專利名稱：布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物制品技術(shù)，具體說就是布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗 體檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)檢測方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其 分泌的細胞因子的實驗方法。隨著學(xué)科間的相互滲透，免疫學(xué)涉及的范圍不斷擴大，新的免 疫學(xué)檢測方法層出不窮。免疫學(xué)方法的應(yīng)用范圍亦在日益擴大，不僅成為多種臨床疾病診 斷的重要方法，也為眾多學(xué)科的研究提供了方便?？乖c相應(yīng)抗體相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，并在外界條件的影響下呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn) 象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗體)檢測未知抗體(或抗原)。試驗所采用的 抗體常存在于血清中，因此又稱之為血清學(xué)反應(yīng)(serological reaction)。抗原種類繁多，按其物理性狀可分顆粒性和可溶性兩類。前者指細胞性抗原(包 括細菌抗原)，其制備較為簡便，一般用新鮮細胞以無菌生理鹽水或磷酸緩沖液洗滌后配成 一定濃度。若系細菌抗原，則取新鮮培養(yǎng)物，經(jīng)集菌作如下處理，H抗原因不耐熱用0.3% 0.5%甲醛處理，0抗原耐熱可加熱100°C2h去除H抗原后應(yīng)用?？扇苄钥乖梢允羌毎?膜、細胞漿、細胞核及核膜等細胞組成部分，也可能是經(jīng)細胞分泌至體液中的一些可溶性因 子。細胞組成部分常需經(jīng)過機械或酶解法等破碎、離心獲得粗制抗原，并通過選擇性沉淀或 層析等方法進一步純化。而體液中(如血清等)的可溶性抗原則可直接用生化手段獲得所 需成分。有些可溶性抗原僅具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性，此類抗原尚需與載體偶聯(lián)方可 成為完全抗原。布魯氏菌病(Brucellosis)又稱地中海弛張熱，馬爾他熱，波浪熱或波狀熱，是由 布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病，其臨床特點為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大 等。1886年英國軍醫(yī)Bruce在馬爾他島從死于“馬爾他熱”的士兵脾臟中分離出“布魯氏 菌”，首次明確了該病的病原體。1897年Wright與其同事發(fā)現(xiàn)病人血清與布魯氏菌的培養(yǎng) 物可發(fā)生凝集反應(yīng)，稱為Wright凝集反應(yīng)，從而建立了迄今仍用的血清學(xué)診斷方法。我國 古代醫(yī)籍中對本病雖有描述，但直到1905年Boone于重慶對本病作正式報道。目前該病在 世界分布，只有幾個國家消滅此病，而在中國的東北，華北，西北一帶有流行和分布，其它地 區(qū)有散發(fā)，且日益廣泛和危害嚴重。對畜牧業(yè)和人類來嚴重經(jīng)濟損失。布魯氏菌是一類革蘭陰性的短小桿菌，內(nèi)毒素是重要的致病物質(zhì)。布魯氏菌有強侵襲力，細菌可通過完整皮膚和粘膜進入宿主。布魯氏菌有6個生物型，我國流行的是羊布 魯氏菌，牛布魯氏菌和豬布魯氏菌三種，其中以羊布魯氏菌最常見。自然情況下，有60多種 動物可感染布魯氏菌，其主要是山羊，綿羊，牛和豬，以流產(chǎn)為主，孕期動物最為宜感。人類 對布魯氏菌易感，細菌進入人體后，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，發(fā)熱呈波浪式，如不治療，后果嚴 重。根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點和特征性病變，不難做出布魯氏菌病的初步診斷，但由于在臨床上小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染存在相似的癥狀， 必須借助實驗室診斷技術(shù)才能對布魯氏菌病進行最后確診。為了建立適合本病診斷和流行 病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準確的方法，國內(nèi)外許多學(xué)者進行了大量研究，并取得了顯著 的成績。先后建立了病原鑒定、熒光抗體中和檢等檢測方法。我國目前應(yīng)用虎紅和試管凝 集的方法，它們的敏感性及特異性差，是國際貿(mào)易淘汰的技術(shù)，且反應(yīng)時間較長，與我國實 際檢測普查工作需求存在一定的矛盾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種價格適中，反應(yīng)時間短，與我國實際檢測普查工作需 求密切結(jié)合的布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的它是利用平滑型布氏桿菌與粗糙型布氏桿菌的純化 脂多糖混合物作抗原包被酶標板，用S1119. 