檢測i型志賀毒素雙抗夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及試劑盒領域，具體涉及一種檢測I型志賀毒素（StXl)雙抗夾心酶聯(lián)免 疫檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 腸出血性大腸桿菌感染是一種食物源性傳染性疾病，國外俗稱為"漢堡病"，其病 原為腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)，其典型菌株為EHEC0157:H7， 主要表現(xiàn)癥狀為出血性結腸炎、闌尾炎、食管狹窄和結腸穿孔等嚴重胃腸道并發(fā)癥，在兒童 和老年人中還可引起溶血性尿路綜合癥（haemolyticuraemicsyndrome，HUS)和血栓性血 小板紫癜（thrombocytpenicpurpura，TTP)等全身性并發(fā)癥。HUS和TTP的病情兇險，病 死率高。據(jù)報道，由于0157 :H7感染力強，耐酸，100-200個0157細菌就能突破胃酸屏障，在 腸道內大量繁殖，引起人感染此病，而其它致病性大腸桿菌需要100萬個細菌以上才能引 起發(fā)病。由于該菌對人的致病力強、可造成后遺癥、預后差和目前國內外尚無特效療法而引 起世界各國的高度重視。
[0003] 研宄表明，EHEC感染的主要致病機理可分為兩個方面，一是由菌體基因組毒力 島LEE(LocusofEnterocyteEffacement)編碼的多種致病因子所介導的粘附抹平機制 (AttachingandEffacing,A/E)，通過A/E機制，細菌可破壞腸上皮細胞，粘附并定植于腸 道；二是分泌志賀毒素（Shigatoxin,Stx)，Stx可以穿越破損的腸上皮細胞進入血液循 環(huán)，與其受體-丙糖?；拾贝糋b3或丁糖酰基鞘氨醇Gb4結合，造成腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng) 等器官的損傷，特別是Gb3受體含量較高的腎臟，受損后易引發(fā)HUS，危及生命；該毒素分 為StxI和StxII兩個亞型。針對志賀毒素的研宄，以往主要集中在StxII上，因為臨床上 StxII較StxI更能引起HUS。然而，由StxI引起的HUS還是經(jīng)常被報道，本發(fā)明制備的抗 體及檢測試劑盒填補了此方面的空白。
[0004] 臨床上檢測〇157:H7的常用方法包括細菌的分離培養(yǎng)法、免疫學方法、PCR擴增技 術。細菌培養(yǎng)發(fā)展得比較成熟，因其所需設備要求不高，己成為基層最常用的方法，但操作 復雜、費時，不能做到早期診斷。PCR雖然快速、敏感性和特異性高，但需特異性基因，目前除 rfbE基因特異性較高外，大部分與其他微生物具有一定的同源性，特異性還不理想。免疫 學方法因其靈敏性、特異性和可視性廣泛用于臨床疾病的診斷與監(jiān)測，特別是ELISA檢測， 敏感性高、操作簡便，配套儀器設備的發(fā)展使操作程序規(guī)范化和自動化，并進一步提高了穩(wěn) 定性，被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其它體液中微量蛋白成分、細胞因子 等。但是目前免疫學方法檢測〇157:H7的候選抗體尚不理想。
[0005] 為了提供一種以StxI為靶向的快速、易操作的診斷EHEC感染的方法，本發(fā)明制備 多株針對StxI的單克隆抗體，從中篩選出非競爭性的兩株單抗，分別為8E7-E6和2F6-F8， 制備雙抗體夾心法ELISA試劑盒。本發(fā)明制備的雙抗體夾心法ELISA試劑盒能夠特異性檢 測Stxl，具有很好的臨床應用價值。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗StxI的單克隆抗體或其片段，包括輕鏈⑶R1-3和 重鏈⑶R1-3,其特征在于，所述輕鏈⑶R1-3的氨基酸序列為：
[0007] CDRl :如序列表中SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11 所示；
[0008] CDR2 :如序列表中SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :12 所示；
[0009] CDR3 :如序列表中SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :13 所示；
[0010] 進一步，所述輕鏈⑶R1-3的核苷酸序列為：
[0011] CDRl :如序列表中SEQ ID NO :46或SEQ ID NO :52 所示；
[0012] CDR2 :如序列表中SEQIDNO :47 或SEQIDNO :53 所示；
[0013] CDR3 :如序列表中SEQ ID NO :48或SEQ ID NO :54 所示；
[0014] 所述重鏈⑶R1-3的氨基酸序列為：
[0015]CDRl :如序列表中SEQIDNO :4 或SEQIDNO : 14 所示；
[0016]CDR2 :如序列表中SEQIDNO :5 或SEQIDNO : 15 所示；
[0017]CDR3 :如序列表中SEQIDNO :6 或SEQIDNO :16 所示。
[0018] 進一步，所述重鏈⑶R1-3的核苷酸序列為：
[0019]CDRl :如序列表中SEQIDNO :49 或SEQIDNO :55 所示；
[0020] CDR2 :如序列表中SEQIDNO :50 或SEQIDNO :56 所示；
[0021] CDR3 :如序列表中SEQIDNO :51 或SEQIDNO :57 所示。
