轉(zhuǎn)基因蛋白g10-epsps的定量檢測方法及所用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種g10?epsps定量檢測試劑盒，包括如下組分：抗體預(yù)包被酶標板；樣品稀釋液，為磷酸鹽緩沖液；洗滌液，為含Tween?20的磷酸鹽緩沖液；反應(yīng)終止液，為H2SO4溶液；Ⅴ、酶標抗體，為辣根過氧化物酶標記的鼠抗g10?epsps單克隆抗體；Ⅵ、顯色劑；Ⅶ、g10?epsps標準品。本發(fā)明還同時公開了利用試劑盒進行的定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白g10?epsps的方法，包括以下步驟：從待檢樣本中提取蛋白，得蛋白提取液；用g10?epsps定量檢測試劑盒對蛋白提取液進行檢測；通過用g10?epsps蛋白標準品制作的濃度?吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的g10?epsps蛋白濃度。
【專利說明】
轉(zhuǎn)基因蛋白g1〇-epsps的定量檢測方法及所用試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種轉(zhuǎn)基因蛋白EPSPS的獲取和 定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)明人所在的研究組前期研究從假單胞桿菌(gl〇)中克隆到抗除草劑的EPSPS基 因。EPSP 合成酶（5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)是生物體內(nèi)芳 香族氨基酸--色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵性酶;草甘磷是通過抑制 EPSP合成酶的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導致受試植物死亡。但是某些細菌的 EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以細菌EPSPS基因的表達可以使植物免受除草劑 的傷害。將除草劑抗性基因EPSPS轉(zhuǎn)入大豆，旨在培育具抗草甘膦優(yōu)良特性的轉(zhuǎn)基因大豆， 提高大豆生產(chǎn)中的田間除草效果，降低生產(chǎn)成本。
[0003] 本研究組利用從假單胞桿菌中克隆的抗除草劑的EPSPS基因，構(gòu)建了植物組成型 表達載體PS0Y19,由35S啟動子驅(qū)動，可以為轉(zhuǎn)基因植物提供草甘膦抗性。PS0Y19質(zhì)粒中只 含有1種能在植物細胞中表達的基因：細菌EPSPS，位于CaMV 35S啟動子的控制下。抗除草劑 基因表達質(zhì)粒為9557bp。插入序列EPSPS基因全長1321bp，編碼一個含有440個氨基酸的多 肽。通過農(nóng)桿菌介導法，已將EPSPS外源基因轉(zhuǎn)化大豆華春3號和Jack品種并獲得轉(zhuǎn)EPSPS基 因的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆材料。
[0004] 目前轉(zhuǎn)基因蛋白的常規(guī)檢測方法是PCR，但是PCR方法對場地、儀器、技術(shù)人員的要 求比較高，樣本處理復(fù)雜，不適合大量的篩選檢測。有部分轉(zhuǎn)基因蛋白已經(jīng)可以通過速測試 紙和ELISA試劑盒的方法進行檢測，但是glO-epsps為一個新引進的轉(zhuǎn)基因蛋白，目前尚無 該方面的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于準確、可靠地進行轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-ep sp s的定量檢測方法和所用的試劑盒。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種glO-epsps定量檢測試劑盒，包括如下組 分：
[0007] I、抗體預(yù)包被酶標板；
[0008] Π 、樣品稀釋液，為磷酸鹽緩沖液；
[0009] m、洗滌液，為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液；
[0010] IV、反應(yīng)終止液，為H2SO4溶液；
[0011] V、酶標抗體，為辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗gio-epsps單克隆抗體；
[0012] VI、顯色劑(為TMB顯色劑）；
[0013] VH、gl0_epsps 標準品。
