專利名稱：布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢驗(yàn)方法，具體說(shuō)就是布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒。
(二)
背景技術(shù)：
免疫學(xué)檢測(cè)方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測(cè)定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法。隨著學(xué)科間的相互滲透，免疫學(xué)涉及的范圍不斷擴(kuò)大，新的免疫學(xué)檢測(cè)方法層出不窮。免疫學(xué)方法的應(yīng)用范圍亦在日益擴(kuò)大，不僅成為多種臨床疾病診斷的重要方法，也為眾多學(xué)科的研究提供了方便。
抗原與相應(yīng)抗體相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，并在外界條件的影響下呈現(xiàn)某種反應(yīng)現(xiàn)象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗體)檢測(cè)未知抗體(或抗原)。試驗(yàn)所釆用的抗體常存在于血清中，因此又稱之
為血清學(xué)反應(yīng)(serological reaction)?？乖N類繁多，按其物理性狀可分顆粒性和可溶性兩類。前者指細(xì)胞性抗原(包括細(xì)菌抗原)，其制備較為簡(jiǎn)便， 一般用新鮮細(xì)胞以無(wú)菌生理鹽水或磷酸緩沖液洗滌后配成一定濃度。若系細(xì)菌抗原，則取新鮮培養(yǎng)物，經(jīng)集菌作如下處理，H抗原因不耐熱用0. 3% ~0. 5%甲醛處理，0抗原耐熱可加熱IO(TC2h去除H抗原后應(yīng)用?？扇苄钥乖梢允羌?xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核及核膜等細(xì)胞組成部分，也可能是經(jīng)細(xì)胞分泌至體液中的一些可溶性因子。細(xì)胞組成部分常需經(jīng)過(guò)機(jī)械或酶解法等破碎、離心獲得粗制抗原，并通過(guò)選擇性沉淀或?qū)游龅确椒ㄟM(jìn)一步純化。而體液中(如血清等)的可溶性抗原則可直接用生化手段獲得所需成分。有些可溶性抗原僅具有免疫反應(yīng)性，而無(wú)免疫原性，此類抗原尚需與載體偶聯(lián)方可成為完全抗原。
布魯氏菌病(Brucellosis)又稱地中海弛張熱，馬爾他熱，波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病，其臨床特點(diǎn)為長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。1886年英國(guó)軍醫(yī)Bruce在馬爾他島從死于"馬爾他熱"的士兵脾臟中分離出"布魯氏菌"，首次明確了該病的病原體。1897年Wright與其同事發(fā)現(xiàn)病人血清與布魯氏菌的培養(yǎng)物可發(fā)生凝集反應(yīng)，稱為Wright凝集反應(yīng)，從而建
立了迄今仍用的血清學(xué)診斷方法。我國(guó)古代醫(yī)籍中對(duì)本病雖有描述，
但直到1905年Boone于重慶對(duì)本病作正式報(bào)道。目前該病在世界分布，只有幾個(gè)國(guó)家消滅此病，而在中國(guó)的東北，華北，西北一帶有流行和分布，其它地區(qū)有散發(fā)，且日益廣泛和危害嚴(yán)重。對(duì)畜牧業(yè)和人類來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
布魯氏菌是一類革蘭陰性的短小桿菌，內(nèi)毒素是重要的致病物質(zhì)。布魯氏菌有強(qiáng)侵襲力，細(xì)菌可通過(guò)完整皮膚和粘膜進(jìn)入宿主。布魯氏菌有6個(gè)生物型，我國(guó)流行的是羊布魯氏菌，牛布魯氏菌和豬布魯氏菌三種，其中以羊布魯氏菌最常見(jiàn)。自然情況下，有60多種動(dòng)物可感染布魯氏菌，其主要是山羊，綿羊，牛和豬，以流產(chǎn)為主，孕期動(dòng)物最為宜感。人類對(duì)布魯氏菌易感，細(xì)菌進(jìn)入人體后，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，發(fā)熱呈波浪式，如不治療，后果嚴(yán)重。
根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)和特征性病變，不難做出布魯氏菌病的初步診斷，但由于在臨床上小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0: 157感染存在相似的癥狀，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)才能對(duì)布魯氏菌病進(jìn)行最后確診。為了建立適合本病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的方法，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著的成績(jī)。先后建立了病原鑒定、熒光抗體中和檢測(cè)等檢測(cè)方法。然而，我國(guó)目前應(yīng)用的虎紅平板和試管凝集方珠為國(guó)際貿(mào)易淘汰方法，技術(shù)落后，假陽(yáng)性也相對(duì)較高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種滿足我國(guó)動(dòng)物防疫需求的、快速、敏感、特異、穩(wěn)定的布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的它是利用平滑型布氏桿菌(B. abortus S1119. 