3免疫健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性 血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，以酶標記的與哺乳動物Fc段結(jié)合的受體一蛋 白質(zhì)AG作酶標記結(jié)合物，配以血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液Β、Η202、終止液，組 裝組成。本發(fā)明還有以下技術(shù)特征所述的抗原包被酶標板制備方法如下(1)菌種制作抗原用菌種分別為B. abortus Sl 119. 3 和 B. abortus RB51 ；B. abortus S1119. 3株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C經(jīng)48小時孵育始能長出透明的、無色或淺黃色、邊 緣光滑的菌落，菌落直徑l_2mm ；B. abortus RB51株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C經(jīng)48小時 孵育始能長出透明度低、邊緣粗燥、表面干燥的菌落，在折射光下呈暗白或黃色，菌 落直徑 l-2mm ；(2)抗原一級種子制備及鑒定將凍干B. abortus Sl 119. 3株和B. abortusRB51株用等量 滅菌生理鹽水溶解，分別接種馬鈴薯浸液瓊脂斜面，在37°C培養(yǎng)48小時；觀察菌落形態(tài)，分 別選取光滑型和粗糙型培養(yǎng)特性的菌落，移植于含有5%小牛血清和0. 酵母浸液的馬 鈴薯浸液瓊脂扁瓶，接種面向下于37°C溫箱培養(yǎng)72小時，用0. 5%苯酚生理鹽水收獲細菌 培養(yǎng)物，進行生物純度檢驗，合格的作為一級種子，置-20°C保存；二級種子繁殖取兩種菌株一級種子分別接種于馬鈴薯浸液瓊脂37°C培養(yǎng)72小時，收獲細菌培 養(yǎng)物；分別進行形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、變異檢查、純凈檢驗等檢驗；符合 要求的菌種，置2°C 8°C保存；(3)抗原制備菌懸液制備分別將鑒定合格的B. abortus Sl 119. 3株和B. abortus RB51株二級種子接種于 含有5%小牛血清和0. 酵母浸液的馬鈴薯浸液瓊脂的扁瓶中，37°C培養(yǎng)72小時；經(jīng)變異 檢查，將有雜菌污染或生長不典型的扁瓶棄去；吸棄扁瓶中凝集水，每瓶加入含有0.5%苯 酚的生理鹽水20ml，洗下培養(yǎng)物，收集于高壓滅菌好的玻瓶中；將收集好的菌懸液加熱到80°C，維持90分鐘；存于4°C;對滅活菌液應(yīng)進行活性檢驗，37°C溫育10天后不應(yīng)有細菌生 長；(4)抗原提取分別將兩種滅活菌液以3000g離心75分鐘，收集沉淀；將50g濕重細菌加入170ml 雙蒸水，加熱到66 °C，然后加入66 °C的90%苯酚溶液；66 °C持續(xù)攪拌15分鐘，于4°C以 10，OOOg離心15分鐘；用一長管吸棄下層棕紅色的酚相，必要時，用Whatman 1號濾紙過濾 去除大菌體碎片；然后加入500ml含有1 %飽和醋酸鈉的冷甲醇，4°C孵育2小時，IOOOOg離 心10分鐘，棄上清，將沉淀用80ml雙蒸水重懸，18小時后，4°C 10，OOOg離心10分鐘；上清 液于4°C保存；將沉淀懸浮于80ml滅菌蒸餾水，于4°C再攪拌2小時；依上法離心獲上清液， 并與前述上清液混合；隨后，在上清液中加入8g三氯乙酸，室溫攪拌15分鐘后，按10，OOOg 離心15分鐘，棄去沉淀，上清液以蒸餾水透析過夜，換液2次(每一次至少4000毫升)，然 后將透析袋內(nèi)容物_粗抗原凍干；(5)抗原包被板抗原包被板的制備包被無菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的體積，按1 5 的比例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0.05M pH9.6的碳酸緩沖液按1 1000稀釋，以 100 μ 1/孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加蓋于4°C溫孵18小時；洗滌以0. 01mol/l pH值為7. 2的PBST (見5洗滌液)作洗滌液，加入足量室溫 作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止；封閉用含0. 牛血清白蛋白的O.Olmol/1 pH值為6. 3的PBST(見4血清稀釋 液)按IOOul/孔，加入至酶標板中，37°C作用1小時，甩去，加入足量洗滌液，室溫作用3分 鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止，自然干燥。所述的陽性對照血清、弱陽性血清制備方法如下(1)陽性對照血清的制備制造用動物制備陽性對照血清的牛需要經(jīng)過實驗室檢測，必須是18月齡性成熟、 健康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染、以及無繁殖系統(tǒng)感 染等抗體陰性的健康牛。觀察一周；免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37°C培養(yǎng)48小時， 待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含0.5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗 下，傾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為0. 2%，置37°C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗 按中國獸藥典進行合格，于4°C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做10倍 稀釋，用作免疫原。于2°C 8°C冰箱保存?zhèn)溆?；免疫程序用免疫原?ml/點分4點肌肉注射，免疫動物，14日后，同法免疫一次， 再14日后采血，分離血清，用ELISA檢測。血清OD45tlnm和陰性血清OD45tlnm的比值(P/N) > 1方可大量采血。如檢驗不合格，應(yīng)再加強免疫一次；血清制造強陽性血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清，將其作為待檢血清，用血清稀釋