[0014]作為本發(fā)明的gl〇-epsps定量檢測試劑盒的改進:所述抗體預(yù)包被酶標板的制備 方法包括如下步驟：
[0015] (1)、將特異性鼠抗gio-epsps單克隆抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為1.8~2.2μ g/ml，加至96孔酶標板(每孔100u 1)，37 °C反應(yīng)3h或4°C靜置過夜（12h);
[0016] 所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；
[0017] (2)將板孔溶液甩干后加入洗滌液洗滌，再干燥；
[0018] 例如具體可:將板孔溶液甩干，加入洗滌液，浸泡5~lOmin，將板孔溶液甩干，在吸 水紙上拍干；
[0019] ⑶將封閉液加至96孔酶標板(每孔150ul)，37°C反應(yīng)2~3h;
[0020] (4)干燥(例如將板孔溶液甩干，在吸水紙上拍干，用冷凍干燥機抽干）后;得抗體 預(yù)包被酶標板。
[0021 ]備注說明:所得的抗體預(yù)包被酶標板用真空包裝機包裝于鋁箱袋中。
[0022]作為本發(fā)明的gio-epsps定量檢測試劑盒的進一步改進：
[0023] 所述碳酸鹽緩沖液為(優(yōu)選)Na2C03-NaHC0 3緩沖液，其濃度為0.1Μ，ρΗ值為9.6;
[0024]所述特異性鼠抗gio-epsps單克隆抗體的包被濃度為(優(yōu)選）1.9~2. lμg/ml;更優(yōu) 選2iig/ml;
[0025]所述封閉液為含BSA的碳酸鹽緩沖液;該封閉液中，BSA的濃度為1%，碳酸鹽緩沖 液Na2C03-NaHC03緩沖液，其濃度為0.1M，pH值為9.6。
[0026]作為本發(fā)明的gl〇-epsps定量檢測試劑盒的進一步改進：
[0027] 特異性鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體為通過用gl〇-epsps重組蛋白免疫BALB/c小鼠， 然后通過細胞融合、克隆化篩選制備得到單克隆抗體細胞株，接著制備小鼠腹水，經(jīng)過純化 得到。
[0028]作為本發(fā)明的gio-epsps定量檢測試劑盒的進一步改進：gio-epsps為將G1中的 glO-印sps基因經(jīng)過優(yōu)化后構(gòu)建入大腸桿菌表達體系，重組表達純化得到。
[0029]作為本發(fā)明的gio-epsps定量檢測試劑盒的進一步改進
[0030]組分V中，辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的濃度為8~ 12μg/ml (優(yōu)選9 ~llμg/ml、更優(yōu)選 10μg/ml)。
[0031 ]備注說明：辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗g 10 - e p s p s單克隆抗體的制備方法 為：
[0032] l、5mg HRP溶于純水，加入高碘酸鈉，室溫反應(yīng)30分鐘；
[0033] 2、將5mg抗體用偶聯(lián)緩沖液透析過夜；
[0034] 3、將HRP加入抗體溶液中，室溫反應(yīng)2小時；
[0035] 4、加入硼氫化鈉封閉反應(yīng)位點；
[0036] 5、PBS透析過夜，加入等量甘油保存于-20 °C。
[0037]作為本發(fā)明的gio-epsps定量檢測試劑盒的進一步改進：
[0038] 作為組分IV的H2S〇4溶液，硫酸的濃度為為1.8~2.2M(優(yōu)選1.9~2.1M、更優(yōu)選2M)。
[0039] 本發(fā)明還同時提供給了利用上述試劑盒進行的定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的方法，包括以下步驟：
[0040] (1)從待檢樣本中提取蛋白，得蛋白提取液；
[0041] (2)用gio-epsps定量檢測試劑盒對蛋白提取液進行檢測，檢測過程包括加樣、孵 育、洗滌、加酶、孵育、洗滌、顯色、終止和讀數(shù)；
[0042] (3)通過用glO-epsps蛋白標準品制作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中 的gl〇-epsps蛋白濃度。
[0043]作為本發(fā)明的定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps的方法的改進：
[0044] 加入HRP標記的抗glO-epsps蛋白的多克隆抗體后的孵育溫度為22~26°C (優(yōu)選25 °C )，孵育時間為40~50分鐘(優(yōu)選45分鐘）。
[0045] 在本發(fā)明中，所用鼠抗EPSPS為通過用EPSPS重組蛋白免疫BALB/c小鼠，然后通過 細胞融合、克隆化篩選制備得到單克隆抗體細胞株，然后制備小鼠腹水，經(jīng)過純化得到。所 述EPSPS標準品為將G1中的EPSPS基因經(jīng)過優(yōu)化后構(gòu)建入大腸桿菌表達體系，重組表達純化 得到。