3)與粗後型布氏桿菌(B. abortus RB51)的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標(biāo)板，用S1119. 3免疫健康牛制備陽(yáng)性對(duì)照奶液，用健康非免疫牛制備陰性對(duì)照奶液，以酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG作酶標(biāo)記結(jié)合物，配以稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、終止液，組裝組成。本發(fā)明還有以下技術(shù)特征
1. 所述的抗原包被酶標(biāo)板的制備方法如下
(1) 包被無(wú)菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的體積，按1: 5的比例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0. 05MpH9. 6的碳酸緩沖液按1:1000稀釋，以100(al/孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加蓋于4匸溫孵18小時(shí)；
(2) 洗滌以0.01mo1/1 pH值為7. 2的PBST作洗滌液，加入足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3次，拍干至無(wú)水印為止；
(3) 封閉用含O. P/。牛奶液白蛋白的0.01mo1/1 pH值為6.3的PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37X:作用l小時(shí)，甩去，加入足量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3次，拍干至無(wú)水印為止，自然干燥；
(4) 包裝將封閉好的抗原包被酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg包裝的干燥劑，用真空包裝機(jī)將抗原包被酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
2. 所述的陽(yáng)性對(duì)照奶液制備方法如下
(1)制造用動(dòng)物制備陽(yáng)性對(duì)照奶液的牛需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，必須是18月齡性成熟、健康牛，無(wú)小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0: 157感染、以及無(wú)繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛。觀察一周；
(2 )免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37'C培養(yǎng)48小時(shí)，待形成一層菌落時(shí)，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含O. 5%苯酴的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為O. 2y。，置37'C振蕩滅活48小時(shí)，按《中國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)合格，于4X:以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO倍稀釋，用作免疫原；于2t: 8'C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (3)免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫懷孕晚期動(dòng)物，14日后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用
7ELISA檢測(cè);奶液OD450nm和陰性奶液OD450nm的比值(P/N) >1方可大量釆奶液；如檢驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；
(4) 陽(yáng)性奶液制造以常規(guī)方法釆血，分離其奶液，將其作為待檢奶液，用奶液稀釋液作l: 2, 1: 4...…l: 128稀釋，用質(zhì)控陽(yáng)性奶液作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢奶液OD450nm/質(zhì)控陽(yáng)性奶液
OD450nm值-l時(shí)的待檢奶液稀釋度作為奶液稀釋倍數(shù)，用奶液稀釋液對(duì)奶液進(jìn)行稀釋；
(5) 除菌與分裝將奶液用0.45jam的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽。
3. 所述的陰性對(duì)照奶液的制備方法如下
(1) 以常規(guī)方法釆集健康動(dòng)物奶液，分離其奶液；
(2) 奶液處理與分裝將奶液用0.45pm的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
