用于檢測(cè)雄激素類藥物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能識(shí)別雄激素類藥物 的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)雄激素類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法（ELISA)和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白同化雄激素是一類人工合成的留體性激素，具有環(huán)戊烷多氫菲的基本結(jié)構(gòu)， 此類藥物在獸醫(yī)臨床上具有重要的作用，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和骨骼肌的生長(zhǎng)，通過抑 制脂肪的增長(zhǎng)，從而使肌肉變發(fā)達(dá)，并且能夠刺激動(dòng)物對(duì)食物的欲望，使動(dòng)物的日增重提 高，同時(shí)大大提高了飼料的利用效率。若大劑量攝入雄激素會(huì)對(duì)骨髓的造血功能有刺激作 用，尤其是能夠促進(jìn)生成紅細(xì)胞并能刺激長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)。
[0003] 此類藥物通常比較穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，并且在動(dòng)物體內(nèi)殘留，人類長(zhǎng)期 食用含有雄激素及其代謝物的動(dòng)物性食品會(huì)產(chǎn)生頭痛、胸悶、心悸、肌肉疼痛等中毒癥狀， 還能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)、痤瘡、毛發(fā)減少和禿頂?shù)劝Y狀，也可引起低蛋白血癥，對(duì)男性生殖系 統(tǒng)造成損傷，除此之外還能造成肝臟、腎臟的病變，甚至能導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。 我國(guó)于2002年發(fā)布的文件中規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出甲睪酮、群勃龍、丙酸睪酮、苯 丙酸諾龍等性激素藥物。目前關(guān)于雄激素類藥物的儀器檢測(cè)方法很多，例如氣象色譜法 (GC)，高效液相色譜法（HPLC)，氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS)等。儀器分析方 法雖然靈敏、準(zhǔn)確、分離度高并且可進(jìn)行多殘留檢測(cè)的定性、定量研宄，但是需要昂貴的儀 器、繁瑣的前處理、熟練的專業(yè)操作員。免疫化學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有 快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合高通量樣品篩選，對(duì)于快速檢測(cè)雄激素藥 物更具優(yōu)勢(shì)。
[0004] CN102336830A公開了一種抗諾龍的特異性抗體，它是將17 0 -NT半抗原與BSA 蛋白連接合成免疫原；CN103116031A公開了一種群勃龍殘留快速檢測(cè)試紙卡，它是以群 勃龍一牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到的單克隆抗體可識(shí)別群勃龍，對(duì)諾龍也有一定 的交叉反應(yīng)率?，F(xiàn)有的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒只能識(shí)別1-2種雄激素類藥物，不能同時(shí)進(jìn) 行多種藥物成分的檢測(cè)，更加沒有能同時(shí)檢測(cè)諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍四種雄激素類藥 物的酶聯(lián)免疫試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：
[0006] (1)提供一種能同時(shí)識(shí)別多種雄激素類藥物的單克隆抗體；
[0007] (2)利用該單克隆抗體，制備一種用于多種雄激素類藥物檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑 盒；
[0008] (3)利用該試劑盒，建立一種用于多種雄激素類藥物非診斷目的檢測(cè)的ELISA方 法；
[0009] 上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0010] -種單克隆抗體，能識(shí)別雄激素類藥物，所述單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201494的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12所分泌的。
[0011] 所述雄激素類藥物為諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍。
[0012] 所述的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201494。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了 一種能檢測(cè)肉類食物中雄激素類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方 法，包括以下步驟：
[0014] (1)將結(jié)構(gòu)為式⑴所示的化合物（甲睪酮3-對(duì)肼基苯甲酸，MT-CPD)與匙孔藍(lán) 蛋白（KLH)偶聯(lián)得到免疫原（MT-CPD-KLH);
[0015] (2)用免疫原免疫小鼠獲得保藏號(hào)為CCTCCN0:C201494的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12;
[0016] (3)用保藏號(hào)為CCTCCN0:C201494的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12制備單克隆抗體；
[0017] (4)將半抗原（MT-CPD)與卵清白蛋白（OVA)偶聯(lián)得到包被原（MT-CPD-OVA);
[0018] (5)用步驟⑷的包被原包被固相載體；
[0019] (6)將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
[0020]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能識(shí)別雄激素類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCCN0:C201494的雜 交瘤細(xì)胞株NT4D12所分泌的，所述雄激素類藥物為諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍。
2. -株雜交瘤細(xì)胞株NT4D12,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201494,所述雜交瘤細(xì)胞株NT4D12分泌的單克隆抗體能識(shí)別雄激素類藥物，所述雄激 素類藥物為諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍。
3. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)雄激素類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng) 用。
4. 包含權(quán)利要求1所述單克隆抗體的試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)雄激素類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6. 權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在雄激素類藥物非診斷目的檢測(cè)中的應(yīng)用。
7. -種檢測(cè)肉類食物中雄激素類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其特征在于包括以下步 驟： (1) 將結(jié)構(gòu)為式（1)所示的化合物與卵清白蛋白偶聯(lián)得到包被原； (2) 用保藏號(hào)為CCTCCN0:C201494的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12制備單克隆抗體； (3) 用步驟（1)的包被原包被固相載體； (4) 將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)肉類食物中雄激素類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其特征 在于：所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品用酸化乙腈進(jìn)行提取，提取液氮?dú)獯蹈珊?用PBS緩沖液復(fù)溶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能同時(shí)識(shí)別諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍的特異性單克隆抗體,它是由保藏號(hào)為CCTCC？NO:C201494的雜交瘤細(xì)胞株NT4D12所分泌的。本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)雄激素類藥物的酶聯(lián)免疫方法和試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時(shí)檢測(cè)諾龍、甲睪酮、睪酮、群勃龍四種雄激素類藥物，且檢測(cè)靈敏度高，特異性好。本發(fā)明的ELISA方法和試劑盒檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好。CCTCC NO:C20149420140520
【IPC分類】C07K16-26, C12R1-91, G01N33-577, C12N5-20, G01N33-72
【公開號(hào)】CN104558176
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410829543
【發(fā)明人】袁宗輝, 王惠, 彭大鵬, 潘源虎, 王玉蓮, 陳冬梅, 馮亮, 朱永利, 劉振利
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日