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環(huán)孢霉素a半抗原的制備方法及環(huán)孢霉素a的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒的制作方法

文檔序號:6013126閱讀:163來源:國知局
專利名稱:環(huán)孢霉素a半抗原的制備方法及環(huán)孢霉素a的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測試劑,特別是環(huán)孢霉素A半抗原的制備方法及環(huán)孢霉素A的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)
環(huán)孢霉素A (cyclosporin Α)是一種從真菌中提取,由瑞士山德士藥廠1976年首次發(fā)現(xiàn)并報告有免疫抑制作用的藥物。同年英國劍橋的R. Calne在動物的器官移植上應(yīng)用取得了令人難忘的結(jié)果,并于1978年成功地試用于臨床腎臟移植和骨髓移植。環(huán)孢霉素A 的出現(xiàn)對器官移植的發(fā)展起了巨大的推動作用,如今被稱之為“器官移植的環(huán)孢霉素”,是目前最常用的免疫抑制劑,也用于自身免疫疾病的治療。其主要作用是通過可選擇性地抑制免疫應(yīng)答,有選擇性地抑制活性T細(xì)胞增殖依賴的細(xì)胞因子IL-2,致使T細(xì)胞分化、發(fā)育產(chǎn)生障礙,從而保護(hù)移植物(器官)免遭T細(xì)胞毒性作用的破壞,而對其他的免疫細(xì)胞的抑制作用則相對較弱。在臨床上,環(huán)孢霉素A的使用劑量、血藥濃度與療效、藥物毒性密切相關(guān),在高血濃度時有一定的毒性,主要是神經(jīng)毒性和腎毒性。因此臨床使用需要制定合理的用藥方案, 經(jīng)常測定血中環(huán)孢霉素A的濃度來監(jiān)測環(huán)孢霉素A的用量是否合適。據(jù)統(tǒng)計,截至2008年,我國移植手術(shù)總量已經(jīng)超過10萬次,現(xiàn)在我國已經(jīng)成為繼美國之后的世界第二大器官移植國家,每年器官移植手術(shù)已經(jīng)超過1萬例,而且隨著經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療水平的發(fā)展,以后的器官移植患者會越來越多。環(huán)孢霉素A由于具有上市早,藥效明顯,價格相對低廉的特點,是當(dāng)前居于市場首位的免疫抑制劑,約占當(dāng)前免疫抑制劑市場份額的25%。一般移植手術(shù)后2月內(nèi),病人需要每1-2周檢測一次血藥濃度,4月內(nèi)每2-4周檢測一次血藥濃度,半年以上要每月檢測一次血藥濃度。現(xiàn)在國內(nèi)市場上用于環(huán)孢霉素A檢測的試劑盒幾乎全部依賴進(jìn)口,生產(chǎn)檢測試劑盒的廠家主要有美國Dade Behring公司、美國雅培制藥有限公司、德國羅氏集團(tuán)、西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品公司,其中用于檢測反應(yīng)的半抗原環(huán)孢霉素A都包被為微粒子結(jié)構(gòu),以適用于配套的分析儀器進(jìn)行檢測,這樣就提高了醫(yī)院及檢測中心的準(zhǔn)入門檻,對檢測實驗操作人員要求也比較高,同樣附加于病人的診療費用也相應(yīng)提高。而國內(nèi)實際情況是,人均國民經(jīng)濟(jì)水平偏低,器官移植患者對于進(jìn)口試劑的經(jīng)濟(jì)承受能力有限,而且醫(yī)療衛(wèi)生檢測機(jī)構(gòu)水平差距非常大,對于很多進(jìn)口儀器的操作和數(shù)據(jù)分析,缺乏專業(yè)技術(shù)人員;而酶標(biāo)儀已經(jīng)逐步國產(chǎn)化,相對于進(jìn)口試劑配套的檢測儀器,酶標(biāo)儀的價格是目前大多數(shù)地方醫(yī)院及檢測中心所能接受的,且酶標(biāo)儀操作簡單、便捷,對技術(shù)人員要求不高?,F(xiàn)在的酶標(biāo)儀只適合檢測包被為板式的抗原板或抗體板,而環(huán)孢霉素A本身為小分子藥物,屬于半抗原,采用現(xiàn)有技術(shù)中常用的抗原包被方法,均無法得到靈敏度高、重復(fù)性好的適于檢測應(yīng)用的酶標(biāo)板,因此,首先得克服這一技術(shù)困難,才能做成適于國內(nèi)普遍適用的環(huán)孢霉素A檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述領(lǐng)域的空白及需求,本發(fā)明提供一種環(huán)孢霉素A酶聯(lián)免疫檢測試劑盒, 具有高靈敏度和精確度,能滿足檢測需要,而且操作簡單快捷,不需要購買昂貴的分析儀器與之配套檢測,不需要特殊的技術(shù)人員進(jìn)行操作,這樣可以解決二線、三線城市檢測中心的檢測需求。