液作1 2，1 4......1 126稀釋，用質(zhì)控強陽性血清作參照進行ELISA試驗，取待檢
血清OD45tlnm/質(zhì)控強陽性血清OD45tlnm值=1時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清稀釋液對血清進行稀釋；弱陽性血清制造將強陽性血清用血清稀釋液作1 1.5稀釋；除菌與分裝將血清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為 0. 02 %以防腐，然后無菌條件下定量分裝、凍干。所述的陰性對照血清的制備方法如下制造用動物同陽性對照血清制造用動物，觀察一周；血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清；血清處理與分裝將血清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳 汞和慶大霉素使其終濃度均為0. 02%以防腐，然后無菌條件下定量分裝，貼上標簽。所述的酶標記的與哺乳類動物Fc結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG的制備方法如下用 pH7.2，PBS溶液作為酶結(jié)合物稀釋液，按0.5mg/ml稀釋酶標記結(jié)合物。過濾除菌。將酶標 結(jié)合物用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均 為0. 02%以防腐。分裝凍干無菌條件下按0. 2ml/瓶分裝酶標結(jié)合物。 本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，建立適合布魯氏菌病 診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準確的方法，結(jié)果判定客觀、操作簡便，既適合大 規(guī)模篩選試驗，又能用于布魯氏菌病的最后確診診斷。
具體實施例方式下面對本發(fā)明作進一步說明。實施例1，本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，它是利用平 滑型布氏桿菌與粗糙型布氏桿菌的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標板，用S1119. 3免疫 健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，以酶標 記的與哺乳動物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG作酶標記結(jié)合物，配以血清稀釋液、洗滌液、 底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成。所述的抗原包被酶標板制備方法如下(1)菌種制作抗原用菌種分別為B. abortus Sl 119. 3和B. abortus RB51 ； B. abortus S1119. 3株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C經(jīng)48小時孵育始能長出透明的、無色或 淺黃色、邊緣光滑的菌落，菌落直徑l_2mm ；B. abortus RB51株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C 經(jīng)48小時孵育始能長出透明度低、邊緣粗燥、表面干燥的菌落，在折射光下呈暗白或黃色， 菌落直徑l_2mm ；(2)抗原一級種子制備及鑒定將凍干B. abortus Sl 119. 3株和B. abortus RB51 株用等量滅菌生理鹽水溶解，分別接種馬鈴薯浸液瓊脂斜面，在37°C培養(yǎng)48小時；觀察菌 落形態(tài)，分別選取光滑型和粗糙型培養(yǎng)特性的菌落，移植于含有5%小牛血清和0. 酵母 浸液的馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，接種面向下于37°C溫箱培養(yǎng)72小時，用0. 5%苯酚生理鹽水 收獲細菌培養(yǎng)物，進行生物純度檢驗，合格的作為一級種子，置-20°C保存；二級種子繁殖取兩種菌株一級種子分別接種于馬鈴薯浸液瓊脂37°C培養(yǎng)72小時，收獲細菌培 養(yǎng)物；分別進行形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、變異檢查、純凈檢驗等檢驗；符合 要求的菌種，置2°C 8°C保存；
(3)抗原制備
