Cdc45l肽及包含它的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及CDC45L肽及包含它的疫苗。具體地，提供了自SEQ?ID?NO:18衍生的分離的肽或片段，其結(jié)合HLA抗原且誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。該肽可包括上述氨基酸序列之一及1、2、或幾處氨基酸序列替換、刪除、或添加。本發(fā)明還提供了包括這些肽的藥物組合物。本發(fā)明的肽可用于治療癌癥。
【專利說明】CDC45L肽及包含它的疫苗
[0001] 本申請是2010年5月25日提交的申請?zhí)枮?01080033325.X，發(fā)明名稱為“CDC45L肽及包含它的疫苗”的中國專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
_2] 優(yōu)先權(quán)
[0003]本申請要求2009年5月26日提交的美國臨時申請N0.61/217，133的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。
[0004]本發(fā)明涉及生物科學領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極其有效的新肽，和用于治療和預防腫瘤的藥物。 【背景技術(shù)】
[0005]肺癌是癌癥的最常見形式，占每年1090萬例癌癥新病例中的135萬例。它還是癌癥相關(guān)疾病所致死亡的首要原因，占全世界670萬癌癥相關(guān)死亡中的118萬(NPLl)。盡管最近系統(tǒng)療法諸如化療和分子靶向療法取得改進，但是晚期肺癌患者的預后仍然很差(NPL2)。在50%的患者中肺癌在手術(shù)后復發(fā)，而且不到25%的患者響應系統(tǒng)化療。因而，迫切需要更加有效的治療模態(tài)，而且免疫療法對于未來的肺癌療法代表一種有希望的辦法(NPL3-5)。
[0006]治療性癌癥疫苗的成功最終可依賴于在腫瘤中相對于正常組織過表達的免疫原性抗原的鑒定。腫瘤相關(guān)抗原(TAA)對細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的有效誘導已顯示出有希望的結(jié)果(NPL6-7)。最近，與基因組信息關(guān)聯(lián)的cDNA微陣列技術(shù)的開發(fā)提供了惡性細胞的基因表達的綜合譜，然后可將其與正常細胞的比較(NPL8)。用cDNA微陣列技術(shù)進行的基因表達譜分析是鑒定可用于癌癥診斷和免疫療法的新TAA的一種有效辦法(NPL9-12)。
[0007]雖然已經(jīng)發(fā)表了在肺癌中表達的幾種候選TAA(NPL13-14)，但是重要的是要鑒定在給定癌癥中過表達的多種TAA以開發(fā)更加有效的T細胞介導的癌癥免疫療法(NPL15)。
[0008]⑶C45L(細胞分裂周期45樣)是一種至關(guān)重要的細胞蛋白質(zhì)，其在DNA復制的啟動和延長二者中發(fā)揮功能，以確保染色體DNA每個細胞周期只復制一次(NPL16-19)。⑶C45L在所有真核生物間高度保守，而且在小鼠中對此基因的靶向破壞引起胚胎致死(NPL20)。在成人中，絕大多數(shù)細胞已經(jīng)分化并停止細胞分裂，而且只有小群細胞在一些自我更新組織中增殖(NPL21)。因此，雖然CDC45L在長期休眠的、終末分化的且衰老的人細胞中不存在，但是它存在于增殖中的癌細胞的整個細胞周期(NPL18)。因而，CDC45L表達與增殖中的細胞群密切相關(guān)，并因此被認定為癌細胞生物學中新增殖標志物的一種有希望的候選(NPL18, 22)。然而，尚未完全調(diào)查⑶C45L作為癌癥免疫療法靶標的有用性。
[0009]弓丨用表
[0010]非專利文獻
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0033]本發(fā)明至少部分基于可充當免疫療法靶標的肽的發(fā)現(xiàn)。由于TAA有時被免疫系統(tǒng)察覺為“自身”并因此常常沒有免疫原性，適宜靶標的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。如上所述，⑶C45L(典型氨基酸序列和基因序列分別顯示于SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 17，而且序列還可得自GenBank登錄號NM_003504)已經(jīng)被鑒定為在癌癥中上調(diào)，所述癌癥的例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。因此，⑶C45L是癌癥/腫瘤免疫療法的候選靶標。
[0034]本發(fā)明進一步涉及⑶C45L基因產(chǎn)物的擁有誘導對⑶C45L特異性的CTL的能力的特定表位肽的鑒定。如下文詳細討論的，使用自⑶C45L衍生的HLA-A*2402或HLA_A*0201結(jié)合性候選肽來刺激從健康供體獲得的外周血單個核細胞(PBMC)。然后建立了具有針對經(jīng)每一種候選肽沖激的HLA-A24或HLA-A2陽性靶細胞的特異性細胞毒性的CTL系。這些結(jié)果證明，這些肽是能誘導針對表達⑶C45L的細胞的強力且特異性的免疫應答的HLA-A24或HLA-A2限制表位肽。另外，結(jié)果指示，CDC45L具有強免疫原性，而且它的表位是癌癥/腫瘤免疫療法的有效靶標。
[0035]因而，本發(fā)明的一個目的是提供分離的結(jié)合HLA抗原的肽，特別是那些自CDC45L(SEQ ID NO: 18)或其免疫學活性片段衍生者。這些肽預期具有CTL誘導能力，并因此可用于離體誘導CTL或用于給受試者施用以誘導針對癌癥的免疫應答，所述癌癥諸如睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、結(jié)腸直腸癌等等。優(yōu)選的肽是九肽或十肽，更優(yōu)選具有選自SEQ ID NO:1至16的氨基酸序列的肽。其中，具有選自SEQ ID NO: 2, 3,4,7和12的氨基酸序列的肽顯示強CTL誘導能力，并因此是最優(yōu)選的。
[0036]本發(fā)明的肽涵蓋其中替換、刪除或添加了 I個、2個或更多個氨基酸的肽，只要所得經(jīng)過修飾的肽保留原始的CTL誘導能力。
[0037]本發(fā)明還提供了分離的編碼本發(fā)明任一種肽的多核苷酸。這些多核苷酸可用于誘導具有CTL誘導能力的APC，并可供施用給受試者以誘導針對癌癥的免疫應答，正如本發(fā)明的肽那樣。
[0038]當對受試者施用時，本發(fā)明的肽優(yōu)選呈遞在APC的表面上，以誘導靶向相應肽的CTL0因而，本發(fā)明的另一個目的是提供誘導CTL的組合物或作用劑，此類組合物或物質(zhì)包括一種或多種本發(fā)明肽或多核苷酸。本發(fā)明進一步涵蓋包括一種或多種本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或作用劑，其配制為用于治療和/或預防癌癥以及防止其手術(shù)后復發(fā)，此類癌癥包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。因此，本發(fā)明還提供了用于治療和/或預防癌癥，和/或防止其手術(shù)后復發(fā)的藥物組合物或作用劑，此類藥物組合物或作用劑包括一種或多種本發(fā)明肽或多核苷酸。作為上述肽或多核苷酸的補充和/或替代，本發(fā)明的藥物組合物或作用劑可任選包括呈遞一種或多種本發(fā)明肽的APC或外來體作為活性組分。
[0039]本發(fā)明的肽和多核苷酸能誘導在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復合物的APC，例如通過使自源自受試者的的APC接觸本發(fā)明肽，或?qū)⒕幋a此類肽的多核苷酸導入APC來實現(xiàn)。此類APC具有針對靶肽的高CTL誘導能力，而且可用于癌癥免疫療法。因此，本發(fā)明涵蓋用于誘導具有CTL誘導能力的APC的方法及通過此類方法獲得的APC。
`[0040]本發(fā)明還提供了用于誘導CTL的方法，其包括共培養(yǎng)⑶8陽性細胞與在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體的步驟?；蛘?，該方法可包括導入如下基因的步驟，該基因包括編碼能與本發(fā)明肽結(jié)合的T細胞受體(TCR)亞基多肽的多核苷酸。通過此類方法獲得的CTL可用于治療和/或預防癌癥，癌癥的例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。因此，本發(fā)明涵蓋通過本發(fā)明方法獲得的CTL。
[0041]本發(fā)明的又一個目的是提供用于在有此需要的受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法，其包括施用包含本發(fā)明CDC45L多肽或其免疫學活性片段、編碼本發(fā)明CDC45L多肽的多核苷酸、或呈遞此類CDC45L多肽的外來體或APC的組合物的步驟。
[0042]具體而言，本發(fā)明提供了下述[1]_[22]:
[0043][I] 一種結(jié)合HLA抗原且具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力的分離的肽，其中該肽衍生自由氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其免疫學活性片段組成的多肽，
[0044][2] [I]的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或A2，
[0045][3] [I]或[2]的分離的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列:
[0046](a) SEQ ID NO: 4，2，3，7 和 12 ;和
[0047](b)SEQ ID NO:4, 2，3，7和12，其中替換、插入、刪除和/或添加1、2、或幾個氨基酸，
[0048][4] [I]至[3]中任一項的分離的肽，其中上述肽具有下列特征之一或二者:
[0049](a)N端起第二個氨基酸為或修飾為選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和
[0050](b) C端氨基酸為或修飾為選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的
氨基酸，
[0051][5] [I]至[3]中任一項的分離的肽，其中上述肽具有下列特征之一或二者:
[0052](a) N端起第二個氨基酸為或修飾為選自亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和
[0053](b) C端氨基酸為或修飾為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸，
[0054][6] [I]至[5]中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽，
[0055][7] 一種分離的多核苷酸，其編碼[I]至[6]中任一項的肽，
[0056][8] 一種用于誘導CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種[I]至[6]中任一項所述的肽或者一種或多 種[7]所述的多核苷酸，
[0057][9] —種用于治療和/或預防癌癥和/或防止其手術(shù)后復發(fā)的藥物組合物，其中該組合物包含一種或多種[I]至[6]中任一項所述的肽或者一種或多種[7]的多核苷酸，
[0058][10] [9]的藥物組合物，其配制為用于對HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的受試者施用，
[0059][11] [9]或[10]的藥物組合物，其配制為用于治療癌癥，
[0060][12] 一種用于誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中該方法包括選自下組的步驟:
[0061](a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸[I]至[6]中任一項的肽；和
[0062](b)將編碼[I]至[6]中任一項的肽的多核苷酸導入APC，
[0063][13] 一種用于誘導CTL的方法，其中該方法包括選自下組的步驟:
[0064](a)共培養(yǎng)⑶8陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與[I]至[6]中任一項的肽的復合物的APC ；
[0065](b)共培養(yǎng)⑶8陽性T細胞中與在其表面上呈遞HLA抗原與[I]至[6]中任一項的肽的復合物的外來體；和
[0066](c)將包含編碼能夠結(jié)合[I]至[6]中任一項的肽的T細胞受體(TCR)亞基多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細胞，
[0067][14] 一種分離的APC，其在其表面上呈遞HLA抗原與[I]至[6]中任一項的肽的復合物，
[0068][15] [14]的APC，其是通過[12]的方法誘導的，
[0069][16] 一種分離的CTL，其靶向[I]至[6]中任一項的肽，
[0070][17] [16]的CTL，其是通過[13]的方法誘導的，
[0071][18] 一種在受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法，其中該方法包括對所述受試者施用包含一種或多種[I]至[6]中任一項的肽、一種或多種其免疫學活性片段、或一種或多種編碼所述肽或片段的多核苷酸的組合物，
[0072][19] 一種抗體或其片段，其針對[I]至[6]中任一項的肽，
[0073][20] 一種載體,其包含編碼[I]至[6]中任一項的肽的核苷酸序列，[0074][21] 一種宿主細胞，其經(jīng)過依照[20]的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，和
[0075][22].—種診斷試劑盒，其包含[I]至[6]中任一項的肽、[7]的核苷酸或[19]的抗體。
[0076]本發(fā)明的適用性延伸至多種涉及或源自⑶C45L過表達的疾病中的任何一種，諸如癌癥，例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0077]在閱讀下面的詳述，結(jié)合所附的圖和實施例之后，本發(fā)明在上文之外的其它目的和特征會變得更加完全顯然。然而，要理解，前面的發(fā)明概述和下面的詳述都是關(guān)于例示性實施方案，而非限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它備選實施方案。特別地，雖然本文中參照一些例示性實施方案描述了本發(fā)明，但是會領(lǐng)會該描述對本發(fā)明的例示而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會想到各種更改和應用，不背離所附權(quán)利要求中描述的本發(fā)明精神和范圍。類似地，根據(jù)此概述和下文描述的某些實施方案，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)點會是明顯的，而且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。根據(jù)上文，結(jié)合所附實施例、數(shù)據(jù)、圖和自其得出的所有合理推論，或者再考慮本文中收錄的參考文獻，此類目的、特征、好處和優(yōu)點會是顯然的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0078] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應用:
[0079][圖1]圖1由一系列照片，A至F構(gòu)成，是描繪人正常組織、癌細胞系和癌組織中表達的⑶C45L mRNA分析的結(jié)果的圖。A，B部分:多種正常組織中表達的⑶C45L mRNA的RT-PCR和Northern印跡分析。C部分:多種癌細胞系中表達的CDC45L mRNA的RT-PCR分析。D部分:肺癌組織和鄰近正常肺組織中表達的⑶C45L mRNA的RT-PCR分析。E部分:自胃癌、肝膽管癌、乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸直腸癌衍生的多種癌細胞系中表達的CDC45L mRNA的RT-PCR分析。F部分:腺癌、鱗癌、小細胞癌、正常肺、睪丸和正常皮膚中表達的⑶C45L蛋白的免疫組織化學分析(原始放大倍數(shù)X400)。陽性染色信號呈棕色。比例尺，50微米。
[0080][圖2]圖2是描繪用于自PBMC誘導⑶C45L特異性CTL的方案的圖。自供體分離PBMC，并分別使用抗CD8單抗或抗CD14單抗包被的微珠自HLA-A24陽性健康供體和肺癌患者的PBMC分離⑶8+T細胞和⑶14+細胞。通過在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)5天，自⑶14+細胞獲得DC。在β 2-微球蛋白存在下將DC用HLA-A24結(jié)合肽于37°C沖激2小時。然后輻照這些將肽沖激的DC，并以1:20的比例與自體⑶8+T細胞混合以生成肽反應性CTL。在第O天在補充有2%自身血清的AM-V中用IL-7培養(yǎng)細胞，并在第2天給這些培養(yǎng)物補充IL-2。在第7天和第14天用經(jīng)肽加載的自體PHA胚細胞(PHA-blasts)再進行兩次每周一次的刺激。在對⑶8+T細胞的第三輪肽刺激后6天實施INF- Y ELI SPOT,⑶107a動員(mobilization)和 51Cr 釋放測定法。
