專利名稱：Ly6h基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，其在大腦中有很高水平的特異性表達(dá)，尤其是這樣一種基因，其編碼隸屬于Ly6家族(參見下文引用的文獻(xiàn))的一種新型蛋白，該蛋白用于純化血干細(xì)胞、研究血細(xì)胞的分化、激活免疫細(xì)胞、抑制活性免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、治療腫瘤等等。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種由所述基因編碼的新型蛋白及其特異性的抗體。另外，本發(fā)明也涉及到一種用于神經(jīng)變性疾病如早老性癡呆的治療或預(yù)防的組合物。
Ly6家族在骨髓及淋巴細(xì)胞中有高水平的特異性表達(dá),其因此被用于T細(xì)胞分化及造血干細(xì)胞的標(biāo)記(免疫細(xì)胞生物學(xué)(Immunol.CellBiol.,),73,277-296(1995)]。雖然其在體內(nèi)的很多功能仍未知，但其在淋巴系統(tǒng)中的表達(dá)受到高度調(diào)控的發(fā)現(xiàn)提示這些蛋白在免疫系統(tǒng)中有著重要的作用，尤其是在T細(xì)胞的分化及功能方面。例如，據(jù)報(bào)道，Ly6c調(diào)控CD8+T細(xì)胞通過整合素依賴性粘附返回淋巴結(jié)[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,94,6898-6903(1997)]。
另外,許多GPI-固著蛋白已知與蛋白激酶互相作用[科學(xué)(Science)，254,1016-1019(1991)]。例如，Ly6與pS61ck及p59fyn的相互作用提示其可能與T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[Eur.J.Immunol.,23,825-831(1993)]。同樣也已經(jīng)報(bào)道了獲自Ly6a缺陷性小鼠的T細(xì)胞在對(duì)抗原刺激反應(yīng)時(shí)增殖能力的增強(qiáng)[J.Exp.Med.,186,705-717(1997)]。其不僅可能調(diào)控T細(xì)胞的活化，同時(shí)也可能調(diào)控B細(xì)胞的活化[J.Immunol.,144,2197-2204(1990)]。
另外,幾個(gè)GPI-固著蛋白已知在淋巴系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)中被表達(dá)并且發(fā)揮作用[自然(Nature),379,826-829(1996)；Curr.Biol.,7,705-708(1997)]。已有報(bào)道，Ly6家族中的Ly6a.2及Ly6E在這兩個(gè)系統(tǒng)中呈遞并發(fā)揮作用[Proc.Nati.Acad.Sci.,USA.,85,2255-2259(1996)；J,lmmunol,157,969-973(1996)]。
闡明Ly6家族的這種蛋白所起的生理學(xué)作用及編碼該蛋白的基因及其所延伸的其他信息，被認(rèn)為在與血干細(xì)胞純化、血細(xì)胞的分化研究、免疫細(xì)胞的激活、免疫細(xì)胞激活的抑制、腫瘤的治療等相關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)科學(xué)研究及制藥領(lǐng)域是非常有用的。
最近有報(bào)道，在患有早老性癡呆癥的病人體內(nèi)存在與年齡相關(guān)性腦萎縮相應(yīng)的腦顳葉過度萎縮[Jobst,K.A.,et al.,Lancet,343,829-830(1994)]，這提示與腦顳葉相關(guān)的一些基因或基因組在某種程度上與早老性癡呆癥的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)系。根據(jù)邏輯上分析，該已被鑒別且詳細(xì)描述的基因應(yīng)該對(duì)早老性癡呆病癥的治療和預(yù)防起一定的作用。
因此，本發(fā)明的目的是提供上述信息，尤其是一種屬于Ly6家族的新的人類蛋白及編碼該蛋白的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種藥物組合物，其用于治療或預(yù)防不同的神經(jīng)變性疾病，尤以早老性癡呆癥為代表。
本發(fā)明的發(fā)明者研究獲自不同人體組織的基因，并成功分離及表征滿足上述目的的新的腦特異性基因。發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種新分離的基因的表達(dá)水平在早老性癡呆癥病人的顳葉中顯著降低，包括海馬及內(nèi)嗅皮層；這正是早老性癡呆癥發(fā)生和發(fā)展、癡呆及其它身心障礙的病因因素；該基因及其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)于治療和預(yù)防早老性癡呆癥有顯著作用。本發(fā)明正是建立在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上。
(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(b)具有將如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列刪除、替代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后形成的氨基酸序列的蛋白，其生理學(xué)活性選自神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及記憶(腦記憶形成)活性中的至少一種。
本發(fā)明同樣提供了上述基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，更為特別的是其為一個(gè)人類基因。
另外，本發(fā)明提供了一個(gè)基因其包括下述核苷酸序列(a)或(b)，尤其是相應(yīng)的人類基因。
(a)一個(gè)含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多聚核苷酸(b)一個(gè)多聚核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA進(jìn)行雜交。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)含有所述基因的基因表達(dá)載體、含有所述基因表達(dá)載體的寄主細(xì)胞、一個(gè)由所述寄主細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物、一個(gè)為本發(fā)明基因編碼的蛋白及一個(gè)與所述表達(dá)產(chǎn)物或所述蛋白進(jìn)行結(jié)合的抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的組合物，其包括所述蛋白或其等價(jià)物，或作為一種活性成分與藥物載體結(jié)合的所述表達(dá)產(chǎn)物。更為詳細(xì)的是，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的組合物，其中所述活性成分是一種具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白或其等價(jià)物；或一種基因產(chǎn)物，其通過含有如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的基因的全部或部分表達(dá)而獲得，且其生理學(xué)活性選自神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及腦記憶形成(記憶、編碼)活性中的至少一種。
特別是，本發(fā)明提供了一種治療及預(yù)防早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病的組合物。
此外，本發(fā)明提供了一個(gè)含有SEQ ID NO:2所示核苷序列中的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸組成的有義寡聚核苷酸鏈、一個(gè)基因治療組合物，其含有所述的寡聚核苷酸有義鏈作為活性成分與藥物載體結(jié)合、及一個(gè)含有由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)組成核苷酸形成的寡聚核苷酸序列的基因特異性探針。
此外，本發(fā)明提供了一個(gè)用于篩選候選組合物的方法，此組合物或者能夠連接到所述蛋白、其等價(jià)物或表達(dá)產(chǎn)物上，或者能夠影響所述蛋白、其等價(jià)物或表達(dá)產(chǎn)物的活性。還提供了一個(gè)用于所述篩選的試劑盒和被篩選的所述組合物。
氨基酸、多肽、核苷酸序列、核苷酸等等的表述在說明書中都使用簡(jiǎn)寫，其與IUPAC-IUB(IUPAC-IUB生物術(shù)語(yǔ)通訊(Communicationon Biological Nomenclature),Eur.J.Biochem.,138,9(1984))、“與核苷酸序列和/或氨基酸序列相關(guān)的專利說明書的書寫準(zhǔn)則”(日本專利局編輯)及本領(lǐng)域內(nèi)編碼或符號(hào)使用習(xí)慣所推薦的規(guī)則一致。
本發(fā)明基因的一個(gè)具體的實(shí)施例是一個(gè)由名為＂LY6H＂的PCR產(chǎn)物的DNA序列演繹的基因,如后實(shí)施例所述。其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
LY6H基因是一個(gè)cDNA，其含有一個(gè)420個(gè)密碼子可讀框(ORF)編碼一個(gè)具有如SEQ ID NO:1所示140個(gè)殘基的氨基酸序列的新腦特異性蛋白(LY6H蛋白)，且其具有一個(gè)854個(gè)核苷酸的全長(zhǎng)序列。
使用FASTA程序在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索[Person,W.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,85,2444-2448(1988)]，發(fā)現(xiàn)作為本發(fā)明基因表達(dá)產(chǎn)物的LY6H蛋白與鼠Ly6家族蛋白具有很高的同源性[Immunol.Cell Biol.,73,277-296(1995)]。此外還發(fā)現(xiàn)了高度的基因?qū)蛲葱?。因此，本發(fā)明的基因被認(rèn)為是一種新的人類Ly6基因。
經(jīng)過測(cè)序隨機(jī)選自一個(gè)胎兒人腦cDNA庫(kù)的超過28000cDNA克隆，本發(fā)明的LY6基因被鑒別為這樣一種基因，其在腦中被特異性表達(dá)。通過RH染色體繪圖[Hum.Mol.Genet.,5,339-346(1996)]，基因在染色體上的定位被認(rèn)為在8q24.3。
因此，本發(fā)明的基因及表達(dá)產(chǎn)物有助于監(jiān)測(cè)該基因在不同組織中的表達(dá)、通過基因工程技術(shù)制備人類LY6H蛋白及構(gòu)建其抗體，由此使造血干細(xì)胞的純化，血細(xì)胞分化的研究，免疫細(xì)胞的激活或抑制、腫瘤的治療等成為可能。
此外，本發(fā)明所提供的表達(dá)產(chǎn)物(多肽)使得神經(jīng)變性疾病如早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、帕金森病及腦缺血的預(yù)防及治療藥物的供應(yīng)成為可能。更進(jìn)一步，本發(fā)明的基因有義鏈可被用作一種藥物組合物用于基因治療，從而可以抑制或阻止上述神經(jīng)變性疾病的發(fā)生與發(fā)展。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，用于篩選連接于本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物(多肽)或影響其活性的組合物。還提供一個(gè)相關(guān)的篩選試劑盒及被篩選的組合物。對(duì)于該篩選組合物的鑒別，可以利用與本發(fā)明基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的抗體來(lái)進(jìn)行。
在說明書中，術(shù)語(yǔ)“基因”被用于意指一個(gè)雙鏈DNA及其組成單鏈DNA，無(wú)論正義或反義，無(wú)論長(zhǎng)短。因此，除非特別指出，本發(fā)明的基因(DNA)包括一個(gè)含有人類基因組DNA的雙鏈DNA、一個(gè)包括cDNA的單鏈DNA(有義鏈)、一個(gè)具有與所述有義鏈互補(bǔ)序列的單鏈DNA(反義鏈)及所述DNA的片斷。
本發(fā)明的基因(DNA)可以包括一個(gè)引導(dǎo)序列、一個(gè)編碼區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子。多聚核苷酸包括RNA及DNA。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA。多肽包括其片斷、同源體、衍生物或突變體。突變體包括天然形成的等位基因、天然不存在的突變體、其氨基酸序列通過刪除、替代、增加和/或插入發(fā)生變異的突變體及與修飾的氨基酸序列功能相同的突變體。
氨基酸序列的這種修飾(如突變)例如可以源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可以通過人工誘導(dǎo)天然基因產(chǎn)生(如本發(fā)明的特異性基因)。
這些突變體與未突變多肽至少可以有70％的同源性，較好為80％，更好為95％，最好為97％。上述多肽、其突變體及同源體具有一個(gè)共有的保守結(jié)構(gòu)特征，并且可能具有如本發(fā)明基因的表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，例如神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)元生長(zhǎng)促進(jìn)活性、神經(jīng)再生活性及神經(jīng)膠質(zhì)激活活性。通過使用序列分析軟件如FASTA[Clustal,V.,Methods Mol.Biol.,25,307-318(1994)]搜索數(shù)據(jù)庫(kù)如SWISSPLOTS數(shù)據(jù)庫(kù)，可以分析多肽的同源性。
編碼該突變體的基因?qū)τ诎被崽鎿Q不發(fā)生作用。因此，該核苷酸序列編碼的氨基酸殘基不發(fā)生改變。
可保守性替換的氨基酸殘基，即此氨基酸殘基可被其他氨基酸殘基替代但不丟失具有原始氨基酸殘基的多肽的活性，及相應(yīng)的原始氨基酸殘基列舉如下原始氨基酸殘基保守性替代的氨基酸殘基Ala SerArg LysAsn Gln,HisAsp GluCys SerGln AsnGlu AspGly ProHis Asn或GlnIle Leu或ValLeu Ile或ValLys Arg、Aln或GluMet Leu或IlePhe Met、Leu或TyrSer ThrThr SerTrp TyrTyr Trp或PheVal Ile或Leu此外，Cys可以被替換為另一種不同的氨基酸殘基，例如Ser,Ala或Val。
本發(fā)明的基因和表達(dá)產(chǎn)物提供了用于闡釋、詳述、診斷、預(yù)防和治療神經(jīng)變性疾病如早老性癡呆癥、腦缺血及帕金森氏病的信息及方法。本發(fā)明的基因同樣可被有效地用于開發(fā)新的藥物，此藥物能夠誘導(dǎo)用于治療所述神經(jīng)變性疾病的基因的表達(dá)。此外，監(jiān)測(cè)本發(fā)明基因的表達(dá)及在個(gè)體或組織中的表達(dá)產(chǎn)物，以及監(jiān)測(cè)基因突變(刪除或點(diǎn)突變)或其異常表達(dá)，可被有效地用于闡釋及診斷所述神經(jīng)變性疾病。
本發(fā)明的基因包括但并不限于具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列(其編碼一個(gè)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白)的基因，例如，一個(gè)具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的基因(LY6H基因)。例如，本發(fā)明的基因可以是一個(gè)基因，其編碼一個(gè)通過指定修飾源自上述定義氨基酸序列的氨基酸序列；一個(gè)基因，其編碼一個(gè)具有與上述定義氨基酸序列有指定同源性的氨基酸序列；或者一個(gè)基因，其具有與上述任一基因具有指定同源性的核苷酸序列。
上面提到的對(duì)于一個(gè)已定義的核苷酸序列或氨基酸序列的指定的同源性意味著該同源性至少不低于70％，優(yōu)選不低于90％，更優(yōu)選不低于95％，最優(yōu)選不低于97％。本發(fā)明包括了具有該同源性的同源體(基因同源體及蛋白同源體)。
本發(fā)明的基因包括“一個(gè)基因，其編碼的多肽的氨基酸序列(修飾的氨基酸序列)由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列刪除、替代或者增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后形成”?！皠h除、替代或者增加”的范圍和/或位置并非特別限制在當(dāng)具有修飾氨基酸序列的多肽在生物學(xué)功能上等價(jià)于具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽(LY6H蛋白)時(shí)。上面提到的生物學(xué)“功能”包括神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性、及記憶(腦記憶形成)活性等生理活性，且“等價(jià)物”是一個(gè)具有這些功能的多肽。因此，具有此修飾氨基酸序列的蛋白包括一個(gè)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的片斷(一個(gè)連續(xù)殘基片斷)的蛋白(等價(jià)物)及生理學(xué)活性類似于上述全長(zhǎng)氨基酸序列的蛋白。更進(jìn)一步，編碼具有上述修飾氨基酸序列的多肽的基因可能是一種基因，其可與本發(fā)明編碼一個(gè)具有修飾前氨基酸序列的多肽的基因一起監(jiān)測(cè)。被用于所述修飾的術(shù)語(yǔ)“多數(shù)”一般指不少于2個(gè)至幾個(gè)，但該范圍并不是限制性的。
本發(fā)明的LY6H基因的同源體(及該基因表達(dá)產(chǎn)物的同源體)意指一系列相關(guān)的基因(及其表達(dá)產(chǎn)物)，其在序列上具有同源性，且基于結(jié)構(gòu)特征、相同的基因表達(dá)模式、所述生物學(xué)功能的相似性其已被認(rèn)為是一個(gè)基因家族。其當(dāng)然包括本發(fā)明基因的等位基因。
一個(gè)氨基酸序列的修飾(突變)可以自然發(fā)生，例如通過自發(fā)突變及翻譯后修飾，但也可在天然基因的基礎(chǔ)上人工誘導(dǎo)(例如本發(fā)明的特異性基因)。本發(fā)明覆蓋一些或所有具有上述特征的修飾基因，不考慮突變或修飾的原因或方式。
所述氨基酸序列人工修飾(突變)方法包括基因工程技術(shù)例如定點(diǎn)突變[酶學(xué)方法(Methods in Enzymology),154,350,367-382(1987)；ibid.,100,468(1983)；核酸研究(Nucleic Acids Res.),12,9441(1984)；＂Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，第二叢)1″:IdenshiKenkyuho(基因研究方法)Ⅱ，日本生物化學(xué)協(xié)會(huì)(ed.),p105(1986),etc.]、化學(xué)合成方法例如磷酸三酯法及磷酰胺法[J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967)；ibid.,91,3350(1969)；科學(xué)(Science),150,178(1968)；Tetrahedron Lett.,22,1859(1981)；ibid.,24,245(1983)]及這些方法的組合。
