專利名稱：：人TCRVβ7.1_H3F7基因及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因序列，具體涉及人類T細(xì)胞抗原受體TCRV07.1—H3F7基因的序列及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于放療和化療對機(jī)體造成的嚴(yán)重性傷害以及效果的不如人意，生物治療越來越成為腫瘤治療研究的主要目標(biāo)，其中免疫療法是腫瘤生物治療的一個(gè)主要組成部分。機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩大類，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答是抗腫瘤細(xì)胞免疫的重要組成部分。T淋巴細(xì)胞是體內(nèi)細(xì)胞免疫進(jìn)行抗原識別的主要細(xì)胞群體，特定的抗原只能由特定氨基酸序列組成的T細(xì)胞抗原受體TCR識別，機(jī)體通過特定的TCR對腫瘤細(xì)胞特異性識別并殺傷腫瘤細(xì)胞。TCR是T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志分子，是T細(xì)胞進(jìn)行抗原識別，發(fā)揮細(xì)胞免疫重要功能的基礎(chǔ)。TCR以非共價(jià)鍵形式與T細(xì)胞所特有CD3分子結(jié)合，組成具有跨膜結(jié)構(gòu)的TCR-CD3復(fù)合體。TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號由CD3分子轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞內(nèi)。通常情況下TCR分子不能直接識別蛋白質(zhì)抗原表位，只能識別特異性的抗原肽-MHC分子復(fù)合物，因此其識別過程具有抗原肽表位和自身腿C分子多態(tài)性部位的雙特異性。MHC分子被認(rèn)為是TCR進(jìn)行抗原表位識別過程中不可缺少的輔助分子，其主要功能有提供TCR識別的必需的位點(diǎn)，增加識別過程中T細(xì)胞與相關(guān)分子結(jié)合的敏感性和牢固性，提供T細(xì)胞活化的輔助信號等等。MHC限制性的TCR對抗原肽的識別經(jīng)典模式是，CD8+TCRaP+T細(xì)胞識別MHCI類分子結(jié)合的抗原肽，此類抗原肽長度一般為810個(gè)氨基酸。另一種識別模式是CD4+TCRa0+T細(xì)胞識別MHCII類分子結(jié)合的抗原肽，與fflCI類分子的凹槽兩端封閉不同，由于II類分子的凹槽兩端開放，可以容納的抗原肽長度變化較大，為13-17個(gè)氨基酸殘基甚至更多，由于結(jié)構(gòu)上的差異，使II類分子所容納的抗原肽的共同基序的結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比I類分子復(fù)雜。TCR分子由兩條不同肽鏈構(gòu)成，二者均是跨膜蛋白，并由一條二硫鍵相連組成異二聚體結(jié)構(gòu)，TCR的肽鏈有ci、P、y、5四種類型，根據(jù)TCR肽鏈的組合，可將人外周血中的T細(xì)胞分為兩類，即TCRa3+T細(xì)胞和TCRYS+T細(xì)胞，其中TCRaP+T細(xì)胞的數(shù)量占絕大多數(shù)，在抗原肽識別發(fā)揮特異性細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮著重要作用。TCRa基因TCRA定位在染色體的14q11-12位，TCRP基因TCRB定位于染色體的7q32-35位，TCRA包括v、J和C三個(gè)基因片段，而TCRB由V、D、J、C四個(gè)基因片段組成，V、D、J基因片段連在一起編碼TCR分子肽鏈的可變區(qū)V區(qū)，C基因片段編碼TCR分子肽鏈的恒定區(qū)C區(qū)。TCR基因與一般基因有著很大的不同，即其需要具有高度的可變性用于識別千差萬別的抗原，這就需要TCR基因在胚系基因的發(fā)育過程中經(jīng)歷基因重排這一重要過程。TCR的胚系基因片段，特別是V和J，數(shù)目有很多種，在T細(xì)胞發(fā)育成熟的過程中，這些基因片段發(fā)生不同的重排和組合，產(chǎn)生數(shù)量巨大、識別特異性抗原的TCR。TCRA包括70-80個(gè)V基因片段，被分為41個(gè)家族，TCRA包括61個(gè)J基因片段，其中有50個(gè)為有功能的基因，TCRA還包括一個(gè)編碼TCRa鏈恒定區(qū)的C基因片段。對于TCRB，比較權(quán)威的說法是TCRVP基因片段有65個(gè)，其中19個(gè)為假基因pseudogene，有功能的基因片段為46個(gè)，這46個(gè)TCRVe基因片段根據(jù)其序列相似性程度高低，將序列一致性低于75%的基因劃分為不同家族，共得到了23個(gè)TCRVP基因家族，而序列一致性高于75%的片段為同一家族的亞家族，相關(guān)知識可見于RowenL,KoopBF，HoodLThecomplete685-kilobaseDNAsequenceofthehumanbetaTcellreceptorlocus.Science1996;272:1755-1762。