[0022] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗StxI的單克隆抗體8E7-E6,所述的單克隆抗體 8E7-E6的輕鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分別如序 列表中SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示。所述單克隆抗體8E7-E6的重鏈蛋 白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQIDNO: 4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 所示。
[0023] 進一步，所述的單克隆抗體8E7-E6的輕鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1、 CDR2、CDR3 的核苷酸序列，分別如序列表中SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48 所示。所述單克隆抗體8E7-E6的重鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3的 核苷酸序列分別如序列表中SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51所示。
[0024] 所述單克隆抗體8E7-E6包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中 SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示，其編碼基因分別如序列表中SEQIDN0:9、SEQIDN0:10 所示。
[0025] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗StxI的單克隆抗體2F6-F8,所述的單克隆抗體 2F6-F8的輕鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分別如序 列表中SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13所示。所述單克隆抗體2F6-F8的重 鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶RlXDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQID NO: 14、SEQIDNO: 15、SEQIDNO: 16 所示。
[0026] 進一步，所述的單克隆抗體2F6-F8的輕鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1、 CDR2、CDR3 的核苷酸序列，分別如序列表中SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54 所示。所述單克隆抗體2F6-F8的重鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3的 核苷酸序列分別如序列表中SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57所示。
[0027] 所述單克隆抗體2F6-F8包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中 SEQIDNO:17、SEQIDNO:18所示，其編碼基因分別如序列表中SEQIDNO:19、SEQIDNO: 20所示。
[0028] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測I型志賀毒素的ELISA試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒中的抗體或其片段輕鏈⑶R1-3的氨基酸序列選自SEQIDNO:1-3或11-13,重鏈 CDR1-3的氨基酸序列選自SEQIDNO:4-6或14-16。
[0029] 進一步，所述ELISA試劑盒為雙抗夾心法ELISA試劑盒，所述包被抗體為8E7-E6 單克隆抗體，所述檢測抗體為2F6-F8單克隆抗體。
[0030] 進一步，試劑盒還包括下列試劑中的一種或幾種：辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋 白標準品Stxl、陰性對照樣品、底物、BSA、PBS+0. 05%Tween20洗液、封閉液、終止液。
[0031] 本發(fā)明的目的在于提供上述單克隆抗體或其片段、ELISA試劑盒在制備檢測I型 志賀毒素中的應用。
[0032] 本發(fā)明的目的在于提供上述的單克隆抗體或其片段在制備治療I型志賀毒素所 引起疾病的藥物中的應用。
[0033] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明提供的抗體特異性靶標Stxl，所制備的雙抗夾心ELISA試 劑盒僅識別I型志賀毒素，而不識別II型志賀毒素，具有很好的臨床應用價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1.從雜交瘤細胞中抽提的總RNA
[0035] 圖2.MHV11/MHCG1引物組合擴增的條帶
[0036]泳道 1 為Lanelvk;泳道 2 為lane2vh;泳道 3 為marker
[0037] 圖3.MHV2/MHCG1引物組擴增的條帶
[0038]泳道 1 為Lanelvk;泳道 2 為lane2vh