[0046]本發(fā)明利用自主研發(fā)的gio-epsps單克隆抗體制備了 gio-epsps定量檢測試劑盒， 使用雙抗體夾心的ELI SA來檢測轉(zhuǎn)基因材料中的蛋白含量。
[0047]本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因蛋白EPSPS的定量檢測方法準確、可靠，與已有技術(shù)相比具有 操作時間短，成本低的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0048]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0049] 圖1是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的表達；
[0050] 1:誘導前；2:誘導后（約45KD)。
[0051 ] 圖2是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的表達形式；
[0052] 1:上清;2:包涵體;3、全菌。
[0053] 圖3是SDS-PAGE檢測gl〇-epsps蛋白的純化效果；
[0054] 1:250mM咪唑洗脫液;2:150mM咪唑洗脫液；
[0055] 3: lOOmM咪唑洗脫液;4:50mM咪唑洗脫液。
[0056]圖4是SDS-PAGE檢測glO-epsps蛋白的透析效果；
[0057] 1:50mM咪唑洗脫液。
[0058]圖5是使用本發(fā)明方法檢測EPSPS的標準曲線。
【具體實施方式】
[0059] 下文以示例性地方式對本發(fā)明進行更詳細地描述。
[0060] 實施例1、EPSPS蛋白的表達純化 [0061] (1)蛋白的小試表達
[0062] 1、載體構(gòu)建
[0063]根據(jù)蛋白序列（gio-epsps)，合成基因序列，并構(gòu)建入載體pET30a，得到pET30a-EPSPS陽性質(zhì)粒。
[0064] 2、菌種活化：利用EMD Biosciences公司出售的商用的ET表達載體骨架，構(gòu)建了 glO-epsps-E陽性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，涂布LB固體培養(yǎng)基(卡那濃度50yg/mL)。次日，挑取 單克隆菌落接入5mL LB液體培養(yǎng)基(卡那濃度50yg/mL)，37°C培養(yǎng)12h-14h。
[0065] 3、小試表達:次日，菌種以l:50(v:v)接入5mL LB液體培養(yǎng)基(卡那濃度50yg/mL)， 37 °C培養(yǎng)至0D = Ο . 4-0.6，吸取lmL菌液離心處理后作為誘導前對照。4mL菌液加入濃度為 0.8mM的IPTG，25°C誘導表達6h后菌液8000rpm、4°C離心lmin，收集菌體。SDS-PAGE鑒定蛋白 的形式，結(jié)果顯示（圖1)有明顯目的蛋白的表達。
[0066] 4、蛋白表達形式的鑒定:上述表達的菌體（即，上述步驟所收集的菌體)加入lmL破 碎液進行超聲波裂解。裂解條件:溫度冰浴、功率240W、超聲2s、間隔2s、時間30min。將得到 的全菌離心，12000rpm、4°C離心lmin，收集上清和包涵體。SDS-PAGE鑒定蛋白表達形式，結(jié) 果顯示（圖2)目的蛋白主要以可溶形式表達。
[0067] 圖2中的"2:包涵體"即指上文中的沉淀；"3:全菌"即指上文中的離心前的破碎產(chǎn) 物。
[0068] (2)蛋白的大量表達和純化
[0069] 1、菌種活化：固體平板上挑取pET30a-EPSPS單克隆菌落接入5mL LB液體培養(yǎng)基 (卡那濃度50yg/mL)，37°C培養(yǎng) 12h-14h。
[0070] 2、小試表達：次日，菌種以l:50(v:v)接入800mL LB液體培養(yǎng)基（卡那濃度50yg/ mL)，37°C培養(yǎng)至0D = 0.4-0.6，加入濃度為0.8mM的IPTG，25°C誘導表達6h后菌液8000rpm、4 °C離心15min，收集菌體。
[0071] 3、菌種裂解:加lOOmL破碎液進行超聲波裂解。裂解條件:溫度冰浴、功率240W、超 聲2s、間隔2s、時間lSmirul^OOOrpnKfC離心15min，收集上清。
[0072] 4、上清純化:收集的上清利用高親和性NI樹脂（即，Ni-NTA親和層析樹脂(鎳柱）） 進行純化，分別以50mM、100mM、150mM、200mM咪唑進行洗脫；