具體來(lái)說，DNA可以通過化學(xué)方法合成，例如磷酸三酯法或磷酰胺法，通過市售的自動(dòng)寡核苷酸合成儀可以完成該合成。通過合成一個(gè)互補(bǔ)鏈，且在適宜條件下退火或利用一適宜引導(dǎo)序列及DNA多聚酶，可由化學(xué)合成的單鏈片斷制備雙鏈片斷。
本發(fā)明基因的一個(gè)具體的實(shí)施例是一個(gè)具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的基因。該核苷酸序列的編碼區(qū)(如SEQ ID NO:2所示序列)是一個(gè)編碼如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的各自氨基酸殘基的密碼子的組合的實(shí)施例。本發(fā)明的基因不限制于具有所定義的核苷酸序列的基因而且包括通過選擇編碼每一個(gè)氨基酸殘基的密碼子的任意組合獲得的核苷酸序列的基因。密碼子的挑選可以參照寄主細(xì)胞中密碼子的使用通過常規(guī)的方法進(jìn)行[核酸研究(Nucleic Acid Res.),9,43(1981)]。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的基因包括一個(gè)與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有一定水平同源性的核苷酸序列。由所述同源性水平推斷，多聚核苷酸及互補(bǔ)的多聚核苷酸與SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列至少具有70％的同源性，較好為90％，更好為95％。具有如此水平同源性的基因可以作為一種多聚核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA進(jìn)行雜交。更為具體的是，具有所述同源性水平的基因范疇內(nèi)包括一個(gè)基因，其核苷酸序列在6×SSC在65℃下過夜或50％甲酰胺-4×SSC在37℃下過夜培養(yǎng)的條件下能與具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的DNA進(jìn)行雜交。這里，SSC代表標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(1×SSC=0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉)。
以本發(fā)明所述基因在說明書中所述的任一具體實(shí)施例所提供的序列信息為基礎(chǔ)，利用常規(guī)的基因工程技術(shù)可以很容易制備和分離本發(fā)明基因。[例如，分子克隆，第2版(MolecularCloning,2dEd),Cold SpringHarbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生化實(shí)驗(yàn)，第2系列(Experinents in Biochemistry,Second Series)):“Idenshi Kenkyuho(基因研究方法(Methods in Gene Research))Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ，日本生化協(xié)會(huì)(ed.),(1986)]。
更為詳細(xì)的是，從合適的來(lái)源制備cDNA庫(kù)也可完成上述實(shí)驗(yàn)，其中通過利用傳統(tǒng)程序并使用本發(fā)明基因的特異性抗體或合適的探針從該庫(kù)中挑選目的克隆，可使本發(fā)明的基因得以表達(dá)。[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981)；科學(xué)(Science),222,778(1983)]。
可用于上述程序的cDNA的來(lái)源,可以包括表達(dá)本發(fā)明基因的不同的細(xì)胞及組織及由此獲得的培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是腦組織?？梢砸詡鹘y(tǒng)的方式從這樣一個(gè)來(lái)源進(jìn)行全部RNA的分離、mRNA的分離和純化、及cDNA的獲得和克隆。此外，cDNA庫(kù)是可購(gòu)得的，且利用這樣一個(gè)cDNA庫(kù)可實(shí)施本發(fā)明，例如，這些cDNA庫(kù)可獲自CLONTECH Lab.Inc。
從cDNA文庫(kù)中篩選本發(fā)明的基因的方法并不是專門限制性的，傳統(tǒng)的方法也可以被使用。篩選方法的實(shí)施例包括一種免疫篩選方法，其用cDNA所產(chǎn)生蛋白的特異性抗體去挑選出相應(yīng)的cDNA克?。灰环N方法，其利用一探針選擇性連接到目的DNA序列，例如噬斑雜交法、克隆雜交法及上述方法的組合。
按照本發(fā)明基因的核苷酸序列信息化學(xué)合成的DNA通?？梢宰鳛樯鲜龇椒ǖ奶结?。已經(jīng)獲得的本發(fā)明的基因或其中的片斷也可被有效地用作探針。按照本發(fā)明基因的核苷酸序列信息建立的正義引物及反義引物可被用作篩選探針。
作為探針使用的核苷酸序列可以是相應(yīng)于SEQ ID NO:2的部分核苷酸序列，且其包括至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，較好為20個(gè)連續(xù)的核苷酸，更好為30個(gè)連續(xù)的核苷酸，最好為50個(gè)連續(xù)的核苷酸。此外，具有如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸序列的陽(yáng)性克隆也可被用作探針。
在獲取本發(fā)明基因時(shí)，可優(yōu)先使用PCR進(jìn)行DNA/RNA擴(kuò)增[科學(xué)(Science),230,1350(1985)]。尤其是當(dāng)一全長(zhǎng)cDNA很難從庫(kù)中獲取時(shí)，可優(yōu)先使用RACE方法[cDNA末端的快速擴(kuò)增(Rapidamplification of cDNA ends)；Jikken Igaku(實(shí)驗(yàn)藥學(xué)(ExperimentalMedicine)),12(6),35(1994)],尤其是5′-RACE方法[M.A.Frohman,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988)]。
參照此處公開的本發(fā)明基因的序列信息，可以很科學(xué)地確定且使用傳統(tǒng)的方法合成在該P(yáng)CR方法中所使用的引物。使用前述傳統(tǒng)方法可以進(jìn)行擴(kuò)增DNA/RNA片斷的分離或純化，如凝膠電泳法。
使用雙脫氧測(cè)序法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977)]或者化學(xué)測(cè)序法[酶學(xué)方法(Methods in Enzymology),65,499(1980)]或者更為方便的商業(yè)用途的測(cè)序試劑盒，可對(duì)由上述方法獲得的本發(fā)明基因或各種DNA片斷進(jìn)行測(cè)序。
例如，利用如此獲得的本發(fā)明基因，使用本發(fā)明基因的核苷酸序列的全部或一部分可特異性監(jiān)測(cè)本發(fā)明基因在一個(gè)體或指定的組織中的表達(dá)或不表達(dá)。
上述監(jiān)測(cè)可以通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行。例如使用RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；E.S.Kawasaki,et al.,Amplification of RNA.In PCRProtocol.A guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,21-27(1991)]、RNA印跡法[分子克隆(Molecular Cloning),Cold Spring Harbor Lab.(1989)]、用原位RT-PCR進(jìn)行細(xì)胞水平上的測(cè)定[Nucl.Acids Res.,21,3159-3166(1993)]或者原位雜交、NASBA[核酸序列基礎(chǔ)上的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplifimtion)，自然(Nature),350,91-92(1991)]及類似的傳統(tǒng)技術(shù)來(lái)進(jìn)行RNA擴(kuò)增。首選使用RT-PCR檢測(cè)方法。
當(dāng)使用PCR方法用于上述目的時(shí)所使用的引物并未限制在以下范圍內(nèi)其為本發(fā)明基因特有的，能夠選擇性擴(kuò)增特定的基因，能夠在本發(fā)明基因的序列信息的基礎(chǔ)上進(jìn)行科學(xué)地確定。一般來(lái)講，引物具有本發(fā)明基因的一部分序列，其大約是10-35個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，最好是15-30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
因此，本發(fā)明的基因包括可作為特定引物和/或特定探針用于檢測(cè)本發(fā)明LY6H基因的DNA片斷。
上面提到的DNA片斷可被定義為一種多聚核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:2所顯示的核苷酸序列的多聚核苷酸進(jìn)行雜交。上面提到的嚴(yán)格條件可以是針對(duì)引物或探針的一般條件，其并未特別限制。例如，上面提到的條件6×SSC、65℃、過夜或50％甲酰胺-4×SSC、37℃、過夜培養(yǎng)。
通過在標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)中應(yīng)用本發(fā)明的基因，可大量制備此基因的表達(dá)產(chǎn)物(多肽)或一個(gè)含有其的蛋白，同時(shí)具有很高的重現(xiàn)性。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種多肽其具有本發(fā)明基因編碼的氨基酸序列(本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物)、一種用于制備該多肽的本發(fā)明基因的載體、一個(gè)用該載體轉(zhuǎn)染的寄主細(xì)胞、一種包括培養(yǎng)寄主細(xì)胞在內(nèi)的用于制備本發(fā)明多肽的方法。
具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽(LY6H蛋白)是本發(fā)明多肽的一個(gè)特定的實(shí)施例。本發(fā)明多肽并不限制于該LY6H蛋白，還包括其同源體。該同源體可以是一種多肽，其氨基酸序列由如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列刪除、替代、或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后形成，且其保留LY6H蛋白的功能。該同源體的一個(gè)特定的實(shí)施例是所述LY6H基因同源體的表達(dá)產(chǎn)物(LY6H等價(jià)基因包括其等位基因)。
更進(jìn)一步，本發(fā)明LY6H蛋白的同源體包括與含有如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的多肽(其獲自任一哺乳動(dòng)物如馬、羊、牛、犬、猴、貓、熊，及嚙齒類如大鼠、小鼠、兔子等)活性或功能相同的蛋白。
利用傳統(tǒng)的重組DNA技術(shù)[例如，科學(xué)(Science),224,1431(1984)；生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.),130,692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80,5990(1983)]，基于本發(fā)明所提供的基因序列信息，可制備本發(fā)明的多肽。
更為特定的情況，所述多肽的制備包括下列程序構(gòu)建一個(gè)重組DNA(表達(dá)載體)，其允許編碼目的蛋白的基因在寄主細(xì)胞中表達(dá)；使用載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞；培養(yǎng)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體；從液體培養(yǎng)基收集多肽。
上面所提到的寄主細(xì)胞可以是任何一個(gè)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核寄主細(xì)胞可以是大腸桿菌、枯草桿菌或其他普通的細(xì)菌，最好使用大腸桿菌，尤其是大腸桿菌K12。真核寄主細(xì)胞包括脊椎動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞及其前體，還有猴細(xì)胞系COS[Cell,23:175(1981)]，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞及其二氫葉酸還原酶缺陷細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,77:4216(1980)]。作為后者，酵母屬酵母細(xì)胞可被優(yōu)先考慮，但并不排除其他選擇。
當(dāng)原核細(xì)胞被用作寄主細(xì)胞時(shí)，通過使用一個(gè)可在特定的寄主細(xì)胞中復(fù)制的載體并且在本發(fā)明基因的上游增加一個(gè)啟動(dòng)子及一個(gè)SD(Shine及Dalgarno)序列，可以制備表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，以便該基因可在那里表達(dá)，且蛋白合成起動(dòng)必需的起始密碼子(如ATG)也可被有效使用。經(jīng)常使用獲自大腸桿菌的質(zhì)粒例如pBR322,pBR325,pUC12,pUC13等等作為上面所提到的載體。但是這些并非唯一的選擇，其他已知的載體也可被使用。使用大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)所使用的商業(yè)載體包括PGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech)、pMAL-C2、pMA1-P2(New England Biolabs)、pET21、pET21/lacq(Invitrogen)及pBAD/His(Invitrogen)。
當(dāng)脊椎動(dòng)物細(xì)胞被用作寄主細(xì)胞時(shí)所使用的表達(dá)載體常具有一個(gè)處于要表達(dá)的本發(fā)明基因上游的啟動(dòng)子、RNA接合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。該載體可進(jìn)一步具有一個(gè)必需的復(fù)制起點(diǎn)。例如這樣一個(gè)表達(dá)載體，其為攜有SV40的早期啟動(dòng)子的pSV2dhfr[分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.),1:854(1981)]。除了上述載體外，幾個(gè)已知的商業(yè)上使用的載體也可被使用。商業(yè)上使用的用于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體包括用于動(dòng)物細(xì)胞的載體，例如pEGFP-N、pEGFP-C(CLONTECH)、pIND(Invitrogen)、pcDNA3.1/His(Invitrogen)等等，及用于昆蟲細(xì)胞的載體，例如pFastBac HT(Gibci BRL)、pAcGHLT(PharMingen)、pAc5/V5-His、pMT/V5-His及pMT/Bip/V5-his(allInvitrogen)。
具有酸性磷酸酯酶基因的啟動(dòng)子的pAM82[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80:1(1983)]是使用酵母細(xì)胞作為寄主細(xì)胞時(shí)的表達(dá)載體的一個(gè)具體的例子。商業(yè)的用于酵母細(xì)胞的表達(dá)載體包括pPICZ(invitrogen)及pPICZα(Invitrogen)。
啟動(dòng)子也并不特別限定。當(dāng)埃希氏桿菌屬用作寄主細(xì)胞時(shí)，色氨酸(trp)啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、PL/PR啟動(dòng)子等等可被有效使用。當(dāng)寄主細(xì)胞是芽孢桿菌屬時(shí)，SP01啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等等可被使用。當(dāng)酵母細(xì)胞被用作寄主細(xì)胞時(shí)，pH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等等可被優(yōu)先使用。當(dāng)寄主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，啟動(dòng)子優(yōu)選SV40-衍生啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫因啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子及SRα啟動(dòng)子。
作為本發(fā)明基因的表達(dá)載體，傳統(tǒng)的結(jié)合蛋白表達(dá)載體可以優(yōu)先被使用。pGEX(Promega)對(duì)于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)-融合蛋白的表達(dá)是載體的一個(gè)具體例子。
多聚核苷酸序列中編碼成熟多肽的序列有助于多肽從寄主細(xì)胞中表達(dá)和分泌。此多聚核苷酸序列包括分泌序列、引導(dǎo)序列及標(biāo)記序列。(hexahistidine標(biāo)記，histidin標(biāo)記)用于在細(xì)菌細(xì)胞中結(jié)合成熟多肽的純化，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該標(biāo)記為血球凝集素(HA)標(biāo)記。
將重組DNA(表達(dá)載體)引入寄主細(xì)胞的方法及相關(guān)的轉(zhuǎn)化方法并不特別限制，各種標(biāo)準(zhǔn)方法也可被使用。
獲得的轉(zhuǎn)化體可以用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，借此按照本發(fā)明專門設(shè)計(jì)的基因所編碼的目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外、或細(xì)胞膜上表達(dá)且產(chǎn)生(聚集/分泌)。
所使用到的培養(yǎng)基按照其所采納的寄主細(xì)胞的類型從不同的傳統(tǒng)培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，該培養(yǎng)基必須有利于寄主細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明的重組蛋白(LY6H蛋白)可以通過不同的分離技術(shù)充分利用其物化特性進(jìn)行選擇性分離和純化，例如[＂Seikagaku Data Book(生化數(shù)據(jù)手冊(cè))Ⅱ＂,1175-1259，第一版，第一次印刷，June 23,1980,TokyoKagaku Dojin K.K.；生物化學(xué)(Biochemistry),25(25),8274(1986)；Eur.J.Biochem.,163,313(1987),etc.]。