[0081][圖3]圖3由一系列柱狀圖，A至C構(gòu)成，是描繪健康供體中對⑶C45L衍生肽的CTL應答的圖。A，B, C部分:自HLA-A24陽性健康供體的PBMC生成的⑶C45L肽反應性CTL的ELISP0T測定法(A，C，健康供體-1 ；B,健康供體-4)。用自體單核細胞衍生DC刺激⑶8+T細胞(第O天)并用16種候選肽(SEQ ID NO:1至16)中4種的混合物沖激自體PHA胚細胞(第7天和第14天)。在第20天收集CTL，并通過ELISPOT測定法來檢測I生成FN- Y的CTL。柱形指示當用經(jīng)⑶C45L衍生肽(空心柱)或無關(guān)HIV-A24肽(實心柱)沖激的C1R-A2402細胞再刺激CTL系時IFN-Y點的數(shù)目。效應細胞對靶細胞比為10:1。數(shù)據(jù)表示為一式三份測定法的均值+/-SD。為每位供體顯示了代表性具有相似結(jié)果的兩次獨立實驗中的一個代表。
[0082][圖4]圖4由一系列小圖構(gòu)成，是描繪抗原刺激后CD8+T細胞的細胞表面上暴露的CD107a的水平的圖。所有肽以I μ /ml的終濃度使用。顯示的事件是對CD8+T細胞設門的。上部和中間小圖:用關(guān)聯(lián)CDC45L衍生肽刺激。下部小圖:用無關(guān)HIV-A24肽刺激。圖內(nèi)部的數(shù)值指示具有象限特征的細胞群(CD8+CD107a+T淋巴細胞)的百分比。每條道是具有相似結(jié)果的兩次獨立實驗中的一個代表。
[0083][圖5]圖5由一系列圖，A至D構(gòu)成，是描繪自HLA-A24陽性肺癌患者的PBMC誘導CDC45L特異性人CTL的圖。A部分:自肺癌患者誘導的、與經(jīng)CDC45L-A24-9-109-2 (SEQID N0:2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO: 3)、CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4)、CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO:7)或 CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12)肽沖激的靶細胞一起共培養(yǎng)的CTL的ELISPOT測定法。用經(jīng)肽沖激的C1R-A*2402細胞刺激的IFN-Y生成顯著大于用經(jīng)HIV肽沖激C1R-A*2402細胞刺激的IFN-Y生成。柱形指示當用經(jīng)⑶C45L衍生肽(空心柱)或無關(guān)HIV-A24肽(實心柱)沖激的C1R-A2402細胞再刺激生成的CTL系時IFN-Y點的數(shù)目。效應細胞對靶細胞比為10:1。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為一式三份測定法的均值+/-SD。B部分=51Cr釋放測定法中CTL針對經(jīng)關(guān)聯(lián)⑶C45L衍生肽(白色三角形；CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO: 2)、CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ IDN0:3)、CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO: 4)、CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO:7)或CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO: 12))沖激的 C1R-A2402 細胞和經(jīng)無關(guān) HIV-A24 肽(黑色三角形)沖激的C1R-A2402細胞的細胞毒性。每個值代表基于一式三份測定法的均值計算的特異性溶解百分比。C部分:使用抗CDC45L抗體對源自下述細胞的全細胞溶胞物的Western印跡分析:Lu99細胞(左邊小圖，第I道)、經(jīng)⑶C45L siRNA轉(zhuǎn)染的Lu99細胞(左邊小圖，第2道)或經(jīng)對照GFP siRNA轉(zhuǎn)染的Lu99細胞(左邊小圖，第3道)、EBC-1細胞(右邊小圖，第I道、經(jīng)⑶C45L siRNA轉(zhuǎn)染的EBC-1細胞(右邊小圖，第2道)或經(jīng)對照GFPsiRNA轉(zhuǎn)染的EBC-1細胞(右邊小圖，第3道)。β -肌動蛋白充當內(nèi)部對照。D部分:通過下調(diào) Lu99 和 EBC-1 靶細胞(CDC45L+，HLA_A*2402+)中的 CDC45L 蛋白消除 CTL 的 CDC45L特異性細胞毒性活性。通過51Cr釋放測定法來分析CTL針對Lu99、EBC-U⑶C45L siRNALu99、CDC45L siRNA EBC-UGFP siRNA Lu99、GFP siRNA EBC-1、或 A549 的細胞毒性活性。每個值代表基于一式三份測定法的均值計算的特異性溶解百分比。
[0084][圖6]圖6由一系列圖構(gòu)成，是描繪抗HLAI類單抗對⑶C45L反應性CTL應答的抑制的圖。將Lu99靶細胞與抗HLA I類單抗(W6/32，IgG2a)或?qū)φ湛笻LA II類單抗(IgG2a) —起溫育I小時后，將Lu99細胞與通過用CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ IDN0:2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO: 3)、CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO:4)或CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO:7)肽刺激自健康供`體或肺癌患者的CD8+T細胞生成的CTL一起共溫育。標示了由CTL介導的IFN-Y生成(A部分)和細胞毒性(B部分)。白色圓圈，Lu99 ;黑色圓圈，Lu99+W6/32 ;白色方框，Lu99+對照單抗。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為一式三份測定法的均值+/-SD。統(tǒng)計學顯著差異以星號指示(*P〈0.05)。
[0085][圖7]圖7由一系列圖，A至C構(gòu)成，是描繪使用CDC45L-A2-9-556-4(SEQID NO: 4，在本文中也稱為 CDC45L-A24-9-556-4)，556KFLDALISL564,肽進行的刺激對HLA-A24 (A*2402)和HLA-A2 (A*0201)限制性CTL 二者的誘導的圖。A部分:與經(jīng)CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO:4)肽沖激的T2細胞一起共培養(yǎng)的、自HLA_A*0201陽性健康供體誘導的CTL的IFN- Y ELISPOT測定法。數(shù)據(jù)表示為一式三份測定法的均值+/_SD。B部分:通過51Cr釋放測定法分析的，CTL針對經(jīng)CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO:4)肽沖激的T2細胞(白色三角形)、經(jīng)對照HIV-A2肽沖激的T2細胞(黑色三角形)、和經(jīng)CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO:4)肽沖激的C1R-A2402細胞(黑色方框)的細胞毒性活性。C部分:通過51Cr釋放測定法分析的抗HLA I類單抗對⑶C45L反應性CTL應答的抑制。將 Panel 靶細胞(CDC45L+，HLA-A2+，HLA-A240 與抗 HLA I 類單抗(W6/32，IgG2a)或?qū)φ湛笻LA II類單抗(IgG2a) —起溫育I小時后，將Panel細胞與通過用CDC45L-A2-9-556-4 (SEQID NO:4)肽刺激自HLA-A*0201陽性健康供體的⑶8+T細胞生成的CTL 一起共溫育。白色圓圈，Panel細胞；黑色圓圈，Pancl+W6/32 ;白色方框，Panel+對照單抗。每個值代表基于一式三份測定法的均值計算的特異性溶解百分比。顯示了來自具有相似結(jié)果的三個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。
[0086][圖8]圖8由一系列圖，A至D構(gòu)成，是描繪N0D/SCID小鼠中⑶C45L反應性人CTL的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖。A, B, C部分:通過用三種⑶C45L衍生肽的混合物刺激自兩名健康供體生成的人CTL的肽特異性細胞毒性活性。A部分:與經(jīng)⑶C45L-A24-9-109-2 (SEQID N0:2)、CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO:3)或CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO:4)肽中任一者沖激的C1R-A2402細胞一起共培養(yǎng)后的CTL的IFN- y ELISPOT測定法。B部分:通過51Cr釋放測定法分析的，在不存在(白色圓圈)或存在抗HLA I類單抗(W6/32，黑色圓圈)或?qū)φ湛笻LA II類單抗(白色方框)的條件下，CTL針對Lu99 (CDC45L+，HLA-A24+)的CDC45L特異性細胞毒性。C部分:通過5`1Cr釋放測定法分析的，CTL針對經(jīng)三種⑶C45L衍生肽之一(白色圓圈，CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2);白色方框，CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ IDNO: 3);白色三角形，CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO:4))或無關(guān) HIV-A24 肽(黑色圓圈)沖激的C1R-A2402細胞的細胞毒性活性。D部分:靜脈內(nèi)接種經(jīng)⑶C45L誘導的CTL(黑色方框，n=5)、對照CD8+T細胞(白色菱形，n=5)、或單獨的PBS(白色圓圈，n=5)的N0D/SCID小鼠中的腫瘤。當腫瘤大小在皮下腫瘤植入后第7天達到大約25mm2時，靜脈內(nèi)接種對三種⑶C45L肽的混合物有反應性的人CTL(4X106個)。在第14天重復CTL誘導。也將經(jīng)無關(guān)HLA-A24限制性HIV肽刺激的對照CD8+T細胞接種入小鼠作為對照。腫瘤大小以平方毫米表示。每個符號代表每組小鼠的均值腫瘤大??；短棒指示SD。使用雙尾Student氏t檢驗來確定第42天時兩組之間的差異的顯著性。
具體實施方案
[0087]現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因為它們可依照例行實驗和/或優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。
[0088]通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。
[0089]1.定義
[0090]如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非另有明確說明。
[0091]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基可以是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應的天然存在氨基酸的人工化學模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0092]如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎化學結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合)但具有一個或多個經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學化合物。
[0093]氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-1UB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。
[0094]術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，用它們普遍接受的單字母符號來指稱。
[0095]如本文中使用的，術(shù)語“組合物”意圖涵蓋包括規(guī)定量的規(guī)定組分的產(chǎn)物，以及任何直接或間接作為規(guī)定量的規(guī)定組分的組合的結(jié)果的產(chǎn)物。該術(shù)語在涉及“藥物組合物”時意圖涵蓋包括活性組分和構(gòu)成載體的任何惰性組分的產(chǎn)物，以及任何直接或間接作為任何兩種或更多種組分的組合、復合或聚集的結(jié)果、或作為一種或多種組分的解離的結(jié)果、或作為一種或多種組分的其它類型反應或相互作用的結(jié)果的產(chǎn)物。因而，在本發(fā)明的語境中，短語“藥物組合物”涵蓋任何通過混合本發(fā)明的化合物和藥學或生理學可接受載體而制備的組合物。如本文中使用的，短語“藥學可接受載體”或“生理學可接受載體”表示藥學或生理學可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于自一個器官或身體部分至另一個器官或身體部分攜帶或運輸活性組分涉及的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。
[0096]除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達⑶C45L基因的癌癥或腫瘤，它的例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0097]除非另有定義，術(shù)語“細胞毒性T淋巴細胞”、“細胞毒性T細胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞(例如腫瘤/癌細胞、病毒感染的細胞)并誘導此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。
[0098]除非另有定義，術(shù)語“HLA-A24”指包含諸如HLA_A*2402等亞型的HLA-A24類型。
[0099]除非另有定義，如本文中使用的，術(shù)語“HLA-A2”代表性地指諸如HLA_A*0201和HLA-A*0206 等亞型。
[0100]除非另有定義，如本文中使用的，術(shù)語“試劑盒”用于指試劑和其它材料的組合?？紤]試劑盒可包括微陣列、芯片、標志物、等等。術(shù)語“試劑盒”并非意圖限于試劑和/或材料的特定組合。
[0101]以本發(fā)明的方法和組合物在癌癥“治療”的語境中有用為限，當治療導致臨床效益，諸如受試者中⑶C45L基因表達的減少、或癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力的降低，認為該治療是“有效”的。當預防性地應用治療時，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。
[0102]以本發(fā)明的方法和組合物可用于癌癥“預防”和“防范”的語境為限，所述術(shù)語在本文中可互換使用，指降低來自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病進展和癥狀出現(xiàn)以及降低已建立的疾病的負面影響的活動，這通過恢復功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來實現(xiàn)。或者，預防和防范可包括廣泛的預防療法，它們旨在減輕特定病癥的嚴重性，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
[0103]在本發(fā)明的語境中，治療和/或預防癌癥和/或預防其手術(shù)后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)清除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預防降低患癌個體的死亡率并改善其預后，降低血液中腫瘤標志物的水平，及減輕伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預防包括10%、20%、30%或更多降低，或病情穩(wěn)定。
[0104]在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抗體”指能與指定的蛋白或其肽特異性反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，而且具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學活性?！翱贵w”指示所有類別(例如IgA、IgD, IgE, IgG和IgM)。