TCRB還包括2個(gè)D基因片段、13個(gè)J基因片段和兩個(gè)編碼TCR3鏈恒定區(qū)的C基因片段。TCR基因的重排一般規(guī)律是在未成熟的T細(xì)胞中首先發(fā)生(D)J基因重排，然后V(D)J基因重排，在基因水平上進(jìn)行，當(dāng)TCRV基因重排完成后，在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)V(D)J基因與C基因的重排，通過真核mRNA的剪接機(jī)制，最后得到成熟的包含V(D)JC基因片段的m脂A，經(jīng)翻譯組裝成為完整的一條TCR肽鏈。因?yàn)楸姸嗟腣、(D)、J基因片段只選一個(gè)參與重排，可以產(chǎn)生眾多的V區(qū)基因片段組合，同時(shí)在V、(D)、J基因片段重排后的連接處可以丟失或N-核苷酸插入即加入數(shù)個(gè)核苷酸，以上機(jī)制顯著增加了TCR的多樣性。TCRa鏈和曰鏈都需要經(jīng)過基因重排過程后，二者再進(jìn)行組合裝配，這樣會產(chǎn)生更多的多樣性。在T細(xì)胞的發(fā)育過程中一般TCRg鏈的重排進(jìn)行過程中是與前TCRci組合進(jìn)行發(fā)育，待TCR3鏈基因重排完成之后，才會進(jìn)行成熟TCRa鏈的基因重排，這樣最終發(fā)育成熟的T細(xì)胞表達(dá)的同一個(gè)TCR3鏈可能與多個(gè)不同的TCRa鏈進(jìn)行組合，而對于每一個(gè)TCRa鏈來說，其只能與一種TCRP鏈進(jìn)行組合。對不同基因片段多種連接的可能性和幾種產(chǎn)生連接多樣化的機(jī)制導(dǎo)致了識別抗原TCR的多樣性。TCRa鏈和P鏈都由可變區(qū)V區(qū)和恒定區(qū)C區(qū)兩部分組成，V區(qū)是識別抗原肽/MHC復(fù)合物pMHC的關(guān)鍵部位，TCRci鏈和P鏈的V區(qū)各含有三個(gè)與免疫球蛋白的V區(qū)結(jié)構(gòu)類似的高變區(qū)，也稱互補(bǔ)決定區(qū)CDR，一般用CDR1、CDR2和CDR3表示，另外，TC歸鏈還含有第四個(gè)高變區(qū)HV4或CDR4;TCRVcc鏈由TCRA基因V、J片段重排后轉(zhuǎn)錄翻譯得到，TCRVe鏈由TCRB基因的V、D、J片段編碼得到，其中CDR1、CDR2和HV4這三部分由V基因片段編碼得到，而CDR3區(qū)存在比其他三區(qū)更高的變化程度，其是由V、(D)、J片段的重排連接后的基因片段編碼而成，由于連接處可隨機(jī)插入或丟失數(shù)個(gè)核苷酸，使最終翻譯得到的CDR3區(qū)高度變化，因此要得到兩個(gè)氨基酸序列完全相同的CDR3區(qū)幾乎不太可能。已有眾多的研究發(fā)現(xiàn)，TCR分子的V區(qū)中的CDR1和CDR2區(qū)在抗原識別過程中與腿C分子的識別密切相關(guān)，而HV4區(qū)在超抗原與TCRVP鏈的結(jié)合時(shí)發(fā)揮重要作用，但真正起到對抗原肽特異性識別作用的主要還是CDR3區(qū)，相關(guān)知識可見于GarciaKC,TeytonL，WilsonIA.StructuralbasisofTcellrecognition.AnnuRevImmunol,1999，17:369397。由于TCRci鏈和3鏈的V、(D)、J基因片段重排時(shí)會發(fā)生n-核苷酸的隨機(jī)插入或刪除，這樣最后生成的TCRV區(qū)的CDR3出現(xiàn)同一序列的可能性極低，且各序列組成也無規(guī)律性可言，這樣就無法對最終生成的TCR分子進(jìn)行規(guī)類，于是就按照編碼CDR1、CDR2及HV4區(qū)的TCRV基因片段對TCR分子進(jìn)行規(guī)類，依照V基因片段序列的一致性差別歸為不同的家族和亞家族，進(jìn)行TCR分子的V基因的家族規(guī)類多是用來分析T細(xì)胞出現(xiàn)了針對某一種或某一類抗原出現(xiàn)的克隆增殖現(xiàn)象，其中以對V3基因的分析和研究最為多見。成熟的T細(xì)胞由胸腺組織向外周血輸出，這些原始T細(xì)胞上TCRVa0分子的家族分步是呈現(xiàn)一定規(guī)律的，主要表現(xiàn)為Va和V3基因各家族比較均勻的平均分布現(xiàn)象，有部分家族略微比其他家族高，這一特征反應(yīng)了機(jī)體免疫系統(tǒng)在未遇到特定抗原時(shí)的T細(xì)胞群體分布特點(diǎn)。當(dāng)機(jī)體遇到外來抗原剌激后，相同或相似的抗原決定簇會驅(qū)使T細(xì)胞的群體分布發(fā)生改變，發(fā)生針對特定抗原決定簇的T細(xì)胞亞群的克隆性擴(kuò)增現(xiàn)象，如果是針對同一個(gè)抗原決定簇的克隆擴(kuò)增即為單克隆T細(xì)胞群，這些T細(xì)胞具有序列完全相同的TCRVa0分子，如果特定抗原的決定簇不只一個(gè)，則出現(xiàn)的T細(xì)胞擴(kuò)增為寡克隆或多克隆，這些T細(xì)胞表達(dá)的TCRVa3分子氨基酸序列不完全相同。如果知道了這些異常TCRVcxp分子在機(jī)體免疫功能中所發(fā)揮的作用就可以加以利用，如果是有益的功能，就能利用這些特定TCRVci3基因修飾改造T細(xì)胞，制備出大量表達(dá)這種TCRVa3分子的效應(yīng)細(xì)胞用于治療；如果這種TCRVcie分子對機(jī)體是有害的，可以設(shè)計(jì)出針對這種克隆性T細(xì)胞的基因疫苗，用于清除這些有害的T細(xì)胞克隆。