組成，為beta-actin基因自5，端第868-849位堿基，擴增片段長度為564bp。使用購自hvitrogen公司的基因組DNA提取試劑盒分別對不攜帶HLA_B*1502基因的3人(編號1、2、3)以及攜帶HLA-B*1502基因的3人(編號4、5、6)的外周血(骨髓或組織亦可)進行基因組DNA提取，同時將核酸模板分裝后于-70°C保存。然后，以提取的受試者骨髓的基因組DNA為模板，分別在引物STOR-I和STOR-2的引導下進行STOR Green I PCR擴增，同時以beta-actin為內(nèi)參。25 μ 1 PCR篩選體系為2*PCR Mix(購自歐比特公司)12. 5ul，目的基因檢測mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或內(nèi)參基因檢測 mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，樣品 DNA 2ul (25-100ng)，用 DEPC水補充反應(yīng)體系至25 μ 1。PCR程序為先熱啟動95°C lOmin，1個循環(huán)；然后變性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。擴增結(jié)束后，根據(jù)擴增后的熒光信號強度及融解曲線來判斷引物的擴增效果及特異性。結(jié)果如圖1所示(A為STOR-I引物組合的融解曲線，B為STOR-2引物組合的融解曲線；橫坐標為溫度，縱坐標為熒光值)，顯示第一組引物(STOR-I)的融解曲線存在著雜峰，表明引物的特異性不高，第二組引物(STOR-幻的融解曲線沒有雜峰，表明引物的特異性高。兩組引物的熒光信號差別不大。六分樣本獲得了與預(yù)期一致的結(jié)果。因此，將STOR-2 作為對HLA-B*1502基因進行STOR Green I檢測的引物。實施例2、對HLA-B*1502基因進行STOR Green I檢測的反應(yīng)體系的優(yōu)化一、引物用量的優(yōu)化引物濃度是影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素。若引物濃度低，會導致反應(yīng)不完全。若引物太多，則發(fā)生錯配及產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的可能性就增大。上、下游的引物量選擇一致。引物濃度的范圍在0. I-Ium0實驗中分別以0. 3um、0. 5um、Ium三個不同的引物濃度，針對同一模板(攜帶HLA-B*1502基因的患者的外周血基因組DNA)進行STOR Green I檢測，除引物外反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例1相同。結(jié)果如圖2A-圖2D所示(圖2A為0. 3um和0. 5um引物濃度下的STOR Green I 擴增曲線(曲線1為0. 5um,曲線2為0. 3um，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值)；圖2B為 0. 3um引物濃度下的熔解曲線圖，圖2C為0. 5um引物濃度下的熔解曲線，圖2D為Ium引物濃度下的熔解曲線圖，橫坐標為溫度，縱坐標為熒光值)，當引物達到Ium時，熔解曲線會出現(xiàn)小的雜峰，而0. 3um與0. 5um的熔解曲線都很好，但0. 5um的CT值更低些，說明模板的擴增效率更高。所以采用0. 5um作為對HLA-B*1502基因進行STOR Green I檢測的引物的終濃度。二、HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測中PCR反應(yīng)體積和模板用量的選擇考慮到不同熒光PCR儀器之間的通用性能，本發(fā)明選擇25μ 1反應(yīng)體系，已在 Roche, ABI, Bio-Rad系列等儀器上經(jīng)過測試。DNA模板上樣量的選擇選擇一系列的稀釋梯度模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度。一般來說，反應(yīng)的CT值在15-30個循環(huán)內(nèi)是比較合適的。選擇了模板 (攜帶HLA-B*1502基因的患者的外周血基因組DNA)的四個梯度濃度(100ng、50ng、25ng、 5ng)進行STOR Green I檢測，除模板外反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例1相同。
結(jié)果如圖3所示(曲線1為IOOng模板用量的擴增曲線，曲線2為50ng模板用量的擴增曲線，曲線4為25ng模板用量的擴增曲線，曲線4為5ng模板用量的擴增曲線，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值)，在模板濃度為IOOng的時候，CT值接近18 ；在模板濃度低至25ng的時候，CT值已經(jīng)接近30個循環(huán)，而5ng的時候已經(jīng)超出了，表明模板濃度在 25ng-100ng進行檢測是較為適宜的。所以本發(fā)明HLA-B*1502基因的STOR Green I檢測中 PCR反應(yīng)體系中的DNA總量定為25-100ng/反應(yīng)。實施例3、HLA-B^l502 基因的 STOR Green I 檢測一、構(gòu)建攜帶HLA_B*1502基因的重組質(zhì)粒p-HLA_B*1502由上海英杰公司合成HLA_B*1502基因序列，并克隆至pGEM-T fesy載體(購自Promega公司)載體多克隆位點的NoT I和Eco RI酶切位點之間，得到重組載體 p-HLA-B*1502。二、用HLA_B*1502基因的STOR Green I法檢測10份臨床樣本將5份確診的攜帶HLA_B*1502基因患者的外周血基因組DNA及5份不攜帶 HLA-B^l502基因患者的外周血基因組DNA作為模板(以p-HLA_B*1502作為陽性對照，以無菌水作為陰性對照)，用實施例1中的STOR-2引物和beta-actin內(nèi)參基因引物進行 HLA-B*1502基因的STOR Green I法檢測。每份樣本重復(fù)平行檢測3次。臨床樣本檢測體系為25μ1，依次加入下列成分2*PCR Mix(購自歐比特公司)12. 5ul，目的基因檢測mix(上、下游引物混合液，各1.25ul，0.4um/ul)或內(nèi)參基因檢測 mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，樣品 DNA2ul (25-100ng)，DEPC 水 8μ I。