這些技術(shù)例如有傳統(tǒng)的重組方法、蛋白質(zhì)沉降劑的處理(鹽析法)、離心、滲透休克法、超聲波分裂、超濾法、不同類型的層析技術(shù)如分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析及高壓液相層析(HPLC)、透析、及上述技術(shù)的組合。優(yōu)選的技術(shù)包括親和層析，其柱上偶聯(lián)了本發(fā)明蛋白的特異性抗體。
在設(shè)計(jì)編碼本發(fā)明多肽的目的基因時(shí)，具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的LY6H基因可被優(yōu)先使用。如果需要，可在各氨基酸殘基的特異性密碼子發(fā)生轉(zhuǎn)變之后使用該基因。另外，當(dāng)為L(zhǎng)Y6H基因編碼的氨基酸序列中的任一氨基酸殘基或部分序列通過替代、刪除或增加進(jìn)行修飾時(shí)，該修飾可以通過前述不同方法來(lái)完成，如定點(diǎn)突變方法。
本發(fā)明的多肽可按照SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)方案來(lái)進(jìn)行制備。該方法包括多肽合成的傳統(tǒng)液相方法及固相方法。
更為具體的情況是，多肽合成的方法包括所謂的逐步延長(zhǎng)方法，其中組成氨基酸一個(gè)接一個(gè)地偶聯(lián)以進(jìn)行鏈的延長(zhǎng)；及片斷縮合法，其包括預(yù)先合成包括有幾個(gè)氨基酸的片段，然后將這些片斷偶聯(lián)。本發(fā)明蛋白的合成可通過上述兩種方法之一進(jìn)行。
上述多肽合成所使用的縮合方法可以是傳統(tǒng)的方法，包括疊氮化合物法、混合酸酐法、DCC法、活化酯法、氧化還原法過程、DPPA(二苯基磷酰疊氮)法、DCC+添加劑(1-羥基苯并三唑、N-羥基丁二酰胺、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺等)法及Woodward's試劑法。
這些方法中要用到的溶劑可以選自本領(lǐng)域內(nèi)周知的用于多肽合成縮合反應(yīng)的普通溶劑。例如其包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六甲基磷酸胺、二氧六環(huán)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯等及其混合物。
在進(jìn)行多肽合成反應(yīng)時(shí)，氨基酸或多肽片斷中的任何不應(yīng)參加反應(yīng)的羧基基團(tuán)可以首先被保護(hù)，一般酯化成低烷基酯，如甲酯、乙酯、叔丁酯等等；或者一個(gè)芳烷基酯，如芐酯、p-甲氧基芐酯、p-硝基芐酯等等。
談及在其側(cè)鏈上具有一個(gè)功能基團(tuán)的任一氨基酸，例如，酪氨酸殘基的氫氧基基團(tuán)，可以首先用一個(gè)乙?；?、苯甲基、芐氧羰基、叔丁基或其他基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，盡管該保護(hù)并非必不可少。更進(jìn)一步，一個(gè)精氨酸殘基的胍基基團(tuán)可以用合適的保護(hù)基團(tuán)如硝基、對(duì)甲苯磺酰基、p-甲氧苯磺?；?、亞甲基-2-磺?；⑵S氧羰基、異冰片氧羰基、金剛烷氧羰基等。
從保護(hù)的氨基酸、多肽或者本發(fā)明蛋白終產(chǎn)物中脫除該保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)可同樣以常規(guī)方法進(jìn)行，例如，通過催化還原，或者使用液態(tài)氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟乙酸、乙酸、蟻酸、甲磺酸或其他試劑的方法。
本發(fā)明的多肽可以通過上面提到的不同技術(shù)進(jìn)行純化，例如離子交換樹酯層析、分配層析、凝膠層析、反向分配等多肽化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)方法。
本發(fā)明的多肽可以被有效地用作免疫原以制備其特異性的抗體。通過使用該免疫原，可以獲得抗血清(多克隆抗體)及單克隆抗體。
誘導(dǎo)抗體的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)共知的，已知的操作程序可以應(yīng)用于本發(fā)明[e.g.Zoku Seikagaku Jikken Koza(Experiments inBiochemistry,Second Series)＂Men-eki Seikagaku Kenkyuho(免疫生物化學(xué)方法(Methods in Immunobiochemistry))＂，日本生物化學(xué)協(xié)會(huì)編輯(1986)]。
例如，普通的動(dòng)物例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、小雞等等可被任意選擇作為免疫動(dòng)物以獲得目的抗血清。用所述的免疫原進(jìn)行免疫，使用傳統(tǒng)方法收集血液。
單克隆抗體的制備可以使用傳統(tǒng)的技術(shù)手段進(jìn)行，其包括在一個(gè)用所述免疫原免疫的動(dòng)物的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)及一個(gè)漿細(xì)胞瘤之間構(gòu)建一個(gè)雜交瘤，挑選產(chǎn)生目的抗體的克隆并培養(yǎng)該克隆。選擇免疫動(dòng)物一般考慮其與在細(xì)胞融合時(shí)所使用的漿細(xì)胞瘤之間的相匹配性，一般優(yōu)先使用小鼠或大鼠。免疫操作程序可以與所述抗血清的制備相同，如果需要的話，也可和傳統(tǒng)佐劑聯(lián)合使用。
在所述雜交中所使用的漿細(xì)胞瘤并不特別限制，包括幾種骨髓瘤細(xì)胞例如p3(p3/x63-Ag8)[自然(Nature),256:495-497(1975)]、p3-U1[微生物學(xué)及免疫學(xué)的當(dāng)代主題(Current Topics in Microbiology andImmunoloy),81:1-7(1978)]、NS-1[Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976)]、MPC-11[細(xì)胞(cell),8:405-415(1976)]、SP2/0[自然(Nature),276:269-271(1978)]等，R210[自然(Nature),277:131-133(1979)]及鼠類的其他細(xì)胞和由此派生的細(xì)胞。
所述免疫細(xì)胞及所述漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的雜交可以通過已知技術(shù)在傳統(tǒng)雜交促進(jìn)劑如聚乙二醇(PEG)或者仙臺(tái)病毒(HVJ)的存在下進(jìn)行。目標(biāo)雜交瘤的分離可以以已知方式進(jìn)行[酶學(xué)方法(Meth.In Enzymol.),73:3(1981)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(ditto)]。
目標(biāo)抗體誘導(dǎo)細(xì)胞克隆的搜索及單克隆抗體的制備同樣可以以常規(guī)方式進(jìn)行。例如，抗體誘導(dǎo)雜交瘤細(xì)胞的搜索可以使用常規(guī)用于檢測(cè)抗體的各種技術(shù)，例如ELISA[Meth.in Enzymol.,70:419-439(1980)]、噬斑方法、印跡方法、凝集反應(yīng)方法、奧脫洛尼方法、放射性免疫分析等，同時(shí)使用本發(fā)明蛋白作為抗原。
從所得雜交瘤獲得本發(fā)明抗體的方法如下通過以傳統(tǒng)方法培養(yǎng)雜交瘤并收集培養(yǎng)上清液作為抗體，或?qū)⒃撾s交瘤移至一相容的哺乳動(dòng)物且收集腹水形式的抗體。前一種方法適宜于產(chǎn)生高純度的抗體而后一種方法適宜于該抗體的大規(guī)模制備。這樣產(chǎn)生的抗體可以通過傳統(tǒng)方法進(jìn)一步純化，如鹽析法、凝膠過濾法、親和層析等。
獲得的抗體的特點(diǎn)在于其與本發(fā)明LY6H蛋白的結(jié)合親和性，且其可被有效地用于LY6H蛋白的純化及通過免疫學(xué)技術(shù)確定或鑒別該蛋白。另外，由于已證實(shí)在一個(gè)患有早老性疾病(其是一種神經(jīng)變性疾病)的病人的腦顳葉中本發(fā)明基因的表達(dá)減少，所以該抗體可用于篩選LY6H蛋白的興奮劑或拮抗劑。
本發(fā)明也提供了上述新的抗體。
本發(fā)明的多肽在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)是非常有用的，它可作為藥物產(chǎn)品的活性成分。因此，本發(fā)明提供了一個(gè)藥物組合物，其含有本發(fā)明的多肽并將其作為其中的活性成分。
本發(fā)明多肽作為所述藥物組合物或在其中的有效性可歸于該腦特異性多肽固有的神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性，神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及記憶活性。證實(shí)這些活性的方法的實(shí)施例包括下述針對(duì)每一種活性的方法。
1)神經(jīng)元生存支持活性下述方法可用于定量本發(fā)明多肽的神經(jīng)元生存支持活性。例如，從一個(gè)SD鼠胎兒的全腦中無(wú)菌分離海馬且用酶進(jìn)行處理，并在含有終濃度為2×105細(xì)胞/cm2的10％牛胎血清-DMEM的聚L-賴氨酸(Sigma)預(yù)包被的96孔板上培養(yǎng)。
在細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)的最后，培養(yǎng)基改為含有DMEM的1％N2補(bǔ)充物(Gibco)。然后，加入本發(fā)明的活性成分多肽(發(fā)明組)。而在對(duì)照組中，加入經(jīng)沸水熱處理5分鐘的本發(fā)明多肽(煮沸蛋白組)。
將以上述方向制備的每一組細(xì)胞(培養(yǎng)物)培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)。然后，用Promega細(xì)胞滴度96-孔分析系統(tǒng)進(jìn)行MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)出本發(fā)明多肽對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)元生存支持活性。
相似地，如上從相同的SD鼠胎兒的全腦中無(wú)菌分離腹側(cè)中腦，然后如上以相同的方式進(jìn)行MTT試驗(yàn)，本發(fā)明多肽對(duì)中腦神經(jīng)元的神經(jīng)元生存支持活性可以被測(cè)出。
2)多巴胺能神經(jīng)元生存支持活性作為一種評(píng)價(jià)本發(fā)明多肽的神經(jīng)元生存支持活性的方法，下面的多巴胺能神經(jīng)元生存支持活性的定量方法將被提及。將如1)準(zhǔn)備的每一組細(xì)胞或培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時(shí)后，與4％多聚甲醛-PBS在室溫下進(jìn)行混合15分鐘，然后，使用1％Triton X 100/PBS，使培養(yǎng)物透過膜。
為了避免抗體的非特異性結(jié)合，細(xì)胞在10％羊血清-PBS中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)，然后，使用一個(gè)抗酪氨酸羥化酶的多克隆抗體(Chemicon，在PBS中稀釋1000倍)，然后在4℃下溫育16個(gè)小時(shí)。除去抗體液以后，細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗滌，然后，加入過氧化物酶標(biāo)記的葡聚糖聚合物偶聯(lián)的羊抗兔免疫球蛋白(Dako)，在室溫下溫育一個(gè)小時(shí)。
酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)可以通過以二氨基聯(lián)苯胺為底物的顯色反應(yīng)來(lái)完成。在這個(gè)方法中，可使用酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量作為指標(biāo)測(cè)試本發(fā)明多肽的多巴胺能神經(jīng)元生存支持活性。
3)神經(jīng)延長(zhǎng)活性本發(fā)明多肽的神經(jīng)延長(zhǎng)活性(軸突延長(zhǎng)促進(jìn)活性)的確定可以通過使用PC12細(xì)胞如下完成[ATCC收藏號(hào)CRL1721；Science,229,393-395(1985)]。PC12細(xì)胞在修飾過的含有5％熱失活的(56℃,30min)馬血清及10％的牛胎血清(FCS)的Dalbecco's MEM(D-MEM)中進(jìn)行繼代培養(yǎng),然后移殖至一個(gè)膠原蛋白覆蓋的直徑35mm塑料有蓋培養(yǎng)皿中，且濃度為6×104細(xì)胞/3毫升。移殖2天后，培養(yǎng)基換成含有不同濃度的本發(fā)明的多肽及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF；Wako Pure Chemical Ind.)及FCS的D-MEM。然后繼續(xù)培養(yǎng)。第三天，使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。通過與對(duì)照組比較估計(jì)神經(jīng)突的是否形成或神經(jīng)突生長(zhǎng)是否得到促進(jìn)，可以評(píng)價(jià)本發(fā)明多肽的軸突延長(zhǎng)促進(jìn)性。
4)神經(jīng)膠質(zhì)激活活性例如，可以通過按照Kniss等或Bogler等的方法[Kniss,D.A.,及Burry,R.W.,Brairi Res.,439,281-288(1988)；Bogler,O.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,87(16),6368-6372(1990)]確定本發(fā)明多肽對(duì)于FGF激活神經(jīng)膠質(zhì)的影響，來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)膠質(zhì)激活活性。
5)記憶活性記憶活性可按照Morris的water-maze方案進(jìn)行評(píng)價(jià)[Morris.R.G.M.,J.Neurosci.Meth.,11,47-60(1984)]。
另一種估價(jià)方法包括將LY6H蛋白或其拮抗劑或激活劑通過篩選使其進(jìn)入一個(gè)具有Alzheimervs疾病的動(dòng)物模型中,例如突變的β淀粉前體蛋白基因或突變的早老1型基因的轉(zhuǎn)基因小鼠[例如.Nature,373,523-527(1995)；Nature Med.,5,560-564(1999)]，并與未處理的對(duì)照組比較評(píng)價(jià)該種疾病的進(jìn)展度或者神經(jīng)變性的程度。
此外，為了獲得在人顳葉中進(jìn)行表達(dá)的基因(基因治療)，可使用一種腺病毒載體[Straus,E.S.,Plenum Press New York,451-496(1984)；Setoguchi,Y.,et al.,Blood,84,2953-2964(1994)]。這樣，一種可能的操作步驟包括在腺病毒載體中克隆本發(fā)明的基因，在干細(xì)胞中對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，將其直接導(dǎo)入顳葉或通過外周靜脈血管輸入，且檢查阿爾茨海默類型癡呆或早老性癡呆是否得以改善或其進(jìn)程受到抑制。
作為本發(fā)明藥物組合物活性成分的多肽包括其藥用合格的鹽。該鹽包括具有堿金屬、堿性稀土金屬或者銨的非毒性鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽及銨鹽。這些鹽可使用本領(lǐng)域慣用的技術(shù)進(jìn)行制備。更進(jìn)一步，所謂鹽包括非毒性酸加成鹽，其可以使用合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸與本發(fā)明的活性成分多肽反應(yīng)進(jìn)行制備。具有代表性的非毒性酸加成鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、延胡羧酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、羥乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、抗壞血酸鹽、苯磺酸鹽、萘磺酸鹽等。
本發(fā)明的藥物組合物包括由具有藥用有效量的本發(fā)明多肽和一個(gè)適宜的非毒性藥物載體或者稀釋液組成的組合物。
可被用于所述藥物組合物(藥理學(xué)準(zhǔn)備)的藥物載體包括稀釋液或賦形劑，其可以照慣例根據(jù)劑型，例如填充劑、擴(kuò)容劑、粘合劑、致濕劑、崩解劑、表面活性劑及潤(rùn)滑劑等，進(jìn)行使用。這些可以根據(jù)所使用組合物的單位劑型進(jìn)行科學(xué)地選擇。
本發(fā)明尤為優(yōu)選的藥物組合物可以使用不同的添加劑來(lái)進(jìn)行制備。這些添加劑可表述于普通的蛋白制備方法中，例如穩(wěn)定劑、殺蟲劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。
穩(wěn)定劑包括人類血清白蛋白、L-氨基酸、糖及纖維素衍生物。這些可單獨(dú)使用或與必要的表面活性劑等聯(lián)合使用。與表面活性劑聯(lián)合使用可導(dǎo)致活性成分更為穩(wěn)定。
L-氨基酸并不特別限制，其還可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一個(gè)。
糖類并不特別限制，其還可包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等等；糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木糖醇等等；二糖，例如蔗糖、麥芽糖、乳糖等等；多聚糖，例如葡聚糖、羥丙基淀粉、硫化軟骨素、透明質(zhì)酸等等，及他們的衍生物。
表面活性劑并不特別限制，其可以包括離子或非離子表面活性劑。表面活性劑的實(shí)例有聚氧化乙烯乙二醇山梨聚糖烷基酯，聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖單?；ゼ爸舅岣视王?。
所使用到的纖維素衍生物也不特別限制，其可以包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素及羧甲基纖維素鈉。
所述糖與其他添加劑的添加量可以參照普通使用量進(jìn)行選擇。一般來(lái)講，所使用糖的比例為在每微克活性成分中不少于0.0001mg，最好在大約0.01至10mg之間。所使用表面活性劑的比例為在每微克活性成分中一般不少于0.00001mg，最好在0.0001至0.01mg之間。人血清清蛋白作為一種穩(wěn)定劑，可使用的比例為每微克活性成分中不少于大約0.0001mg，最好在大約0.001至0.1mg之間。作為另一種穩(wěn)定劑，氨基酸的量可從每微克活性成分中大約0.001至10mg之間選擇。纖維素衍生物的加入水平不少于大約0.00001mg，并優(yōu)選約0.001至大約0.1mg之間。