環(huán)孢霉素A半抗原的制備方法,步驟如下(1)環(huán)孢霉素A按質(zhì)量體積比3g Iml比例溶于嘧啶中,再逐滴加入與嘧啶等體積的二氯甲烷,在常溫充氬氣環(huán)境中攪拌過夜;(2)將步驟(1)的產(chǎn)物真空蒸發(fā)干燥得到固體殘渣溶于二氯甲烷,溶液過凝膠柱分離純化,得到二氧化硅化環(huán)孢霉素A (TMS-CsA));(3)制備一級粗產(chǎn)品按質(zhì)量體積比5g Iml將TMS-CsA溶入乙醚中,再按TMS-CsA與甲苯的質(zhì)量體積比為Ig 30ml加入甲苯和按TMS-CsA與氫化鈉質(zhì)量比2 1加入氫化鈉,在通氬氣的條件下常溫攪拌30min后冷卻到4°C,按TMS-CsA與環(huán)氧乙烷的質(zhì)量體積比為Ig 6ml用注射器加入環(huán)氧乙烷,然后將反應(yīng)器加蓋封口,常溫攪拌反應(yīng)M小時后,加入2 3倍反應(yīng)物體積的水,用IM的HCL酸化,加入4 6倍反應(yīng)物體積的二氯甲烷混合,分離有機(jī)相后,加水洗提,洗提產(chǎn)物用硫酸鎂干燥并過凝膠柱分離純化得到一級粗產(chǎn)品;(4)于常溫、通氬氣的條件下,將一級粗產(chǎn)品2份和1,4 丁二醇二縮水甘油醚按質(zhì)量1份溶于甲苯中,一級粗產(chǎn)品與甲苯的質(zhì)量體積比為Ig 5 10ml,常溫攪拌池后,按一級粗產(chǎn)品與乙酸乙酯質(zhì)量體積比為Ig 100 200ml加入乙酸乙酯,及與乙酸乙酯等體積的水,分離混合液中有機(jī)相,用50%的氯化鈉溶液洗提有機(jī)相,洗提產(chǎn)物用硫酸鎂干燥并過凝膠柱分離純化得到二級粗產(chǎn)品;(5)在攪拌狀態(tài)下,取按二級粗產(chǎn)品與甲醇的質(zhì)量體積比為Ig 40ml將二級粗產(chǎn)品加入甲醇中,補(bǔ)充水直至混合液有明顯霧團(tuán),加入與二級粗產(chǎn)品質(zhì)量比為1 0.5 1.5 的無水碳酸鉀,常溫通氬氣攪拌過夜,用IM鹽酸酸化處理,加入與甲醇等體積的水,用二氯甲烷提取有機(jī)相,用與甲醇等體積的鹽水洗滌(有機(jī)相),硫酸鎂干燥得到環(huán)孢霉素A半抗原。環(huán)孢霉素A的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒,包括抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體或抗抗體包被的酶標(biāo)板,酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A 半抗原;或與載體蛋白偶聯(lián)的環(huán)孢霉素A半抗原包被的酶標(biāo)板,酶標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體或抗抗體;其特征在于所述用于包被酶標(biāo)板的環(huán)孢霉素A半抗原和酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A半抗原采用上述制備方法獲得。所述抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的包被濃度為 0. 10-0. 25μ g/ml。所述與載體蛋白偶聯(lián)的環(huán)孢霉素A半抗原包被的酶標(biāo)板的包被濃度為 0.15-0. 45 μ g/ml 所述抗抗體包被的酶標(biāo)板的包被濃度為0. 15-0. 34 μ g/ml。
所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、 藍(lán)血蛋白或卵清蛋白。所述試劑盒還包括樣品前處理液、樣品稀釋液、環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液、環(huán)孢霉素 A質(zhì)量控制溶液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液。所述樣品前處理液為含20_100mM硫酸鋅的甲醇溶液與乙二醇混合液;樣品稀釋液為含0. 3-0. 