4. 所述的酶標(biāo)記結(jié)合物是酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體--蛋白質(zhì)AG，酶標(biāo)記蛋白質(zhì)AG，用pH7. 2，PBS溶液作為酶標(biāo)記結(jié)合物稀釋液，按O. 5mg/ml稀釋酶標(biāo)記結(jié)合物；過(guò)濾除菌；將酶標(biāo)記緒合物用0.45iam的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐；分裝凍干無(wú)菌條件下按O. 2ml/瓶分裝酶標(biāo)記結(jié)合物。
本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，建立適合布魯氏菌病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，滿足我國(guó)動(dòng)物防疫的需求。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1,本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，它是利用平滑型布氏桿菌(B.abortus S1119. 3)與粗糙型布氏桿菌(B. abortus RB51)的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標(biāo)板，用S19疫苗免疫健康牛制備陽(yáng)性對(duì)照奶液，用健康非免疫牛制備陰性對(duì)照奶液，以酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG作酶標(biāo)記結(jié)合物，配以稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、HA、終止液，組裝組成。本發(fā)明還有以下技術(shù)特征
1. 所述的抗原包被酶標(biāo)板的制備方法如下
(1 )包被無(wú)菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮到凍干前的體積，按1:5的比例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0. 05M pH9. 6的碳酸緩沖液按1:1000稀釋，以lOO^il/孔，包被聚苯乙烯96孔板(冊(cè)NC620或同等材料)，加蓋于4'C溫孵18小時(shí)；
(2) 洗滌以0.01mo1/1 pH值為7. 2的'PBST作洗滌液，加入足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3次，拍干至無(wú)水印為止；
(3) 封閉用含O. P/。牛奶液白蛋白的0.01mo1/1 pH值為6. 3的PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37匸作用1小時(shí)，甩去，加入足量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3次，拍干至無(wú)水印為止，自然干燥；
(4) 包裝將封閉好的抗原包被酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg包裝的干燥劑，用真空包裝機(jī)將抗原包被酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
2. 所述的陽(yáng)性對(duì)照奶液制備方法如下
(1)制造用動(dòng)物制備陽(yáng)性對(duì)照奶液的牛需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，必須是18月齡性成熟、健康牛，無(wú)小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0: 157感染、以及無(wú)繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛。觀察一周；
(2 )免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37。C培養(yǎng)48小時(shí)，待形成一層菌落時(shí)，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含O. 5%苯酴的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為O. 2%，置37°。振蕩滅活48小時(shí)，按《中國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)合格，于4。C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO倍稀釋，用作免疫原；于2'C 8'C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (3) 免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫懷孕晚期動(dòng)物，14日后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用ELISA檢測(cè);奶液OD450nm和陰性奶液OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量釆奶液；如檢驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；