菌懸液制備分別將鑒定合格的B. abortus Sl 119. 3株和B. abortus RB51株二級 種子接種于含有5%小牛血清和0. 酵母浸液的馬鈴薯浸液瓊脂的扁瓶中，37°C培養(yǎng)72 小時；經(jīng)變異檢查，將有雜菌污染或生長不典型的扁瓶棄去；吸棄扁瓶中凝集水，每瓶加入 含有0. 5%苯酚的生理鹽水20ml，洗下培養(yǎng)物，收集于高壓滅菌好的玻瓶中；將收集好的菌 懸液加熱到80°C，維持90分鐘；存于4°C;對滅活菌液應(yīng)進行活性檢驗，37°C溫育10天后不 應(yīng)有細菌生長；(4)抗原提取分別將兩種滅活菌液以3000g離心75分鐘，收集沉淀；將50g濕重 細菌加入170ml雙蒸水，加熱到66°C，然后加入66°C的90%苯酚溶液；66°C持續(xù)攪拌15分 鐘，于4°C以10，OOOg離心15分鐘；用一長管吸棄下層棕紅色的酚相，必要時，用Whatman 1 號濾紙過濾去除大菌體碎片；然后加入500ml含有飽和醋酸鈉的冷甲醇，4°C孵育2小 時，IOOOOg離心10分鐘，棄上清，將沉淀用80ml雙蒸水重懸，18小時后，4°C 10，OOOg離心 10分鐘；上清液于4°C保存；將沉淀懸浮于80ml滅菌蒸餾水，于4°C再攪拌2小時；依上法 離心獲上清液，并與前述上清液混合；隨后，在上清液中加入8g三氯乙酸，室溫攪拌15分鐘 后，按10，OOOg離心15分鐘，棄去沉淀，上清液以蒸餾水透析過夜，換液2次(每一次至少 4000毫升)，然后將透析袋內(nèi)容物_粗抗原凍干；(5)抗原包被板抗原包被板的制備包被無菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍 干前的體積，按1 5的比例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0.05M pH9.6的碳酸緩沖液按 1 1000稀釋，以100μ 1/孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加蓋于4°C溫 孵18小時；洗滌以0. 01mol/l pH值為7. 2的PBST (見5洗滌液)作洗滌液，加入足量室溫 作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止；封閉用含0. 牛血清白蛋白的O.Olmol/1 pH值為6. 3的PBST(見4血清稀釋 液)按IOOul/孔，加入至酶標板中，37°C作用1小時，甩去，加入足量洗滌液，室溫作用3分 鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止，自然干燥。所述的陽性對照血清、弱陽性血清制備方法如下(1)陽性對照血清的制備制造用動物制備陽性對照血清的牛需要經(jīng)過實驗室檢測，必須是18月齡性成熟、 健康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染、以及無繁殖系統(tǒng)感 染等抗體陰性的健康牛。觀察一周；免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37°C培養(yǎng)48小時， 待形成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含0.5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗 下，傾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為0. 2%，置37°C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗 按中國獸藥典進行合格，于4°C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做10倍 稀釋，用作免疫原。于2°C 8°C冰箱保存?zhèn)溆?；免疫程序用免疫原?ml/點分4點肌肉注射，免疫動物，14日后，同法免疫一次， 再14日后采血，分離血清，用ELISA檢測。血清OD45tlnm和陰性血清OD45tlnm的比值(P/N) > 1方可大量采血。
如檢驗不合格，應(yīng)再加強免疫一次；血清制造強陽性血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清，將其作為待檢血清，用血清稀釋
液作1 2，1 4......1 126稀釋，用質(zhì)控強陽性血清作參照進行ELISA試驗，取待檢
血清OD45tlnm/質(zhì)控強陽性血清OD45tlnm值=1時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清 稀釋液對血清進行稀釋；弱陽性血清制造將強陽性血清用血清稀釋液作1 1.5稀釋；除菌與分裝將血 清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為 0. 02 %以防腐，然后無菌條件下定量分裝、凍干。所述的陰性對照血清的制備方法如下制造用動物同陽性對照血清制造用動物，觀察一周；血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清；血清處理與分裝將血清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳 汞和慶大霉素使其終濃度均為0. 02%以防腐，然后無菌條件下定量分裝，貼上標簽。所述的酶標記的與哺乳類動物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG的制備方法如下用 pH7.2，PBS溶液作為酶結(jié)合物稀釋液，按0.5mg/ml稀釋酶標記結(jié)合物。過濾除菌。將酶標 結(jié)合物用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均 為0. 02%以防腐。