[0105]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。
[0106]I1.At
[0107]為了證明CDC45L衍生的肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對CDC45L(SEQ IDNO: 18)衍生的肽進行分析以確定它們是否為HLA-A24或A2 (它們是常見的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al., Tissue Antigens47:93-101，1996;Kondo A et al., JImmunol155:4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol152:3913-24, 1994)。
[0108]基于它們對HLA-A24的結(jié)合親和力來鑒定⑶C45L衍生的HLA-A24結(jié)合肽的候選者?？紤]下述肽作為用于免疫療法的候選肽:[0109]CDC45L-A24-9-237-1(SEQ ID NO:1),
[0110]CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO:2)，
[0111]CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO:3),
[0112]CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO:4)，
[0113]CDC45L-A24-9-328-5(SEQ ID NO:5)，
[0114]CDC45L-A24-9-396-6(SEQ ID NO:6)，
[0115]CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO:7)， [0116]CDC45L-A24-9-192-8(SEQ ID NO:8)，
[0117]CDC45L-A24-9-541-9(SEQ ID NO:9),
[0118]CDC45L-A24-9-364-10(SEQ ID NO:10)，
[0119]CDC45L-A24-10-109-11(SEQ ID NO:11)，
[0120]CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO:12)，
[0121]CDC45L-A24-10-271-13(SEQ ID NO:13)，
[0122]CDC45L-A24-10-313-14(SEQ ID NO:14)，
[0123]CDC45L-A24-10-21-15(SEQ ID NO:15)，和
[0124]CDC45L-A24-10-459-16(SEQ ID NO:16)。
[0125]此外，用經(jīng)這些肽沖激(加載)的樹突細胞(DC)體外刺激T細胞后，使用下述每種肽，成功地建立了 CTL:
[0126]CDC45L-A24-9-109-2(SEQ ID NO:2)，
[0127]CDC45L-A24-9-294-3(SEQ ID NO:3)，
[0128]CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO:4)，
[0129]CDC45L-A24-9-370-7(SEQ ID NO:7)，和
[0130]CDC45L-A24-10-556-12(SEQ ID NO:12)。
[0131]這些建立的CTL針對經(jīng)相應肽沖激的靶細胞顯示強且特異性的CTL活性。本文中的結(jié)果證明⑶C45L是被CTL識別的抗原，而且被測試的肽是⑶C45L的受HLA-A24限制的表位肽。
[0132]在這些肽中，CDC45L-A24-9-556-4(SEQ ID NO: 4)還被鑒定為候選 HLA-A2 結(jié)合肽。在本文中，CDC45L-A24-556-4(SEQ ID NO:4)在HLA-A2限制肽的語境中也稱作CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO:4) ? 使用該肽，成功建立了針對表達 CDC45L 和 HLA-A2 的靶細胞的CTL。因此，CDC45L-A2-9-556-4(SEQ ID NO: 4)不僅是由HLA-A24限制的表位肽，而且還是由HLA-A24限制的表位肽。
[0133]由于CDC45L基因在包括例如睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌的癌細胞和組織中過表達且在大多數(shù)正常器官中不表達，它是良好的癌癥免疫治療靶標。因此，本發(fā)明提供對應于CDC45L的被CTL識別的表位的九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)?；蛘?，本發(fā)明提供了分離的能結(jié)合HLA抗原并誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的肽，其中該肽具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列組成或是它的免疫學活性片段。本發(fā)明的特別優(yōu)選的例子包括那些具有SEQ ID NO:2, 3,4,7和12的肽。[0134]—般而言，目前可以通過例如互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序,諸如Parker KC et al.，J Immunoll994Janl, 152(1):163-75and Nielsen M et al., Protein Sci2003;12:1007-17 中描述的那些，可以用來在計算機上(in silico)計算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如Parker KC et al., J Immunol 1994Janl, 152 (I):163-75, Kuzushima K et al.,Blood2001, 98(6):1872-81, Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.20070ct31;8:424, Buus S et al.Tissue Antigens.，62:378-84，2003，Nielsen Met al.,Protein Sci2003; 12:1007-17，及 Nielsen M et al.PLoS 0NE2007; 2: e796,它們匯總于例如 Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220中描述的那樣進行測定。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如Journal of ImmunologicalMethods, 1995，185:181-190 及 Protein Science, 2000，9:1838-1846 中有描述。因此，可使用此類軟件程序來選擇與HLA抗原具有高結(jié)合親和力的自CDC45L衍生的片段。因此，本發(fā)明涵蓋由任何根據(jù)這些已知程序，可與HLA抗原結(jié)合的⑶C45L衍生的片段構(gòu)成的肽。另外，此類肽可以包括由全長⑶C45L組成的肽。
[0135]本發(fā)明的九肽和十肽的側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要所得的肽保持其CTL誘導能力即可。額外的氨基酸序列可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要它們不損害原來的肽的CTL誘導能力。因此，本發(fā)明涵蓋具有對HLA抗原的結(jié)合親和力的肽，包括自⑶C45L衍生的肽。這樣的肽例如少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，且通常少于約15個氨基酸。
[0136]一般而言，肽中一個或多個氨基酸的修飾不會影響肽的功能，而且在有些情況下甚至會增強原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替換、添加、刪除和/或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA1984, 81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Resl982,10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA1982, 79:6409-13)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽既具有CTL誘導能力，又具有選自SEQ ID N0:2，3，4，7和12的氨基酸序列中添加、刪除和/或替換一個、兩個或甚至更多個氨基酸而得到的氨基酸序列。
[0137]本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加、刪除或替換往往會導致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它們經(jīng)常稱作“保守替換”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導致具有與原始蛋白質(zhì)類似的功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如:疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R, D, N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能團或特征的側(cè)鏈:脂肪族側(cè)鏈(G, A, V, L, Ι,Ρ);含羥基側(cè)鏈(S, Τ, Y);含硫原子側(cè)鏈(C, Μ);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D, N, Ε, Q);含堿側(cè)鏈(R, K, H);和含芳香基團側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領(lǐng)域公認互為保守替換的氨基酸:
[0138]I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
[0139]2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
[0140]3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0141]4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；[0142]5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；[0143]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
[0144]7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和
[0145]8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteinsl984)。
[0146]此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該修飾的肽保留原始肽的CTL誘導能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應排除CDC45L的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導CTL的肽。
[0147]為了保持所需的CTL誘導能力，可以修飾(即插入、刪除、添加和/或替換)少數(shù)(例如，I個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語“數(shù)個”意指5個或更少的氨基酸，如4個或3個或更少。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%或更少，更優(yōu)選15%或更少，和甚至更優(yōu)選10%或更少或1_5%。
[0148]當在癌癥免疫療法的語境中使用時，本發(fā)明的肽應呈遞在細胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA抗原的復合物。因此，優(yōu)選選擇不僅誘導CTL而且還擁有對HLA抗原的高結(jié)合親和力的肽。為此，可對本發(fā)明的肽通過替換、插入、和/或添加氨基酸殘基進行修飾以產(chǎn)生具有改良結(jié)合親和力的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由于通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律是已知的(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogeneticsl995, 41:178; J Immunol 1994, 155:4307)，可將基于該規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。
[0149]例如，可能希望進行替換，將自N端起的第二個氨基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或?qū)⑽挥贑端的氨基酸替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸，以提高HLA-A24結(jié)合親和力。因此，具有選自SEQ ID NO: 2，3，4，7和12的氨基酸序列，其中自N端起第二個氨基酸被替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸和/或其中位于C端的氨基酸被替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。
[0150]或者，可能希望進行替換，將自N端起的第二個氨基酸替換為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或?qū)⑽挥贑端的氨基酸替換為纈氨酸或亮氨酸，以提高HLA-A2結(jié)合親和力。因此，具有選自SEQ ID N0:4的氨基酸序列，其中自N端起第二個氨基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中位于C端的氨基酸被替換為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。
[0151]不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替換，而且可以在潛在的T細胞受體(TCR)識別位置處引入替換。數(shù)項研究證明了具有氨基酸替換的肽可具有等同于或好于原來功能的功能，例如 CAP1、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gpl00(2(l9_217)(Zaremba et al.Cancer Res.57, 4570-4577，1997, T.K.Hoffmann et al.J Tmmunol.(2002)FebI;168(3):1338-47.，S.0.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52:199-206及 S.0.Dionne et al.Cancer Immunology, Immunotherapy (2004)53, 307-314)。
[0152]本發(fā)明還考慮向本發(fā)明肽的N和/或C端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。
[0153]然而，當肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能誘導副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可得的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標肽相比差I(lǐng)個或2個氨基酸的肽亦不存在時，可以修飾目標肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。
[0154]雖然預期如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標選出的候選肽檢查了 CTL誘導能力的存在。這里，短語“CTL誘導能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細胞(APC)上時誘導細胞毒性淋巴細胞(CTL)的能力。另外，“CTL誘導能力”包括肽誘導CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN-Y生成的能力。