[0073] 收集流穿液、洗脫液。SDS-PAGE檢測純化效果，結(jié)果顯示（圖3) 50mM咪唑洗脫時蛋 白純度最佳。用50mM，pH = 8.0的Tris-HCl緩沖液將洗脫液中的咪唑透析去除，SDS-PAGE檢 測透析效果，結(jié)果顯示（圖4)蛋白透析后純度和濃度均可行。經(jīng)檢測，最終目的蛋白純度大 于90%，濃度2mg/mL，蛋白量10mg。
[0074] (3)結(jié)果
[0075] pET30a-EPSPS蛋白誘導表達條件為：IPTG濃度0.8mM，誘導溫度25°C，誘導時間6h。 蛋白主要在上清表達，上清經(jīng)NI柱純化、透析去除咪唑，最終所得gl〇-epsps蛋白：濃度2mg/ mL、純度大于90%、蛋白10mg。
[0076] 實施例2、抗體制備
[0077] (!)單抗制備：
[0078] 1、免疫原制備:將表達純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑、Y0UL0NG佐劑混合乳化均 勻，成油包水狀態(tài)，以備免疫小鼠。
[0079] 2、免疫策略:將蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，間隔4周，最后經(jīng)ELISA檢 測，抗血清效價如下：
[0081 ] 3、細胞融合:最后一次免疫后兩周，腹腔注射抗原（具體為gio-epsps蛋白表達純 化的蛋白）進行加強免疫，三天后進行細胞融合。將小鼠斷頸處死，70%乙醇浸泡30min消 毒，在超凈臺剪開腹腔，取出脾臟，磨碎，過80目篩網(wǎng)，得到脾細胞，加入SP2/0骨髓瘤細胞， 在PEG4000的作用下進行細胞融合。
[0082] 4、融合篩選:將融合好的細胞鋪進96孔板，用HAT培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，三天后換液，改 用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。10天后，取細胞培養(yǎng)上清進行檢測。使用間接ELISA方法進行篩選，0D值〉 陰性對照孔2.1倍的孔判斷為陽性孔。
[0083]間接ELI SA方法主要包括以下步驟：
[0084] 1)、用0.1Μ，ρΗ = 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋表達純化的蛋白至lug/ml，加入96孔酶 標板，每孔l〇〇ul，37°C反應(yīng)3h或者4°C靜置過夜；
[0085] 2)、甩去板孔中液體，加入250ul洗滌緩沖液，靜置30s，甩去板中液體，重復(fù)3次；
[0086] 3)、加入檢測樣本，每孔lOOul，同時加入陽性對照（2中所取陽性小鼠血清）、陰性 對照(免疫前小鼠血清)和空白對照(不加小鼠血清)37°C反應(yīng)45min;
[0087] 4)、重復(fù)步驟2);
[0088] 5)、加入HRP標記的羊抗鼠酶標二抗，每孔1 OOul，37 °C反應(yīng)45min。
[0089] 5、克隆化與建株:使用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，10天后檢測，將陽性克隆 繼續(xù)有限稀釋法進行克隆化，直到得到的克隆都為陽性，可建立陽性細胞株。最終獲得陽性 細胞株5株。
[0090] 6、擴大培養(yǎng):將建株的單克隆細胞擴大培養(yǎng)，并凍存于液氮中。
[0091] (2)腹水制備與純化
[0092] 1、腹水制備:提前一周在小鼠腹腔注射礦物油，將一定數(shù)量(約106)的細胞注射入 小鼠腹腔，1 〇天左右收集腹水，4000rpm離心，得上清即為單克隆抗體腹水。
[0093] 2、單克隆抗體純化:腹水離心15min(4000rpm，室溫），取上清10ml，在4°C攪拌下逐 滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌30min，離心30min( 13000rpm，4°C )，棄上清;沉 淀溶于約1 OmlPBS (0.01M，pH7.4);在4 °C攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33 %，繼續(xù)攪拌 30min，離心30min( 13000rpm，4°C)，棄上清;沉淀溶于適量10mlPBS(0 · 01M，pH7.4)，4°C透析 過夜，測定抗體含量，_20°C凍存?zhèn)溆?。硫酸銨沉淀后繼續(xù)采用Protein G小柱進行純化，新 柱子先用5ml超純水過柱，再用5ml 0.4M PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;抗體過柱，過程 中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好的結(jié)合在結(jié)合位點上;繼續(xù)l〇ml 0.4M PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱;5ml 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.7)洗脫結(jié)合位點上的抗體，并在洗 脫液中加入lMTris-HCl(pH 8.0)0.5ml中和甘氨酸，使pH保持為適合抗體保存的中性。 [0094]從而得鼠抗gio-epsps單克隆抗體。