(4) 陽(yáng)性奶液制造以常規(guī)方法釆血，分離其奶液，將其作為待檢奶液，用奶液稀釋液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀釋，用質(zhì)控陽(yáng)性奶液作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢奶液OD450nm/質(zhì)控陽(yáng)性奶液OD450nm值4時(shí)的待檢奶液稀釋度作為奶液稀釋倍數(shù)，用奶液稀釋液對(duì)奶液進(jìn)行稀釋；
(5) 除菌與分裝將奶液用0.45jam的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽。
3. 所述的陰性對(duì)照奶液的制備方法如下
(1) 以常規(guī)方法釆集健康動(dòng)物奶液，分離其奶液；
(2) 奶液處理與分裝將奶液用0.45nm的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
4. 所述的酶標(biāo)記結(jié)合物是酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體--蛋白質(zhì)AG;酶標(biāo)記蛋白質(zhì)AG,用pH7. 2，PBS溶液作為酶標(biāo)記結(jié)合物稀釋液，按O. 5mg/ml稀釋酶標(biāo)記結(jié)合物；過(guò)濾除菌；將酶標(biāo)記結(jié)合物用0.45jam的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐；分裝凍干無(wú)菌條件下按O. 2ml/瓶分裝酶標(biāo)記結(jié)合物。
5. 所述的稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、終止液為O. 05M碳酸溶液、r/。的BSA溶液、IO倍洗液(PBST)、 IO倍樣品稀釋液、IO倍底物溶液A、底物溶液B 、 HA液和10倍終止液；所述的O. 05M碳酸溶液制備如下碳酸鈉，1.93克；碳酸氫鈉，3.80克；加蒸餾水至1000亳升，pH 9.6， 10磅高壓15分鐘；
所述的iy。的BSA溶液配制方法是取PBST溶液1000亳升，力口BSA 10克，調(diào)pH值7. 0,過(guò)濾除菌；
所述的10倍洗液(PBST)配制氯化鈉，8克；磷酸二氫鉀，0.2克；磷酸氫二鈉(12H20)， 6. 29克；加蒸餾水至100毫升，力口O. 5毫升吐溫20;調(diào)pH值7.2, 10磅高壓15分鐘；
所述的10倍樣品稀釋液的配制氯化鈉，8. 5克；磷酸二氫鉀，0. 2克；磷酸氫二鈉(12H20)， 6. 29克;0. 5亳升吐溫20， EDTA, 5.7克，加蒸餾水至100亳升，pH6. 3， 10磅高壓15分鐘；
所述的10倍底物溶液A的配制取檸檬酸4. 2g，醋酸鈉13. 5g,加去離子水100ml，調(diào)pH值4. 0,過(guò)濾除菌；1. 2ml/瓶分裝，密封瓶口，粘貼標(biāo)簽；
所述的底物溶液B配制取TMB 0. 2192g， 二甲基亞砜20ml,室溫下溶解；0.5ml/瓶分裝于黑瓶，密封瓶口，粘貼標(biāo)簽；
所述的11202液為0. 3%， 0. 2ml/瓶分裝于黑瓶，密封瓶口 ，粘貼標(biāo)簽；
所述的10倍終止液的配制取55. 6毫升98%的濃硫酸加入80毫升水中，調(diào)至總體積100毫升；1.2亳升/瓶分裝于小瓶，密封瓶口，粘貼標(biāo)簽、批次。
實(shí)施例2，就本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒的有關(guān)問(wèn)題作如下說(shuō)明
1菌種選擇
布魯氏菌牛型S1119. 3是傳統(tǒng)的提取抗原的菌株。它來(lái)源于美國(guó)USDA,因S1119. 3不易轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?，是?guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)認(rèn)可的提取平滑型細(xì)菌脂多糖的菌株。RB51是牛布魯氏菌粗糙型的變異菌株，作為一種牛布魯氏菌疫苗株，也是國(guó)際通用提取粗糙型細(xì)菌脂多糖的菌株。用兩種細(xì)菌脂多糖的混和物作抗原檢測(cè)布魯氏菌病抗體，目的是為了能夠檢測(cè)所有血清型布魯氏菌抗體，提高檢測(cè)試劑盒的檢出率，避免漏檢。2抗原制備
2.1細(xì)菌繁殖盡管布魯氏菌在我國(guó)劃為二類病原，但由于是人畜共患病原，所有活菌的繁殖與檢定工作均在P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
2.2細(xì)菌滅活方式出于生物安全性考慮，除活菌操作外，其他工作可在P2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。滅活檢驗(yàn)效果表明，布魯氏菌RB51和S1119. 3的0. 5。/。苯酚生理鹽水洗液80OC維持90分鐘，能夠有效殺死細(xì)菌，并對(duì)脂多糖提取沒(méi)有影響。
2.3純化、濃縮抗原的純度是保證試劑盒特異性的關(guān)鍵指標(biāo)。為提高脂多糖的純度，利用布魯氏菌脂多糖能特異性地存在于有機(jī)相苯酚的特性，釆用將醋酸鈉甲醛溶液沉淀脂多糖抗原，再用水透析，從而獲得純化、濃縮的抗原。
2.4效價(jià)測(cè)定提純抗原為用于包被酶標(biāo)板，需用抗脂多糖的單克隆抗體測(cè)定抗原效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)研究，因?yàn)閱慰寺】贵w識(shí)別單一抗原位點(diǎn)的專一性，按生產(chǎn)規(guī)程制備的抗原純度基本符合試劑盒要求，但每批抗原的制造過(guò)程中LPS的量不是確定不變的，所以每批抗