本發(fā)明藥物組合物活性成分的量可以在一個(gè)很大范圍自由選擇，但一般選自下列范圍，大約0.00001到大約70重量百分比，優(yōu)選大約0.0001到大約5重量百分比。
本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步添加一個(gè)緩沖液、一個(gè)等滲劑及一個(gè)螯合劑來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充。緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、ε-氨基已酸、谷氨酸及其相應(yīng)的鹽(他們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如，鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)。等滲劑包括氯化鈉、氯化鉀、糖及甘油。螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸。這些添加劑的加入水平可以在傳統(tǒng)的使用水平范圍內(nèi)。
本發(fā)明的藥物制劑可以以液體的形式提供，而且以凍干的形式進(jìn)行保存。該凍干的制劑可以臨時(shí)溶解，例如溶在一個(gè)含有合適濃度的水、鹽等的緩沖液中。
本發(fā)明藥物組合物的單位劑型可以是多種型式，其可按照治療目的進(jìn)行選擇。代表性的劑型包括固體劑型，例如片劑、丸劑、粉劑、干粉劑，顆粒、膠囊等等；液態(tài)劑型，例如溶液、懸浮液、乳狀液、糖漿、酏劑等等。這些劑型可以按照給藥途徑一般分為口服制劑、注射制劑、鼻劑、陰道栓劑、直腸栓劑、舌下片劑、藥膏及其它。這些藥劑的每一種劑型可以按照配方或確定的制藥程序來(lái)制備。
例如，所述藥物載體的片劑的生產(chǎn)中使用不同的賦形劑，例如乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸、磷酸鉀等等；粘合劑，例如水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等；崩解劑，例如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、低取代度的羥丙基纖維素、干淀粉、海藻酸鈉、瓊脂粉末、海帶多糖粉末、碳酸氫鈉，碳酸鈣等等；表面活性劑，例如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯等等；崩解抑制劑，例如蔗糖、硬脂酸甘油酯、可可油脂、氫化油等等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨、十二烷基硫酸鈉等等；致濕劑，例如甘油、淀粉等等；吸收劑，例如淀粉、乳糖、高嶺土、斑脫土、硅膠等等；潤(rùn)滑劑，例如純化的滑石粉、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等等。
如果有必要的話，這些片劑可用傳統(tǒng)的包衣進(jìn)行包裹以提供一個(gè)糖衣片劑、明膠包被的片劑、腸衣片劑及薄膜包被片劑。雙層或多層片劑也可被使用。
可被用于生產(chǎn)丸劑的藥物載體包括不同的賦形劑，例如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可油脂、氫化植物油、高嶺土、滑石粉等等；粘合劑，例如阿拉伯膠粉、黃芪膠粉末、明膠、乙醇等等；以及崩解劑，例如海帶多糖及瓊脂。
膠囊可以以傳統(tǒng)方式進(jìn)行制備。將本發(fā)明的活性成分與藥物載體進(jìn)行混合，然后將該混合物填充至一個(gè)硬的明膠膠囊殼、軟的膠囊殼等。
口服給藥的液體制劑包括藥用合格的溶液、乳狀液、懸浮液、糖漿、酏劑等等，并用常用的惰性稀釋劑(例如水)進(jìn)行配制。這些劑型也可包括有一種潤(rùn)濕劑、乳化劑、懸浮劑及/或其他輔助添加劑。其可以以確立的制藥程序進(jìn)行制造。
用于注射給藥的液體制劑包括無(wú)菌的水溶液及非水溶液、乳化液或懸浮液。其可以使用如水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧代異十八醇、聚氧化異十八醇、聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯及橄欖油等植物油等稀釋液進(jìn)行制備。此外，可配制可注射的有機(jī)酯類，例如油酸乙酯。更進(jìn)一步，也可以加入傳統(tǒng)的增溶劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、崩解劑等等。
上述不同的藥劑以常規(guī)的方式進(jìn)行消毒。用一個(gè)細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾，用殺生物劑處理，用紫外線照射或熱處理。更進(jìn)一步，可以提供他們的無(wú)菌的固體組合物形式，其可以臨時(shí)被溶解在無(wú)菌的水或合適的無(wú)菌介質(zhì)中。
用于直腸或陰道給藥的藥物生產(chǎn)中，可使用的藥物載體有聚乙二醇、可可油脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成的甘油酯等等。
藥膏，例如糊劑、乳劑及膠凍，可以使用如白礦酯，石蠟，甘油、纖維素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅樹酯、斑脫土、橄欖油等植物油等稀釋劑來(lái)進(jìn)行制備。
鼻腔或舌下給藥的組合物可以使用眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑通過慣用方法來(lái)制備。
如果必需的話，本發(fā)明的這些藥物制劑可以加入著色劑、防腐劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑或其他藥物。
這些藥物制劑的給藥方法并不特別限制，可以按照具體的劑型、患者的年齡、性別及其它因素、患病嚴(yán)重程度及其它可變因素來(lái)進(jìn)行選擇。例如，片劑、藥丸、溶液、懸浮液、乳狀液、顆粒及膠囊可以經(jīng)過口服給藥。而注射用產(chǎn)品可進(jìn)行靜脈給藥，其或者單獨(dú)注射，或者與傳統(tǒng)的葡萄糖、氨基酸或其他灌輸液混合注射；或者，如果需要的話，可以單獨(dú)進(jìn)行肌內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射。直腸栓劑可給藥至直腸，陰道栓劑可給藥至陰道，鼻劑可給藥至鼻腔，舌下制劑可以通過口腔給藥，藥膏可局部給藥以使藥物透過皮膚滲入。
上述任一藥物制劑的劑量并不特別限制，其可以按照預(yù)期的治療目的、給藥方法、治療的持續(xù)時(shí)間、患者的背景如年齡、性別及其它因素，從一個(gè)很廣泛的范圍進(jìn)行選擇。一般來(lái)講，推薦的活性成分常用劑量為每公斤患者的體重大約0.01μg-10mg/天，優(yōu)選大約0.1μg-1mg/天。上述劑量可以以每天一次、兩次或者更多次給藥。
更進(jìn)一步，正如在其后將要描述的工作實(shí)施例所指出的那樣，本發(fā)明所述基因的表達(dá)在早老性癡呆癥患者的顳葉中已經(jīng)終止或者減弱。因此，通過構(gòu)建一個(gè)攜有本發(fā)明基因的一部分或者全部的表達(dá)載體并將其引入顳葉組織中以使得該基因在組織中強(qiáng)迫表達(dá)，有可能抑制顳葉中神經(jīng)變性，其包括神經(jīng)元的過分萎縮，早老性癡呆癥病情的進(jìn)展可以因此得到抑制。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于基因治療的藥物組合物(基因治療試劑)，其具有上述神經(jīng)變性抑制活性。
本發(fā)明基因進(jìn)一步提供了上述表達(dá)載體或者用于基因治療的載體、被本發(fā)明基因通過所述載體引導(dǎo)而轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、及一個(gè)用于基因治療的藥物組合物，其包括上述任一活性成分。
使用所述基因治療試劑的基因治療過程選自以下的至少一種，其包括有用于引導(dǎo)且表達(dá)本發(fā)明基因的載體，用本發(fā)明基因通過所述載體導(dǎo)入神經(jīng)變性疾病患者腦神經(jīng)元或顳葉組織中去的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過這樣一種途徑，在該組織中神經(jīng)變性可以得到抑制，早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、帕金森病、腦缺血可以得到緩解。
現(xiàn)在進(jìn)一步詳細(xì)描述基因治療。在下面一個(gè)基因治療過程中，使用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)，除非特別指出其他的技術(shù)。這些技術(shù)均有介紹，尤其是Maniatis,T..,et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory),Cold Spring Harbor,New York(1982)),Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual,2nd Ed.(Cold Spring harborLaboratory),Cold Spring harbor,New York(1981)),Ausbel,F.M.,etal.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NewYork(1992)),Glover,D.,DNA Cloning,Ⅰ及Ⅱ(Oxford Press(1985)),Anand,Techniques forthe Analysis of Complex Genomes(Academic Press(1992),Guthrie,G.,et al.,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press(1991))以及Fink,et al.,Hum.Gene Ther.,3,11-19(1992)。
通過使用一個(gè)攜有本發(fā)明基因的一部分或全部的基因治療載體,或者一個(gè)借助所述載體被本發(fā)明基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以進(jìn)行基因治療。該基因治療可以是將LY6H基因或其功能補(bǔ)充到那些所述基因不能表達(dá)的細(xì)胞中去的方法。通過這樣的基因治療，受體細(xì)胞或者靶細(xì)胞周圍的神經(jīng)變性可以得到抑制。
本發(fā)明的基因或者基因的一個(gè)片斷可以由一個(gè)適于在染色體外保存基因的載體引入到細(xì)胞中去。在這種情況下，特定的基因可被染色體外的細(xì)胞表達(dá)。而且，當(dāng)通過引入基因片斷進(jìn)入腦神經(jīng)系統(tǒng)的顳葉位置(這里并未發(fā)現(xiàn)該基因有所表達(dá))，LY6H基因?qū)⒁磉_(dá)時(shí)，基因的特定片斷可以是一編碼LY6H蛋白一部分的基因片斷，其中的LY6H蛋白為細(xì)胞生存和非生瘤性生長(zhǎng)必需的。
基因轉(zhuǎn)移載體可以是許多已知載體中的任何一個(gè)，其中本發(fā)明基因被亞克隆化，這些后面將要進(jìn)一步描述。
基因轉(zhuǎn)移載體向靶細(xì)胞的導(dǎo)入可以使用將DNA引入到不同的細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染(共沉降)、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及其它技術(shù)。被本發(fā)明基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可被用作一種治療大腦的神經(jīng)變性紊亂的藥物，其含有大腦神經(jīng)系統(tǒng)過早萎縮的抑制劑；或被用作治療研究的模型。
正如上面所提到的那樣，當(dāng)將本發(fā)明基因或基因片斷引入本發(fā)明的基因治療時(shí)，其提高了相關(guān)基因產(chǎn)物在大腦神經(jīng)或周邊組織中的表達(dá)，以致大腦神經(jīng)在表達(dá)該基因的組織中的萎縮得到抑制。該基因治療可有效用于腦神經(jīng)組織，其中LY6H基因或LY6H蛋白在這些組織中的表達(dá)已經(jīng)被廢止。其還可有效用于腦神經(jīng)組織，其中所述基因的表達(dá)水平顯著降低。
按照本發(fā)明的基因治療可以如下進(jìn)行。首先，按照計(jì)算機(jī)X線斷層造影(CT)篩選基因治療的候選患者。具體做法是，將掃描位置固定在具有阿爾茨海默病癥早老性癡呆癥的患者的顳葉處以檢查顳葉是否萎縮或萎縮的進(jìn)展情況。
然后，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明基因的表達(dá)，在靶細(xì)胞中創(chuàng)造細(xì)胞內(nèi)LY6HmRNA并促進(jìn)其翻譯以加速LY6H基因的表達(dá)。對(duì)于這個(gè)目的，最好產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)于該基因mRNA的正義寡聚核苷酸鏈并將其導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中去。通過上述基因治療，使得該細(xì)胞具有促進(jìn)LY6H基因表達(dá)的活性，腦受體細(xì)胞或靶細(xì)胞中的神經(jīng)變性可由此得到抑制。
按照上述使用正義寡聚核苷酸進(jìn)行基因治療的方法，通過將LY6H基因亞克隆進(jìn)一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或者AAV衍生的載體并將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)腦神經(jīng)靶細(xì)胞，引起該正義寡聚核苷酸的表達(dá)。由此，腦神經(jīng)變性得以抑制且神經(jīng)變性癥狀的也隨之緩解或停止。
當(dāng)本發(fā)明基因的一個(gè)正義寡聚核苷酸鏈被引進(jìn)一個(gè)大腦神經(jīng)元或組織以增加LY6H蛋白的表達(dá)時(shí)，該正義寡聚核苷酸不必是LY6H基因的全長(zhǎng)核苷酸，其可以是修飾產(chǎn)物，其中其保留了母基因的實(shí)際功能且提高了LY6H基因或包括可保留所述功能的部分序列在內(nèi)的片斷的表達(dá)。
可用于引導(dǎo)目的基因并用于DNA重組及染色體外基因維持的載體在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)都是已知的，且任何一種已知的載體可被用于本發(fā)明的實(shí)施。這樣的載體例如有病毒或一個(gè)質(zhì)粒載體，其含有與表達(dá)控制因子結(jié)合的LY6H基因正義寡聚核苷酸的一個(gè)復(fù)制子，并且其能在靶細(xì)胞中表達(dá)正義寡聚核苷酸產(chǎn)物。任何一個(gè)上面提到的表達(dá)載體可以被用到，但優(yōu)選如下所公開的載體作為起始載體USP5252479及WO93/07282(具體為pWP-7A、pWP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21和/或pRSVL)或pRC/CMV(Invitrogen)。更好的載體應(yīng)該為各種病毒載體，其下文將要描述。
作為在基因治療載體中使用的促進(jìn)劑，優(yōu)選那些因各種疾病有待治療的受影響組織所固有的促進(jìn)劑。這些促進(jìn)劑可以是清蛋白、α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、鐵傳遞蛋白、肝中的甲狀腺素運(yùn)載蛋白、結(jié)腸中的碳酸酐酶Ⅰ及癌胚抗原。當(dāng)作用組織為子宮及胎盤時(shí)，這些促進(jìn)劑可以是雌激素，芳香酶，細(xì)胞色素P450，膽固醇側(cè)鏈切割酶P450，及17α-羥化酶P450。
對(duì)于前列腺，前列腺特異性抗原、gp91-fox基因及前列腺特異性激肽釋放酶可以作為促進(jìn)劑。對(duì)于胸腺，erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白及乳清蛋白可以作為促進(jìn)劑。對(duì)于肺，表面活性劑蛋白C及尿球蛋白可以作為促進(jìn)劑。對(duì)于皮膚，K-14-角蛋白，人類角蛋白1或6及l(fā)eucline可以是這樣的促進(jìn)劑。對(duì)于大腦，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、成熟的星形膠質(zhì)特異蛋白、髓磷脂、酪氨酸羥化酶胰腺絨毛蛋白、胰增血糖素及胰島淀粉狀多肽可以是這樣的促進(jìn)劑。對(duì)于甲狀腺，甲狀腺球蛋白及降血鈣素可以是這樣的促進(jìn)劑。對(duì)于骨骼，α1膠原蛋白、骨鈣素及骨骼唾液酸糖蛋白可以是這樣的促進(jìn)劑。對(duì)于腎臟，腎素，肝臟/骨骼/腎堿性磷酸酶及促紅細(xì)胞生成素可以是促進(jìn)劑。對(duì)于胰腺，其可以為淀粉酶及PAPl。
更進(jìn)一步，在產(chǎn)生用于引導(dǎo)正義寡聚核苷酸鏈的載體中，如上述，基于本發(fā)明基因所提供的核苷酸序列信息并使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)，可以很容易準(zhǔn)備及獲得待引導(dǎo)的正義寡聚核苷酸(其具有本發(fā)明基因序列的全長(zhǎng)或部分序列)。
可以通過本領(lǐng)域共知的各種技術(shù)來(lái)轉(zhuǎn)移載體以將正義寡聚核苷酸引入細(xì)胞中去，如電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染(共沉降)、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等。由所述正義寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在處于單獨(dú)的狀態(tài)時(shí)具有腦神經(jīng)變性抑制活性，因而可被用作抑制或終止神經(jīng)變性損傷進(jìn)展的藥物或治療研究的模型。
在基因治療中，上述用于引導(dǎo)寡聚核苷酸鏈的載體可被局部注射到患者顳葉或周邊區(qū)域，或進(jìn)行全身性注射。更進(jìn)一步，其可與干細(xì)胞一起培養(yǎng)，然后通過全身或局部注射給藥。通過這樣給藥，載體可被引入患者腦部的神經(jīng)細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因并不永久性地處于每一靶細(xì)胞的染色體上時(shí)，可以通過周期性重復(fù)注射使其攝入。
按照本發(fā)明的基因治療方法包括體內(nèi)技術(shù)，其包括將用于引導(dǎo)所述正義寡聚核苷酸的構(gòu)成物(正義寡聚核苷酸轉(zhuǎn)移載體)直接導(dǎo)入體內(nèi)；及離體技術(shù)，其包括將基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的干細(xì)胞中去，然后經(jīng)過移殖或其他步驟將細(xì)胞引入患者體內(nèi)。將所述正義寡聚核苷酸直接引入細(xì)胞的基因治療同樣也是可行的。
本發(fā)明基因的正義寡聚核苷酸鏈所進(jìn)入的靶細(xì)胞可以按照基因治療的目的進(jìn)行科學(xué)選擇。例如，靶細(xì)胞包括有腦神經(jīng)元、腦神經(jīng)組織及淋巴細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及造血細(xì)胞。
在上述基因治療中引入正義寡聚核苷酸鏈的方法包括病毒引導(dǎo)技術(shù)及非病毒引導(dǎo)技術(shù)。