[0095] 實施例3、本發(fā)明試劑盒的組裝：
[0096] 1、緩沖液的配制
[0097] (1)包被緩沖液，0 · 1M碳酸鹽緩沖液CB(Na2C03-NaHC03緩沖液），pH值為9 · 6;
[0098] (2)稀釋液，0.0 ImM磷酸鹽緩沖液PBS，pH值為7.4;
[0099] (3)洗滌液，含0 · 2 %吐溫-20的PBS;
[0100] 即，在l〇〇ml的PBS中加入0.2g的吐溫-20,該ros為O.OlmM磷酸鹽緩沖液roS，pH值 為 7.4;
[0101] (4)封閉液，含 1%BSA 的 CB;
[0102] SP，在 100ml 的 CB 中加入 lg 的 BSA，該 CB為0.1M的 Na2C〇3-NaHC〇3緩沖液，pH 值為9.6;
[0103] (5)終止液，觀 H2S〇4。
[0104] 2、酶標板的制備
[0105] (1)包被
[0106]移取一定量EPSPS抗體(實施例2所得鼠抗glO-epsps單克隆抗體)于所需體積的包 被緩沖液中，使其濃度約為2μ8/ιΛ，配置成包被工作液。將包被工作液按每孔100yL加入酶 標板微孔，4°C靜置過夜或者37°C反應(yīng)3h(注意要防止水分蒸發(fā)）。
[0107] (2)封閉
[0108] 在CB緩沖液(pH9.6)中加入1 %的BSA，配置成封閉工作液(封閉液）。
[0109] 酶標板利用洗滌液以洗板機吸干-洗滌二次(洗滌時浸泡5~lOmin)，將板條在潔 凈的吸水紙上拍干。
[0110]將封閉工作液按每孔150yL加入微孔，37 °C烘焙3小時。
[0111] (3)抽干密封
[0112] 棄去封閉液，將板條在潔凈的吸水紙上拍干，放入冷凍真空干燥機抽干3小時，真 空熱封。
[0113] 3、EPSPS標準品凍干粉的制備
[0114] 大腸桿菌E.coli中原核表達并通過親和純化的His-EPSPS(實施例2所得），N端帶 有6個His標簽，其母液濃度為3mg/ml，用稀釋液稀釋到900ng/ml，3mL棕色玻璃瓶加入100yL 900ng/ml標準品，冷凍干燥機過夜抽干得到標準品凍干粉，即作為組分W的EPSPS標準品 (gl〇-epsps標準品）。
[0115] 4、酶標記抗體工作液的配置
[0116] 酶標抗體的制備:取純化的特異性兔多抗，與HRP進行偶聯(lián)，得到酶標記抗體。
[0117] 取一定量的酶標記抗體加入到稀釋液中，充分混勻，使其終濃度為2yg/mL，2-8°C 避光保存;作為組分V的酶標抗體。
[0118]即，酶標抗體，為辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗gio-epsps單克隆抗體。
[0119] 5、樣品稀釋液，為磷酸鹽緩沖液。
[0120] 6、試劑盒的組裝
[0122] 顯色劑，為TMB顯色劑。
[0123] 實施例4、使用本發(fā)明試劑盒檢測植物中的轉(zhuǎn)基因蛋白EPSPS
[0124] (1)準備標準品和未知濃度樣品
[0125] 1)標準品配制：
[0126] 用lmL稀釋液溶解EPSPS標準品凍干粉，此溶液濃度為2ppb;
[0127] 取2ppb EPSPS標準品300yL，加入TBA緩沖液（0.1M Tris，0.1M Na2B4〇7 · IOH2O， 0.01M MgCl2,0.05%(v/v)Tween-20，pH 7.8)300yL，此溶液濃度為lppb;
[0128] 取lppb EPSPS標準品300yL，加入TBA緩沖液300yL，此溶液濃度為0 · 5ppb;
[0129] 取0 · 5ppb EPSPS標準品300yL，加入TBA緩沖液300yL，此溶液濃度為0 · 25ppb;
[0130] 取0.25ppb EPSPS標準品300yL，加入TBA緩沖液300yL，此溶液濃度為0· 125ppb;
[0131] 2)未知濃度樣品的處理：
[0132] (1)葉片前處理方法:取5-10mm2的葉片樣本，放入1.5mL離心管中搗碎，加入250yL 的TBA緩沖液，振蕩混勻5分鐘，4000rpm離心3分鐘，取100yL上清用于分析。
[0133] 種子前處理方法:取0. lg碾碎后的種子樣本，放入1.5mL離心管中，加入lmLTBA緩 沖液，振蕩混勾5分鐘，4000rpm離心3分鐘，取100yL上清用于分析。
[0134] 散糧前處理方法:取0. lg碾碎后的散糧樣本，放入1.5mL離心管中，加入lmLTBA緩 沖液，振蕩混勾5分鐘，4000rpm離心3分鐘，取100yL上清用于分析。
