一種抗蛇毒血清的制取工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種抗蛇毒血清的制取工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]抗蛇毒血清含有特異性抗體，具有中和相應(yīng)蛇毒的作用，用于蛇咬傷者的治療，世界上每年有500萬(wàn)人被毒蛇咬傷，有5萬(wàn)人因?yàn)闆](méi)有及時(shí)注射蛇毒血清死于非命。提取微量蛇毒，少量液體蛇毒(不足以致命的量)注入某動(dòng)物體內(nèi)(如馬，牛等)，一段時(shí)期之后，動(dòng)物體內(nèi)將會(huì)產(chǎn)生大量的抗蛇毒血清，然后將抗蛇毒血清從動(dòng)物血液中提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)加工以后就是抗蛇毒血清了，但這種方法獲得的抗蛇毒血清數(shù)量有限，而且純度較低，而采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，專門(mén)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生抗蛇毒血清的B細(xì)胞，不但能夠獲得大量抗蛇毒血清，而且血清的純度高，治療效果明顯，被毒蛇咬傷后，及時(shí)注射抗蛇毒血清，能夠特異性進(jìn)行解毒，從而達(dá)到治療效果，申請(qǐng)?zhí)枮镃N202020279274.0公開(kāi)了一種中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的制備方法及用法，涉及多價(jià)抗血清的制備及用法。本發(fā)明選擇達(dá)到一定效價(jià)水平的幾種蝰科毒蛇的特異性單價(jià)抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，裝量成20ml/瓶注射劑，經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)該血清能有效中和我國(guó)常見(jiàn)五種蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-220mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙鐵頭蛇毒55_75mg或竹葉青蛇毒20_35mg或蝮蛇毒
20-35mg，可直接應(yīng)用于蛇傷重?；颊?，不需鑒定咬傷蛇種類，降低蝰科毒蛇傷致殘率和死亡率，但是蛇毒本身較為稀有，直接采用蛇毒制得的抗蛇毒血清，血清量少，成本高，不能批量化生產(chǎn)，而且該抗蛇毒血清沒(méi)有明顯的標(biāo)記基因一一熒光蛋白基因，不便于醫(yī)學(xué)診斷的進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明目的是提供一種抗蛇毒血清的制取工藝。
[0004]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0006](I)動(dòng)物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50 μ g加佐劑脾內(nèi)注射0.8?2ml ；3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過(guò)0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5?7天后采血測(cè)其效價(jià)；2?3周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合；
[0007](2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過(guò)細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用；
[0008](3)基因重組:運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用；
[0009](4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓細(xì)胞離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次，計(jì)數(shù)，取得20-7細(xì)胞備用；
[0010](5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞；
[0011](6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時(shí)，開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞；
[0012](7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200 μ I，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0013]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0014]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(5)中，所述融合過(guò)程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
[0016]有益效果:本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物的選擇與免疫、制備免疫細(xì)胞、基因重組、制備骨髓細(xì)胞、細(xì)胞融合、選擇培養(yǎng)和后期培養(yǎng)七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時(shí)，過(guò)程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽(yáng)性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養(yǎng)，同種細(xì)胞具有很高的雜交融合率，抗體細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產(chǎn)生容易，縮短了制取時(shí)間，同時(shí)在細(xì)胞融合過(guò)程中加入的飼養(yǎng)細(xì)胞使細(xì)胞生產(chǎn)繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術(shù)成熟，DNA重組技術(shù)完善，因此本發(fā)明的抗蛇毒血清生產(chǎn)適于推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0018]本實(shí)施例的一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0019](I)動(dòng)物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒35 μ g加佐劑脾內(nèi)注射1.4ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過(guò)0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5天后采血測(cè)其效價(jià)；2周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量350 y g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合；
[0020](2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過(guò)細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用；
[0021](3)基因重組:運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取14重組細(xì)胞懸液備用；
[0022](4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓細(xì)胞離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次，計(jì)數(shù)，取得14細(xì)胞備用；
[0023](5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞；
[0024](6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時(shí)，開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞；
[0025](7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200 μ I，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0026]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0027]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(5)中，所述融合過(guò)程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0028]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
[0029]實(shí)施例2:其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，步驟(2)中添加的佐劑為福氏不完全佐劑，本實(shí)施例中，成本較低，但是作用效果相對(duì)較低。
[0030]實(shí)施例3:其余與所述實(shí)施例1相同，不同之處在于，步驟(5)將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞數(shù)量比例該為2: 5，本實(shí)施例中，重組細(xì)胞用量少，制取成本降低，且時(shí)間縮短，但融合效率變低。
[0031]經(jīng)實(shí)際應(yīng)用中可知，通過(guò)動(dòng)物的選擇與免疫、制備免疫細(xì)胞、基因重組、制備骨髓細(xì)胞、細(xì)胞融合、選擇培養(yǎng)和后期培養(yǎng)七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時(shí)，過(guò)程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽(yáng)性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養(yǎng)，同種細(xì)胞具有很高的雜交融合率，抗體細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產(chǎn)生容易，縮短了制取時(shí)間，同時(shí)在細(xì)胞融合過(guò)程中加入的飼養(yǎng)細(xì)胞使細(xì)胞生產(chǎn)繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術(shù)成熟，DNA重組技術(shù)完善，因此本發(fā)明的抗蛇毒血清生產(chǎn)適于推廣應(yīng)用。
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，其工藝步驟如下: (1)動(dòng)物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50μ g加佐劑脾內(nèi)注射0.8?2ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過(guò)0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5?7天后采血測(cè)其效價(jià)；2?3周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合； (2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過(guò)細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用； (3)基因重組:運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用； (4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓細(xì)胞離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次，計(jì)數(shù)，取得20-7細(xì)胞備用； (5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞； (6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時(shí)，開(kāi)始檢測(cè)抗蛇毒血清，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞； (7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200μ 1，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(5)中，所述融合過(guò)程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟為：(1)動(dòng)物的選擇與免疫；(2)制備免疫細(xì)胞；(3)基因重組：運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用；(4)制備骨髓細(xì)胞；(5)細(xì)胞融合；(6)選擇培養(yǎng)；(7)后期培養(yǎng)，本發(fā)明的抗蛇毒血清中具有明顯的標(biāo)記基因——熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時(shí)，過(guò)程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽(yáng)性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C07K16-18, C12N15-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104558170
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410808069
【發(fā)明人】崔強(qiáng)軍, 張政, 劉新亮, 余煉
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月22日