原均需進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。使用經(jīng)過(guò)標(biāo)定的單克隆抗體，在抗原量足夠時(shí)，其OD應(yīng)為l. 5~2. 0，這個(gè)顯色區(qū)間是ELISA最敏感，抗原量稍有變化，其OD即迅速變化，抗原量小于標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，OD值可能偏低，試驗(yàn)不靈敏，OD值偏高(大于3.0)，可能會(huì)出現(xiàn)超出酶標(biāo)儀的檢測(cè)范圍。
3酶標(biāo)結(jié)合物
抗哺乳類動(dòng)物Fc受體一蛋白質(zhì)AG為克服傳統(tǒng)間接ELISA方法酶標(biāo)二抗宿主的單一性問(wèn)題，采用酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體-蛋白質(zhì)AG作為均一的酶標(biāo)記物且與所有哺乳類動(dòng)物抗體的Fc段結(jié)合。
4陰性對(duì)照動(dòng)物奶液和陽(yáng)性對(duì)照動(dòng)物奶液
陽(yáng)性對(duì)照奶液是試劑盒中驗(yàn)證ELISA試驗(yàn)操作是否正確、反應(yīng)是否特異的一個(gè)重要成分，也是反應(yīng)試劑盒是否工作的指標(biāo)。為降低對(duì)照奶液的非特異性，制備陰性對(duì)照奶液和陽(yáng)性對(duì)照奶液的動(dòng)物均需進(jìn)行布魯氏菌抗體、小腸結(jié)腸炎耶氏菌抗體、乙型副傷寒桿菌抗體，大
腸桿菌0: 157抗體檢驗(yàn)，并且檢測(cè)陰性。
用大劑量滅活布魯氏菌多次免疫的方法制備陽(yáng)性奶液。動(dòng)物首次
免疫10天后開(kāi)始產(chǎn)生抗體，隨著多次免疫刺激，其抗體水平在第二次免疫后20天左右達(dá)到高峰，持續(xù)時(shí)間達(dá)半年左右；
確診為自然感染布魯氏菌動(dòng)物的奶液經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后也可用作陽(yáng)性對(duì)照血清，但必須經(jīng)質(zhì)控血清進(jìn)行標(biāo)定。
根據(jù)動(dòng)物奶液布魯氏菌病抗體間接ELISA試驗(yàn)的靈敏性試驗(yàn)研究，陽(yáng)性對(duì)照奶液對(duì)單抗的陽(yáng)性率接近10(W(陽(yáng)性百分率)，基本上
完全顯色。陰性對(duì)照奶液對(duì)單抗沒(méi)有竟?fàn)幰种?，由于奶液的影響，在間接ELISA實(shí)驗(yàn)中其OD值就略大于空白對(duì)照。
5關(guān)于臨界值(cutoff )值確定陰陽(yáng)性限值是決定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性非常重要的指標(biāo)。理論上檢測(cè)限應(yīng)為檢測(cè)大量的陰性血清樣品，進(jìn)行陽(yáng)性百分率分布研究，以排除非特異性反應(yīng)影響特異性，但在實(shí)際工作上，難以得到大量的確定陰性樣品，只能通過(guò)和其他的檢測(cè)試劑進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定。
本發(fā)明的研究實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用研制的動(dòng)物奶液布魯氏菌病抗體間接ELISA試劑盒檢測(cè)30份布魯氏菌病陰性奶液，53份免疫動(dòng)物布魯氏菌感染奶液及免疫奶液，應(yīng)用國(guó)際上OIE已確認(rèn)準(zhǔn)確性的動(dòng)物奶液結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，30份確定陰性樣品其陽(yáng)性百分率率均在20%以下。因此，確定檢測(cè)限為20% P (陽(yáng)性百分率)。
6試劑盒的特異性特異性是確定診斷結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要指標(biāo)之一。為驗(yàn)證其特異性，用OIE標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性動(dòng)物奶液、標(biāo)準(zhǔn)陰性奶液、陰性參考奶液、人工感染奶液、免疫奶液檢測(cè)，陰性檢出率為100%。用乙型副傷寒桿菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、大腸桿菌0:157陰、陽(yáng)性奶液進(jìn)行檢測(cè)，克服交叉反應(yīng)的特異性達(dá)96.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)動(dòng)物奶液布魯氏菌病抗體間接ELISA試劑盒具有較高的特異性。
在實(shí)際應(yīng)用時(shí)和對(duì)每批產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)不可能也沒(méi)有必要對(duì)所
13有病進(jìn)行一一檢測(cè)，所以在制訂特異性標(biāo)準(zhǔn)時(shí)只對(duì)與小腸結(jié)腸炎耶氏