篩選腫瘤特異性TCR的一般方法是利用比較明確的腫瘤特異性抗原肽篩選單克隆的T淋巴細(xì)胞，再進(jìn)行TCR基因的分析，但由于腫瘤特異性抗原的篩選異常困難，目前發(fā)現(xiàn)的一些腫瘤特異性抗原大多都是從人惡性黑色素瘤細(xì)胞中分離獲得的，相應(yīng)的TCR基因的篩選也都是針對黑色素瘤細(xì)胞的，MARYBETHS等人利用人工合成HLA-A2分子四聚體呈遞下的黑色素瘤MART-1抗原肽篩選針對MART-1的T細(xì)胞克隆，得到一株MART-1反應(yīng)性T細(xì)胞克隆M1F12，分析其TCR基因?yàn)門CRVa35"10.3，利用類似的方法RichardA.Morgan等人篩選出針對黑色素瘤gplOO抗原肽的TCR基因TCRVa19V312.3，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些TCR基因確能改造成熟T細(xì)胞，表達(dá)腫瘤抗原特異性TCR基因的T細(xì)胞在體外細(xì)胞學(xué)及荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。目前針對肝癌特定腫瘤抗原的TCR基因篩選還未見報(bào)道。而肝癌又是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，尋找到對癥的TCR基因進(jìn)行生物免疫療法是非常重要和迫在眉睫的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種人TCRVP7.1—H3F7基因。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述基因的篩選擴(kuò)增方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述人TCRVe7.1—H3F7基因的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種人TCRV37.1—H3F7基因，其基因序列由942個(gè)堿基組成，蛋白序列由312個(gè)氨基酸組成，序列表如下1-ATCGCJCTGCACJGCTGCTCTGCTCTGCGGnCTCTCTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGAC-60l-M&CRLLCCAVLCLLGAVFID-2061-ACTGMGnACCCAGACACCAMACACCTWTCATc;GGAATGAC雄TAAGMGTCTTTG-12021-TEVTQTFKHLVMGMTNKKSL-40121-雄TCTGAACAACATATdGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAMGCTAA(;AAG-ISO'41-KCEQHMGHRAMYWYKQKAKK-S0181-CCACCGGAGCTCATGTTTGTCTACAGCTATCAGMACTCTCTATAMTCAAAGTGTGCCA-24061-PPELMFVYSYEKLSiriESVP-80241-AGTCGCTTCTCACCTCAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTG-30081-SRFSPECFNSSLLJfLHLHAL-100301—CAGCCAGMGACTCAGCCCTCTATCTCTCCWXAGCAGCCAAGCCGGGACAGGGMCACC-3S0101-QPEDSALYLCASSQAGTGNT-120361-GMGAGCTGTnTTTGGAGAAGGCTaAGGaGACCGTACTGGAGGACCTCMAAACGTG—420121-GELFFGEGSELTVLEDLKNV-140421-nCCCACCCGAGGTCGCTCTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAG-480141-FPPEVAVFEPSEAEISHTQK-160481-GCCACACTCGTCTGCCTCGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGrcGAGCTCAGCTCGTGG-5401S1-ATLVCLATGFYPDHVELSWW-180541-GTC'MTGGGAAGGAGGTCCACAGTCGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCMGGAGCAG-600181-VNGKEVHSGVSTDPQFLKEQ-200601-CCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTC-S60201-PALNDSRYCLSSKLKVSATF-220S61-TGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTCTCMGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAAT-720221-鄰QNPRIfHFRCQVQFYGLSEN-240721-GACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCMACCTCTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGG-780241-DEWTQDRAKPVTQIVSAEAW-260781-GGTAGAGCAGACTGTCGCnCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACC-,261-GRADCGFTSESYQQGVLSAT-280841-ATCCTaATGAGATCTTGCTAGWMGGCCACCTTGTATGCiXTGCTGGTCAGTGCCCTC-900231-ILYEILLGKATLYAVLVSAL-300901-GTGCTGArcGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG-942301-VLMAfflVKEKDSRG*X-320本發(fā)明同時(shí)提供了所述的基因的篩選擴(kuò)增方法，包括以下步驟:(1)T淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物基因克隆入表達(dá)載體pcDNA-kan上；(4)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindIII將TCR基因和載體pcDNA-kan進(jìn)行雙酶切，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，最后在含卡那霉素的LB平板上篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆細(xì)菌，將篩選得到的重組子進(jìn)行測序。其中，步驟(2)所述引物為V7CK和C2CK，其序列如下V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCAAGCTT+CTAGCCTCTGGAATCCTTTCT引物前端都含有3個(gè)保護(hù)堿基序列，V7CK引物中還含有限制性內(nèi)切酶EcoRI的序列和Kozark序列，C2CK引物中含有限制性內(nèi)切酶HindIII的序列。步驟(3)所述克隆選用pcDNA-kan載體多克隆位點(diǎn)中的EcoRI和HindIII位點(diǎn)為基因插入位點(diǎn)。步驟(4)所述測序以T7通用引物和BGH反向測序引物作為測序引物。本發(fā)明提供了所述基因的應(yīng)用，用所述基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，能增強(qiáng)其腫瘤識別和增強(qiáng)殺傷作用，基于這種作用，所述基因可應(yīng)用于制備抗肝癌疫苗及其他藥物。利用RT-PCR結(jié)合Southern雜交技術(shù)，本申請人在檢測T細(xì)胞TCRP鏈V區(qū)亞家族表達(dá)情況中發(fā)現(xiàn)，相對于正常人，肝癌患者的TCR基因表達(dá)均有不同程度的減弱，即優(yōu)勢表達(dá)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)TCRVβ亞家族，同時(shí)其它TCRVP亞家族顯著減少或完全缺如，即有受體偏移現(xiàn)象。因此致使T細(xì)胞對于腫瘤抗原的識別及應(yīng)答能力減弱，從而造成了腫瘤細(xì)胞的大量增值并引起一系列的嚴(yán)重癥狀。因此將此缺失的TCRV3基因，采用體外轉(zhuǎn)染外周血單個(gè)核細(xì)胞以增強(qiáng)TCR識別抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentcell,APC)提呈的腫瘤抗原的能力，可促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL活化，從而恢復(fù)對腫瘤細(xì)胞的識別與殺傷功能，最終全面恢復(fù)腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能。本發(fā)明的有益效果是(1)提供了一種全新的基因序列，填補(bǔ)了本領(lǐng)域空白；(2)克隆出部分TCRVP7.l基因，并進(jìn)行序列測定，有利于對l基因生物學(xué)研究；(3)為制備抗腫瘤疫苗、藥物的研制提供必要的基礎(chǔ)與技術(shù)實(shí)現(xiàn)手段，并提供了攻克肝癌的可靠前景。圖lT7引物的測序結(jié)果(部分)圖2BGH反向引物測序結(jié)果(部分)圖3TCRVe7.1—H3F7基因序列圖4TCRVe7.1—H3F7基因在未經(jīng)轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況圖5TCRVP7.1—H3F7基因在轉(zhuǎn)染組T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況圖6共聚焦顯微鏡檢測TCRV37.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染前后在T細(xì)胞表面的表達(dá)情況圖7雙熒光標(biāo)記激光共聚焦顯微鏡檢測腫瘤細(xì)胞周圍淋巴細(xì)胞浸潤的情況圖8倒置相差顯微鏡觀察TCRVe7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷情況圖9TCRV67.