至于病毒引導(dǎo)技術(shù)，考慮到這樣的事實(shí)，即要被轉(zhuǎn)移的正義寡聚核苷酸鏈?zhǔn)且粋€(gè)專門表達(dá)于正常腦細(xì)胞的外源物質(zhì)，則可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法。可使用的其他病毒載體包括腺病毒載體、HIV(人類免疫缺陷性病毒)載體、腺伴隨病毒(AVV)載體、皰疹病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體及埃-巴二氏病毒(EBV)載體。
現(xiàn)在具體描述構(gòu)造用于轉(zhuǎn)移正義寡聚核苷酸鏈的病毒載體的方法及將該正義寡聚核苷酸鏈轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或目標(biāo)組織中去的方法。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括一個(gè)病毒載體及一個(gè)輔助細(xì)胞(包裝細(xì)胞)。輔助細(xì)胞指的是這樣一個(gè)細(xì)胞，其已經(jīng)表達(dá)了編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)蛋白gag(在病毒顆粒中的結(jié)構(gòu)蛋白)、pol(反轉(zhuǎn)錄酶)、env(殼蛋白)等等的基因，但是其還未形成病毒顆粒。在另一方面，該病毒載體具有包裝信號(hào)及LTR(長(zhǎng)末端重復(fù))，但其缺少為病毒復(fù)制所必須的結(jié)構(gòu)基因，例如gag,pol,env等。包裝信號(hào)是一個(gè)序列，其在組裝病毒顆粒的過程中起到一個(gè)標(biāo)簽的作用。選擇性基因(neo,hyg)及已連接于克隆位點(diǎn)的目標(biāo)正義寡聚核苷酸鏈插入到病毒基因中去。為了獲得高滴度的病毒顆粒，使用一個(gè)盡可能短的插入子，提供一個(gè)很廣泛的包裝信號(hào)(包括gag基因的一部分)，并小心不要離開gag基因的ATG位點(diǎn)。這些都非常重要。
當(dāng)攜有目標(biāo)正義寡聚核苷酸的載體DNA被轉(zhuǎn)移到輔助細(xì)胞中時(shí)，載體基因組RNA為輔助細(xì)胞所形成的病毒結(jié)構(gòu)蛋白所包裹，由此病毒顆粒形成且分泌。作為重組病毒的病毒顆粒感染靶細(xì)胞，結(jié)果，從病毒基因組RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA序列被整合進(jìn)細(xì)胞核中，以致插入載體的正義基因得以表達(dá)。
可以使用粘連蛋白片斷的技術(shù)以提高目的基因的轉(zhuǎn)移效率，其中此蛋白片段含有細(xì)胞粘連區(qū)、肝磷脂結(jié)合位點(diǎn)和偶聯(lián)片斷[Hanenberg,H.,et al.,Exp.Hemat.,23,747(1995)]。
用于上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體實(shí)例是獲自鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒[McLachlin,J.R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.,38,91-135(1990)]。
下面詳細(xì)描述使用腺病毒載體的方法,腺病毒載體可按照下面所述的方法進(jìn)行構(gòu)建，Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Tmmunol.,158,39-66(1992),Setoguchi,Y.,et al.,Blood,84,2946-2953(1994),Kanegae,H.et al.[Jikken Igaku(Experimental Medicine),12,28-34(1994))及Ketner,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,6186-6190(1994)。
例如，為了構(gòu)建一個(gè)非增殖的腺病毒載體，腺病毒的早期區(qū)域E1和/或E3首先被切除，然后，一個(gè)含有目的外源基因表達(dá)單元(其含有待轉(zhuǎn)移的正義寡聚核苷酸鏈、所述正義寡聚核苷酸鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、用于保障該轉(zhuǎn)錄基因穩(wěn)定性的多聚腺苷酸)的質(zhì)粒載體、腺病毒基因組DNA的一部分及一個(gè)含有腺病毒基因組的質(zhì)粒被用來(lái)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。當(dāng)由此產(chǎn)生同源重組以替代基因表達(dá)單元E1時(shí)，獲得一個(gè)攜有目的正義寡聚核苷酸鏈的非增殖的腺病毒載體。也可通過將腺病毒基因組DNA結(jié)合到裝配型質(zhì)粒載體來(lái)構(gòu)建一個(gè)具有末端蛋白的3′-末端腺病毒載體。此外，YAC載體也可以用于構(gòu)建腺病毒載體。
下面簡(jiǎn)要描述腺伴隨病毒(AAV)載體的構(gòu)建。AAV被發(fā)現(xiàn)是污染腺病毒培養(yǎng)體系的一種小病毒。細(xì)小病毒屬，其在能夠在寄主細(xì)胞中獨(dú)立增殖而不需要輔助病毒進(jìn)行病毒復(fù)制，及需要輔助病毒的依賴病毒屬已確定為這種病毒。該AAV具有一個(gè)很廣泛的寄主范圍，且是一種感染不同類型細(xì)胞的普通病毒。病毒基因組是一個(gè)含有4680個(gè)核苷酸的線性單鏈DNA，其兩個(gè)末端均有145個(gè)核苷酸且具有ITR(反向末端重復(fù))序列特征。該ITR區(qū)域是復(fù)制起點(diǎn)且能起到引物的作用。該ITR對(duì)于病毒顆粒的包裝及AAV整合進(jìn)寄主細(xì)胞染色體DNA是必須的。關(guān)于病毒蛋白，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組的左半段為調(diào)控蛋白R(shí)ep，其控制著復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。
通過利用AAV的特性使其整合進(jìn)染色體DNA來(lái)進(jìn)行重組AAV的構(gòu)建，從而可制備目的基因轉(zhuǎn)移載體。該方法下面進(jìn)行詳細(xì)描述。首先，構(gòu)建一個(gè)在野生型AAV的5′端及3′端保留有ITRs且攜有待轉(zhuǎn)移的正義寡聚核苷酸鏈的質(zhì)粒(AAV載體質(zhì)粒)。病毒復(fù)制和病毒顆粒形成所必須的病毒蛋白從另一個(gè)輔助質(zhì)粒中獲取。必須保證兩個(gè)質(zhì)粒之間無(wú)共同的核苷酸序列存在，以使野生型病毒在DNA重組過程中不會(huì)出現(xiàn)。然后，這兩個(gè)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染的方法被轉(zhuǎn)移進(jìn)入293細(xì)胞，再用腺病毒作為輔助病毒(當(dāng)使用293細(xì)胞時(shí)，腺病毒是非增殖病毒)感染細(xì)胞，這樣就產(chǎn)生了目的非增殖性重組AAV。既然重組AAV存在于細(xì)胞核中，將細(xì)胞冷凍解凍并復(fù)原且將污染的腺病毒加熱至56℃以使之失活。然后，如果必要的話，重組AAV通過氯化銫超速離心法進(jìn)行分離且濃縮。以這種方式，可以獲得用于基因轉(zhuǎn)移的目的重組AAV。
EBV載體的構(gòu)建可以使用Shimidzu等所描述的方法[Shimidzu,N.,SAIBO KOUGAKU(Cell Technology,14(3),280-287(1995)]。
現(xiàn)簡(jiǎn)要描述用于轉(zhuǎn)移本發(fā)明正義寡聚核苷酸鏈的EBV載體的構(gòu)建。EB病毒(埃-巴二氏病毒)為皰疹病毒屬的一種,其首次由Epstein及其合作者從非洲淋巴瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中分離得到[Kieff,E.及Liebowitz,D:Virology,第二版Raven Press,New York,1990,pp1889-1920]。該EBV具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性,且為了將其作為一種基因轉(zhuǎn)移的載體，有必要準(zhǔn)備一個(gè)缺失該轉(zhuǎn)化活性的病毒。這些可以如下進(jìn)行操作。
首先，克隆鄰近于目標(biāo)DNA(其中將要插入目的的外源基因)的EBV基因組，然后，插入該外源基因的一個(gè)DNA片斷及一個(gè)抗藥性基因，以構(gòu)建一個(gè)載體用于制備重組病毒。然后，當(dāng)用一個(gè)合適的限制性酶進(jìn)行切割時(shí)，用于制備重組病毒的載體被轉(zhuǎn)染到EBV陽(yáng)性的Akata細(xì)胞。然后，用抗表面免疫球蛋白處理以促進(jìn)病毒的產(chǎn)生，同源重組形成的重組病毒與野生型的Akata EBV一起得以回收。重組病毒被感染進(jìn)入EBV陰性Akata細(xì)胞，且在一個(gè)藥物的存在下，挑選抗性菌落。由此獲得沒有野生型EBV的重組病毒專一感染的Akata細(xì)胞。此外，通過在重組病毒感染的Akata細(xì)胞中引入病毒活性，目的的重組病毒載體可以大批量制備。
在本發(fā)明的基因治療中將目的基因引入靶細(xì)胞或組織中去的方法包括有下面兩個(gè)具有代表性的方法。
第一個(gè)方法包括從待治療的患者體內(nèi)收集目標(biāo)細(xì)胞，在白細(xì)胞介素-2(IL-2)等存在的條件下體外培養(yǎng)該細(xì)胞，以轉(zhuǎn)移逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所攜帶的目的正義寡聚核苷酸鏈，然后重新移殖至結(jié)果細(xì)胞上(體外方法)。該方法適于由基因缺陷或癌癥導(dǎo)致的遺傳性疾病的治療。
第二種方法是直接轉(zhuǎn)移基因的方法，其包括將目的的正義寡聚核苷酸直接注射入患者體內(nèi)或目標(biāo)位點(diǎn)如大腦組織(直接方法)。
更為具體的是，第一種方法可以以所例舉的下列方式進(jìn)行。使用血篩從單核細(xì)胞中細(xì)小分離獲白患者的單核細(xì)胞，例如干細(xì)胞，并在IL-2的存在下在一適宜的培養(yǎng)基例如AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)，隨后加入攜有待引入正義寡聚核苷酸的載體。為了增強(qiáng)正義寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)移效率，細(xì)胞在精蛋白存在下在32℃下培養(yǎng)1小時(shí)，然后在2500ppm下離心，再在10％的CO2氣體及37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。重復(fù)該程序幾次以后，細(xì)胞在IL-2的存在下進(jìn)一步培養(yǎng)，例如可在AIM-V培養(yǎng)基下培養(yǎng)48小時(shí)，然后用鹽進(jìn)行洗滌。對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過所述原位PCR評(píng)價(jià)正義寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，或者當(dāng)目標(biāo)是酶的活性時(shí)評(píng)價(jià)酶活性程度。
如細(xì)菌或真菌在培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)、支原體感染的存在與否、內(nèi)毒素的搜索等安全性檢查可用于證實(shí)其安全性。然后，用預(yù)計(jì)的正義寡聚核苷酸的有效劑量轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞通過靜脈點(diǎn)滴注射重新回到患者體內(nèi)。上述步驟以幾個(gè)禮拜或幾個(gè)月為間隔重復(fù)進(jìn)行，以完成基因治療。
病毒載體的劑量可以根據(jù)靶細(xì)胞來(lái)進(jìn)行科學(xué)選擇。通常優(yōu)選的劑量是，每1×108目標(biāo)細(xì)胞病毒滴度1×103cfu-1×108cfu。
上述第一種方法也可采取一種替換方法，其包括共培養(yǎng)具有攜有目標(biāo)正義寡聚核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒產(chǎn)生細(xì)胞及患者的細(xì)胞，以將正義寡聚核苷酸引入靶細(xì)胞中去。
對(duì)于基因治療所采用的第二種方法(直接方法)，特別優(yōu)選進(jìn)行一個(gè)體外預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢查目的正義寡聚核苷酸是否確實(shí)可以通過載體基因cDNA的PCR或原位PCR等基因轉(zhuǎn)移方法進(jìn)行引導(dǎo)，或者檢查預(yù)期的治療效果，例如特定活性的提高或靶細(xì)胞的生長(zhǎng)或生長(zhǎng)抑制，是否可以通過引入目的正義寡聚核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，當(dāng)用到一個(gè)病毒載體時(shí)，通過進(jìn)行增殖逆轉(zhuǎn)錄病毒等的PCR研究、確定逆轉(zhuǎn)錄酶的活性、或者通過RCR技術(shù)來(lái)監(jiān)控包裹蛋白(env)基因等，來(lái)證實(shí)引導(dǎo)目的正義寡聚核苷酸在基因治療中的安全性。這些非常重要。
對(duì)于早老性癡呆癥、阿次海默類型癡呆癥或帕金森疾病的本發(fā)明的基因治療可以是對(duì)神經(jīng)變性疾病的治療，其包括從患者體內(nèi)收集干細(xì)胞或腦神經(jīng)細(xì)胞，通過酶處理等方法建立一個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞系，使用AAV等將目的正義寡聚核苷酸引入到目標(biāo)腦神經(jīng)細(xì)胞中去，用G418細(xì)胞進(jìn)行篩選，測(cè)量IL-12等在體內(nèi)的表達(dá)量，給予放射性處理，然后將細(xì)胞接種到患者腦組織或者顳葉位點(diǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)藥物組合物或制劑(基因治療試劑)，其包括本發(fā)明的正義寡聚核苷酸轉(zhuǎn)移載體或用該正義寡聚核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，其中正義寡聚核苷酸作為活性成分以藥理有效量與合適的非毒性藥物載體或稀釋液組合。
可被用于本發(fā)明藥物組合物(藥物制劑)的藥物載體包括稀釋液或賦形劑，例如填充劑、擴(kuò)容劑、粘合劑、致濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑等等，其可以按照藥物組合物的使用模式來(lái)使用，而且可以按照預(yù)期的單位劑型進(jìn)行選擇。
本發(fā)明藥物制劑的單位劑型與所提到的本發(fā)明的多肽制劑制備相同。按照治療目的可以選擇合適的劑型。
下面詳細(xì)描述按照本發(fā)明的神經(jīng)變性疾病治療和預(yù)防的方法。
本發(fā)明提供了一種治療神經(jīng)變性疾病的方法，例如早老性癡呆癥、阿次海默類型癡呆癥、腦缺血或帕金森疾病等，其中涉及到LY6H多肽的過量或短缺。當(dāng)LY6H多肽活性過度時(shí)，可以采取幾種方法。第一種方法包括以有效劑量給予一抑制化合物(拮抗劑)，通過與藥用合格載體結(jié)合阻斷其與配體、底物、受體、酶等的結(jié)合或者抑制第二信使，由此抑制LY6H多肽的功能，進(jìn)而改善異常的狀態(tài)。另一個(gè)替代的方法包括給予可溶型LY6H多肽，其能夠和內(nèi)源LY6H多肽競(jìng)爭(zhēng)性地與配體、底物、受體、酶等結(jié)合。該競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的一個(gè)典型的實(shí)施例包括LY6H多肽的一個(gè)片斷。在另一種方法中，給予一個(gè)可溶性的能與內(nèi)源LY6H多肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體的LY6H。該競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的一個(gè)典型的實(shí)例包括LY6H多肽的一個(gè)片斷。
在另一種方法中，通過對(duì)LY6H基因產(chǎn)物運(yùn)用基因表達(dá)抑制技術(shù)，可抑制編碼內(nèi)源LY6H多肽的基因的表達(dá)。已知該技術(shù)包括使用內(nèi)源性或分次給藥的反義序列[例如，Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expresion,CRC Press,Boca Raton,FL(1988),O′Connor,J.Neurochem 56:560(1991)]。作為一種替代方法，使用一個(gè)能夠與所提供的基因形成三股螺旋的寡聚核苷酸[e.g.Lee etal.,Nucleic Acids Res.,6:3073(1979)；Cooney等等，Science,241:456(1988)；Dervan等等，Science,251:1360(1991)]。這些寡聚物可以同樣給藥，或者相關(guān)寡聚物可在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
對(duì)于涉及LY6H及其活性的過低表達(dá)的異常癥狀的治療，可以使用幾種不同方法。第一種方法包括把一能以有效治療劑量聯(lián)合藥用合格載體激活LY6H的化合物給藥到一受治體中，并以此改善該癥狀。在另一種方法中，經(jīng)過基因治療，受治體中的相關(guān)細(xì)胞可啟動(dòng)LY6H的內(nèi)源性產(chǎn)生。例如可以使本發(fā)明的多聚核苷酸通過一缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如上所述進(jìn)行表達(dá)。然后，分離該逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)結(jié)構(gòu)且用一個(gè)攜有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞中去，以致包裝細(xì)胞形成含有目的基因的傳染性病毒顆粒。將得到的細(xì)胞給藥到受治體中，以對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)調(diào)控，從而可使多肽在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。至于基因治療的綜述，可參考Human Molecular Genetics,T.Strachan及A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd.(1996),第20章-基因治療及基于分子遺傳學(xué)的其他治療方法，包括其中所引用的特定參考資料。一個(gè)替代方法包括將合適的藥物載體與治療劑量的LY6H多肽聯(lián)合給藥。
細(xì)胞可以在磷酸鹽緩沖鹽(pH 7.4)、Ringer′s溶液或胞內(nèi)組合物注射液中進(jìn)行配制，或者配成一種劑型，其可用于與有助于提高基因傳移效率的物質(zhì)如精蛋白一起給藥。
上述藥物制劑的給藥方法并不特別限制，可以按照特定的劑型、患者的年齡、性別及其它因素、病情的嚴(yán)重程度等確定合適的給藥方式。
藥物制劑中活性成分的量及劑量并不特別限制，可以從一個(gè)很廣泛的范圍內(nèi)依照預(yù)期的治療效果、給藥方法、治療持續(xù)的時(shí)間、包括年齡、性別在內(nèi)的患者背景及其它可變的因素來(lái)進(jìn)行自由選擇。
