用于檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能識(shí)別卡巴氧和喹賽多代 謝產(chǎn)物的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫方法（ELISA) 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 脫二氧卡巴氧和脫二氧喹賽多屬于喹噁啉類(lèi)藥物，是原型藥物卡巴氧和喹賽多在 動(dòng)物體內(nèi)脫氧代謝的產(chǎn)物，具有苯并吡嗪1，4-二氮萘的基本結(jié)構(gòu)，卡巴氧和喹賽多抗菌譜 較廣，抗革蘭氏陰性菌的作用要強(qiáng)于陽(yáng)性菌。在獸醫(yī)臨床和養(yǎng)殖業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。人們 為了追求經(jīng)濟(jì)利益而濫用藥物，導(dǎo)致藥物在動(dòng)物食品中大量殘留。喹噁啉類(lèi)藥物會(huì)對(duì)動(dòng)物 產(chǎn)生三致作用、光敏反應(yīng)和腎上腺皮質(zhì)損壞等毒副作用，部分文獻(xiàn)報(bào)道，藥物對(duì)動(dòng)物機(jī)體還 有一定程度的生殖毒性和細(xì)胞毒性。
[0003] 現(xiàn)已發(fā)展了多種用于檢測(cè)該類(lèi)藥物殘留的方法，如微生物方法、儀器方法及酶聯(lián) 免疫方法。微生物法被用于大量樣品的初步篩選，儀器方法常用于對(duì)陽(yáng)性樣品的確證， ELISA方法既可以定性也可以半定量。在這些殘留分析方法中，儀器方法由于其所需儀器昂 貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高，而不利于大批量樣品的篩選及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。微生物法雖在殘留篩 選高通量上表現(xiàn)出良好的性能，但方法缺乏特異性，不能確證殘留物的種類(lèi)，且所用細(xì)菌對(duì) 不同種類(lèi)的抗菌藥物敏感性存在差異，易導(dǎo)致假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。而ELISA方法 操作簡(jiǎn)便、高通量、高靈敏度、低費(fèi)用，能很好的克服儀器方法和微生物方法的缺陷。
[0004] 但目前，針對(duì)喹噁啉類(lèi)脫二氧代謝物的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道，所以建立一種特異性 好、靈敏度高的單克隆抗體以檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)或肉類(lèi)食物中卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物顯得十 分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能同時(shí)識(shí)別多種卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的單 克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，制備一種用于檢測(cè)卡巴氧和喹賽多體 內(nèi)代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用該試劑盒，建立一種能用于卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物 非診斷目的檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。
[0008]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種能識(shí)別卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201495的雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1所分泌的。
[0010] 上述雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCCNO:C201495。
[0011] 制備所述單克隆抗體所用的免疫原是由4- (4- (2-(喹噁啉-2基亞甲基）肼羰基） 苯氧基）丁酸（QHCPA)與人血清白蛋白偶聯(lián)制備的。
[0012] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肉類(lèi)食物中卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物殘留的酶聯(lián)免疫檢 測(cè)方法，該方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的提取和檢測(cè)等步驟，具體如 下：
[0013] (1)將喹噁啉-2-羧酸（QCA)與卵清白蛋白（OVA)偶聯(lián)得到包被原（QCA-OVA);
[0014] (2)用保藏號(hào)為CCTCCN0:C201341的雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1制備單克隆抗體；
[0015] (3)用步驟⑵的包被原包被固相載體；
[0016] (4)將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
[0017] 優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品先用體積比為乙酸乙酯：乙腈 =1 : 1的混合溶劑振蕩提取，再加入lmol/L的NaOH，靜置，取有機(jī)層用氮?dú)獯蹈?，加入?釋液離心后取上清，
[0018] 所述稀釋液的成分為：NaCl8. 0g，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g，KCl0? 2g， Tween200. 5mL，加雙蒸水至 1000mL，調(diào)節(jié)pH至 7. 4〇
[0019] 本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其他試劑組合，制成了 能檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法，實(shí)現(xiàn)了 對(duì)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
[0020] 所述的卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物是：脫二氧卡巴氧、脫二氧喹賽多和M-脫一氧 喹賽多。
[0021] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是：
[0022] 1、本發(fā)明在單克隆抗體制備時(shí)，采用QHCPA作為半抗原，該半抗原具有脫二氧卡 巴氧和脫二氧喹賽多的共同結(jié)構(gòu)，包括喹噁啉母環(huán)、2-位側(cè)鏈上的碳氮雙鍵和碳氧雙鍵，由 該半抗原制備的單克隆抗體可同時(shí)識(shí)別脫二氧卡巴氧和脫二氧喹賽多等多種卡巴氧和喹 賽多代謝產(chǎn)物。
[0023] 2、本發(fā)明制備的單克隆抗體對(duì)脫二氧喹賽多、M-脫一氧喹賽多和脫二氧卡巴氧 的靈敏度高，IC5tl分別為3. 75yg/L、3. 80yg/L和2. 89yg/L;該抗體對(duì)其它帶有甲基的脫 二氧代謝物均沒(méi)有識(shí)別，顯示出良好的特異性。