菌陽(yáng)性奶液、乙型副傷寒桿菌陽(yáng)性奶液，大腸桿菌O: 157陽(yáng)性奶液，疫苗型抗體，OIE標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和標(biāo)準(zhǔn)陰性奶液進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證。
7試劑盒的敏感性
由于我國(guó)大規(guī)模強(qiáng)制免疫動(dòng)物，畜群中存在免疫抗體，從而使得一般血清學(xué)檢測(cè)方法很難區(qū)分診斷。ELISA是目前檢測(cè)抗布魯氏菌病抗體最敏感的方法之 一 ，但在實(shí)際檢測(cè)普查等工作中急需 一 種可以應(yīng)用于快速，敏感，交叉反應(yīng)小又盡量避免免疫抗體干擾的篩選檢測(cè)方法。
研究過(guò)程中選用人工布魯氏菌攻毒奶液37份，OIE標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性奶液16份，0IE標(biāo)準(zhǔn)陰性奶液8份，免疫疫苗陽(yáng)性奶液5份分別用動(dòng)物奶液布魯氏菌間接ELISA試劑盒進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果51份魯氏菌病陽(yáng)性奶液為陽(yáng)性，敏感性為96. 23% (51/53)。
8關(guān)于用法與判定試驗(yàn)方法與試驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)，正確的操作和恰當(dāng)?shù)呐卸ú拍艿贸稣_的結(jié)果，ELISA是非常敏感的檢測(cè)方法，往往因?yàn)閷?shí)驗(yàn)搡作不當(dāng)造成檢測(cè)結(jié)果差異很大，因此對(duì)用法與結(jié)果判定方法也做出具體規(guī)定試劑盒在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，因冰冷的診斷試劑加入到酶標(biāo)板上需要時(shí)間才能使反應(yīng)條件達(dá)到18 ~ 28QC，這樣就造成實(shí)際反應(yīng)時(shí)間不足，影響抗原抗原結(jié)合。在洗板機(jī)操作條件下，4次洗板就足夠。結(jié)果計(jì)算中，設(shè)計(jì)了兩個(gè)陰陽(yáng)性及空白對(duì)照以計(jì)算平均值，檢測(cè)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。陽(yáng)性百分率的計(jì)算方法為國(guó)際上通用的計(jì)算方法。
9關(guān)于注意事項(xiàng)因?yàn)镋LISA檢測(cè)試劑盒中的成分均為生物活性成分，其中的抗體等又都是蛋白成分，在室溫下及頻繁升降溫能夠造成蛋白變性從而影響試劑盒的檢測(cè)效果，所以必須按要求存放使用；另外，試劑盒中的顯色劑及終止液均含有對(duì)人有害的化學(xué)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)避免皮膚接觸。
10關(guān)于穩(wěn)定性、貯存和有效期布魯氏菌病抗體I-ELISA檢測(cè)試劑盒后分別放置在2 ~ 8QC和室溫，每隔l個(gè)月取幾條包被好的酶標(biāo)板條進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明檢測(cè)試劑盒在2 80C保存12個(gè)月，室溫保存至
少4個(gè)月，其物理性狀，檢測(cè)特異性及靈敏性均不受影響。因此將保存期暫定為2-8i:保存，有效期1年。
實(shí)施例3,診斷布魯氏菌病的初級(jí)結(jié)合試驗(yàn)，包括熒光偏振檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。熒光偏振法是一種均相法，不需要除去未結(jié)合試劑，操作速度快，兩分鐘便得到結(jié)果，可以消除一些疫苗反應(yīng)。它既可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，也可以運(yùn)用于牧場(chǎng)和野外，適合野生動(dòng)物布魯氏菌病的檢測(cè)。FPA的敏感性高，是優(yōu)秀的篩選試驗(yàn)。價(jià)格相對(duì)低廉，準(zhǔn)確度與其它的初級(jí)結(jié)合試驗(yàn)一樣。這種類型的測(cè)定，也適合自動(dòng)化。它的原理是測(cè)量分子反應(yīng)率變化，這種改變是由于在試驗(yàn)樣品中抗體與可溶性抗原反應(yīng)引起。如果抗體結(jié)合抗原，抗原的旋轉(zhuǎn)率將下降，則可測(cè)量這種反應(yīng)。FPA的基本原理是分子在溶液中旋轉(zhuǎn)隨機(jī)利率與其大小成反比(小分子旋轉(zhuǎn)快速，較大的分子更慢)。如果一
個(gè)小分子通過(guò)依附在一個(gè)更大的分子上使其變大，就可以測(cè)量小分子的旋轉(zhuǎn)速度變化。FPA使用的是通過(guò)水解特異多糖再標(biāo)記熒光制備的抗原。這種分子的平均相對(duì)分子質(zhì)量為22kD ，使其遠(yuǎn)小于分子量為160kD的抗體分子(如IgG抗體)。FPA的操作方法中，可在玻璃管或96孔板內(nèi)稀釋血清、血液或牛奶后，使用FPA分析儀去掉本底的熒光讀數(shù)。這個(gè)讀數(shù)被存儲(chǔ)并且在以后的讀值中減去它。FPA分析儀通過(guò)偏振光通過(guò)特定的角度測(cè)量分子的轉(zhuǎn)動(dòng)速度。然后加入熒光標(biāo)記的特異多糖抗原，混合后，孵育2分鐘(血清或牛奶；全血孵育15秒)，最后用分析儀讀取最終數(shù)值。如果在被驗(yàn)樣品有抗體，抗原分子的旋轉(zhuǎn)時(shí)間增加，導(dǎo)致較高的毫偏振單位(mP)讀數(shù)。亳偏振單位(mP)讀數(shù)的大小與抗體存在的數(shù)量成比例。