分裝凍干無菌條件下按0. 2ml/瓶分裝酶標結(jié)合物。所述的血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液的制備方法如 下(1)血清稀釋液為0. 05M碳酸溶液碳酸鈉1. 93克；碳酸氫鈉3. 80克；加蒸餾水至1000毫升，pH9. 6，10磅高壓15分 鐘；1 % 的 BSA 溶液取PBST溶液1000毫升，加BSA 10克。調(diào)pH值7. 0，過濾除菌；(2)洗滌液為10倍洗液氯化鈉，8克；磷酸二氫鉀，0. 2克；磷酸氫二鈉(12Η20)，6· 29克；加蒸餾水至100 毫升，加0. 5毫升吐溫20。調(diào)pH值7. 2，10磅高壓15分鐘；10倍樣品稀釋液氯化鈉，8. 5克；磷酸二氫鉀，0. 2克；磷酸氫二鈉(12H20)，6. 29克；0. 5毫升吐溫 20，EDTA, 5. 7克，加蒸餾水至100毫升，ρΗ6· 3，10磅高壓15分鐘；(3)底物溶液為10倍底物溶液A取檸檬酸4. 2g，醋酸鈉13. 5g，過氧化尿0. 5g，加去離子水100ml，調(diào)pH值4. 0，過 濾除菌；(4)底物溶液B取TMB 0. 2192g，二甲基亞砜20ml，室溫下溶解；(5) H2O2 液由美國VWR公司生產(chǎn)，0. 2ml/瓶分裝于黑瓶，密封瓶口，粘貼標簽；(6) 10倍終止液 取55. 6毫升98%的濃硫酸加入80毫升水中，調(diào)至總體積100毫升。
實施例2，就本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的有關(guān)問 題說明如下。1菌種選擇布魯氏菌牛型SI 119. 3是傳統(tǒng)的提取抗原的菌株。它來源于美國USDA，因SI 119. 3 不易轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?，是國際動物衛(wèi)生組織(0IE)認可的提取平滑型細菌脂多糖的菌株。 RB51是牛布魯氏菌粗糙型的變異菌株，作為一種牛布魯氏菌疫苗株，也是國際通用提取粗 糙型細菌脂多糖的菌株。用兩種細菌脂多糖的混和物作抗原檢測布魯氏菌病抗體，目的是 為了能夠檢測所有血清型布魯氏菌抗體，提高檢測試劑盒的檢出率，避免漏檢。2抗原制備2. 1細菌繁殖盡管布魯氏菌在我國劃為二類病原，但由于是人畜共患病原，所有活 菌的繁殖與檢定工作均在P3實驗室內(nèi)進行。2. 2細菌滅活方式出于生物安全性考慮，除活菌操作外，其他工作可在P2級實驗 室進行。滅活檢驗效果表明，布魯氏菌RB51和S1119.3的0.5%苯酚生理鹽水洗液80°C維 持90分鐘，能夠有效殺死細菌，并對脂多糖提取沒有影響。2. 3純化、濃縮抗原的純度是保證試劑盒特異性的關(guān)鍵指標。為提高脂多糖的純 度，利用布魯氏菌脂多糖能特異性地存在于有機相苯酚的特性，采用將醋酸鈉甲醛溶液沉 淀脂多糖抗原，再用水透析，從而獲得純化、濃縮的抗原。2. 4效價測定提純抗原為用于包被酶標板，需用抗脂多糖的單克隆抗體測定抗原 效價，根據(jù)試驗研究，因為單克隆抗體識別單一抗原位點的專一性，按生產(chǎn)規(guī)程制備的抗原 純度基本符合試劑盒要求，但每批抗原的制造過程中LPS的量不是確定不變的，所以每批 抗原均需進行效價測定。使用經(jīng)過標定的單克隆抗體，在抗原量足夠時，其0D應(yīng)為1. 5 2. 0，這個顯色區(qū)間是ELISA最敏感，抗原量稍有變化，其0D即迅速變化，抗原量小于標準 時，0D值可能偏低，試驗不靈敏，0D值偏高(大于3. 0)，可能會出現(xiàn)超出酶標儀的檢測范圍。3酶標結(jié)合物為克服傳統(tǒng)間接ELISA方法酶標二抗宿主的單一性問題，采用酶標記物蛋白質(zhì)AG 作為均一的酶標二抗且與所有哺乳類動物抗體的Fc段結(jié)合。4陰性對照血清和陽性對照血清陽性對照血清是試劑盒中驗證ELISA試驗操作是否正確，反應(yīng)是否特異的一個重 要成分，也是反應(yīng)該試劑盒是否工作的指標。為降低對照血清的非特異性，制備陰性對照血 清和陽性對照血清的動物均需進行布魯氏菌抗體、小腸結(jié)腸炎耶氏菌抗體、乙型副傷寒桿 菌抗體，大腸桿菌0:157抗體檢驗，并且檢測陰性。用大劑量滅活布魯氏菌多次免疫的方法制備陽性血清。動物首次免疫10天后開 始產(chǎn)生抗體，隨著多次免疫刺激，其抗體水平在第二次免疫后20天左右達到高峰，持續(xù)時 間達半年左右；確診為自然感染布魯氏菌動物的血清經(jīng)無菌過濾后也可用作陽性對照血清，但必 須經(jīng)質(zhì)控血清進行標定。根據(jù)動物布魯氏菌病抗體間接ELISA試驗的靈敏性試驗研究，陽性對照血清對單 抗的陽性率接近100% P，基本上完全顯色。陰性對照血清對單抗沒有競爭抑制，由于血清 的影響，在間接ELISA實驗中其0D值就略大于空白對照。
5關(guān)于臨界值(cut off)確定陰陽性限值是決定檢測結(jié)果準確性非常重要的指 標。理論上檢測限應(yīng)為檢測大量的陰性血清樣品，進行陽性百分率分布研究，以排除非特異 性反應(yīng)影響特異性，但在實際工作上，難以得到大量的確定陰性樣品，只能通過和其他的檢 測試劑進行比對來確定。本研究實驗中，應(yīng)用研制的間接ELISA試劑盒檢測30份布魯氏菌病陰性血清，53 份免疫動物布魯氏菌感染血清及免疫血清，應(yīng)用國際上0IE已確認準確性的間接ELISA試 劑盒檢測結(jié)果進行比對，30份確定陰性樣品其陽性百分率均在20%以下，因此，確定檢測 限即臨界值為20% P(陽性百分率)。6試劑盒的特異性特異性是確定診斷結(jié)果準確與否的重要指標之一。為驗證其特 異性，用0IE標準陽性血清、標準陰性血清、陰性參考血清、人工感染血清、免疫血清檢測， 陰性檢出率為100%。