一般來(lái)說，作為一種藥物制劑，攜有正義寡聚核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的劑量以每天每公斤體重的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度來(lái)衡量，可在大約1×103pfu至1×1015pfu之間。
攜有用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的正義寡聚核苷酸的細(xì)胞，其劑量可以從下列范圍進(jìn)行恰當(dāng)選擇1×104細(xì)胞/個(gè)體至1×1015細(xì)胞/個(gè)體。
上述制劑的給藥可以每天一次或者幾次，或者以一周或幾周為間隔進(jìn)行間歇式給藥。優(yōu)選將有助于提高基因轉(zhuǎn)移效率的物質(zhì)例如精蛋白或者其制劑聯(lián)合給藥。
當(dāng)本發(fā)明的基因治療用于治療神經(jīng)變性疾病時(shí)，其可以與其他的基因治療(結(jié)合基因治療)，或與使用乙酰膽堿酯酶抑制劑等藥物療法和/或復(fù)原治療一起聯(lián)合進(jìn)行。本發(fā)明的基因治療可以參照NIH指南，其中包括安全性方面[Recombinant DNA Advisory Committee,HumanGene Therapy,4,365-389(1993)]。
此外，按照本發(fā)明，為了檢測(cè)LY6H基因是否存在，可準(zhǔn)備一個(gè)生物樣品，例如血液或血清、核酸的選擇性提取物，并對(duì)其進(jìn)行LY6H基因的分析。
檢測(cè)基因的方法可包括制備本發(fā)明基因的一個(gè)DNA片斷，對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)以使其可被用于篩選LY6H基因和/或其擴(kuò)增。更為具體的是，有可能構(gòu)建一個(gè)DNA片斷，其具有探針的特性，可用于具有噬斑雜交、克隆雜交、DNA印跡法或RNA印跡法等等；或者具有探針特性，可用于制備本發(fā)明基因全長(zhǎng)或部分DNA，其可為一個(gè)利用聚合酶擴(kuò)增核苷酸序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所擴(kuò)增。對(duì)于這個(gè)目的，首先制備一個(gè)具有與LY6H基因相同序列的引物。然后，該引物作為篩選用探針與生物樣品(核酸樣品)進(jìn)行反應(yīng)，以檢查特定的LY6H基因序列存在與否。核酸樣品可以通過不同的利于目標(biāo)序列檢測(cè)的技術(shù)進(jìn)行制備，例如變性、限制性酶切、電穿孔或印跡法等等。
至于所述篩選的方法，PCR技術(shù)的使用從靈敏性的角度來(lái)看是特別適用的。因?yàn)楸景l(fā)明基因的一個(gè)片斷被用作引物，所以該技術(shù)并不特別限制。這樣可以使用迄今已知的技術(shù)[Science,230,1350-1354(1985)]及改進(jìn)的PCR，其近來(lái)正在發(fā)展中或者將進(jìn)一步發(fā)展[Sakaki,Yoshiyuki等(ed.),Jikken Igaku(Experimental Medicine)，增補(bǔ)版8(9)(1990),Yodosha；Protein,Mucleic Acid,Enzyme:Special Supplement,Kyoritsu Shuppan,35(7)(1990)]。
用作引物的DNA片斷是化學(xué)合成的寡-DNA，且該寡-DNA可使用自動(dòng)DNA合成儀等進(jìn)行合成，例如Pharmacia LKB Gene Assembler Plus(Pharmacia)。待合成的引物(正義引物或反義引物)的優(yōu)選長(zhǎng)度大約為10-30個(gè)核苷酸。所述篩選中所使用的探針經(jīng)常為一個(gè)標(biāo)記的探針，但也可以是沒有標(biāo)記的，或者根據(jù)與經(jīng)直接或間接標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合而進(jìn)行檢測(cè)。適宜的標(biāo)記及標(biāo)記探針或者配基的方法是現(xiàn)有技術(shù)。在現(xiàn)有技術(shù)中，標(biāo)記包括放射性同位素、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、酶、抗體等等。其可以通過已知程序來(lái)得以使用，例如切口移位、隨機(jī)引導(dǎo)及激酶處理。
用于檢測(cè)的PCR技術(shù)例如有RT-PCR，也可以使用本領(lǐng)域常用的各種改進(jìn)技術(shù)。
此外，通過使用一個(gè)試劑盒來(lái)從樣品中檢測(cè)LY6H基因?qū)⑹股鲜鰧?shí)驗(yàn)方法更加便利。
因此，本發(fā)明提供了一個(gè)LY6H基因檢測(cè)試劑盒，其包括本發(fā)明基因的一個(gè)DNA片斷。
該試劑盒至少包括一個(gè)與全部或一部分如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)行雜交的DNA片斷作為其基本成分，且還可以選擇性含有其他成分，例如標(biāo)記試劑及PCR試劑(例如，TaqDNA多聚酶、脫氧核苷三磷酸、引物等等)。
標(biāo)記試劑可以是放射性同位素或化學(xué)修飾劑如熒光物質(zhì)，DNA片斷可以與標(biāo)記試劑進(jìn)行偶聯(lián)。該試劑盒可進(jìn)一步包括適宜的反應(yīng)溶劑或稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)抗體、緩沖液、洗滌液、反應(yīng)終止溶液等等，其可以使得試驗(yàn)較容易進(jìn)行。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)診斷神經(jīng)變性疾病的方法其包括使用上述試驗(yàn)方法并使用診斷試劑或診斷試劑盒以實(shí)施所述方法。
使用上述方法直接或間接地對(duì)獲自試樣的LY6H基因進(jìn)行測(cè)序，由此可能發(fā)現(xiàn)與野生型LY6H基因有高同源性的新的LY6H基因相關(guān)基因。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，其可以在試樣中篩選人類與LY6H基因相關(guān)的基因，其包括進(jìn)行上述試驗(yàn)并對(duì)試樣中含有的LY6H基因進(jìn)行測(cè)序。
通過使用由本發(fā)明的人類LY6H基因編碼的蛋白(一個(gè)具有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的多肽)、一個(gè)多肽(其氨基酸序列由如SEQID NO:1所示序列刪除、替代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基后形成)、它們的片斷或其抗體等，可測(cè)定野生型LY6H和/或突變LY6H。
因此，本發(fā)明提供了一種測(cè)定抗野生型LY6H和/或突變LY6H抗體的方法，或者提供了一種測(cè)定其抗原的方法。通過這些方法，腦神經(jīng)的損傷程度可以通過野生型LY6H(多肽)的變化來(lái)檢測(cè)。通過利用上述現(xiàn)有技術(shù)對(duì)LY6H進(jìn)行測(cè)序，可以檢測(cè)這些變化。最好是通過用所述抗體(單抗或多抗)檢測(cè)LY6H多肽的差異或其存在與否來(lái)進(jìn)行檢則。
下面是一個(gè)測(cè)定所述野生型和/或突變LY6H的具體實(shí)施例?？筁Y6H抗體可被用于從一個(gè)人體的生物樣品(例如血或血清)中免疫沉淀該LY6H多肽，或者能夠與蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡聚丙烯酰胺凝膠上的LY6H多肽發(fā)生反應(yīng)。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，使用抗LY6H抗體可檢測(cè)石蠟切片或者冷凍組織樣本中的LY6H多肽。抗體的誘導(dǎo)和純化技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，且可選擇性使用適宜的技術(shù)。
有關(guān)野生型或突變型LY6H的優(yōu)選檢測(cè)技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射性免疫試驗(yàn)(RIA)、免疫放射分析(IRMA)及免疫酶試驗(yàn)(IEMA)及一個(gè)使用單抗和/或多抗的夾心技術(shù)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)LY6H配體或LY6H受體，其存在于細(xì)胞膜碎片上或細(xì)胞表面且具有與LY6H多肽結(jié)合的親和力。使在含有細(xì)胞膜碎片的生物樣品中的標(biāo)記的LY6H多肽發(fā)生偶聯(lián)，提取、分離且純化該偶聯(lián)產(chǎn)物，鑒別分離產(chǎn)物的氨基酸序列，從而可獲得LY6H受體。對(duì)該LY6H受體多肽進(jìn)行測(cè)序的方法及制備程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知。
更進(jìn)一步，通過應(yīng)用LY6H受體或其片斷來(lái)篩選不同的藥物，本發(fā)明可以用于挑選不同的化合物(其與LY6H受體反應(yīng)，包括低分子量的化合物、高分子量的化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片斷、抗原、抗體等等)。最好是LY6H受體作為一個(gè)整體被使用。在該篩選中所使用的LY6H受體多肽或其片斷可被固定在固體基質(zhì)上或者作為溶液中的游離物質(zhì)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面。
上述藥物篩選的一個(gè)實(shí)施例是一個(gè)篩選系統(tǒng)，其中用編碼LY6H多肽的重組DNA或其片斷穩(wěn)定轉(zhuǎn)化真核或原核寄主細(xì)胞，優(yōu)選其用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。作為一種替代，所述寄主細(xì)胞，不管是游離態(tài)或固定態(tài)，都被用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)。更為特殊的是，上述藥物篩選試驗(yàn)可以包括使LY6H受體多肽或其片斷與LY6H多肽或其片斷在候選藥劑的存在下發(fā)生反應(yīng)并形成復(fù)合物，檢測(cè)上述候選藥物對(duì)復(fù)合物形成的抑制程度。
因此，本發(fā)明可以提供一個(gè)藥物篩選的方法，其包括用LY6H受體多肽或其片斷接觸候選藥劑，然后，使用一個(gè)配基采用已知技術(shù)檢測(cè)所產(chǎn)生的復(fù)合物或LY6H受體多肽或其片斷的復(fù)合物。此外，通過測(cè)試LY6H受體活性，有可能估計(jì)候選藥物拮抗LY6H受體的活性并由此對(duì)上述LY6H活性進(jìn)行修飾，也就是說，有可能調(diào)控神經(jīng)元的生長(zhǎng)，或者調(diào)控蛋白-蛋白偶聯(lián)或復(fù)合物形成的活性。在這樣一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中，LY6H受體多肽或其片斷是經(jīng)過標(biāo)記的。當(dāng)從蛋白-蛋白復(fù)合物中分離游離的LY6H受體多肽或其片段并且測(cè)量游離物質(zhì)(非復(fù)合型)的標(biāo)記量時(shí)，該測(cè)量值作為衡量測(cè)試元素與LY6H受體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)。該測(cè)量值同樣可以作為L(zhǎng)Y6H受體與LY6H多肽結(jié)合受抑制的尺度。通過以這種方式分析LY6H多肽中的一小肽(假肽)，候選藥物可以被鑒定為具有LY6H受體拮抗活性的物質(zhì)。
本發(fā)明的另一種藥物篩選的方案用于篩選一個(gè)與LY6H受體多肽有足夠結(jié)合親和力的化合物。簡(jiǎn)單的來(lái)說，該程序包括在塑料栓或其他材料表面等固相載體上合成大量不同的測(cè)試肽化合物，用LY6H受體多肽作用測(cè)試肽化合物，洗滌后，使用已知技術(shù)檢測(cè)LY6H受體多肽的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物[例如，PCT專利公開號(hào)WO84-03564]。純化的LY6H受體可被直接包被在板上以用于所述藥物篩選程序。將LY6H受體多肽固定于固相載體，用未中和的抗多肽的抗體可收集其抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步被導(dǎo)向競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選試驗(yàn)的使用。能夠特異性結(jié)合LY6H受體多肽的中和抗體被用于與候選化合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合LY6H受體多肽或其片斷。通過這樣一個(gè)與中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，可以檢測(cè)具有一個(gè)或多個(gè)LY6H受體多肽抗原決定鎳的任何多肽的存在。
作為藥物篩選的進(jìn)一步的方法，本發(fā)明的LY6H多肽或者LY6H基因產(chǎn)物可被用于篩選可激活(激動(dòng)劑)或者抑制(拮抗劑或者抑制劑)LY6H多肽或LY6H基因產(chǎn)物活性的化合物。
通過使用本發(fā)明的LY6H多肽或LY6H基因產(chǎn)物，可以從細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制劑、化學(xué)庫(kù)及天然產(chǎn)生的組合物中鑒別出激動(dòng)劑或抑制劑。這些激動(dòng)劑或者抑制劑可以是天然的或者修飾過的本發(fā)明LY6H多肽的底物、配體、酶或者受體，或者是本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)或功能性復(fù)制體[Coligan等，當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)(current Protocols in Immunology),1(2),Chapter 5(1991)]。
原位雜交研究顯示本發(fā)明LY6H基因在人類正常腦的不同組織中表達(dá)，尤其在海馬及內(nèi)嗅皮質(zhì)有較高水平的表達(dá)，而這些位置正是早老性癡呆癥患者體內(nèi)受損最為嚴(yán)重的部位，而其表達(dá)水平在早老性癡呆癥患者的顳葉包括海馬及內(nèi)嗅皮質(zhì)中，卻有顯著的降低。因此，該基因非常有可能與所述疾病的發(fā)生及發(fā)展緊密聯(lián)系。
因此，預(yù)期該LY6H蛋白或LY6H基因產(chǎn)物的激動(dòng)劑或拮抗劑可作為神經(jīng)變性疾病，例如早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病的治療或預(yù)防藥物使用。
通過篩選用于治療LY6H基因相關(guān)疾病的候選藥劑獲得的化合物具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(本發(fā)明基因的表達(dá)產(chǎn)物)的功能，例如在中樞或其他神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性等等，以及腦部記憶(記憶形成)活性等生理活性，因此其可以被用作不同類型神經(jīng)變性疾病例如早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病的治療或預(yù)防藥物。這樣，本發(fā)明的蛋白(包括基因表達(dá)產(chǎn)物、其部分肽或鹽)可被用作篩選能提高本發(fā)明蛋白功能的化合物的試劑。
本發(fā)明提供了一種篩選可以提高本發(fā)明蛋白功能(下文有時(shí)表示為本發(fā)明蛋白的功能性增強(qiáng)劑)的化合物的方法。更為具體的是，本發(fā)明提供了(a)一種篩選本發(fā)明蛋白的功能性增強(qiáng)劑的方法，其包括一方面使神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織與本發(fā)明的蛋白相接觸(1)，另一方面將該蛋白及測(cè)試化合物與所述神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織相接觸(2)，并比較結(jié)果。還提供了(b)一種篩選本發(fā)明蛋白的功能性增強(qiáng)劑的方法，其包括一方面(1)將本發(fā)明蛋白給藥至一個(gè)脊椎動(dòng)物，另一方面(2)將本發(fā)明蛋白及測(cè)試化合物給藥至該脊椎動(dòng)物，并比較結(jié)果。
更為具體的是，在上述篩選方法(a)中，在上述(1)和(2)的條件下測(cè)量中樞或其他神經(jīng)系統(tǒng)中的生理活性，例如神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性或者神經(jīng)膠質(zhì)激活活性，且比較其結(jié)果。在篩選方法(b)中，在上述(1)和(2)的條件下測(cè)量腦中的記憶(記憶形成)活性，且比較其結(jié)果。
用于上述篩選的神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì))包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及他們的雜交瘤細(xì)胞(例如，N18TG-2、IMR-32、GOTO(例如、GOTO-P3)、NBl、C6BU-1、U251、KNS42、KNS81及NG108-15細(xì)胞及與神經(jīng)細(xì)胞具有潛在區(qū)別的PC12細(xì)胞)?？杀挥玫降纳窠?jīng)組織包括小鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞、大鼠海馬初次培養(yǎng)細(xì)胞、鼠肽培養(yǎng)Prukinje細(xì)胞及小鼠背根神經(jīng)中樞。測(cè)試化合物包括多肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物及血漿。這些化合物可以是新型化合物或者已知化合物。
在進(jìn)行所述的篩選方法(a)時(shí)，本發(fā)明的蛋白(包括其部分肽或鹽)被溶解或懸浮在篩選緩沖液中以制備本發(fā)明蛋白的樣品。緩沖液可以是任一緩沖溶液，只要其不干擾本發(fā)明蛋白與神經(jīng)細(xì)胞或組織之間的接觸。(例如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液等等，其pH大約為4-10，優(yōu)選pH大約為6-8)。接觸的持續(xù)時(shí)間一般大約是1-10天，優(yōu)選7-10天。接觸的溫度一般大約為37℃。本發(fā)明蛋白在中樞或其他神經(jīng)系統(tǒng)中的活性，例如，神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、或者神經(jīng)膠質(zhì)激活活性可以通過慣用方法來(lái)確定，例如軸突延長(zhǎng)的視覺估計(jì)、胞內(nèi)Ca2+濃度的測(cè)量等等。
經(jīng)過在上述條件(1)和條件(2)下進(jìn)行比較，當(dāng)測(cè)試化合物的所述生理活性，例如，神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、或者神經(jīng)膠質(zhì)激活活性，提高至少大約20％，較好不少于大約30％，更好是不低于大約50％，最好是不低于大約70％時(shí)，其可被選擇作為本發(fā)明蛋白的功能性增強(qiáng)劑。