兩種類型的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于對(duì)抗體的檢測(cè)。它們是間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，以抗體結(jié)合在固相上，用一種能與所選擇的或所有同種型的抗體結(jié)合的酶標(biāo)記試劑的反應(yīng)。因?yàn)橐呙缈贵w也可能用這個(gè)法檢測(cè)到，所以它主要是用來(lái)作為篩選試驗(yàn)。它有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括自動(dòng)化、商業(yè)供貨、準(zhǔn)確性、相對(duì)短的檢驗(yàn)時(shí)間、相對(duì)便宜等適應(yīng)性。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(IELISA)用于檢測(cè)平滑或粗糙型布魯氏菌產(chǎn)生的抗體，可用于大部分哺乳動(dòng)物。此檢驗(yàn)法可在90分鐘內(nèi)完成也可作為優(yōu)秀的篩選 試驗(yàn)，用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。它的敏感性最高，主要有于布魯氏菌菌病的 消除計(jì)劃。
快速間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(RIELISA)，用于檢測(cè)平滑或粗糙型 布魯氏菌產(chǎn)生的抗體，可用于大部分哺乳動(dòng)物。此檢驗(yàn)法可在15分
鐘內(nèi)完成可作為優(yōu)秀的篩選試驗(yàn)，最大優(yōu)點(diǎn)是可以在牧場(chǎng)、田間操作、 快捷。
奶液間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(MIELISA),用于檢測(cè)反芻動(dòng)物奶水 內(nèi)的布魯氏菌抗體，此常規(guī)檢測(cè)法可測(cè)出平滑型布魯氏菌在牛羊奶內(nèi) 的抗體。耗時(shí)90分鐘，為作為混合奶樣品的篩選試驗(yàn)。因?yàn)闄z測(cè)動(dòng) 物的奶液可以用于布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)，同時(shí)也減少了對(duì)產(chǎn)奶動(dòng)物的刺 激。
竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)使用單克隆抗體與檢驗(yàn)樣品中的抗體竟 爭(zhēng)。它不僅具有間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)屬性，且有選擇合適的親和力 竟?fàn)幙贵w用以消除由于疫苗和交叉反應(yīng)的抗體引起的血清學(xué)反應(yīng)。竟 爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(CELISA)，用于檢測(cè)平滑型布魯氏菌產(chǎn)生的抗 體，適用于人和幾乎全部動(dòng)物。此檢測(cè)法以高敏感度的單克隆抗體為 基礎(chǔ)，是很好的最后布魯氏菌病的確診試驗(yàn)，也是用于區(qū)分疫苗免疫 和野毒感染的唯一方法。
權(quán)利要求
1.一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，其特征在于它是利用平滑型布氏桿菌(B.abortus S1119.3)與粗糙型布氏桿菌(B.abortus RB51)的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標(biāo)板，用S1119.3疫苗免疫健康牛制備陽(yáng)性對(duì)照奶液，用健康非免疫牛制備陰性對(duì)照奶液，以酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體--蛋白質(zhì)AG作酶標(biāo)記結(jié)合物，配以稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、終止液，組裝組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的抗原包被酶標(biāo)板的制備 方法如下(l)包被無(wú)菌條件下，將兩種純化的凍干抗原用蒸餾水懸浮 到凍干前的體積，按1: 5的比例混合光滑型與粗糙型抗原，再用0. 05M pH9. 6的碳酸緩沖液按1:1000稀釋，以100|11/孔，包被聚苯乙烯96 孔板(NUNC620或同等材料)，加蓋于4'C溫孵18小時(shí)；(2 )洗滌以0. 01mol/l pH值為7. 2的PBST作洗滌液，加入 足量室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗3次， 拍干至無(wú)水印為止；(3) 封閉用含O. 1%牛奶液白蛋白的0. 01mol/l pH值為6.3的 PBST按100ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37。