用乙型副傷寒桿菌、小 腸結(jié)腸炎耶氏菌、大腸桿菌0:157陰、陽性血 清進行檢測，克服交叉反應(yīng)的特異性達96. 5%0試驗結(jié)果表明，動物布魯氏菌病間接ELISA 抗體檢測試劑盒具有較高的特異性。在實際應(yīng)用時和對每批產(chǎn)品進行檢測時不可能也沒有必要對所有病進行檢測，所 以在制訂特異性標準時只對與小腸結(jié)腸炎耶氏菌陽性血清、乙型副傷寒桿菌陽性血清，大 腸桿菌0:157陽性血清，疫苗型抗體，0IE標準陽性和標準陰性血清進行檢驗驗證。7試劑盒的敏感性由于我國大規(guī)模強制免疫動物，畜群中存在免疫抗體，從而使得一般血清學(xué)檢測 方法很難區(qū)分診斷。ELISA是目前檢測抗布魯氏菌病抗體最敏感的方法之一，但在實際檢測 普查等工作中我們急需一種可以應(yīng)用于田間、敏感、交叉反應(yīng)小又盡量避免免疫抗體干擾 的篩選檢測方法。研究過程中選用人工布魯氏菌攻毒血清37份，0IE標準陽性血清16份，0IE標準 陰性血清8份，免疫疫苗陽性血清5份分別用動物布魯氏菌間接ELISA試劑盒進行了檢測， 結(jié)果51份布魯氏菌病陽性血清為陽性，敏感性為96. 23% (51/53)。8關(guān)于用法與判定試驗方法與試驗結(jié)果密切相關(guān)，正確的操作和恰當?shù)呐卸ú拍?得出正確的結(jié)果，ELISA是非常敏感的檢測方法，往往因為實驗操作不當造成檢測結(jié)果差異 很大，因此對用法與結(jié)果判定方法也做出具體規(guī)定試劑盒在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，因冰冷 的診斷試劑加入到酶標板上需要時間才能使反應(yīng)條件達到18 28°C，這樣就造成實際反 應(yīng)時間不足，影響抗原抗體結(jié)合。在洗板機操作條件下，4次洗板就足夠。結(jié)果計算中，設(shè)計 了兩個陰陽性及空白對照以計算平均值，檢測試驗的準確性。陽性百分率的計算方法為國 際上通用的計算方法。9關(guān)于注意事項因為ELISA檢測試劑盒中的成分均為生物活性成分，其中的抗體 等又都是蛋白成分，在室溫下及頻繁升降溫能夠造成蛋白變性從而影響試劑盒的檢測效 果，所以必須按要求存放使用；另外，試劑盒中的顯色劑及終止液均含有對人有害的化學(xué)物 質(zhì)，實驗中應(yīng)避免皮膚接觸。10關(guān)于穩(wěn)定性、貯存和有效期在進行保存期研究時，布魯氏菌病抗體I-ELISA檢 測試劑盒后分別放置在2 8°C和室溫，每隔1個月取幾條包被好的酶標板條進行檢驗，結(jié) 果表明檢測試劑盒在2 8°C保存12個月，室溫保存至少4個月，其物理性狀，檢測特異性 及靈敏性均不受影響。因此將保存期暫定為2 8°C保存，有效期1年。
實施例3，診斷布魯氏菌病的初級結(jié)合試驗，包括熒光偏振檢測和酶聯(lián)免疫吸附試 驗。熒光偏振法是一種均相法，不需要除去未結(jié)合試劑，操作速度快，兩分鐘便得到結(jié)果，可 以消除一些疫苗反應(yīng)。它既可以用于實驗室檢測，也可以運用于牧場和野外，適合野生動物 布魯氏菌病的檢測。FPA的敏感性高，是優(yōu)秀的篩選試驗。價格相對低廉，準確度與其它的 初級結(jié)合試驗一樣。這種類型的測定，也適合自動化。它的原理是測量分子反應(yīng)率變化，這 種改變是由于在試驗樣品中抗體與可溶性抗原反應(yīng)引起。如果抗體結(jié)合抗原，抗原的旋轉(zhuǎn) 率將下降，則可測量這種反應(yīng)。FPA的基本原理是分子在溶液中旋轉(zhuǎn)隨機利率與其大小成反 比(小分子旋轉(zhuǎn)快速，較大的分子更慢)。如果一個小分子通過依附在一個更大的分子上使 其變大，就可以測量小分子的旋轉(zhuǎn)速度變化。FPA使用的是通過水解特異多糖再標記熒光制 備的抗原。這種分子的平均相對分子質(zhì)量為22kD，使其遠小于分子量為160kD的抗體分子 (如IgG抗體)。FPA的操作方法中，可在玻璃管或96孔板內(nèi)稀釋血清、血液或牛奶后，使用 FPA分析儀去掉本底的熒光讀數(shù)。這個讀數(shù)被存儲并且在以后的讀值中減去它。FPA分析 儀通過偏振光通過特定的角度測量分子的轉(zhuǎn)動速度。然后加入熒光標記的特異多糖抗原， 混合后，孵育2分鐘(血清或牛奶；全血孵育15秒)，最后用分析儀讀取最終數(shù)值。如果在 被驗樣品有抗體，抗原分子的旋轉(zhuǎn)時間增加，導(dǎo)致較高的毫偏振單位(mP)讀數(shù)。毫偏振單 位(mP)讀數(shù)的大小與抗體存在的數(shù)量成比例。兩種類型的酶聯(lián)免疫吸附試驗用于對抗體的檢測。它們是間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 和競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗，以抗體結(jié)合在固相上，用一種能與所選 擇的或所有同種型的抗體結(jié)合的酶標記試劑的反應(yīng)。因為疫苗抗體也可能用這個法檢測 到，所以它主要是用來作為篩選試驗。它有幾個優(yōu)點，包括自動化、商業(yè)供貨、準確性、相對 短的檢驗時間、相對便宜等適應(yīng)性。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(IELISA)用于檢測平滑或粗糙 型布魯氏菌產(chǎn)生的抗體，可用于大部分哺乳動物。此檢驗法可在90分鐘內(nèi)完成也可作為優(yōu) 秀的篩選試驗，用于實驗室檢測。它的敏感性最高，主要有于布魯氏菌菌病的消除計劃?？