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞后腫瘤細(xì)胞DNALadder檢測圖圖10電鏡觀察TCRVP7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用后腫瘤細(xì)胞核變圖圖11TCRV37.1_H3F7基因修飾的T細(xì)胞局部注射荷瘤SCID小鼠抗癌效果圖圖12TCRV07.1一H3F7基因轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞作用荷瘤動物后腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤圖，HE染色，其中左上圖為10X，右上圖和左下圖皆為100X圖13免疫組化檢測腫瘤組織中TCRVP7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的TCRV07.1一H3F7基因的表達(dá)情況，其中左圖為10X，右圖為40X圖14荷瘤動物其它正常組織中無淋巴細(xì)胞浸潤圖，HE染色其中左圖為腦組織40X，右圖為肺組織40X，下圖為腎組織40X具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例l:利用基因優(yōu)勢取用的方法篩選出抗肝癌特異性TCRe基因收集肝癌患者和健康人的外周血單核細(xì)胞，分別和肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)剌激后分離T淋巴細(xì)胞，然后用PBS將細(xì)胞洗兩遍，細(xì)胞總RNA提取按照Invitrogen公司試劑盒提供的方法進(jìn)行，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA。分別設(shè)計(jì)合成TCR3基因家族26個(gè)家族成員的CDR3引物，以以上兩種細(xì)胞中抽提總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物利用濃度1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，選取保守序列設(shè)計(jì)并合成地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行Southern雜交并顯影成像，發(fā)現(xiàn)健康人來源的T淋巴細(xì)胞經(jīng)肝癌細(xì)胞刺激后，TCR0基因出現(xiàn)隨機(jī)的擴(kuò)增；而肝癌患者來源的T淋巴細(xì)胞經(jīng)肝癌細(xì)胞刺激后，僅TCR日7.1亞家族出現(xiàn)明顯擴(kuò)增表達(dá)。實(shí)施例2:利用PCR方法擴(kuò)增出完整的TCRVP7.1基因根據(jù)TCRV07.1亞家族的保守序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增TCRV37.1基因家族編碼序列的引物V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCAAGCTT+CTAGCCTCTGGAATCCTTTCT引物前端都含有3個(gè)保護(hù)堿基序列，V7CK引物中含有限制性內(nèi)切酶EcoRI的序列，C2CK引物中含有限制性內(nèi)切酶Hind111的序列，V7CK引物中還含有Kozark序列。從正常人血液樣本，經(jīng)過淋巴細(xì)胞分離——淋巴細(xì)胞RNA的提取——提取后RNA的逆轉(zhuǎn)錄一一PCR擴(kuò)增這一系列的程序，最后將TCR07.1基因克隆入表達(dá)載體pcDNA-kan上。選用pcDNA-kan載體多克隆位點(diǎn)中的EcoRI和HindIII位點(diǎn)為基因插入位點(diǎn)，先以引物V7CK和C2CK從cDNA中擴(kuò)增得到TCR基因，然后分別用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindI工I將TCR基因和載體pcDNA-kan進(jìn)行雙酶切，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，最后在含卡那霉素的LB平板上篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆細(xì)菌。以T7通用引物和BGH反向測序引物作為測序引物，將篩選得到的重組子進(jìn)行測序。經(jīng)測序驗(yàn)證后，我們總共得到20個(gè)屬于TCRP7.1基因家族的克隆，測序部分結(jié)果見圖1和圖2。隨后我們進(jìn)行了一系列的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)克隆的抗腫瘤效果特別明顯，我們將此基因命名為TCRP7.1—H3F7，其完整編碼序列以及氨基酸序列見附圖3，其基因序列由942個(gè)堿基組成，蛋白序列由312個(gè)氨基酸組成，其基因序列表見圖3。