[0135] (2)加標準品或未知濃度樣品：
[0136] 將lOOyL的TBA緩沖液(空白對照)/標準品/未知濃度樣品加入到對應(yīng)的微孔中，輕 輕振蕩混勻，25°C避光環(huán)境中反應(yīng)45min。
[0137] (3)洗板：
[0138] 將孔內(nèi)液體甩干，每次洗滌時，用250yL洗滌液/孔，充分洗滌3次，每次間隔lmin， 用吸水紙拍干。
[0139] (4)加酶標抗體：
[0140] 加入酶標抗體100μL孔，輕輕振蕩混勻，25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)45min，取出重復(fù)步 驟(3)所述的洗板。
[0141] (5)顯色：
[0142] 加入顯色劑100μL7孔，置于25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。
[0143] (6)終止與測定：
[0144] 加入100yL終止液/孔，輕輕振蕩混勻，酶標儀設(shè)定至450nm，測定每孔0D值(優(yōu)選用 雙波長450/630nm進行檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）。
[0145] (7)計算：
[0146] 利用統(tǒng)計學繪圖軟件，根據(jù)所測定的標準品的0D值繪制四參數(shù)擬合標準曲線，如 圖5所示;通過標準曲線和未知濃度樣品的0D值就可計算出未知樣品中EPSPS的濃度。
[0147] (8)結(jié)果:如表1所示。
[0148] 表1、加標樣品檢測效果
[0149]
[0151] 由表1結(jié)果可知，使用本發(fā)明的方法檢測植物中的轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps，其加標 回收率在95 %-120 %之間，說明：本發(fā)明的檢測植物中的轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps的方法具有 較好的準確性。
[0152] 實施例5、使用本發(fā)明試劑盒檢測植物中的轉(zhuǎn)基因蛋白EPSPS
[0153] 1、利用glO-epsps定量檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因大豆中EPSPS的表達；
[0154] 通過EPSPS基因賦予轉(zhuǎn)基因植物除草劑抗性，可以用草甘膦進行檢測；直接噴施 200ml/畝草甘膦可以殺死全部非轉(zhuǎn)基因大豆。
[0155] 轉(zhuǎn)基因大豆除草劑篩選的陽性株系取頂端葉片，用glO-epsps定量檢測試劑盒檢 測插入序列(細菌EPSPS)在轉(zhuǎn)基因陽性植株中的表達量。
[0156] 1.1轉(zhuǎn)基因大豆研究材料:安徽試驗田的兩個轉(zhuǎn)基因大豆株系VI時期（2-3片三出 復(fù)葉)根，莖，葉組織。
[0157] 1.2定量檢測研究結(jié)果
[0158] 安徽大田三個重復(fù)試驗田的兩個轉(zhuǎn)基因大豆株系，株系1 (L1 )，株系2(L2)VI時期 (2-3片三出復(fù)葉發(fā)育時期），頂端三出復(fù)葉，莖，根，取材lOOmg鮮重材料，用glO-epsps定量 檢測試劑盒進行g(shù)l〇 -epsps表達量檢測。
[0159] 1.2.1各個組織器官的總蛋白提取
[0160] a.新鮮組織：稱取lOOmg新鮮的組織用lml的TBA緩沖液（0. 1M Tris，0. 1M Na2B4〇7 · 10H20,0.01M MgCl2,0.05% (v/v)Tween-20at pH 7.8^P0.2% (w/v)L-ascorbic acid)研磨組織，用mirocloth過濾膜(Fisher Scientific，Pittsburgh,PA)過濾并取上清 液。12000rpm離心，取上清為大豆新鮮組織蛋白提取液待用。
[0161] b.干籽粒:取100mg干籽粒干粉，加入lmlTBA緩沖液，12000rpm離心，取上清為大豆 干籽粒蛋白提取液待用。
[0162]采用gl〇-epsps定量檢測試劑盒檢測樣本中的蛋白含量。
[0163] 對以上新鮮組織和干籽粒的蛋白提取液樣品進行102，103，104梯度稀釋，選取最佳 的稀釋度按照實施例4中（2)~(6)步驟進行定量分析。
[0164] c.EPSPS蛋白吸收峰值讀數(shù)是以yg/g鮮重(FW)為單位進行，最后計算各個試驗點 的每種組織EPSPS蛋白含量的算術(shù)平均數(shù)、標準差(SD)。
[0165] 1.2.2定量檢測結(jié)果
[0166] 表2、轉(zhuǎn)基因大豆株系1 (L1)葉，莖，根，籽粒EPSPS表達量
[0167]
[0168] 表3、轉(zhuǎn)基因大豆株系2(L2)葉，莖，根，籽粒EPSPS表達量