在進(jìn)行上述的篩選方法(b)時(shí)，本發(fā)明的蛋白，單獨(dú)或者與測(cè)試化合物聯(lián)合，通過靜脈、皮下、肌肉注射或者口服給藥至測(cè)試動(dòng)物體內(nèi)。用于口服的本發(fā)明蛋白的劑量一般大約是每個(gè)動(dòng)物(基于50kg體重)0.1-100mg/天，較好是大約1.0-50mg/天，更好是大約1.0-20mg/天。注射用藥物劑量應(yīng)按照接受者及給藥方法進(jìn)行選擇，但較好是每一個(gè)哺乳動(dòng)物(50kg體重)靜脈內(nèi)注射大約0.01-30mg/天，更好是大約0.1-20mg/天，最好是大約0.1-10mg/天。
測(cè)試動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，如人、猴子、猩猩、小鼠、大鼠、兔子、羊、豬、牛、馬、貓、狗和魚(例如鯉魚、鮭魚、青魚、虹鱒魚、金魚等等)。
本發(fā)明蛋白在腦中的記憶(記憶形成)活性可按照water maze testprotocol[Morris,R.G.M.,J.Neurosci.Meth.,11,47-60(1984)]來(lái)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)過在所述條件(2)與條件(1)下進(jìn)行比較，當(dāng)測(cè)試化合物的記憶活性提高不少于約20％，較好不少于50％，最好不要低于70％時(shí)，其可作為本發(fā)明蛋白的一個(gè)功能性增強(qiáng)劑。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式，篩選試劑盒中本發(fā)明的蛋白(包括基因的表達(dá)產(chǎn)物、其部分肽或他們的鹽)為其主要成分。含有下述組分1-4的試劑盒是本發(fā)明的篩選試劑盒實(shí)例。
組份1作為試驗(yàn)緩沖液的Hanks溶液；組份2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(本發(fā)明蛋白或其鹽)；組份3神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(所述神經(jīng)細(xì)胞或組織在一個(gè)24孔平板上的培養(yǎng)物，104個(gè)細(xì)胞/孔，使用Eagle's MEM,Hanks溶液在5％CO237℃下培養(yǎng))；組份4一個(gè)用于觀察的倒置顯微鏡；應(yīng)用上述篩選試劑盒的篩選可以按照下述方式進(jìn)行[方法]清點(diǎn)含有測(cè)試化合物的孔中的軸突延長(zhǎng)陽(yáng)性細(xì)胞在每一個(gè)視野范圍內(nèi)的數(shù)目，且與不含有測(cè)試化合物的對(duì)照孔中的軸突延長(zhǎng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，然后統(tǒng)計(jì)性檢驗(yàn)其差別。
由篩選方法或本發(fā)明的篩選試劑盒獲得的化合物或鹽選自多肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物等等，并且是一個(gè)能夠提高本發(fā)明蛋白的功能的化合物。該化合物可具有生理活性，例如神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性或者神經(jīng)膠質(zhì)激活活性等，并因此增加性或協(xié)同性地提高本發(fā)明的蛋白等的功能，或者，盡管其本身并未顯示出該生理活性的組合物，但最終還是提高了本發(fā)明蛋白的功能?；衔锏柠}包括具有生理學(xué)上可以接受的的堿(例如堿金屬)或酸(例如有機(jī)酸，無(wú)機(jī)酸)的鹽。特別優(yōu)選生理學(xué)上可接受的酸加成鹽類，例如，無(wú)機(jī)酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)的鹽或有機(jī)酸(例如乙酸、蟻酸、丙炔酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)的鹽。
可以提高本發(fā)明蛋白功能的化合物或鹽從使用價(jià)值上來(lái)說是一種安全、低毒性的治療-預(yù)防不同類型神經(jīng)變性疾病的藥物。例如，早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病。
上述篩選程序涉及到可以在其細(xì)胞表面表達(dá)LY6H多肽或者對(duì)本發(fā)明蛋白反應(yīng)的細(xì)胞的使用。這些細(xì)胞例如獲自哺乳動(dòng)物、酵母、果蠅屬及大腸桿菌的細(xì)胞。將那些表達(dá)LY6H多肽的細(xì)胞(或者表達(dá)多肽的細(xì)胞膜)或者對(duì)LY6H多肽反應(yīng)的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，以觀察對(duì)結(jié)合反應(yīng)或功能反應(yīng)的促進(jìn)或抑制。然后，將與候選化合物接觸的細(xì)胞的LY6H活性與未接觸的類似細(xì)胞的該活性進(jìn)行比較。
上述試驗(yàn)方式可通過以下程序完成。用經(jīng)直接或間接地標(biāo)記的候選化合物檢測(cè)攜有LY6H多肽的細(xì)胞的結(jié)合力，或者在一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中與標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。在這種方式中，候選化合物的結(jié)合可以很容易被檢測(cè)到。此外，在此測(cè)試中使用一個(gè)適用于攜有LY6H多肽的細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)候選化合物是否因LY6H多肽的激活而產(chǎn)生信號(hào)。該活性的抑制劑在一個(gè)已知激動(dòng)劑的存在下進(jìn)行測(cè)試，且可觀察到候選化合物由于激動(dòng)劑的作用而對(duì)活性產(chǎn)生影響。該測(cè)試方法包括一個(gè)簡(jiǎn)單的程序，首先將候選化合物與含有LY6H多肽的溶液進(jìn)行混合以形成混合物，確定LY6H多肽在混合物中的活性，然后將該混合物的LY6H多肽活性與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。
與LY6H蛋白結(jié)合的低分子量化合物(促進(jìn)劑或拮抗劑)可通過BIACORE 2000篩選獲得，例如，(Markgren,P.O.,等等，AnalyticalBiochemistry,265,340-350(1998)]。
按照本發(fā)明，為了開發(fā)一種更具活性或穩(wěn)定的LY6H多肽衍生物或一種可以增強(qiáng)或阻斷LY6H多肽在體內(nèi)的功能的藥物，可構(gòu)建一個(gè)生物活性多肽或其結(jié)構(gòu)類似物以進(jìn)行相互作用，例如LY6H激動(dòng)劑、LY6H拮抗劑、LY6H抑制劑等。通過X射線結(jié)晶衍射、計(jì)算機(jī)模擬或者這些技術(shù)的聯(lián)合來(lái)確定另一種蛋白與LY6H多肽形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從而獲得上述結(jié)構(gòu)類似物。有關(guān)結(jié)構(gòu)類似體的結(jié)構(gòu)信息可以基于同源蛋白的結(jié)構(gòu)通過多肽模擬獲得。
為了獲得所述更具活性或穩(wěn)定的LY6H多肽衍生物，可以使用丙氨酸掃描分析。該方法包括將每一氨基酸殘基替換為Ala以估計(jì)替換對(duì)多肽活性的影響。當(dāng)對(duì)多肽的每一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行如此分析時(shí)，可確定對(duì)于該多肽活性或穩(wěn)定性具有重要性的區(qū)域。通過這種方式，有可能設(shè)計(jì)出一個(gè)更具活性或穩(wěn)定性的LY6H多肽衍生物。
同樣有可能分離通過功能性測(cè)試及選擇出的目標(biāo)特異性抗體，并分析其晶體結(jié)構(gòu)。通過這種途徑，通?？梢垣@得一個(gè)藥物核心，可以以其為基礎(chǔ)進(jìn)行后繼藥物的設(shè)計(jì)。通過誘導(dǎo)功能性藥物活性抗體的抗獨(dú)特型抗體，有可能從化學(xué)或生物法產(chǎn)生的多肽庫(kù)中鑒別及分離該多肽。因此，可以預(yù)期選擇出的多肽也可以作為一種藥物核心。
利用這種方法，有可能設(shè)計(jì)并開發(fā)出具有更高或更穩(wěn)定的LY6H活性的藥物或用作LY6H活性抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物。
使用次海馬神經(jīng)元初級(jí)培養(yǎng)物，通過滴定法測(cè)量該藥物對(duì)于神經(jīng)元生存活性的影響[Japan.J.Pharmacol,53,221-227(1990)]，或者檢測(cè)其對(duì)早老性癡呆模型動(dòng)物(如突變的β-淀粉狀前體蛋白基因或突變的早老1型基因的轉(zhuǎn)基因鼠)的神經(jīng)變性損傷的影響[Nature,373,523-527(1995):Nature Med.,5,560-564(1999)]，從而可評(píng)價(jià)該藥物。
這樣獲得的化合物不僅可作為藥物用于早老性癡呆，而且可以作為治療性藥物用于腦梗塞及其它神經(jīng)變性疾病。
此外，按照本發(fā)明，通過構(gòu)建LY6H基因攜帶失效小鼠(具有LY6H基因失效背景的轉(zhuǎn)基因小鼠)，有可能確定LY6H基因核苷酸序列的哪個(gè)或哪些位點(diǎn)對(duì)于所述LY6H在體內(nèi)的多種活性產(chǎn)生影響，也可以說，LY6H基因及修飾的LY6H基因的表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)具有哪些功能。
該方法是這樣的一種技術(shù)，其可以通過使用同源重組基因?qū)σ换铙w的遺傳信息進(jìn)行有意修飾，且包括這樣的一種方法，其使用鼠胚干細(xì)胞(ES細(xì)胞)作為樣本[Capeccchi,M.R.,Science,244,1288-1292(1989)]。
構(gòu)建所述突變鼠的方法此刻已是本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的常規(guī)技術(shù)。通過把一個(gè)人類野生型LY6H基因或一個(gè)突變的LY6H基因應(yīng)用于上述技術(shù)的改進(jìn)方法，可以很容易構(gòu)建突變鼠[Noda,Testuo(ed.):Jikken Igaku(Expenimental Medicine)，增補(bǔ)版，14(20)(1996),Yodosha]。因此，通過使用該技術(shù)，有可能設(shè)計(jì)并開發(fā)具有更高或更穩(wěn)定的LY6H活性的藥物或用作LY6H活性抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物。
圖例的簡(jiǎn)要說明

圖1是一個(gè)RNA印跡的圖解說明，其顯示了LY6H基因在早老性癡呆癥患者腦部不同位點(diǎn)的表達(dá)模式。
然后每一個(gè)注入的克隆在1.5ml的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取DNA且使用一個(gè)自動(dòng)的質(zhì)粒提取器PI-100(Kurabo)對(duì)其進(jìn)行純化。污染的E.coli RNA使用RNase降解除去。最后，準(zhǔn)備30μl的DNA溶液且使用其中的2μl，近似的DNA尺寸和數(shù)量通過微型凝膠法來(lái)檢查。一個(gè)7μl部分被用于測(cè)序，剩余的21μl當(dāng)作質(zhì)粒DNA在4℃下儲(chǔ)藏。通過這種方法，一個(gè)可被用于作為FISH(原位熒光雜交，下文將詳細(xì)描述)探針的裝配型質(zhì)粒通過該程序的簡(jiǎn)單修改就可以提取到。
然后，實(shí)施使用T3,T7或一個(gè)合成的寡聚核苷酸引物[Sanger,F.,等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463-5467(1977)]的Sanger等使用的雙脫氧中止反應(yīng)，或聯(lián)合雙脫氧中止反應(yīng)及PCR的循環(huán)序列反應(yīng)[Carothers,A.M.,et al.,Bio.Techniques,7,494-499(1989)]。這些均是鏈延長(zhǎng)技術(shù)，其中鏈末端為專一的4種堿基且以小量(大約為0.1-0.5μg)的質(zhì)粒DNA作為模板。
使用一個(gè)FITC(異硫氰酸熒光素)-標(biāo)記的引物作為序列引物，使用Taq多聚酶進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。對(duì)于熒光標(biāo)記的DNA片斷，使用自動(dòng)DNA序列儀ALFTMDNA序列儀(Pharmacia)確定cDNA的5′端大約有400個(gè)核苷酸序列。
3′-端非翻譯區(qū)在基因中有很高的異源性，適于區(qū)別不同的基因。因此，3′-末端區(qū)域的測(cè)序在某些情況下也在進(jìn)行。
DNA序列儀所產(chǎn)生的大量的核苷酸序列信息被傳輸進(jìn)64-位的計(jì)算機(jī)DEC3400用于同源性分析。該同源性分析使用一數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank,EMBL)按照UWGCGls FASTA程序進(jìn)行搜索[Pearson,W.R.andLipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,85,2444-2448(1988)]。
Fujiwara等詳細(xì)描述了上述分析人胎兒腦cDNA庫(kù)的方法[Fujiwara,T.,等，DNA Res.,2,107-111(1991)]。
ESTs(表達(dá)的序列標(biāo)記表達(dá)基因片斷的部分DNA序列)任意選自如上構(gòu)建的人類胎兒腦cDNA庫(kù)，然后對(duì)其測(cè)序。
按照FASTA程序在GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列搜索中的標(biāo)為GEN-425D01的克隆被發(fā)現(xiàn)與編碼鼠Ly6家族蛋白的基因有很高的同源性。
將一個(gè)雙鏈DNA插入到一個(gè)載體上(pBluescript載體；Stratagene)，以其為模板且以一個(gè)合成的寡聚核苷酸作為引物，含有上述克隆的整個(gè)編碼區(qū)的cDNA的核苷酸序列由Sanger's雙脫氧鏈中止法進(jìn)行確定。
使用ABIPRISMTM377自動(dòng)DNA序列儀進(jìn)行測(cè)序，其揭示了上述獲得的克隆的cDNA序列含有一個(gè)420個(gè)堿基的氨基酸編碼區(qū)，并由此編碼的氨基酸序列具有140個(gè)氨基酸殘基。全長(zhǎng)cDNA克隆的核酸序列由854個(gè)核苷酸組成。全長(zhǎng)序列顯示于SEQ ID NO:3，可讀框的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:2，且為所述核苷酸序列所編碼的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:1。
將人類LY6H蛋白的氨基酸序列與其他的Ly6家族蛋白的序列進(jìn)行比較，且將氨基酸編譯起始區(qū)保存的核苷酸序列[Kozak,M.,J.Biol.Chem.,266,19867-19870(1991)]與人類LY6H基因的5′-區(qū)進(jìn)行比較。由此確定起始密碼子位于位置99-101，其為顯示于SEQ ID NO:3的核苷酸序列的第二個(gè)ATG三聯(lián)體。而且，聚腺苷酸信號(hào)(AATAAA)位于同一核苷酸序列的位置832-837。(2)RNA印跡分析為了確定LY6H在組織中的表達(dá)形狀，使用不同的人類組織進(jìn)行RNA印跡試驗(yàn)分析。
在RNA印跡試驗(yàn)分析中，使用到人類MTN(Multiple-TissueNorthern)BlotⅠ及Ⅱ(CLONTECH)。
使用一個(gè)T3及T7啟動(dòng)子序列構(gòu)成的引物通過PCR擴(kuò)增cDNA片斷。
所述GEN一425D01cDNA克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用[32p]-dCTP(隨意引物DNA標(biāo)記試劑盒，Boehringer Mannheim GmbH)進(jìn)行標(biāo)記以用作一個(gè)探針。
預(yù)雜交含有擴(kuò)增產(chǎn)物的印跡(在制備方案確定的條件下)，然后按照制備方案進(jìn)行雜交。
在含有1M NaCl/50mM Tris-HCl(pH7.5)/2×Denhardt's溶液/10％右旋糖苷硫酸鹽/1％SDS溶液(含有100μg/ml的變性的鮭魚精液DNA)中，在65℃下過夜，以進(jìn)行雜交。產(chǎn)物用2×SSC/0.1％SDS在室溫下洗滌兩次后，再使用0.1SSC/0.1％SDS在65℃下洗滌40分鐘。在-70℃下將該濾膜暴露于X光片(kodak)18個(gè)小時(shí)。
上述測(cè)試通過使用下述成人組織進(jìn)行腦、胰腺、睪丸、小腸、結(jié)腸、胸腺、前列腺及卵巢、心臟、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎、脾、睪丸及外周血液白細(xì)胞。結(jié)果是，在腦、胰腺、睪丸、小腸、結(jié)腸、胸腺、前列腺及卵巢中大約有1kb的轉(zhuǎn)錄物與LY6H顯示出同源性，尤其在腦中同源性最高。(3)使用裝配型質(zhì)?？寺⊥ㄟ^FISH在染色體上定位基因按照已知的方法使用每一種裝配型質(zhì)粒DNA0.5μg作為探針，以進(jìn)行用于染色體定位的FISH[Takahashi,E.et al.,Hum.Genet.,86,14-16(1990)]。其通過Provia 100膠片(Fuji,ISO 100)或者CCD照相機(jī)系統(tǒng)(Applied Imaging Cyto Vision)捕獲FISH信號(hào)。
結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)人類LY6H基因位于第8條染色體的q24.3上。這樣，GEN-425D01被繪制在染色體帶8q24.3上。
屬于Ly6家族的蛋白的抗體作為基因治療的一個(gè)目的已被用于純化血液干細(xì)胞[van de Rijn,M.,等.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,86,4634-4638(1989)]、血液細(xì)胞分化的研究[van de Rijn.M.,et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.,USA.,86,4634-4638(1989)；Classon,B.J.及Coverdale,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,5296-5300(1994)]、免疫細(xì)胞的激活[Malek,T.R,et al.,J.Exp.Med.,164,709-722(1986)]、活化免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抑制[Haque,A.,et al.,Immunology,69,558-563(1990)]等，并且也發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤的活性[Lu,L.,et al.,J.Immunol.,142,719-725(1989)]。本發(fā)明樣品中所提供的人類LY6H基因使得檢測(cè)基因在不同組織中的表達(dá)、通過基因工程技術(shù)制備人類LY6H蛋白及使用該基因構(gòu)建抗體成為可能，由此使得所述的血液干細(xì)胞的純化、血液細(xì)胞分化的研究、免疫細(xì)胞的激活、免疫細(xì)胞激活的抑制及腫瘤的治療成為可能。