[0155]CTL誘導能力的確認如下來實現(xiàn)，誘導攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細胞、巨噬細胞、和樹突細胞(DC))，或者更具體地說，衍生自人外周血單核白細胞的DC，并且在用肽誘導后，與CD8陽性細胞混合，然后測量由CTL針對靶細胞生成和釋放的IFN-Y。作為反應系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L, KrishnanR, Longmate J, Auge C，Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immuno12000Aug, 61(8):764-79,Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitopevaccine in HLA A*0201/DRItransgenic mice: dependent on MHC (HLA) class 11restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標記祀細胞,并且可以自靶細胞釋放的放射性計算細胞毒性活性。或者，CTL誘導能力可以如下評估:測量在攜帶固定化肽的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- Y，并使用抗IFN- Y單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。
[0156]作為如上所述檢查肽的CTL誘導能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自SEQ ID N0:2、3、4、7和12的九肽或十肽顯示特別高 的CTL誘導能力以及對HLA抗原的高親和力。因此，例舉這些肽作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。
[0157]另外，同源性分析的結(jié)果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒有顯著的同源性。因而，用于免疫療法時未知的或不想要的免疫應答的可能性降低了。因此，也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對CDC45L的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選具有選自SEQ ID N0:2、3、4、7和12的氨基酸序列的肽。
[0158]除了上文所述修飾之外，也可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要使得連接肽保留初始肽的所需CTL誘導能力。合適肽的例子包括:本發(fā)明的肽或自其它TAA衍生的CTL誘導性(CTL inducible)肽。合適的肽間接頭是本領(lǐng)域公知的，而且包括例如AAY(P.M.Daftarian et al., J Trans Med2007, 5:26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al., JImmunol.2000, 165:7308-7315)或K (S.0ta et al., Can Res.62, 1471-1476, K.S.Kawamuraet al., J Tmmunol.2002, 168:5709-5715)。
[0159]例如，還可基本上同時使用非⑶C45L腫瘤相關(guān)抗原肽以提高經(jīng)I類和/11類HLA的免疫應答。已經(jīng)公認，癌細胞能表達超過一種腫瘤相關(guān)基因。因此，依照本發(fā)明確定特定受試者是否表達其他腫瘤相關(guān)基因，然后在CDC45L組合物或疫苗中包括自此類基因的表達產(chǎn)物衍生的I類HLA和/或II類HLA結(jié)合肽，這是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的例行實驗的范圍內(nèi)的。
[0160]I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的(例如參見Coulie, Stem Cellsl3:393-403, 1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能容易地使用分子生物學的標準規(guī)程來制備包括一種或多種⑶C45L肽和一種或多種非⑶C45L肽的多肽或編碼此類多肽的核酸。
[0161]上文所述連接肽在本文中稱作“多表位”(polytope)，即兩種或更多種可以以各種排列(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起的潛在免疫原性或免疫應答刺激性肽的組。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以以標準免疫方案來施用(例如給動物)以測試該多表位在刺激、增強和/或引起免疫應答的有效性。
[0162]該等肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的(參見例如Thomson et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA92 (13): 5845-5849, 1995;Gilbert et al., Nature Biotechnol.15(12):1280-1284, 1997;Thomson etal., J Tmmunol.157(2):822-826, 1996;Tarn et al., J Exp.Med.171 (I):299-306，1990)?？芍苽浜胁煌砦粩?shù)目和組合的多表位并測試CTL識別和提高免疫應答的功效。
[0163]也可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要所得連接肽保留初始肽的所需CTL誘導能力。合適的例子包括例如:肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙酰基、天然的和合成的聚合物等。本發(fā)明肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，只要該修飾不破壞初始肽的生物學活性?？蓪嵤┻@些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或使多肽穩(wěn)定。
[0164]例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。可以以多種方式評估多肽的穩(wěn)定性。例如，可使用肽酶和各種生物學介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef etal.,Eur J Drug Metab Pharmacokinl986, 11:291-302)。
[0165]此外，如上所述，在替代、刪除和/或添加I個、2個或數(shù)個氨基酸殘基的經(jīng)修飾肽中，可篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽的方法。一種例示性方法可包括下述步驟:`[0166]a:替代、刪除或添加本發(fā)明肽中的至少一個氨基酸殘基，
[0167]b:測定步驟(a)中產(chǎn)生的肽的活性，和
[0168]c:選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。
[0169]在本文中，要測定的活性可包括MHC結(jié)合活性、APC或CTL誘導能力和細胞毒性活性。優(yōu)選地，要評估的活性是CTL誘導能力，而且此類活性可使用“實施例”中描述的方法來評估。
[0170]在本文中，本發(fā)明的肽也可以記為“⑶C45L肽”或“⑶C45L多肽”。
[0171]II1.CDC45L 狀的制各
[0172]本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為包括兩個或更多個肽的較長多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，使得所述肽基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學物質(zhì)。
[0173]本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞初始肽的生物學活性。其它修飾包括摻入D-氨基酸或其它氨基酸模擬物，其可用于例如延長肽的血清半衰期。[0174]可以根據(jù)選定的氨基酸序列，借助化學合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括:
[0175](i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
[0176](ii) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
[0177](iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen C0., 1975 ；
[0178](iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenC0.,1985 ；
[0179](v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (inJapanese), Vol.14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；
[0180](vi)W099/67288 ;和
[0181](vii)Barany G.&Merrifield R.B., Peptides Vol.2，"Solid Phase PeptideSynthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
[0182]或者，可應用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology1977, 132:349-51;Clark-Curtiss&Curtiss, Methods inEnzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達形式(例如處于相當于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)移入合適宿主細胞。本發(fā)明也提供此類載體和宿主細胞。然后培養(yǎng)宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。
[0183]IV.多核苷酸`
[0184]本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括由天然存在型⑶C45L基因(GenBank登錄號NM_003504(SEQ ID NO: 17))衍生的多核苷酸及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可以修飾核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。
[0185]本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物構(gòu)成。正如本領(lǐng)域公知的，DNA分子由堿基諸如天然存在的堿基A、T、C、和G構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。技術(shù)人員會認可，多核苷酸也可包括非天然存在的堿基。
[0186]本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標志基因等等的表達載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。[0187]重組和化學合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達來擴增多核苷酸(參見例如Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘?，可使用固相技術(shù)來合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48:2223-311;Matthes et al., EMBO J1984, 3:801-5 中記載的。
[0188]V.外來體(exosomes)
[0189]本發(fā)明進一步提供了稱作外來體的細胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來制備，并可以用從治療和/或預防所針對的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進行接種。
[0190]復合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24和HLA-A2，特別是HLA_A*2402和HLA_A*0201還有HLA-A*0206，是最普遍的且因此會適合于治療日本人患者。使用在日本人和白種人中高表達的A24和A2型有利于獲得有效的結(jié)果，而且也可使用諸如A*2402、A*0201和A*0206等亞型。典型的，在臨床上，預先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對此抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導能力的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導能力二者的肽，可以在天然存在的CDC45L部分肽的氨基酸序列的基礎上進行I個、2個或幾個氨基酸的替換、刪除、插入和/或添加。
[0191]在將A24型HLA抗原用于本發(fā)明的外來體時，可使用具有選自SEQ ID NO:2, 3,4,7和12的氨基酸序列的肽。
[0192]或者在將A2型HLA抗原用于本發(fā)明的外來體時，可使用具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的肽。
[0193]V1.杭原旱遞細朐(APC)
[0194]本發(fā)明還提供在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復合物的分離的抗原呈遞細胞(APC)。APC可衍生自要進行治療和/或預防的患者，而且可作為疫苗以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。
[0195]APC不限于特定種類的細胞，包括樹突細胞(DC)、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導活性的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的APC。
[0196]例如， 可通過自外周血單核細胞誘導DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得本發(fā)明的APC。當對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導出呈遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺激)細胞，以在細胞的表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復合物。因此，本發(fā)明的APC可通過將本發(fā)明的肽施用于受試者后自受試者收集APC來獲得?；蛘?，本發(fā)明的APC可通過使自受試者收集的APC接觸本發(fā)明的肽來獲得。
[0197]可以將本發(fā)明的APC施用于受試者以在受試者中以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL)組合來誘導針對癌癥的免疫應答。例如，離體施用可包括下述步驟:
[0198]a:自第一受試者收集APC ；
[0199]b:使肽接觸步驟a的APC ；并
[0200]c:對第二受試者施用步驟b的APC。
[0201]第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。通過步驟b獲得的APC可作為疫苗用來治療和/或預防癌癥，癌癥的例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0202]本發(fā)明提供包括此類用本發(fā)明肽誘導的抗原呈遞細胞的藥物組合物的制造。[0203]依照本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導能力。在術(shù)語“高水平的CTL誘導能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導能力的APC不但可通過上文所述方法制備，還可通過包括在體外將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于進行導入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如CancerResl996, 56:5672-7; J Immunol 1998, 161:5607-13; J Exp Medl996, 184:465-72;國際公開文本N0.2000-509281的已
【公開日】文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的部分肽。