5M NaCL的50mM的磷酸鹽緩沖液;環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液,環(huán)孢霉素A質(zhì)量控制品溶液為含有不同濃度環(huán)孢霉素A 的人全血溶液;所述濃縮洗滌液為pH值為7. 2 8. 5、終濃度為0. 02 0. 05 % Proclin300、 1. 0 2. 0%吐溫-20,0. 01 0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液。所述酶標(biāo)記所用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酯酶。所述酶標(biāo)記所用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶,所述顯色液由顯色A液和顯色B液組成,中A液為的組成為pH值為7. 2 8. 5,濃度為10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(V/V)為0. 02 0. 1% Proclin300,0. 1 1.0%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液;B液為 50mM 的 Tris-HCI 緩沖液中加入終濃度(W/V)為 0. 02 0. 1 % Proclin300,1. 0 3. OmM 的4-碘苯酚,0. 的BSA,0. 1 的溴化十六烷基三甲基銨,10 50mM魯米諾溶液。所述酶標(biāo)記所用的標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時,顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液,終止液為1 2mol/L氫氧化鈉溶液。本發(fā)明提供環(huán)孢霉素A的活化方法,經(jīng)該活化方法處理的環(huán)孢霉素A能夠用于制備用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測的酶標(biāo)板。與現(xiàn)有技術(shù)相比,該方法活化后的環(huán)孢霉素A制備的酶標(biāo)板具有檢測靈敏度高,穩(wěn)定性好等優(yōu)點,檢測效果與進(jìn)口試劑相近,但可用國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)具備的檢測設(shè)備進(jìn)行定量檢測器官移植患者全血中的環(huán)孢霉素A的濃度。實驗結(jié)果表明,本試劑盒具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點;本試劑盒的主要試劑都采用工作液形式,使用方便,成本低廉。用本發(fā)明試劑盒檢測環(huán)孢霉素 A的方法,操作簡便,簡化了傳統(tǒng)檢測方法的步驟,縮短了檢測時間,對樣品的前處理要求低,能同時快速檢測大批量的樣品。


圖1為環(huán)孢霉素A的結(jié)構(gòu)式。圖2為環(huán)孢霉素與二氯甲烷反應(yīng)后產(chǎn)生的中間產(chǎn)品圖3為包被原為環(huán)孢霉素A的單克隆抗體的檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。實施例1.制備環(huán)孢霉素A半抗原1)秤取18001^環(huán)孢霉素4(08々)溶于6ml嘧啶,再逐滴加入6ml 二氯甲烷,在常溫充氬氣環(huán)境中攪拌過夜;2)將以上產(chǎn)物進(jìn)行真空蒸發(fā)干燥后的固體殘渣溶于二氯甲烷,過凝膠柱分離純化,得到 TMS-CsA (1700mg,89% );3)取以上產(chǎn)物(1000mg,0. 78mmol)加入0. 2ml乙醚中,加入30ml甲苯,加入氫化鈉(450mg,形成50 %礦物油懸浮液,用甲苯提取),在通氬氣的條件下常溫攪拌30min后,冷卻到4°C,用注射器加入6ml環(huán)氧乙烷后,將反應(yīng)器加蓋,用石蠟封口,常溫攪拌M后,加入 IOOml水,用(IN)HCL酸化,加200ml 二氯甲烷。將有機(jī)相分離后,加IOOml水洗提,用硫酸