此外，以高水平在大腦中表達(dá)的LY6H基因使得研究神經(jīng)細(xì)胞的分化、神經(jīng)元的激活及神經(jīng)及精神疾病的治療成為可能。
使用人類LY6H蛋白為目標(biāo)篩選化合物同樣也是可能的，且由此獲得的化合物對(duì)于作為抗人類LY6H蛋白抗體使用也是有用的。
為了調(diào)查L(zhǎng)Y6H基因在早老性癡呆癥患者的腦組織中的表達(dá)，使用早老性癡呆癥患者的腦組織及正常人類腦組織進(jìn)行RNA印跡分析。
使用人類正常腦blotⅡ及人類早老性癡呆癥患者腦blotⅡ(都為Invitrogen)進(jìn)行RNA印跡分析，且用正常及早老性癡呆癥腦比較LY6H基因在不同腦組織中的表達(dá)，其分別為額葉、顳葉、頂葉、枕葉、橋、丘腦及腦胼胝體。
結(jié)果如圖1所示。
正如實(shí)施例1所指出的那樣，LY6H基因在大腦中有很高水平的表達(dá)。上述分析揭示了，當(dāng)證實(shí)該基因在人類正常腦的不同組織中的表達(dá)時(shí)，該基因在枕腦葉(包括海馬及內(nèi)嗅皮質(zhì))有特別高水平的表達(dá)，這些區(qū)域也已知為早老性癡呆癥患者受損最為嚴(yán)重的區(qū)域，而當(dāng)患該病以后，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域基因的表達(dá)顯著降低，這些都表明該基因?qū)τ谠缋闲园V呆癥的發(fā)生及發(fā)展都有著密切的關(guān)系。
因此，期望LY6H基因的正義鏈、LY6H基因表達(dá)產(chǎn)物及LY6H蛋白能用作治療早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病的藥物。
此外，也期望LY6H蛋白的激動(dòng)劑及拮抗劑可用作治療早老性癡呆癥或其他疾病的藥物。
作為對(duì)照，本發(fā)明蛋白活性成分在沸水浴中熱處理5分鐘后加入到該培養(yǎng)基中(煮沸蛋白組)。(5)海馬神經(jīng)元生存活性的評(píng)價(jià)如(4)制備的每一組細(xì)胞(培養(yǎng)物)培養(yǎng)72小時(shí)。然后，本發(fā)明蛋白活性成分的海馬神經(jīng)元生存支持活性可通過MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，本MTT實(shí)驗(yàn)可以使用Promega's＂CellTiter 96＂測(cè)試系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。(6)中腦神經(jīng)元的分離及培養(yǎng)在胚胎形成第14天從鼠胎SD中無(wú)菌分離出其全腦并將腹側(cè)中腦切除。使用手術(shù)刀將切除的組織切成細(xì)薄片，并在含有0.25％胰島素及0.002％DNaseⅠ的PBS中，在37℃酶處理培養(yǎng)20分鐘。通過加入牛胎血清使酶反應(yīng)中止后，使用一個(gè)具有塑料頂端的吸液管吹吸細(xì)胞消化液，重復(fù)三次以分散細(xì)胞。使細(xì)胞分散物經(jīng)過一個(gè)由兩層疊層式鏡頭紙組成的濾膜以除去未消化的組織，并在1000rpm下離心5分鐘。細(xì)胞用DMEM/F12(Gibco)洗滌且移入含有10％FCS-DMEM/F12的聚L賴氨酸(Sigma)包被的96-孔板，其最終濃度為3×105cells/cm2。(7)本發(fā)明蛋白活性成分的處理如(6)制備的細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為1％N2補(bǔ)充(Gibco)-DMEM/F12，本發(fā)明蛋白活性成分如(2)進(jìn)行制備后，將其加入到該培養(yǎng)基中(發(fā)明組)。
作為對(duì)照，本發(fā)明蛋白活性成分在沸水浴中熱處理5分鐘后加入到該培養(yǎng)基中(煮沸蛋白組)。(8)中腦神經(jīng)元生存支持活性的評(píng)價(jià)如(7)準(zhǔn)備的每一組細(xì)胞(培養(yǎng)物)培養(yǎng)72小時(shí)。然后，本發(fā)明蛋白活性成分的中腦神經(jīng)元生存支持活性可通過MTT[3-(4,5-dinetyhlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，本MTT實(shí)驗(yàn)可以使用Promega′s＂CellTiter 96＂測(cè)試系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。(9)多巴胺能神經(jīng)元生存支持活性的評(píng)價(jià)如(7)準(zhǔn)備的每一組細(xì)胞(培養(yǎng)物)培養(yǎng)72小時(shí)。然后，在室溫下置于4％多聚甲醛-PBS中15分鐘，然后用1％Triton X100/PBS使其經(jīng)過一個(gè)膜。
為了避免抗體的非特異性結(jié)合，細(xì)胞在10％羊血清一PBS中培育一個(gè)小時(shí)，然后利用一個(gè)抗酪氨酸羥化酶多克隆抗體(Chemicon；使用PBS稀釋1000倍)使細(xì)胞在4℃下溫育16個(gè)小時(shí)。移去抗體溶液后，細(xì)胞用PBS洗滌。然后加入過氧化物酶標(biāo)記的右旋糖苷聚合物偶聯(lián)的羊抗兔免疫球蛋白(Dako)，細(xì)胞在室溫下溫育一個(gè)小時(shí)。
酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞通過以二氨基聯(lián)苯胺作為底物的顏色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。利用作為標(biāo)記的酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，可以評(píng)價(jià)多巴胺能神經(jīng)元生存支持活性。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一個(gè)新型腦特異性基因及其編碼的蛋白，并且通過它們的使用，本發(fā)明也同時(shí)提供了有用的技術(shù)，用于血液干細(xì)胞純化、血細(xì)胞分化的研究、免疫細(xì)胞的激活、活化免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抑制及腫瘤的治療。同時(shí)，本發(fā)明也提供了新型基因，其具有下列生理活性，如大腦神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及腦記憶形成活性。
考慮到在早老性癡呆癥患者的腦顳葉中其表達(dá)水平的顯著降低，本發(fā)明基因被認(rèn)為可以抑制組織的神經(jīng)變性，由此其可被用作一種基因治療藥物。而且，本發(fā)明基因的表達(dá)產(chǎn)物可應(yīng)用于治療或預(yù)防這些神經(jīng)變性疾病的藥物。
序列表<110>Ostuka Pharmaceutical Co.,ltd.<120>LY6H基因<130>P99-45<160>3<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>140<212>PRT<213>人類胚胎大腦<400>1Met Leu Pro Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ala Val1 5 10 15Leu Leu Cys Ser Ala Pro Ala His Gly Leu Trp Cys Gln Asp Cys Thr20 25 30Leu Thr Thr Asn Ser Ser His Cys Thr Pro Lys Gln Cys Gln Pro Ser35 40 45Asp Thr Val Cys Ala Ser Val Arg lle Thr Asp Pro Ser Ser Ser Arg50 55 60Lys Asp His Ser Val Asn Lys Met Cys Ala Ser Ser Cys Asp Phe Val65 70 75 80Lys Arg His Phe Phe Ser Asp Tyr Leu Met Gly Phe Ile Asn Ser Gly85 90 95Ile Leu Lys Val Asp Val Asp Cys Cys Glu Lys Asp Lcu Cys Asn Gly100 105 110Ala Ala Gly Ala Gly His Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu115 120 125Leu Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Trp Ala Gly Pro130 135 140<210>2<211>420<212>DNA<213>人類胚胎大腦<400>2atgctgcctg cagccatgaa gggcctcggc ctggcgctgc tggccgtcct gctgtgctcg 60gcgcccgctc atggcctgtg gtgccaggac tgcaccctga ccaccaactc cagccattgc 120accccaaagc agtgccagcc gtccgacacg gtgtgtgcca gtgtccgaat caccgatccc 180agcagcagca ggaaggatca ctcggtgaac aagatgtgtg cctcctcctg tgacttcgtt 240aagcgacact ttttctcaga ctatctgatg gggtttatta actctgggat cttaaaggtc 300gacgtggact gctgcgagaa ggatttgtgc aatggggcgg caggggcagg gcacagcccc 360tgggccctgg ccggggggct cctgctcagc ctggggcctg ccctcctctg ggctgggccc 420<210>3<211>854<212>DNA<213>人類胚胎大腦<220><221>CDS<222>(99)..(518)<400>3acgccgcccg agcccggagt gcggacaccc ccgggatgct tgcgccccag aggacccgcg 60ccccaagccc ccgcgccgcc cccaggccca cccggagc atg ctg cct gca gcc atg 116Met Leu Pro Ala Ala Met1 5aag ggc ctc ggc ctg gcg ctg ctg gcc gtc ctg ctg tgc tcg gcg ccc 164Lys Gly Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ala Val Leu Leu Cys Ser Ala Pro10 15 20gct cat ggc ctg tgg tgc cag gac tgc acc ctg acc acc aac tcc agc 212Ala His Gly Leu Trp Cys Gln Asp Cys Thr Leu Thr Thr Asn Ser Ser25 30 35cat tgc acc cca aag cag tgc cag ccg tcc gac acg gtg tgt gcc agt 260His Cys Thr Pro Lys Gln Cys Gln Pro Ser Asp Thr Val Cys Ala Ser40 45 50gtc cga atc acc gat ccc agc agc agc agg aag gat cac tcg gtg aac 308Val Arg Ile Thr Asp Pro Ser Ser Ser Arg Lys Asp His Ser Val Asn55 60 65 70aag atg tgt gcc tcc tcc tgt gac ttc gtt aag cga cac ttt ttc tca 356Lys Met Cys Ala Ser Ser Cys Asp Phe Val Lys Arg His Phe Phe Ser75 80 85gac tat ctg atg ggg ttt att aac tct ggg atc tta aag gtc gac gtg 404Asp Tyr Leu Met Gly Phe Ile Asn Ser Gly Ile Leu Lys Val Asp Val90 95 100gac tgc tgc gag aag gat ttg tgc aat ggg gcg gca ggg gca ggg cac 452Asp Cys Cys Glu Lys Asp Leu Cys Asn Gly Ala Ala Gly Ala Gly His105 110 115agc ccc tgg gcc ctg gcc ggg ggg ctc ctg ctc agc ctg ggg cct gcc 500Ser Pro Trp Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ser Leu Gly Pro Ala120 125 130ctc ctc tgg gct ggg ccc tgatgtctcc tccttcccac ggggcttctg 548Leu Leu Trp Ala Gly Pro135 140agcttgctcc cctgagcctg tggctgccct ctccccagcc tggcgtggct ggggctgggg 608gcagccttgg cccagctccg tggctgtggc ctgtggctct cactcctccc ccgacgtgaa 668gcctccctgt ctctccgcca gctctgagtc ccaggcagct ggacatctcc aggaaaccag 728gccatctggg caggaggcct ggggatgagg gtgggggggg acccccaggt cccggagggg 788aagtgaagca acagcccagc tggaagggcg tcttctgcgg agaaataaag tcacttttga 848gtcctg85權(quán)利要求
1．一種基因，其包括編碼下述蛋白(a)或(b)的一個(gè)核苷酸序列。(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(b)具有由如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列刪除、替代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后形成的氨基酸序列的蛋白，其生理學(xué)活性選自神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及腦記憶形成活性組中的至少一種。
2．如權(quán)利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3．一種基因，其包括下述多聚核苷酸(a)或(b)(a)一個(gè)含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多聚核苷酸(b)一個(gè)多聚核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA進(jìn)行雜交。
4．如權(quán)利要求1-3之一所述的基因，其特征在于該基因是一個(gè)人類基因。
5．一種基因表達(dá)載體，其含有如權(quán)利要求2或3所述的基因。
6．一種寄主細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求5所述的基因表達(dá)載體。
7．一種表達(dá)產(chǎn)物，其由如權(quán)利要求6所述的寄主細(xì)胞表達(dá)。
8．一種蛋白，其由如權(quán)利要求1所述基因編碼。
9．一種抗體，其具有與如權(quán)利要求7所述的表達(dá)產(chǎn)物或權(quán)利要求8所述的蛋白的結(jié)合親和力。
10．一種表達(dá)產(chǎn)物，其含有由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列形成的基因的全部或一部分，且其生理活性選白神經(jīng)元生存支持活性、神經(jīng)延長(zhǎng)活性、神經(jīng)再生活性、神經(jīng)膠質(zhì)激活活性及記憶(腦記憶形成)活性中的至少一種。
11．一種治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的組合物，其包括有如權(quán)利要求8所述蛋白、具有其部分氨基酸序列的等價(jià)蛋白，或如權(quán)利要求10所述作為一種活性成分與藥物載體結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物。
12．如權(quán)利要求11所述的用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的組合物，其特征在于所述神經(jīng)變性疾病選自早老性癡呆癥、阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病。
13．一條含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的至少20個(gè)連續(xù)組成核苷酸的有義寡聚核苷酸。
14．一種基因治療組合物，其含有如權(quán)利要求13所述的作為活性成分與藥物載體結(jié)合的有義寡聚核苷酸。
15．一種基因特異性探針，其含有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的至少10個(gè)連續(xù)組成核苷酸的寡聚核苷酸序列。
16．一種用于篩選候選組合物的方法，其包括使用如權(quán)利要求8所述的蛋白、具有其部分氨基酸序列的等價(jià)蛋白、或者如權(quán)利要求10所述的表達(dá)產(chǎn)物，所述候選化合物結(jié)合或影響該蛋白、等價(jià)蛋白或基因產(chǎn)物。
17．用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法，其包括給予患者有效量的如權(quán)利要求8所述的蛋白、具有其部分氨基酸序列的等價(jià)蛋白或者如權(quán)利要求10所述的表達(dá)產(chǎn)物。
18．如權(quán)利要求17所述的用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法，其特征在于所述神經(jīng)變性疾病選自早老性癡呆癥，阿爾茨海默類型癡呆、腦缺血及帕金森病。
19．一種基因治療的方法，其包括給予患者有效量的如權(quán)利要求13所述的有義寡聚核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腦特異性基因，其對(duì)于治療早老性癡呆癥是非常有用的，例如，其包括一個(gè)編碼如SQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列及其片斷的核苷酸序列；一個(gè)含有該基因的表達(dá)載體；一個(gè)含有該表達(dá)載體的寄主細(xì)胞；該基因的一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物；該產(chǎn)物的一個(gè)抗體；一種用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的藥物組合物等。
文檔編號(hào)C07K14/705GK1318099SQ99811019
公開日2001年10月17日 申請(qǐng)日期1999年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月17日
發(fā)明者堀江正人, 奧富圭一, 谷口吉弘, 鈴木干生, 大淵豐 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社