[0204]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的APC可以是在其表面上呈遞在HLA-A24抗原諸如HLA-A*2402與本發(fā)明肽之間形成的復合物的APC?；蛘撸景l(fā)明的APC可在其表面上呈遞在HLA-A2抗原諸如HLA-A*0201與SEQ ID NO:4的肽或其修飾肽之間形成的復合物。
[0205]VI1.細朐毒件T淋巴細朐(CTL)
[0206]被誘導的針對任一本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強靶向癌細胞的免疫應答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明提供由任一本發(fā)明肽特異性誘導或活化的、分離的CTL。
[0207]此類CTL可通過下述步驟來獲得:(I)對受試者施用本發(fā)明的肽；或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)源自受試者的的APC和CD8陽性細胞、或外周血單核白細胞；或(3)在體外使CD8-陽性細胞或外周血單個核白細胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與肽之間形成的復合物的APC或外來體；或(4)導入包括編碼T細胞受體(TCR)亞基的多核苷酸的基因，所述TCR亞基能結(jié)合本發(fā)明的肽。上述APC或外來體可通過上文記載的方法來制備，而且(4)之方法的詳情記載于下文“VII1.T細胞受體(TCR) ”部分。
[0208]可以從要進行治療和/或預防的患者獲取本發(fā)明的CTL，而且可以將它們單獨施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽例如與用于誘導的肽相同的肽的靶細胞起作用。靶細胞可以是內(nèi)源表達CDC45L的細胞，諸如癌細胞，或被CDC45L基因轉(zhuǎn)染的細胞；而且因肽的刺激而在細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細胞也可充當活化CTL攻擊的靶標。
[0209]VII1.T 細朐等體(TCR)
[0210]本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)亞基的多肽的核酸的多核苷酸，及使用該組合物的方法。本發(fā)明的TCR亞基具有形成賦予T細胞針對呈遞CDC45L的腫瘤細胞的特異性的TCR的能力。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出編碼構(gòu)成用本發(fā)明的一種或多種肽誘導的CTL的TCR亞基α和β鏈的核酸(W02007/032255及Morganet al., J Immunol, 171, 3288 (2003)) ?例如，優(yōu)選使用PCR方法來分析編碼TCR亞基的核苷酸序列。用于分析的PCR引物可以是但不限于例如作為5’側(cè)引物的5’-R引物(5，-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:23)和作為 3’ 側(cè)引物的對 TCRa 鏈 C 區(qū)特異性的 3-TRa-C 引物(5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID N0:24)鏈 Cl
區(qū)特異性的 3-TRb-Cl 引物(5，-tcagaaatcctttctcttgac-3，) (SEQ ID NO:25)或?qū)CR^ 鏈C2 區(qū)特異性的 3-TR β -C2 引物(5，-ctagcctctggaatcctttctctt-3’) (SEQ ID NO:26)。衍生的TCR能以高親合力結(jié)合展示CDC45L肽的靶細胞，且任選在體內(nèi)和在體外介導有效的對呈遞⑶C45L肽的靶細胞的殺傷。
[0211]編碼TCR亞單位的核酸可以摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng)域公知的。所述核酸或者包含它們的載體有用地可以轉(zhuǎn)移到T細胞中，例如來自患者的T細胞中。有利的是，本發(fā)明提供了一種即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自身的T細胞(或另一種哺乳動物的)，以快速而容易地產(chǎn)生具有優(yōu)秀的癌細胞殺傷性質(zhì)的修飾T細胞。
[0212]特異性TCR是一種能夠特異性識別本發(fā)明肽和HLA分子形成的復合物的受體，當TCR在T細胞的表面上呈遞時，給予T細胞針對靶細胞的特異性活性。對上述復合物的特異性識別可通過任何已知方法來確認，其優(yōu)選例子包括但不限于使用HLA分子和本發(fā)明肽的HLA多聚體染色分析，及ELISP0T測定法。通過實施ELISP0T測定法，能確認經(jīng)編碼TCR亞基的核酸轉(zhuǎn)導的T細胞是否識別表達HLA分子和CDC45L的細胞，并胞內(nèi)傳輸信號。還能確認通過已知方 法導入T細胞的TCR亞基是否能給予T細胞以細胞毒性活性。優(yōu)選的方法包括例如使用HLA-A2陽性和⑶C45L過表達細胞作為靶細胞的鉻釋放測定法。
[0213]此外，本發(fā)明提供通過用編碼結(jié)合在HLA-A2的背景下SEQ ID NO: 4的⑶C45L肽，以及在HLA-A24的背景下結(jié)合SEQ ID NO: 2, 3，4，7和12的肽的TCR亞基的核酸轉(zhuǎn)導而制備的CTL。
[0214]經(jīng)過轉(zhuǎn)導的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細胞，并且可以利用公知的體外培養(yǎng)方法擴增(例如 Kawakami et al., J Immunol.，142，3452-3461 (1989))?？梢岳帽景l(fā)明的CTL來形成免疫原性組合物，所述組合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療和/或預防癌癥(參見W02006/031221，通過述及而將其內(nèi)容收入本文)。
[0215]IX.藥物作用劑或組合物
[0216]由于⑶C45L表達在癌癥(其例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌)中與正常組織相比特異性升高，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預防癌癥，和/或預防它們的手術(shù)后復發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預防癌癥，和/或預防它們的手術(shù)后復發(fā)的藥物作用劑或組合物，所述藥物作用劑或組合物包括一種或多種本發(fā)明的肽或多核苷酸作為活性組分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細胞(諸如APC)的表面上表達本發(fā)明的肽，以用作藥物作用劑或組合物。另外，上述靶向任一本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥物作用劑或組合物的活性組分。[0217]本發(fā)明的藥物作用劑和組合物(即“藥物作用劑”)也可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。
[0218]本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術(shù)后復發(fā)。
[0219]在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或作用劑中的用途:
[0220](a)本發(fā)明的肽，
[0221](b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0222](c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP
[0223](d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
[0224]或者，本發(fā)明進一步提供用于治療或預防癌癥或腫瘤的選自下組的活性組分:
[0225](a)本發(fā)明的肽，
[0226](b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0227](c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP`[0228](d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
[0229]或者，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學或生理學可接受載體與選自下組的活性組分作為活性組分的步驟:
[0230](a)本發(fā)明的肽，
[0231](b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0232](c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCJP
[0233](d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
[0234]在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療或預防癌癥或腫瘤的藥物組合物或作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學或生理學可接受載體的步驟，其中所述活性組分選自下組:
[0235](a)本發(fā)明的肽，
[0236](b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
[0237](c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP
[0238](d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
[0239]依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID N0:2，3，4，7和12的氨基酸序列的肽是HLA-A24限制性表位肽或能誘導強且特異性的免疫應答的候選者。因此，包括任何這些具有SEQ ID NO:2, 3，4，7和12的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥物作用劑或組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的肽是HLA-A2限制性表位肽。因此，除了對其HLA抗原為HLA-A24的受試者之外，包括具有SEQID N0:4的氨基酸序列的肽的藥物作用劑或組合物也適合于對其HLA抗原為HLA-A2的受試者施用。這同樣適用于含有編碼任何這些肽的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥物作用劑或組合物。
[0240]要用本發(fā)明的藥物作用劑或組合物治療的癌癥不受限制，而且包括其中涉及CDC45L (例如過表達)的任何癌癥，包括例如睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0241]除上述活性組分之外，本發(fā)明的藥物作用劑或組合物還可含有其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞等等。在本文中，其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。
[0242]如果需要，本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分例如任何本發(fā)明肽的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎作用劑或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了藥物自身中的其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學作用劑或組合物順序或同時施用。藥物和藥理學作用劑或組合物的量取決于例如所使用的藥理學作用劑或組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。
[0243]應當理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它作用劑或組合物。
[0244]在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥物物質(zhì)或組合物的容器及標簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標簽應指明該物質(zhì)或組合物用于治療或預防一種或多種疾病狀況。標簽還可指明關(guān)于施用的指導等等。
[0245]除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物作用劑或組合物的試劑盒還可任選進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受稀釋劑`。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。
[0246]如果期望的話，藥物組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
[0247](I)含有肽作為活性組分的藥物作用劑或組合物
[0248]本發(fā)明的肽可以作為藥物作用劑或組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除了本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、等等。另外，藥物作用劑或組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可用于抗癌目的。
[0249]本發(fā)明的肽可作為組合來制備，其包括兩種或更多種本發(fā)明的肽，以在體內(nèi)誘導CTL0肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標準技術(shù)彼此綴合。例如，可以將肽化學連接或表達成為單一融合多肽序列，其可具有一個或幾個氨基酸作為接頭(例如賴氨酸接頭:K.S.Kawamura et al.J.1mmunol.2002, 168:5709-5715)。組合中的各個妝可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度呈遞在APC上，然后誘導出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復合物特異性起反應的CTL。或者，自受試者取出APC (例如DC)，然后用本發(fā)明的肽刺激以獲得在其細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的APC。將這些APC再施用于受試者以在受試者中誘導CTL，結(jié)果能提高針對腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的攻擊性。
[0250]包括本發(fā)明肽作為活性組分、用于治療和/或預防癌癥的藥物作用劑或組合物還可包括已知有效建立細胞免疫的佐劑?；蛘?，藥物物質(zhì)或組合物可以與其它活性組分一起施用，而且它們可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時增強針對蛋白質(zhì)的免疫應答的任何化合物、物質(zhì)或組合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻中記載的那些(Clin Microbiol Revl994，7:277-89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷酸招、氫氧化招、明帆、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISCO基質(zhì)、GM-CSF、CpG, Ο/ff乳液、諸如此類。
[0251]另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制劑、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。
[0252]在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽也可以以藥學可接受鹽的形式施用。優(yōu)選鹽的例子包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽和與無機酸的鹽。