焖匍g接酶聯(lián)免疫吸附試驗(RIELISA)，用于檢測平滑或粗糙型布魯氏菌產(chǎn)生的 抗體，可用于大部分哺乳動物。此檢驗法可在15分鐘內(nèi)完成可作為優(yōu)秀的篩選試驗，最大 優(yōu)點是可以在牧場、田間操作、快捷。奶液間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(MIELISA)，用于檢測反芻動物奶水內(nèi)的布魯氏菌抗 體，此常規(guī)檢測法可測出平滑型布魯氏菌在牛羊奶內(nèi)的抗體。耗時90分鐘，為作為混合奶 樣品的篩選試驗。因為檢測動物的奶液可以用于布魯氏菌病的監(jiān)測，同時也減少了對產(chǎn)奶 動物的刺激。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗使用單克隆抗體與檢驗樣品中的抗體競爭。它不僅具有間 接酶聯(lián)免疫吸附試驗屬性，且有選擇合適的親和力競爭抗體用以消除由于疫苗和交叉反應(yīng) 的抗體引起的血清學(xué)反應(yīng)。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(CELISA)，用于檢測平滑型布魯氏菌產(chǎn) 生的抗體，適用于人和幾乎全部動物。此檢測法以高敏感度的單克隆抗體為基礎(chǔ)，是很好的 最后布魯氏菌病的確診試驗，也是用于區(qū)分疫苗免疫和野毒感染的唯一方法。
權(quán)利要求
一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于它是利用平滑型布氏桿菌與粗糙型布氏桿菌的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標板，用S1119.3免疫健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，以酶標記的與哺乳動物Fc段結(jié)合的受體--蛋白質(zhì)AG作酶標記結(jié)合物，配以血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其 特征在于所述的抗原包被酶標板制備方法如下(1)菌種制作抗原用菌種分別為 B. abortus Sl 119. 3 和 B. abortus RB51 ；B. abortus S1119. 3 株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C經(jīng)48小時孵育始能長出透明的、無色或淺黃色、邊緣光滑的 菌落，菌落直徑l_2mm ；B. abortus RB51株在馬鈴薯浸液瓊脂上，37°C經(jīng)48小時孵育始能長 出透明度低、邊緣粗燥、表面干燥的菌落，在折射光下呈暗白或黃色，菌落直徑l_2mm ；(2)抗原一級種子制備及鑒定將凍干B. abortus Sl 119. 3株和B. abortusRB51株用等量滅菌 生理鹽水溶解，分別接種馬鈴薯浸液瓊脂斜面，在37°C培養(yǎng)48小時；觀察菌落形態(tài)，分別選 取光滑型和粗糙型培養(yǎng)特性的菌落，移植于含有5%小牛血清和0. 酵母浸液的馬鈴薯 浸液瓊脂扁瓶，接種面向下于37°C溫箱培養(yǎng)72小時，用0. 5%苯酚生理鹽水收獲細菌培養(yǎng) 物，進行生物純度檢驗，合格的作為一級種子，置-20°C保存；二級種子繁殖取兩種菌株一級種子分別接種于馬鈴薯浸液瓊脂37°C培養(yǎng)72小時，收獲細菌培養(yǎng)物； 分別進行形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、變異檢查、純凈檢驗等檢驗；符合要求的 菌種，置2°C 8°C保存；(3)抗原制備菌懸液制備分別將鑒定合格的B. abortus Sl 119. 3株和B. abortus RB51株二級種子接種于含 有5%小牛血清和0. 酵母浸液的馬鈴薯浸液瓊脂的扁瓶中，37°C培養(yǎng)72小時；經(jīng)變異 檢查，將有雜菌污染或生長不典型的扁瓶棄去；吸棄扁瓶中凝集水，每瓶加入含有0.5%苯 酚的生理鹽水20ml，洗下培養(yǎng)物，收集于高壓滅菌好的玻瓶中；將收集好的菌懸液加熱到 80°C，維持90分鐘；存于4°C;對滅活菌液應(yīng)進行活性檢驗，37°C溫育10天后不應(yīng)有細菌生 長；(4)抗原提取分別將兩種滅活菌液以3000g離心75分鐘，收集沉淀；將50g濕重細菌加入170ml雙蒸 水，加熱到66°C，然后加入66°C的90%苯酚溶液；66°C持續(xù)攪拌15分鐘，于4°C以10，OOOg 離心15分鐘；用一長管吸棄下層棕紅色的酚相，必要時，用Whatman 1號濾紙過濾去除大菌 體碎片；然后加入500ml含有飽和醋酸鈉的冷甲醇，4°C孵育2小時，IOOOOg離心10分 鐘，棄上清，將沉淀用80ml雙蒸水重懸，18小時后，4°C 10，000g離心10分鐘；上清液于4°C 保存；將沉淀懸浮于80ml滅菌蒸餾水，于4°C再攪拌2小時；依上法離心獲上清液，并與前 述上清液混合；隨后，在上清液中加入8g三氯乙酸，室溫攪拌15分鐘后，按10，OOOg離心 15分鐘，棄去沉淀，上清液以蒸餾水透析過夜，換液2次(每一次至少4000毫升)，然后將透析袋內(nèi)容物-粗抗原凍干； (5)抗原包被板 抗原包被板的制備包被無菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的體積，按1 5的比 例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0. 05M pH9. 