鎂干燥處理后,將粗產(chǎn)品進(jìn)行凝膠分離純化;4)常溫,通氬氣的條件下,取以上產(chǎn)物(300mg ;0. 23mmol)加入1,4 丁二醇二縮水甘油醚(150mg)溶于aiil甲苯,加入50ml乙酸乙酯,50ml水,將有機(jī)相分離后,用鹽水/水 (1 l,2X50ml)洗提,用硫酸鎂干燥處理后,將粗產(chǎn)品進(jìn)行凝膠分離純化;5)在攪拌狀態(tài)下,取以上產(chǎn)品(250mg,0. 17mmol)加入到IOml甲醇,補(bǔ)充水直至混合液有明顯霧團(tuán),加無水碳酸鉀200mg,常溫通氬氣攪拌過夜。用(IN)鹽酸酸化處理,加 20ml水。用二氯甲烷(3X75ml)提取有機(jī)相,用IOml鹽水洗滌,硫酸鎂干燥處理得到環(huán)孢霉素A半抗原。對照環(huán)孢霉素A半抗原的制備方法參照文獻(xiàn)《環(huán)孢霉素A免疫全抗原合成及檢測用單克隆抗體制備研究》(陳米娜,2004年博士論文)中方法進(jìn)行,具體操作為用電子天平準(zhǔn)確稱量60. Omg CsA和12. Omg BBa (4-苯甲酰苯甲酸)。于721型分光光度計比色皿(b =5mm)中,加入丙酮約1. Sml充分溶解,少量取樣(0")。用針管導(dǎo)入小股氮氣(N2)流均勻鼓泡約25分鐘(min),打開冷卻風(fēng)扇及紫外光源開始光照。比色皿外部用冰水冷卻,反應(yīng)過程持續(xù)通入隊。由于氮氣夾帶及光照使溶液溫度升高致溶劑揮發(fā),皿內(nèi)液面不斷下降,當(dāng)殘余液量降至約0. 4-0. 5ml時停止光照,少量取樣(1)。補(bǔ)加丙酮至1. 8ml左右,繼續(xù)通入 N2并光照及取樣。重復(fù)以上操作直至所取樣品在小薄層層析板跑樣結(jié)果非常接近,即反應(yīng)速度己十分緩慢時最終結(jié)束光照。在光解反應(yīng)后的殘余液(約0. 4-0. 5ml略呈淡黃色)加入少量丙酮使終體積在 Iml左右。用帶S號針頭的2ml注射器吸取該混合溶液,在干燥的大薄層板一端劃一道粗細(xì)均勻的樣品線,用吹風(fēng)使溶劑揮發(fā)完全。將板末端浸入盛有層析液的層析缸中層析,待溶劑展開完全時取出層析板,標(biāo)記溶劑的前沿線。將板置于通風(fēng)櫥中,待溶劑揮發(fā)至干,在254nm 紫外燈下顯色,用鉛筆標(biāo)出各帶的大致范圍。刮下Rf值約為0. 55的顏色較深帶的硅膠,壓碎后用2X20ml甲醇抽提,合并抽提液,離心、過濾并旋轉(zhuǎn)蒸干即可得到白色固體粉末狀產(chǎn)物。取少量在相同展開體系中進(jìn)行薄層層析,分析所含雜質(zhì)情況,如仍含CsA和BBa,可換種展開體系CH2CI2/CH30H/CH3C00H = 95 4 1 (體積比)再次薄層層析分離。最終得到的產(chǎn)物即為環(huán)孢霉素A半抗原實施例2、環(huán)孢霉素A單克隆抗體為包被原,標(biāo)記物為酶標(biāo)半抗原的試劑盒制備及使用一、以環(huán)孢霉素A單克隆抗體為包被原、酶標(biāo)記半抗原為標(biāo)記物的試劑盒檢測原理如下在微孔條上預(yù)包被環(huán)孢霉素A抗體,樣本中的環(huán)孢霉素A與酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A 與微孔條上預(yù)包被的抗環(huán)孢霉素A抗體進(jìn)行競爭性結(jié)合,這樣,樣本吸光值與其樣本中所含環(huán)孢霉素A的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中環(huán)孢霉素A的量。二、以環(huán)孢霉素A單克隆抗體為包被原、酶標(biāo)記半抗原為標(biāo)記物的試劑盒組成一般可以包括如下1、包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為抗環(huán)孢霉素A的鼠源單克隆抗體,包被濃度為 0. 10-0. 25μ g/ml。2、酶標(biāo)記半抗原為辣根過氧化物酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A半抗原,其工作稀釋度為 1 500。3、環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶,2ml/瓶,濃度分別為0ng/ml、30ng/ml、lOOng/ml、 300ng/ml、800ng/ml、1500ng/ml。4、環(huán)孢霉素A質(zhì)量控制液2瓶,2ml/瓶,濃度分別為200ng/ml、1000ng/ml。5、樣品稀釋液為含0. 3M NaCL的50mM的磷酸鹽緩沖液,20ml/瓶,1瓶6、底物顯色液其中A液為的組成為pH值為8. 0,濃度為30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(V/V)為0. 05% Proclin300,0. 5%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液;B液為 50mM的Tris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 05% Proclin300, 3mM的4-碘苯酚,