[0024] 3、本發(fā)明建立的ELISA方法和試劑盒能同時(shí)檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物脫二 氧卡巴氧和脫二氧喹賽多等喹噁啉類(lèi)藥物在肉類(lèi)食物中的殘留，從而防止藥物蓄積對(duì)人體 造成的毒副作用。方法準(zhǔn)確度高，精密度好，一次測(cè)定即可完成，與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，在 檢測(cè)藥物的種類(lèi)和效率上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以節(jié)省大量的時(shí)間和成本，具有更好的市場(chǎng) 價(jià)值。
[0025] 4、方法中所涉及的樣品處理簡(jiǎn)單，易操作，樣品處理所用的有機(jī)試劑對(duì)操作者身 體健康危害相對(duì)較小。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明所使用的半抗原（QHCPA)、人血清白蛋白（HSA)和QHCPA-HSA偶聯(lián)物 (免疫原）的紫外掃描圖譜。
[0027] 圖2為本發(fā)明所使用的半抗原（QCA)、卵清白蛋白（OVA)和QCA-OVA偶聯(lián)物（包被 原）的紫外掃描圖譜。
[0028] 圖3為本發(fā)明的單克隆抗體與脫二氧卡巴氧（DCBX)標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反 應(yīng)曲線，X軸為脫二氧卡巴氧（DCBX)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為脫二氧卡巴氧標(biāo)準(zhǔn)品溶液 的光密度值除以"零"孔光密度值（B/B0)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1免疫原和包被原的制備
[0031] I. 1免疫原QHCPA與牛血清白蛋白偶聯(lián)物（QHCPA-HSA)的制備
[0032]I. 1. 12-甲基喹噁啉的合成參照Xu等（2006)的合成方法，并做改進(jìn)。取鄰苯二胺 1.08g(0.01mol)投入到500mL的三口燒瓶中，加入150mL的甲醇，升溫到70°C，回流，攪拌 使之溶解；取丙酮醛〇. 90mL(0.Olmol)，加入IOmL的甲醇使之稀釋?zhuān)鸬渭尤氲缴鲜龅娜芤?中，薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)歷程，展開(kāi)劑用石油醚：乙酸乙酯=3 :1。反應(yīng)12h，熱過(guò)濾，蒸去少量 甲醇，重結(jié)晶，得到1.27g淡黃色針尖狀晶體，即是2-甲基喹噁啉，收率在70.5%。反應(yīng)方 程式如下：
[0033]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能識(shí)別卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO: C201495雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1所分泌的，所述卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物是脫二氧卡巴 氧、脫二氧喹賽多和M-脫一氧喹賽多。
2. -株雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO: C201495，所述雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1分泌的單克隆抗體能識(shí)別卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn) 物，所述卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物是脫二氧卡巴氧、脫二氧喹賽多和M-脫一氧喹賽多。
3. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫試 劑盒中的應(yīng)用。
4. 包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免 疫試劑盒。
6. 權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物非診斷目的檢測(cè)中的應(yīng) 用。
7. -種用于檢測(cè)肉類(lèi)食物中卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其特征在 于包括以下步驟如下： (1) 將喹噁啉-2-羧酸與卵清白蛋白偶聯(lián)得到包被原； (2) 用保藏號(hào)為CCTCC N0:C201495的雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1制備單克隆抗體； (3) 用步驟（1)的包被原包被固相載體； (4) 將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)食物中卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物殘留的酶 聯(lián)免疫方法，其特征在于：所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品先用體積比為乙酸乙 酯：乙腈=1 : 1的混合溶劑振蕩提取，再加入lmol/L的NaOH，靜置，取有機(jī)層用氮?dú)獯?干，加入稀釋液離心后取上清， 所述稀釋液的成分為：NaCl 8. Og，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KCl 0· 2g， Tween20 0· 5mL，加雙蒸水至 1000mL，調(diào)節(jié) pH 至 7. 4〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種能識(shí)別多種卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的特異性單克隆抗體和一種用于檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒,本發(fā)明的單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC？NO:C201495的雜交瘤細(xì)胞株DCBX5B1所分泌的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別脫二氧卡巴氧、脫二氧喹賽多和N4-脫一氧喹賽多，而且具有較高的靈敏度和特異性。本發(fā)明建立的ELISA方法和試劑盒能同時(shí)檢測(cè)卡巴氧和喹賽多代謝產(chǎn)物在肉類(lèi)食物中的殘留，具有檢測(cè)效率和靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC NO:C20149520140520
【IPC分類(lèi)】G01N33-531, C07K16-44, G01N33-577, C12N5-20, C12R1-91
【公開(kāi)號(hào)】CN104558186
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410830131
【發(fā)明人】袁宗輝, 何秀平, 彭大鵬, 潘源虎, 王玉蓮, 陳冬梅, 陶燕飛, 劉振利
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日