6的碳酸緩沖液按1 1000稀釋，以100 μ 1/ 孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加蓋于4°C溫孵18小時；洗滌以0. Olmol/1 pH值為7. 2的PBST (見5洗滌液)作洗滌液，加入足量室溫作用 3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止；封閉用含0. 牛血清白蛋白的0. Olmol/1 pH值為6. 3的PBST(見4血清稀釋液) 按IOOul/孔，加入至酶標板中，37°C作用1小時，甩去，加入足量洗滌液，室溫作用3分鐘后 甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機重復(fù)洗3次，拍干至無水印為止，自然干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其 特征在于所述的陽性對照血清、弱陽性血清制備方法如下(1)陽性對照血清的制備制造用動物制備陽性對照血清的牛需要經(jīng)過實驗室檢測，必須是18月齡性成熟、健 康牛，無小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染、以及無繁殖系統(tǒng)感染 等抗體陰性的健康牛，觀察一周；免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37°C培養(yǎng)48小時，待形 成一層菌落時，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含0. 5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾 入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為0.2%，置37°C振蕩滅活48小時，經(jīng)無菌檢驗按中國 獸藥典進行合格，于4°C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做10倍稀釋， 用作免疫原，于2°C 8°C冰箱保存?zhèn)溆?；免疫程序用免疫原?ml/點分4點肌肉注射，免疫動物，14日后，同法免疫一次，再 14日后采血，分離血清，用ELISA檢測；血清OD45tlnm和陰性血清OD45tlnm的比值(P/N) > 1方 可大量采血；如檢驗不合格，應(yīng)再加強免疫一次； 血清制造強陽性血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清，將其作為待檢血清，用血清稀釋液作1 2,1 4......1 126稀釋，用質(zhì)控強陽性血清作參照進行ELISA試驗，取待檢血清OD45tlnm/質(zhì)控強陽性血清OD45tlnm值=1時的待檢血清稀釋度作為血清稀釋倍數(shù)，用血清稀釋 液對血清進行稀釋；弱陽性血清制造將強陽性血清用血清稀釋液作1 1.5稀釋；除菌與分裝將血清用 0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為0. 02% 以防腐，然后無菌條件下定量分裝、凍干； 所述的陰性對照血清的制備方法如下 制造用動物同陽性對照血清制造用動物，觀察一周； 血清制造以常規(guī)方法采血，分離其血清；血清處理與分裝將血清用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和 慶大霉素使其終濃度均為0. 02%以防腐，然后無菌條件下定量分裝，貼上標簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標記的與哺乳類動物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG的制備方法如下用pH7. 2，PBS溶液作為酶結(jié)合物稀釋液，按0. 5mg/ml稀釋酶標記結(jié)合物，過濾除菌；將酶標結(jié)合物用0. 45 μ m的濾器進行抽濾除菌，無菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃 度均為0. 02%以防腐；分裝凍干，無菌條件下按0. 2ml/瓶分裝酶標結(jié)合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種價格適中，反應(yīng)時間短，與我國實際檢測普查工作需求密切結(jié)合的布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒。它是利用平滑型布氏桿菌與粗糙型布氏桿菌的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標板，用S1119.3免疫健康牛制備陽性對照血清、標準弱陽性血清，用健康非免疫牛血清作陰性對照血清，以酶標記的與哺乳動物Fc段結(jié)合的受體--蛋白質(zhì)AG作酶標記結(jié)合物，配以血清稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成。本發(fā)明建立適合布魯氏菌病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準確的方法；結(jié)果判定客觀、操作簡便，既適合大規(guī)模篩選試驗，又能用于布魯氏菌病的最后的確診診斷。
文檔編號G01N33/535GK101799470SQ20091007163
公開日2010年8月11日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者張曉艷 申請人:張曉艷