[0253]在一些實施方案中,本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可進一步包括引發(fā)(prime)CTL的成分。已經(jīng)將脂質(zhì)鑒定為能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的作用劑或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基附著至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體施用，或在佐劑中乳化后施用。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應答的另一個例子，大腸桿菌(E.coli)脂蛋白，諸如三棕櫚酰基-S-甘油基半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(P3CSS) ，當共價附著至適宜的肽時，可用來引發(fā)CTL (參見例如Dereset al.，Naturel989, 342:561-4)。
[0254]施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依照要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調(diào)整，而且通常是
0.0Olmg至I, OOOmg,例如0.0Olmg至I, OOOmg,例如0.1mg至IOmg,而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當選擇合適的劑量。
[0255](2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物作用劑或組合物
[0256]本發(fā)明的藥物作用劑或組合物也可包括處于可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達形式的”意味著多核苷酸在導入細胞時會在體內(nèi)表達成能誘導抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&CapecchiMR, Celll987, 51:503-12)。還可參見例如 Wolff et al.，Sciencel990, 247:1465-8;U.S.Patent Nos.5，580，859; 5, 589，466; 5, 804，566; 5, 739，118;5, 736，524; 5, 679，647;和W098/04720。基于DNA的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導的)投遞、陽離子脂質(zhì)復合物、和顆粒介導的(“基因槍”)或壓力介導的投遞(參見例如美國專利 N0.5，922，687)。
[0257]本發(fā)明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。在導入宿主后，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利N0.4，722，848。另一種載體是BCG (卡介苗)。BCG 載體記載于 Stover et al.，Naturel991, 351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al., Mol Med Today2000, 6:66-71; Shedlock et al., J LeukocBiol2000,68:793-806;Hipp et al., In Vivo2000, 14:571-85。
[0258]將多核苷酸投遞入患者可以是直接的，其中患者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣多核苷酸轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植入患者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。
[0259]關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al., ClinicalPharmacy 1993, 12:488-505;Wu 和 Wu, Biotherapyl991, 3:87-95;Tolstoshev,Ann RevPharmacol Toxicol1993，33:573-96;Mulligan, Science1993，260:926-32;Morgan&Anderson, Ann Rev Biocheml993, 62:191-217;Trends in Biotechnologyl993, 11 (5):155-215。重組DNA【技術(shù)領(lǐng)域】普遍知道的方法也可用于本發(fā)明。參見例如Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY, 1993;和Krieger, Gene Transferand Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990。
[0260]施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。可以依照要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當調(diào)整合適載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞中的多核苷酸的劑量，而且通常是0.0Olmg至lOOOmg，例如0.0Olmg至1000mg,例如0.1mg至IOmg,而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當選擇合適的劑量。
[0261]X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法
[0262]本發(fā)明的肽和多核苷酸可用于制備或誘導APC和CTL。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不抑制它們的CTL誘導能力。因此，任何上述本發(fā)明藥物作用劑或組合物均可用于誘導CTL，而且在它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導APC，如下文更詳細討論的。
[0263](I)誘導抗原呈遞細胞(APC)的方法
[0264]本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導具有高CTL誘導能力的APC的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸APC的步驟。例如，離體或在體外用肽接觸APC的方法可包括下述步驟:
[0265]a:自受試者收集APC ；并
[0266]b:使肽接觸步驟a的APC。
[0267]APC不限于特定種類的細胞，包括DC、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知它們在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細胞識別。優(yōu)選地，由于DC是APC中具有最強CTL誘導能力的，可使用DC。任何本發(fā)明肽可以以它們自身或與其它本發(fā)明肽一起使用。[0268]另一方面，在將本發(fā)明肽施用于受試者時，APC在體內(nèi)接觸肽，結(jié)果在受試者的身體中誘導出具有高CTL誘導能力的APC。因此，本發(fā)明包括將本發(fā)明的肽施用于受試者。類似地，在將可表達形式的本發(fā)明多核苷酸施用于受試者時，本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達并與APC接觸，結(jié)果在受試者的身體中誘導出具有高CTL誘導能力的APC。因此，本發(fā)明還可涵蓋將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者?！翱杀磉_形式”描述于上文“IX.藥物作用劑或組合物(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物作用劑或組合物”部分。
[0269]本發(fā)明還可包括將本發(fā)明的多核苷酸導入APC以誘導具有CTL誘導能力的APC的步驟。此類方法的一個例示性例子可包括下述步驟:
[0270]a:自受試者收集APC ；并
[0271]b:導入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。
[0272]步驟b可如上文“V1.抗原呈遞細胞”部分中所述來實施。
[0273]或者，本發(fā)明提供了用于制備特異性誘導針對CDC45L的CTL活性的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中該方法可包括下述步驟之一:
[0274](a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸本發(fā)明的肽；和
[0275](b)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導入APC。
[0276](2)誘導CTL的方法
[0277]另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體或APC來誘導CTL的方法。
[0278]本發(fā)明還提供了使用編碼能夠形成T細胞受體(TCR)亞基(其識別本發(fā)明肽和HLA抗原的復合物)的多肽的多核苷酸來誘`導CTL的方法。優(yōu)選地，用于誘導CTL的方法可包括至少一個選自下組的步驟:
[0279]a)使CD8陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽的復合物的抗原呈遞細胞和/或外來體接觸；和
[0280]b)將編碼能夠形成TCR亞基(其識別本發(fā)明肽和HLA抗原的復合物)的多肽的多核苷酸導入⑶8陽性細胞。
[0281]當本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC、或外來體被施用給受試者后，在受試者的身體中誘導出CTL，并增強靶向癌細胞的免疫應答的強度。因此，本發(fā)明的方法包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者的步驟。
[0282]或者，也可通過離體或在體外使用來誘導CTL，并在誘導CTL后，可將活化的CTL返還受試者。例如，該方法可包括下述步驟:
[0283]a:自受試者收集APC;
[0284]b:用肽接觸步驟a)的APC ;并
[0285]c:將步驟b的APC與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)。
[0286]上文步驟c中要與⑶8陽性細胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“V1.抗原呈遞細胞”部分所述，但是本發(fā)明不限于此，而且因此可涵蓋任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的APC。
[0287]作為此類APC的替代，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的外來體。即，本發(fā)明可包括共培養(yǎng)在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復合物的外來體的步驟。此類外來體可通過上文“V.外來體”部分中描述的方法來制備。
[0288]另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞基的多核苷酸的基因?qū)擘?陽性細胞來誘導CTL。此類轉(zhuǎn)導可如上文“VII1.T細胞受體(TCR) ”部分中所述來實施。
[0289]另外，本發(fā)明提供了一種制造用于誘導CTL的藥用物質(zhì)或組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學可接受載體的步驟。
[0290](3)誘導免疫應答的方法
[0291]此外，本發(fā)明提供了誘導針對涉及CDC45L的疾病的免疫應答的方法。合適的疾病包括癌癥，其例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0292]本發(fā)明的方法可包括施用含有任何本發(fā)明肽或其編碼多核苷酸的作用劑或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC。關(guān)于詳情參見“IX.藥物作用劑或組合物”部分，特別是描述本發(fā)明的藥物作用劑或組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于誘導免疫應答的本發(fā)明方法的外來體和APC詳細描述于上文“V.外來體”、“V1.抗原呈遞細胞(APC) ”、和“X.使用肽、外來體、APC和CTL”的(I)和⑵部分。 [0293]本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導免疫應答的藥物作用劑或組合物的方法或工藝，其中該方法可包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學可接受載體的步驟。
[0294]或者，本發(fā)明的方法可包括施用疫苗或藥物作用劑或組合物的步驟，其包含:
[0295](a)本發(fā)明的肽；
[0296](b)處于可表達形式的編碼本文中公開的此類肽的核酸；
[0297](c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體；或
[0298](d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。
[0299]在本發(fā)明的語境中，過表達⑶C45L的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥的例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。因而，在施用包括所述活性組分的疫苗或藥物作用劑或組合物之前，優(yōu)選確認要治療的細胞或組織中的CDC45L表達水平與相同器官的正常細胞增強了。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療(過)表達CDC45L的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟:
[0300]i)測定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的CDC45L表達水平；
[0301]ii)比較⑶C45L表達水平與正常對照水平；并
[0302]iii)對具有與正常對照相比過表達⑶C45L的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至⑷的成分。
[0303]或者，本發(fā)明可提供包括至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物作用劑或組合物，其用于對具有過表達CDC45L的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明CDC45L多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測定源自受試者的細胞或組織中的CDC45L表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者可具有可用本發(fā)明CDC45L多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法將在下面更加詳細的加以敘述。
[0304]任何源自受試者的細胞或組織可用于測定CDC45L表達，只要其包括目標的⑶C45L轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。合適樣品的例子包括但不限于身體組織與體液，例如血液、痰與尿液。優(yōu)選地，源自受試者的細胞或組織樣品含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，較優(yōu)選癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，并將其用為源自受試者的樣品。
[0305]在本發(fā)明的語境中，從已知非癌性的生物學樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，若對照水平從癌性生物學樣品確定，則它稱作“癌性對照水平”。樣品表達水平與對照水平間的差異，可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標準化。示例對照基因包括，但不僅限于，肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。
[0306]要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。
[0307]根據(jù)本發(fā)明，可測定在自受試者獲得的細胞或組織中CDC45L的表達水平。使用本領(lǐng)域已知方法，可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平上確定表達水平。舉例而言，⑶C45L的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒㈥嚵械鹊壬蠈嵤┧鰴z測。對檢測CDC45L的表達水平而言,可優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用CDC45L的序列信息制備上述探針。舉例而言，CDC45L的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達水平可以作為發(fā)生了雜交的標記物的強度檢測。