實(shí)施例3:TCRV37.1—H3F7基因修飾的T細(xì)胞體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡識別肝癌的特異性TCRVP7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀和激光共聚焦光鏡檢測，證實(shí)了TCRV07.1一H3F7分子的表達(dá)占優(yōu)勢地位，見圖4-圖8，圖6中左圖為對照組，右圖為TCRVe7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染組。圖7中左圖為TCRV日7.1—H3F7轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞作用后激光共聚焦顯微鏡示意圖；右圖為計(jì)算機(jī)軟件分析示意圖，柱狀部分為T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合，結(jié)合較為緊密，其它為非特異。圖8中左圖為未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞組，右圖為TCRVe7.l基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞組。與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，DNALadder檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TCRV7.1—H3F7基因的實(shí)驗(yàn)組，肝癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡DNALadder,電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，只有TCRV07.1一H3F7基因轉(zhuǎn)染組的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體，見圖9-10。圖9中，1:正常腫瘤細(xì)胞；2:未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組，1X107;3:TCRV37.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組1，1X106;4:TCRV37.1JBF7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組2，1X107;5:TCRVe7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組3，5Xl()8;6:TCRVe7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組4，1X108;7:TCRVe7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞作用組5，1X109;8:DNAMarker。結(jié)果顯示TCRVP7.1—H3F7基因轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞能增強(qiáng)其腫瘤識別和增強(qiáng)殺傷作用。實(shí)施例4:TCRVP7.1—H3F7基因修飾的T細(xì)胞局部注射荷瘤SCID小鼠表現(xiàn)出明顯的抗癌效果經(jīng)過長期深入的研究，本申請人己完成150只SCID鼠荷瘤模型的建立，初步觀察了特異性TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后的抗肝癌效果。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，對照組小鼠的瘤塊繼續(xù)增大，實(shí)驗(yàn)組瘤塊逐漸減小，肝癌細(xì)胞生長明顯抑制或消失，癌巢中與腫瘤周圍及肝匯管區(qū)有大量淋巴細(xì)胞浸潤并包圍癌巢，而其他組織無淋巴細(xì)胞浸潤。見圖11-14。圖11中，A對照組，B單純PBMC組，CTCR7.l基因轉(zhuǎn)基因組。同時(shí)，對各組荷瘤SCID鼠的存活時(shí)間及給藥最大耐受劑量進(jìn)行研究，摸索出較好的實(shí)驗(yàn)條件，見表l、表2。表1.脂質(zhì)體ZTCRV^7.1—H3F7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PBMC小鼠iv給藥后動物存活數(shù)細(xì)胞濃度107ml劑量(ul/只)開始動物數(shù)(只)死亡數(shù)(只)40022200201002050202520表2.