臨床樣本檢測反應(yīng)條件為先熱啟動95°C IOmin, 1個循環(huán)；然后變性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。結(jié)果如圖4A(5份陰性樣本，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值)和圖4B(5份陽性樣本，橫坐標為循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值)所示，結(jié)果顯示以5份確診的攜帶HLA-B*1502 基因患者的外周血基因組DNA和陽性對照質(zhì)粒為模板時出現(xiàn)了目的熒光擴增曲線，以其余樣本的DNA為模板時，均無該目的熒光擴增曲線，再根據(jù)CT值對結(jié)果做進一步的判讀，方法為1.出現(xiàn)熒光擴增曲線，且當內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于 35時，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為HLA-B*1502陽性，若兩者的CT差值大于 7，則結(jié)果為陰性；2.當內(nèi)參基因CT值小于或等于27時，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進行檢測。首先看是否出現(xiàn)目的熒光擴增曲線，這是一個直觀的判讀，其次還需看CT值，因為當CT值大于35后，檢測結(jié)果就不準確了，即使出現(xiàn)擴增曲線也無法判讀為陽性。CT值是與所檢測樣本的模板量是成反比的，CT值越高，則代表著模板量越低。CT值檢測結(jié)果如表1所示，與熒光擴增的檢測結(jié)果一致，表明用本發(fā)明的方法可用于HLA-B*1502基因檢測。表1用本發(fā)明HLA-B*1502基因的STOR Green I法檢測10份臨床樣本的CT值
權(quán)利要求
1.用于對HLA-B*1502基因進行STORGreen I檢測的引物，是根據(jù)HLA_B*1502基因的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計的，用以定性檢測待測樣品中的HLA-B*1502基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.一種用權(quán)利要求1或2所述引物對HLA-B*1502基因進行的STOR Green I檢測方法，具體方法包括以下步驟1)提取受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA;2)以步驟1)提取的受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA為模板，在所述引物的引導下進行STOR Green I PCR擴增，同時用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和SEQ ID NO 4所示的下游引物對模板中的beta-actin內(nèi)參基因進行STORGreen I PCR擴增；3)擴增結(jié)束后進行結(jié)果判讀1.出現(xiàn)熒光擴增曲線，且當內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35時，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為 HLA-B*1502陽性，若兩者的CT差值大于7，則結(jié)果為陰性；2.當內(nèi)參基因CT值小于或等于 27時，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述步驟2)中的25μ 1 PCR反應(yīng)體系為2*PCR Mix 12. 5ul，目的基因檢測mix或內(nèi)參基因檢測mix 2.5ul，樣品DNA 2ul (25-100ng)，DEPC 7jC 8 μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述步驟2)中的PCR反應(yīng)條件為 先熱啟動95°C 10min，l個循環(huán)；然后變性95°C 15sec，退火71°C lmin，共35個循環(huán)；最后熔解 95°C 15s,60°C lmin,95°C 30s, 60°C 15s。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的檢測方法，其特征在于所述步驟2~)中還包括用含有HLA-B*1502基因的陽性對照品和不含HLA_B*1502基因的陰性對照品作為模板進行STOR Green I PCR擴增的步驟。
7.一種包括權(quán)利要求1或2所述引物的HLA-B*1502基因的STOR Green I檢測試劑品.ο
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含2*PCRMix、目的基因檢測mix、內(nèi)參基因檢測mix和DEPC水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括含有 HLA-B* 1502基因的陽性對照品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測方法及其專用引物與試劑盒。該引物是根據(jù)HLA-B*1502基因的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計的，用以定性檢測待測樣品中的HLA-B*1502基因。所述引物的上游引物具有序列表中SEQID NO1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列。本發(fā)明能快速、準確地檢測出HLA-B*1502基因，對保障人類健康和卡馬西平類藥物的用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測方法及試劑盒可用于多種臨床樣本(骨髓、外周血或組織)中HLA-B*1502基因的核酸檢測，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N21/64GK102296109SQ201110183320
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者吳賡, 徐玉現(xiàn), 毛吉揚 申請人:北京思爾成生物技術(shù)有限公司