的BSA,1 %的溴化十六烷基三甲基銨,50mM魯米諾溶液。7、終止液2mol/l 硫酸。8、濃縮洗滌液pH值為7. 4,含有在所述濃縮洗滌液中的終濃度為0.05% PrOclin300、在所述濃縮洗滌液中的終濃度為2. 0%吐溫_20、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液, 40ml/瓶,1 瓶。9、樣品處理液為含20 IOOmM硫酸鋅的甲醇溶液與乙二醇混合液,IOml/瓶,1瓶。三、以環(huán)孢霉素A單克隆抗體為包被原、酶標(biāo)記半抗原為標(biāo)記物的試劑盒的制備1、包被有環(huán)孢霉素A單克隆抗體的酶標(biāo)板的制備(1)環(huán)孢霉素A單克隆抗體選擇Fitzgerald公司生產(chǎn)的環(huán)孢霉素A單克隆抗體mouse monoclonal anti-Cyclosporine Aantibody,IgG0(2)包被有包被原的酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液(pH值為9. 6,0. lmol/L碳酸鹽緩沖液)將以上環(huán)孢霉素A抗體IgG 進(jìn)行1 4000稀釋(即0. 25ug/ml),加入到酶標(biāo)板孔中,每孔100μ1,37 反應(yīng)2小時,甩掉包被液后,拍干,每孔加入200 μ 1的封閉液(含終濃度為2%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液),37°C反應(yīng)2小時,甩掉封閉液,拍干,自然晾干,用鋁箔袋真空包裝保存。2、酶標(biāo)環(huán)孢霉素A半抗原和對照酶標(biāo)半抗原的制備稱取Img實施例1制備得到環(huán)孢霉素A半抗原和對照環(huán)孢霉素A半抗原,分別溶于3mlN,N-二甲基甲酰胺,室溫攪拌30min,逐滴加入到IOml (含;3mg)的辣根過氧化物酶溶液中,室溫攪拌過夜后,用kphadex G-25進(jìn)行層析純化得到酶標(biāo)環(huán)孢霉素A半抗原和對照酶標(biāo)環(huán)孢霉素A半抗原。四、以環(huán)孢霉素A單克隆抗體為包被原、酶標(biāo)記環(huán)孢霉素A半抗原為酶標(biāo)記物的試劑盒的應(yīng)用1、人全血樣品的前處理將2_8°C冰箱保存的人全血環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)量控制品溶液和待檢樣品,在振蕩器上充分振蕩混勻,立即精確吸取150μ 1每個樣品到相應(yīng)的離心管中,加入等體積的
8樣品前處理液后立即蓋好管蓋,用漩渦混合儀高速旋轉(zhuǎn),確保每個樣品充分混勻,將離心管放入離心機(jī),13000r/min,離心6分鐘。取20 μ 1用于分析。2、檢測向包被有環(huán)孢霉素A單克隆抗體的酶標(biāo)板中加入樣品稀釋液30 μ 1,然后在每孔中加入環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液、質(zhì)量控制品溶液及樣品溶液20 μ 1,每孔中各加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的半抗原50μ 1,用蓋板模封板,37°C恒溫箱中反應(yīng)1小時,甩干孔內(nèi)液體,洗板 5次,拍干;每孔加入底物顯色液A液過氧化脲,底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB),輕輕振蕩混勻,37°C恒溫箱避光顯色15分鐘,每孔加入2mol/l硫酸終止液50 μ 1,輕輕振蕩混勻,用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450/630nm處,測定每孔吸光值(0D值)。對照檢測同上,區(qū)別僅在于酶標(biāo)半抗原為對照環(huán)孢霉素A半抗原。3、檢測結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)示值為X軸,以檢測吸光度值為Y軸,進(jìn)行四參數(shù)擬合,得到回歸方程及擬合曲線圖3。將待檢測樣品吸光度帶入回歸方程,即可求得樣品濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機(jī)專業(yè)軟件,此法更便于大量樣品的快速分析。