脂質(zhì)體/TCRV37.1—H3F7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PBMC小鼠iv給藥后死亡時(shí)間分布<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><400>1atgggctgcMetGlv1Cys鄉(xiāng)ctg5etcLeutgcCystgtCysgcgAlagttVal10etcLeutgtCysetcLeuctgLeuggaGly15gcaAla48gttcccatagacactgaagttacccagacaccaaaacacctggtcatgValProlieAspThrGluValThrGinThrProLysHisLeuValMet20253096ggaatgacaaat￡iagaagtctttgaaatgtgaacaacatatggggcacGlyMetThrAsnLysLysSerLeuLysCysGluGinHisMetGlyHis354045144agggetatgtattggtacaagcagaaagetaagaagccaccggagetcArgAlaMetTyrTrpTyrLysGinLysAlaLysLysProProGluLeu505^60192atgtttgtctacagetatgagaaaetctctataaatgaaagtgtgccaMetPheValTyrSerTyrGiuLysLeuSerlieAsnGluSerValPro65707580240agtcgcttcteacctgaatgccccaacagetctetcttaaaccttcacSerArgPheSerProGluCysProAsnSerSerLeuLeuAsnLeuHis859095288etacacgccctgcagccagaagacteagccctgtatetctgcgccageLeuHisAiaLeuGinProGluAspSer人laLeuTyrLeuCys人laSer100105110336agecaagccgggacagggaacaccggggagctgttttttggagaaggcSerGinAlaGlyThrGlyAsnThrGlyGluLeuPhePheGlyGluGly115120125384tctaggctgaccgtactggaggacctgaaaaacgtgttcccacccgagSerArgLeuThrValLeuGluAspLeuLysAsnValPheProProGlu130135140432gtcgetgtgtttgagccateagaagcagagateteccacacccaaaagValAlaValPheGluProSerGluAlaGlulieSerHisThrGinLys145150155160480gccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagAlaThrLeuValCysLeuAlaThrG丄yPheTyrProAspHisValGlu165170175528ctgagetggtgggtgemtgggaaggaggtgcacagtggggtcage混LeuSerTrpTrpValAsnGLyLysGluValHisSerGlyValSerThr賜L85190576gacccgcagcccetc幼ggagcagcccgccetcaatgactecagatacAspProGLnProLeuLysGluGinProAlaLeuAsnAspSerArgTyr19520020562418Untitled.ST25.txtSEQUENCELISTINGaio〉廣東藥學(xué)院<120>人TCRVP7.1—H3F7基因及其篩選方法和應(yīng)用<130〉<160〉2<170>Patentlnversion3-2<210>1<211〉942<212〉DNA<213〉人工序列CDS(942)oli-es-2tgcctgageagecgcctgagggtcteggccCysLeuSerSerArgLeuArgValSerA丄a210215Untitled.ST25.txtaccttctggcagaaccccThrPheTrpGinAsnPro220cgcaaccacttccgctgtcaagtccagttct.acgggetcteggagaat.ArgAsnHisPheArgCysGinValGLnPheTyrG丄yLeuSerGluAsn225230235240gacgagtggacccaggatagggccaaacct.gtcacccagategtcageAspGluTrpTh:rGinAspArgAlaLysProValThrGinlieValSer245250255gccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctecgagtcttacAlaGluMaTrpGlyArgAlaAspCysGlyPheThrSerGluSerTyr260265270cagcaaggggtcctgtctgccaccateetctatgagatettgetagggGinGinGlyValLeuSerAlaThrlieLeuTyrGlulieLeuLeuGly275280285aaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccetcgtgctgatggccLysAlaThrLeuTyrAlaValLeuValSerAlaLeuValLeuMetAla290295300grtggtcaagagaaaggattec￡igaggctagMetValLysArgLysAspSerArg6iy305310<210〉<211><212><213〉2313PRT人工序列《歸2MetGlyCysArg1LeuLeu5CysCysAlaValLeuCysLeuLeu10Gly15AlaValProlieAspThrGluValThrGinThrProLysHisLeuValMet202530GlyMetThrAsnLysLysSerLeuLysCysGluGinHisMetGLy〖Us354045ArgAlaMetTyrTrpTyrLysGinLysAlaLysLysProProGluLeu505560MetPheVal-TyrSerTyrGluLysLeuSerlieAsnGiuSerValPro65707580SerArgPheSerProGluCysProAsnSerSerLeuLeuAsnLeuHis859095LeuHisAlaLeuGinProGluAspSerAlaLeuTyrLeuCysAlaSerL00105110SerG丄nAlaGlyThrGlyAsnThrGlyGluLeuPhePheGlyGluGly115120125SerArgLeuThrValLeuGluAspLeuLysAsnValPheProProGluL30L35140ValAlaValPheGluProSerGluAlaGlulieSe:rHisThrG丄nLys14515015516067272076S816864912942AlaThrLeuValCysLeuAlaThrGLyPheTyr165170Untitled.ST25.txtProAspHisValGlu丄75LeuSerTrpTrpValAsnGlyLysGluValHisSerGlyValSerThrL80185i90AspProGinProLeuLysGluGinProAlaLeuAsnAspSerArgTyr195200205CysLeuSerSerArgLeuArgValSerAlaThrPheTrpGinAsnPro210215220ArgAsnHisPheArgCysGinValGinPheTyrGlyLeuSerG丄uAsn225230235240AspGLuTrpThrGinAspArgAlaLysProValThrGLnlieValSer245250255AlaGluAlaTrpGlyArgAlaAspCysGlyPheThrSerGluSerTyr260265270GinGinGlyValLeuSerAlaThrlieLeuTyrGlulieLeuLeuGly275280285LysAlaThrLeuTyrAlaValLeuValSerAlaLeuValUuMetAla290295300MetValLysArgLysAspSerArgGly305310權(quán)利要求1、一種人TCRβ7.1_H3F7基因，其特征是基因序列由942個(gè)堿基組成，蛋白序列由312個(gè)氨基酸組成，序列表如SEQIDNO1。2、一種權(quán)利要求1所述的基因的篩選擴(kuò)增方法，其特征是包括以下步驟(1)T淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物基因克隆入表達(dá)載體pcDNA-kan上；(4)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和HindIII將TCR基因和載體pcDNA-kan進(jìn)行雙酶切，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，最后在含卡那霉素的LB平板上篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆細(xì)菌，將篩選得到的重組子進(jìn)行測序。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟(2)所述引物為V7CK和C2CK，其序列如下V7CK:ATTGAATTC+GCC+ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCC2CK:GCCMGCTT+CTAGCCTCTGGMTCCTTTCT引物前端都含有3個(gè)保護(hù)堿基序列，V7CK引物中還含有限制性內(nèi)切酶EcoRI的序列和Kozark序列，C2CK引物中含有限制性內(nèi)切酶HindIII的序列。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟(3)所述克隆選用pcDNA-kan載體多克隆位點(diǎn)中的EcoRI和HindIII位點(diǎn)為基因插入位點(diǎn)。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟(4)所述測序以T7通用引物和BGH反向測序引物作為測序引物。6、一種權(quán)利要求1所述基因的應(yīng)用，其特征是在制備能識別腫瘤和殺傷腫瘤藥物方面的應(yīng)用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述基因的應(yīng)用，其特征是應(yīng)用于制備抗肝癌藥物或疫苗方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的人類TCRVβ7.1_H3F7基因，提供了其基因序列表，本發(fā)明同時(shí)提供了所述基因的篩選擴(kuò)增辦法以及應(yīng)用，為制備抗肝癌腫瘤疫苗及其他藥物的研制提供必要的基礎(chǔ)與技術(shù)實(shí)現(xiàn)手段，并提供了攻克肝癌的可靠前景。文檔編號A61P35/00GK101100666SQ20071002874公開日2008年1月9日申請日期2007年6月22日優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日發(fā)明者吳鳳麟,晗沈,肖蘭鳳,邵紅偉,偉陳,黃樹林申請人:廣東藥學(xué)院