[0169]
[0170]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于上述，即 不意味著本發(fā)明必須依賴上述才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的 任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在 本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. gio-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于包括如下組分：1. 抗體預(yù)包被酶標板； Π 、樣品稀釋液，為磷酸鹽緩沖液； ΙΠ 、洗滌液，為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液； IV、 反應(yīng)終止液，為H2S〇4溶液； V、 酶標抗體，為辣根過氧化物酶標記的鼠抗gio-epsps單克隆抗體； VI、 顯色劑； VH、gl〇-epsps 標準品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于:所述抗體預(yù)包被酶 標板的制備方法包括如下步驟： (1) 、將特異性鼠抗gio-epsps單克隆抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為1.8~2.2μg/ml， 加至96孔酶標板，37 °C反應(yīng)3h或4 °C靜置過夜； 所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液； (2) 將板孔溶液甩干后加入洗滌液洗滌，再干燥； (3) 將封閉液加至96孔酶標板，37 °C反應(yīng)2~3h; (4) 干燥后，得抗體預(yù)包被酶標板。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于： 所述碳酸鹽緩沖液為Na2C03-NaHC03緩沖液，其濃度為0.1M，pH值為9.6; 所述特異性鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的包被濃度為1.9~2. lμg/ml; 所述封閉液為含B S A的碳酸鹽緩沖液；該封閉液中，B S A的濃度為1 %，碳酸鹽緩沖液 Na2C03-NaHC03緩沖液，其濃度為0.1M，pH值為9.6。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于： 特異性鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體為通過用gl〇-epsps重組蛋白免疫BALB/c小鼠，然后 通過細胞融合、克隆化篩選制備得到單克隆抗體細胞株，接著制備小鼠腹水，經(jīng)過純化得 到。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于:gl〇-epsps為將G1中 的gl〇-印sps基因經(jīng)過優(yōu)化后構(gòu)建入大腸桿菌表達體系，重組表達純化得到。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于： 組分V中，辣根過氧化物酶標記的鼠抗gl〇-epsps單克隆抗體的濃度為8~12μg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的gl〇-epsps定量檢測試劑盒，其特征在于： 作為組分1￥的出3〇4溶液，硫酸的濃度為為1.8~2.2M。8. 利用權(quán)利要求1~7所述的試劑盒進行的定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白gl〇-epsps的方 法，其特征在于包括以下步驟： (1) 從待檢樣本中提取蛋白，得蛋白提取液； (2) 用glO-epsps定量檢測試劑盒對蛋白提取液進行檢測； (3) 通過用glO-epsps蛋白標準品制作的濃度-吸光度標準曲線，計算待檢樣品中的 gl〇-epsps蛋白濃度。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白glO-epsps的方法，其特征在于： 加入HRP標記的抗glO-epsps蛋白的多克隆抗體后的孵育溫度為22~26°C，孵育時間為
【文檔編號】G01N33/577GK105866414SQ201610110917
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年2月28日
【發(fā)明人】壽惠霞, 杜娟, 李林, 陸玲鴻, 武愛波, 徐偉
【申請人】浙江大學, 無錫福陽生物科技有限公司