五、試劑盒靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和保存期檢測1、標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗從實施例2步驟三中不同時間段制備的不同批次(01批、02批、03批)的試劑盒中各抽取10個試劑盒,從每個試劑盒的酶標(biāo)板中各抽出20個微孔,測定300ng/ml環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值(0D值),計算變異系數(shù)CV%。實驗結(jié)果如表1所示,標(biāo)準(zhǔn)品吸光值的變異系數(shù)在3. 9% -11. 4%之間,符合精密度小于或者等于20%的規(guī)定。而采用對照環(huán)孢霉素A半抗原的對照試劑盒的檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品吸光值的變異系數(shù)在 8. 68% -21. 3%0表1本發(fā)明試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)品檢測的重復(fù)性試驗(CV% )
權(quán)利要求
1.環(huán)孢霉素A半抗原的制備方法,步驟如下(1)環(huán)孢霉素A按質(zhì)量體積比3g Iml比例溶于嘧啶中,再逐滴加入與嘧啶等體積的二氯甲烷,在常溫充氬氣環(huán)境中攪拌過夜;(2)將步驟(1)的產(chǎn)物真空蒸發(fā)干燥得到固體殘渣溶于二氯甲烷,溶液過凝膠柱分離純化,得到二氧化硅化環(huán)孢霉素A ;(3)制備一級粗產(chǎn)品按質(zhì)量體積比5g Iml將TMS-CsA溶入乙醚中,再按TMS-CsA與甲苯的質(zhì)量體積比為 Ig 30ml加入甲苯和按TMS-CsA與氫化鈉質(zhì)量比2 1加入氫化鈉,在通氬氣的條件下常溫攪拌30min后冷卻到4°C,按TMS-CsA與環(huán)氧乙烷的質(zhì)量體積比為Ig 6ml用注射器加入環(huán)氧乙烷,然后將反應(yīng)器加蓋封口,常溫攪拌反應(yīng)M小時后,加入2 3倍反應(yīng)物體積的水,用IM的HCL酸化,加入4 6倍反應(yīng)物體積的二氯甲烷混合,分離有機(jī)相后,加水洗提, 洗提產(chǎn)物用硫酸鎂干燥并過凝膠柱分離純化得到一級粗產(chǎn)品;(4)于常溫、通氬氣的條件下,將一級粗產(chǎn)品2份和1,4丁二醇二縮水甘油醚按質(zhì)量1 份溶于甲苯中,一級粗產(chǎn)品與甲苯的質(zhì)量體積比為Ig 5 10ml,常溫攪拌池后,按一級粗產(chǎn)品與乙酸乙酯質(zhì)量體積比為Ig 100 200ml加入乙酸乙酯,及與乙酸乙酯等體積的水,分離混合液中有機(jī)相,用50%的氯化鈉溶液洗提有機(jī)相,洗提產(chǎn)物用硫酸鎂干燥并過凝膠柱分離純化得到二級粗產(chǎn)品;(5)在攪拌狀態(tài)下,取按二級粗產(chǎn)品與甲醇的質(zhì)量體積比為Ig 40ml將二級粗產(chǎn)品加入甲醇中,補(bǔ)充水直至混合液有明顯霧團(tuán),加入與二級粗產(chǎn)品質(zhì)量比為1 0.5 1.5的無水碳酸鉀,常溫通氬氣攪拌過夜,用IM鹽酸酸化處理,加入與甲醇等體積的水,用二氯甲烷提取有機(jī)相,用與甲醇等體積的鹽水洗滌有機(jī)相后用硫酸鎂干燥得到環(huán)孢霉素A半抗原。
2.權(quán)利要求1的制備方法得到的環(huán)孢霉素A半抗原。
3.環(huán)孢霉素A的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒,包括抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體或抗抗體包被的酶標(biāo)板,酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A半抗原;或與載體蛋白偶聯(lián)的環(huán)孢霉素A半抗原包被的酶標(biāo)板,酶標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體或抗抗體;其特征在于所述用于包被酶標(biāo)板的環(huán)孢霉素A半抗原和酶標(biāo)記的環(huán)孢霉素A半抗原采用權(quán)利要求1所述的制備方法獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,所述抗環(huán)孢霉素A的特異性單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的包被濃度為0. 