[0308]進一步，⑶C45L的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO: 17)可通過基于擴增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。
[0309]具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件或低嚴格條件下與CDC45L的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其 靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴格條件會是這樣的:其中鹽濃度小于大約1.0M鈉離子，典型地大約0.01-1.0M鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7.0-8.3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，對于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實現(xiàn)。
[0310]或者，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定CDC45L蛋白(SEQID NO: 18)或其免疫學片段的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，其使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測,只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對CDC45L蛋白的結(jié)合能力即可。本發(fā)明也提供針對本發(fā)明肽的此類抗體及其片段。制備這些種類的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。
[0311]作為另一種基于⑶C45L的翻譯產(chǎn)物檢測⑶C45L基因表達水平的方法，可利用針對CDC45L蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量染色的強度。意即，在此測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)的存在/水平增加，且同時表明CDC45L基因的高表達水平。[0312]對于靶基因(例如⑶C45L基因)在癌細胞中的表達水平而言，如果該水平較之靶基因的對照水平(例如在正常細胞中的水平)增加了例如10%、25%或50%，或增加到超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍或者更多的話，可以確定該水平是增加的。
[0313]對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細胞可用作正常對照。或者，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，基于通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的CDC45L基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達樣式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中CDC45L基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中CDC45L基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如,平均值±2S.D.或平均值±3S.D.的范圍可以用作標準值。
[0314]若⑶C45L基因的表達水平相比于正常對照水平提高了或與癌性對照水平相似/等同，則可診斷受試者為具有要治療的癌癥。本發(fā)明還提供了一種(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)選擇受試者進行癌癥治療的方法，該方法可包括下述步驟:
[0315]a)測定CDC45L在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的表達水平；
[0316]b)將⑶C45L的表達水平與正常對照水平比較；
[0317]c)若CDC45L的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并
[0318]d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。
[0319]或者，此類方法可包括下述步驟:
[0320]a)測定CDC45L在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細胞或組織中的表達水平；
[0321]b)將⑶C45L的表達水平與癌性對照水平比較；
[0322]c)若CDC45L的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并
[0323]d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。
[0324]本發(fā)明還提供了用于診斷或確定患有或懷疑患有能用本發(fā)明CDC45L多肽來治療的癌癥的受試者的診斷試劑盒，其亦可用于評價癌癥預后和/或監(jiān)測特定癌癥療法(更特別地，癌癥免疫療法)的功效或適用性。合適的癌癥的例示性例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選可包含至少一種檢測源自受試者的細胞中的CDC45L基因表達的試劑，所述試劑可選自下組:
[0325](a)檢測CDC45L基因的mRNA的試劑；[0326](b)檢測CDC45L蛋白質(zhì)或其免疫學片段的試劑；和
[0327](c)檢測⑶C45L蛋白質(zhì)的生物學活性的試劑。
[0328]適于檢測⑶C45L基因mRNA的試劑的例子包括特異性結(jié)合或鑒定⑶C45L mRNA的核酸，諸如具有與CDC45L mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類的寡核苷酸以對CDC45L mRNA特異性的引物和探針為例?？苫诒绢I(lǐng)域眾所周知的方法制備這些種類的寡核苷酸。如果需要，檢測CDC45L mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測⑶C45L mRNA的試劑。
[0329]另一方面，適于檢測⑶C45L蛋白質(zhì)或其免疫學片段的試劑的例子可包括針對CDC45L蛋白質(zhì)或其免疫學片段的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，所述抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與CDC45L蛋白或其免疫學片段的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備這些種類的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標記技術(shù)進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其靶結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測CDC45L蛋白質(zhì)的試劑。
[0330]所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。所述試劑盒可進一步包括用于結(jié)合針對CDC45L基因的探針或針對CDC45L肽的抗體的固體基質(zhì)和試劑，用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基和容器，陽性和陰性對照試劑，及用于檢測針對CDC45L肽的抗體的二抗。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、針頭、注射器、和帶有使用說明的包裝插頁(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑之類的可與標簽一起保留在容器中。合適的容器可包括瓶、管形瓶和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。
`[0331]作為本發(fā)明的一個實施方案，當所述試劑是針對CDC45L mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位點。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位點?；蛘撸瑢φ瘴稽c可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位點上量較大而在接下來的位點上量較小。在添加測試樣品之后，展示可檢測信號位點的數(shù)目提供了在樣品中存在的CDC45L mRNA量的定量指征。所述檢測位點可配置成任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。
[0332]本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或CDC45L標準樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集⑶C45L陽性樣品，隨后測定其⑶C45L水平來制備。或者，可將純化的CDC45L蛋白或多核苷酸添加到不表達CDC45L的細胞中以形成所述陽性樣品或⑶C45L標準樣品。在本發(fā)明中，純化的⑶C45L可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的⑶C45L水平大于截留值。
[0333]在一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種診斷試劑盒，其包括能夠特異性識別本發(fā)明抗體的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。
[0334]本文中涵蓋的本發(fā)明的蛋白的部分肽和免疫原性片段的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個、優(yōu)選15個、和更優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸構(gòu)成的多肽。癌癥可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽(多肽)檢測樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明肽或蛋白質(zhì)的方法。
[0335]本發(fā)明用于診斷癌癥的方法可通過如上所述測定抗⑶C45L抗體量和相應對照樣品中的量之間的差異來進行。若受試者的細胞或組織含有針對該基因的表達產(chǎn)物(CDC45L)的抗體和抗CDC45L抗體的數(shù)量測定為大于截留值(與正常對照中的水平相比)的話，則懷疑該受試者患有癌癥。
[0336]在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的合適方法早已確立(例如AltmanJD et al.，Science.1996，274(5284):94-6)。因此，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復合物可用于檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌癥的復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進一步，它可用于選擇包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的合適受試者或評估該藥物的治療效果O
[0337]特別地,依照已知方法(參見例如Altman JD et al., Science.1996, 274(5284):94-6)，可制備放射性標記的HLA分子與本發(fā)明肽的寡聚物復合物，諸如四聚體。可使用該復合物來對源自懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細胞中的抗原-肽特異性CTL定量。
[0338]本發(fā)明進一步提供了如本文所述使用肽表位來評估受試者的免疫學應答的方法和診斷劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，本文所述的HLA限制肽可作為試劑用于評估或預測受試者的免疫應答。要評估的免疫應答可通過在體外或在體內(nèi)使免疫原接觸有免疫能力的細胞來誘導。在某些實施方案中，作為試劑采用的物質(zhì)或組合物可以是任何能導致識別和結(jié)合肽表位的抗原特異性CTL的生成的物質(zhì)或組合物。肽試劑無需用作免疫原。用于此類分析的測定系統(tǒng)包括相對較 新的技術(shù)發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放測定法、或ELISP0T測定法。在一個優(yōu)選的實施方案中，要用肽試劑接觸的有免疫能力的細胞可以是抗原呈遞細胞，包括樹突細胞。
[0339]例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測定法，在暴露于腫瘤細胞抗原或免疫原后，對外周血單個核細胞評估抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復合物可用于直接顯現(xiàn)抗原特異性 CTL(參見例如 Ogg et al.，Science279:2103-2106, 1998;和 Altman etal, Sciencel74:94-96, 1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。
[0340]與HLA分子結(jié)合的肽在相應HLA重鏈和β 2_微球蛋白存在下重折疊以生成三分子復合物。在該復合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質(zhì)中的位點處被生物素化。然后，將鏈霉親合素添加至復合物以形成由所述三分子復合物與鏈霉親合素組成的四聚體。借助熒光標記的鏈霉親合素，四聚體能用于對抗原特異性細胞染色。然后可鑒定細胞，例如通過流式細胞術(shù)。此類分析可用于診斷或預后目的。通過該規(guī)程鑒定的細胞也可用于治療目的。
[0341]本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應答的試劑(參見例如 Bertoni et al,J.Clin.1nvest.100:503-513,1997 和 Penna et al.,J Exp.Med.174:1565-1570, 1991)。例如，可使用特定肽對來自具有要治療的癌癥的個體的患者PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細胞的血液樣品可通過培養(yǎng)PBMC并用本發(fā)明的肽刺激該細胞來加以評估。經(jīng)過適宜的培養(yǎng)期后，可對擴增的細胞群體分析例如CTL活性。
[0342]所述肽還可作為試劑用于評估疫苗的功效。例如可使用上文所述的方法來分析自接種過免疫原的患者獲得的PBMC。測定患者的HLA型，并選擇識別患者中存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領(lǐng)域公知技術(shù)(參見例如CURRENTPR0T0C0LSINIMMUN0L0GY，Wiley/Greene, NY;和 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow andLane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用于診斷、檢測或監(jiān)測癌癥。此類抗體可包括識別HLA分子背景下的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC復合物的抗體。