C作用l小時(shí)，甩去，加入足 量洗滌液，室溫作用3分鐘后甩去，如上重復(fù)3次，或用洗板機(jī)重復(fù)洗 3次，拍干至無(wú)水印為止，自然干燥；(4) 包裝將封閉好的抗原包被酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入lg 包裝的干燥劑，用真空包裝機(jī)將抗原包被酶標(biāo)板包裝好，貼上標(biāo)簽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照奶液制備方法 如下(l)制造用動(dòng)物制備陽(yáng)性對(duì)照奶液的牛需要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，必須是18月齡性成熟、健康牛，無(wú)小腸結(jié)腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0: 157感染、以及無(wú)繁殖系統(tǒng)感染等抗體陰性的健康牛,觀察一周；(2 )免疫原制備將布氏桿菌S1119. 3接種馬鈴薯浸液瓊脂扁瓶，置37。C培養(yǎng)48小時(shí)，待形成一層菌落時(shí)，選取純凈扁瓶，吸棄凝集水，用含0.5%苯酚的滅菌生理鹽水將菌苔洗下，傾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至終濃度為O. 2y。，置37。C振蕩滅活48小時(shí)，按《中國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)合格，于4'C以20000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取沉淀，用生理鹽水做IO倍稀釋，用作免疫原，于2i: 8"C冰箱保存?zhèn)溆茫?3) 免疫程序用免疫原按5ml/點(diǎn)分4點(diǎn)肌肉注射，免疫懷孕晚期動(dòng)物，14曰后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用ELISA檢測(cè)，奶液OD450nm和陰性奶液OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量采奶液，如檢驗(yàn)不合格，應(yīng)再加強(qiáng)免疫一次；(4) 陽(yáng)性奶液制造以常規(guī)方法釆血，分離其奶液，將其作為待檢奶液，用奶液稀釋液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀釋，用質(zhì)控陽(yáng)性奶液作參照進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，取待檢奶液OD450nm/質(zhì)控陽(yáng)性奶液OD450nm值^時(shí)的待檢奶液稀釋度作為奶液稀釋倍數(shù)，用奶液稀釋液對(duì)奶液進(jìn)行稀釋；(5) 除菌與分裝將奶液用0.45pm的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝、凍干，貼上標(biāo)簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陰性對(duì)照奶液的制備方法如下(1) 以常規(guī)方法釆集健康動(dòng)物奶液，分離其奶液；(2) 奶液處理與分裝將奶液用0.45nni的濾器進(jìn)行抽濾除菌，無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐，然后無(wú)菌條件下定量分裝，貼上標(biāo)簽。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記結(jié)合物是酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體一蛋白質(zhì)AG;酶標(biāo)記蛋白質(zhì)AG,用 pH7. 2，PBS溶液作為酶標(biāo)記結(jié)合物稀釋液，按O. 5mg/ml稀釋酶標(biāo)記結(jié) 合物；過(guò)濾除菌；將酶標(biāo)記結(jié)合物用0.45nm的濾器進(jìn)行抽濾除菌， 無(wú)菌條件下加入硫柳汞和慶大霉素使其終濃度均為O. 02%以防腐；分 裝凍干無(wú)菌條件下按0.2ml/瓶分裝酶標(biāo)記結(jié)合物。'
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種滿足我國(guó)動(dòng)物防疫需求的、快速、敏感、特異、穩(wěn)定的布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒。它是利用平滑型布氏桿菌與粗糙型布氏桿菌的純化脂多糖混合物作抗原包被酶標(biāo)板，用免疫健康牛制備陽(yáng)性對(duì)照奶液，用健康非免疫牛制備陰性對(duì)照奶液，以酶標(biāo)記的與哺乳動(dòng)物Fc段結(jié)合的受體——蛋白質(zhì)AG作酶標(biāo)記結(jié)合物，配以稀釋液、洗滌液、底物溶液A、底物溶液B、H₂O₂、終止液，組裝組成。本發(fā)明布魯氏菌病間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)桃嚎贵w檢測(cè)試劑盒，建立適合布魯氏菌病診斷和流行病學(xué)調(diào)查的快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，滿足我國(guó)動(dòng)物防疫的需求。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101592660SQ20091007163
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者張曉艷 申請(qǐng)人:張曉艷