10-0. 25μ g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,所述與載體蛋白偶聯(lián)的環(huán)孢霉素A半抗原包被的酶標(biāo)板的包被濃度為0. 15-0. 45 μ g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,所述抗抗體包被的酶標(biāo)板的包被濃度為0· 15-0. 34 μ g/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、藍(lán)血蛋白或卵清蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求3 7任一所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,所述試劑盒還包括樣品前處理液、樣品稀釋液、環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液、環(huán)孢霉素A質(zhì)量控制溶液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液,所述樣品前處理液為含20-100mM硫酸鋅的甲醇溶液與乙二醇混合液;樣品稀釋液為含0. 3-0. 5M NaCL的50mM的磷酸鹽緩沖液;環(huán)孢霉素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液,環(huán)孢霉素A質(zhì)量控制溶液為含有不同濃度環(huán)孢霉素A的人全血溶液;所述濃縮洗滌液為pH值7. 2 8. 5、終濃度為 0. 02 0. 05% Proclin300、l. 0 2. 0% 吐溫 _20、0. 01 0. 03mol/L 的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,酶標(biāo)記所用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶,所述顯色液由顯色A液和顯色B液組成,中A液為的組成為pH值為72 8. 5,濃度為 10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(V/V)為0. 02 0. 1 % Proclin300,0. 1 1. 0% 吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液;B液為50mM的Tris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為 0. 02 0. Proclin300,1. 0 3. OmM 的 4-碘苯酚,0. 1% 1%的 BSA,0. 1 的溴化十六烷基三甲基銨,10 50mM魯米諾溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,酶標(biāo)記所用的標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶,顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液,終止液為1 2mol/L氫氧化鈉溶液。
全文摘要
本發(fā)明“環(huán)孢霉素A半抗原的制備方法及環(huán)孢霉素A的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒”,屬于醫(yī)學(xué)檢測試劑。本發(fā)明主要提供環(huán)孢霉素A半抗原的制備方方法及制備得到的環(huán)孢霉素A半抗原,采用該半抗原的環(huán)孢霉素A的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒可以制作成板式酶標(biāo)板以適應(yīng)國內(nèi)普及的檢測設(shè)備,并且能保證檢測靈敏度高,穩(wěn)定性好,結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/577GK102367270SQ20111018329
公開日2012年3月7日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者李全, 焦守恕, 賈鳳芹 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司
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