[0343]本發(fā)明的肽和組合物還具有多種別的用途，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明提供了一種用于診斷或檢測以⑶C45L免疫原性多肽表達為特征的病癥的方法。這些方法涉及測定⑶C45L HLA結(jié)合肽、或⑶C45L HLA結(jié)合肽和I類HLA分子形成的復合物在生物學樣品中的表達。肽或肽和I類HLA分子形成的復合物的表達可通過用針對肽或復合物的結(jié)合配偶測定來測定或檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對肽或復合物的結(jié)合配偶可以是識別和特異性結(jié)合肽的抗體。CDC45L在生物學樣品諸如腫瘤活檢中的表達也可使用⑶C45L引物通過標準PCR擴增方案來測試。本文中呈現(xiàn)了腫瘤表達的一個例子，而且用于CDC45L擴增的例示性條件和引物的進一步公開內(nèi)容可見于W02003/27322。[0344]優(yōu)選的診斷方法涉及使自受試者分離的生物學樣品接觸對CDC45L HLA結(jié)合肽特異性的作用劑以檢測CDC45L HLA結(jié)合肽在生物學樣品中的存在。如本文中使用的，“接觸”意味著放置生物學樣品使其在適宜條件(例如濃度、溫度、時間、離子強度)下足夠接近試劑以容許試劑和生物學樣品中存在的⑶C45L HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般地，試劑接觸生物學樣品的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的促進生物學樣品中分子與其關(guān)聯(lián)物(例如蛋白質(zhì)與其受體關(guān)聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關(guān)聯(lián)物、核酸與其互補序列關(guān)聯(lián)物)之間的特異性相互作用的條件。用于促進分子與其關(guān)聯(lián)物之間的特異性相互作用的例示性條件記載于授權(quán)給Low等人的美國專利N0.5，108，921。
[0345]本發(fā)明的診斷方法可以在體外和/或在體外實施。因而，生物學樣品在本發(fā)明中可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對CDC45L免疫原性多肽特異性的試劑來檢測此類分子在組織中的存在?；蛘撸稍隗w外收集或分離生物學樣品(例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物學樣品可以是含有細胞的樣品，更優(yōu)選含有腫瘤細胞的樣品，其是自要診斷或治療的受試者收集的。
[0346]或者，診斷可使用容許通過對熒光素標記的HLA多聚體復合物染色而直接定量抗原特異性 T 細胞的方法來進行(例如 Altman, J.D.et al., 1996, Science274:94; Altman, J.D.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:10330)。還提供了對胞內(nèi)淋巴因子的染色和干擾素-Y釋放測定法或ELISPOT測定法。多聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染色和ELISPOT測定法表觀上均比更常規(guī)的測定法靈敏至少10倍(Mural1-Krishna, K.et al., 1998, Immunity8:177; Lalvani, A.et al., 1997, J.Exp.Med.186:859; Dunbar, P.R.et al., 1998, Curr.Biol.8:413)。也可使用五聚體(例如 US2004-209295A) ,Dextramers (e.g., W002/072631)、和 Streptamers (例如 Nature medicine6.631-637 (2002))。
[0347]X1.杭體[0348]本發(fā)明進一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體能特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會結(jié)合(或會微弱結(jié)合)非本發(fā)明肽?；蛘?，抗體能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同系物。針對本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥診斷和預后測定法、及成像方法。類似地，此類抗體可用于其它癌癥的治療、診斷、和/或預后，只要癌癥患者中也表達或過表達CDC45L。此外，胞內(nèi)表達的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用于治療涉及CDC45L表達的癌癥，例子包括但不限于睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0349]本發(fā)明還提供了多種免疫學測定法，用于檢測和/或量化⑶C45L蛋白(SEQ IDNO: 18)或其片段，包括由選自SEQ ID NO:2，3，4，7和12的氨基酸序列組成的多肽。此類測定法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識別和結(jié)合CDC45L蛋白或其片段的抗CDC45L抗體。在本發(fā)明的語境中，能與⑶C45L多肽結(jié)合的抗⑶C45L抗體優(yōu)選識別由選自SEQ IDN0:2，3，4，7和12的氨基酸序列組成的多肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測試來確認。即，當抗體與所分析的全長⑶C45L多肽之間的結(jié)合在任何由選自SEQ ID NO: 2, 3，4，7和12的氨基酸序列組成的片段多肽存在下受到抑制時，證明此抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明的語境中，此類免疫學測定法按照本領(lǐng)域公知的各種免疫學測定模式實施，包括但不限于各種類型的放射免疫測定法、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定法(ELIFA)、等等。[0350]本發(fā)明的有關(guān)的免疫學的但非抗體的測定法也可包括T細胞免疫原性測定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC結(jié)合測定法。另外，本發(fā)明涵蓋能夠檢測表達CDC45L的癌癥的免疫學成像方法，例子包括但不限于使用經(jīng)標記本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測定法在臨床上可用于表達⑶C45L的癌癥的檢測、監(jiān)測、和預后，例子包括但不限于諸如睪丸腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、慢性髓細胞樣白血病(CML)、軟組織腫瘤、胃癌、肝膽管癌、和結(jié)腸直腸癌。
[0351]本發(fā)明還提供了能與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用，例如單克隆或多克隆抗體，而且可進一步包括通過用本發(fā)明的肽免疫動物諸如家兔而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。
[0352]作為抗原用于獲得抗體的本發(fā)明肽可衍生自任何動物物種，但優(yōu)選衍生自哺乳動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選衍生自人。人衍生的肽可以由本文所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。
[0353]根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。
[0354]在本文中，抗體定義為與CDC45L肽的全長或片段起反應的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體能識別由選自SEQ ID NO:2, 3，4，7和12的氨基酸序列組成的CDC45L的片段肽。用于合成寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。在本發(fā)明的語境中，寡肽(例如9或10聚物)可綴合或連接于載體以增強免疫原性。匙孔蟲戚血藍蛋白(KLH)作為載體是公知的。用于綴合KLH和肽的方法也是本領(lǐng)域公知的。
[0355]或者，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述宿主細胞?？梢酝ㄟ^任何標準方法從宿主細胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片段，然后可將其用作抗原?；蛘?，表達肽的完整細胞或其溶胞物或者化學合成的肽也可用作抗原。
[0356]可以用抗原免疫任何哺乳動物，但優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常，可使用卩齒齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。嚙齒科動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形科動物包括例如家兔。靈長科動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
[0357]用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的載體進行免疫。如上所述進行免疫后，可通過標準方法檢驗血清中所需抗體的量的增加。
[0358]可以如下制備針對本發(fā)明肽的多克隆抗體:從經(jīng)過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經(jīng)檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液,并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清，以及可以從所述血清中分離的含有該多克隆抗體的級分。可以使用例如偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識別本發(fā)明肽的級分中制備免疫球蛋白G或M，并進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
[0359]為了制備單克隆抗體，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物 收集免疫細胞，并進行細胞融合。用于細胞融合的免疫細胞可優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細胞融合的優(yōu)選親本細胞包括例如哺乳動物骨髓瘤細胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細胞而獲得的特性的骨髓瘤細胞。
[0360]根據(jù)已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, MethodsEnzymo173:3-46 (1981))的方法，可與將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞進行融合。
[0361]通過在標準選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中進行培養(yǎng)，可以選擇出由細胞融合得到的雜交瘤。通常，細胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數(shù)天至數(shù)周，這段時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然后，可進行標準有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細胞。
[0362]除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達肽的細胞或其溶胞物免疫人淋巴細胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細胞。然后，使經(jīng)過免疫的淋巴細胞與能夠無限分裂的人衍生骨髓瘤細胞諸如U266融合，以產(chǎn)生生成所需人抗體(它能夠與所述肽結(jié)合)的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請N0.Sho63-17688)。
[0363]隨后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進行純化。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動劑和拮抗劑的候選物。[0364]或者，可以通過癌基因使生成抗體的免疫細胞，諸如經(jīng)過免疫的淋巴細胞永生化，并用于制備單克隆抗體。
[0365]如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來重組制備(參見例如Borrebaeck and Larrickj Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導入宿主細胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。
[0366]此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它能結(jié)合一種或多種本發(fā)明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al., Proc Natl Acad SciUSA85:5879-83 (1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段?；蛘?，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在合適的宿主細胞中表達(參見例如Co et al., J Immunol 152:2968-76 (1994) ; Betterand Horwitz, Methods Enzymol178:476-96(1989);Pluckthun and Skerra, MethodsEnzymol178:497-515(1989);Lamoyi,Methods Enzymol121:652-63(1986);Rousseaux et al., Methods Enzymol121:663-9 (1986) ;Bird and Walker, TrendsBiotechnol9:132-7(1991)) o[0367]抗體可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這樣修飾的抗體?？赏ㄟ^化學修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的。
[0368]或者，可以以衍生自非人抗體的可變區(qū)與衍生自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含衍生自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、衍生自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來制備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替換人抗體的相應序列來進行(參見例如Verhoeyen etal.，Science239:1534-1536 (1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中實質(zhì)上小于全部的人可變域已被來自非人物種的相應序列所替換。
[0369]也可以使用在人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完全人的抗體。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法牽涉使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如 Hoogenboom&ffinter, J.Mol.Biol.227:381 (1991))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos.6，150, 584 ；5, 545,807 ；5, 545,806 ；5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。
[0370]可以將如上獲得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)),但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、POROS 和 Sepharose F.F.(Pharmacia)。
[0371]除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進行層析規(guī)程,諸如HPLC和FPLC。[0372]例如，可使用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)和/或免疫熒光來測量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有所需抗體的樣品，諸如生成抗體的細胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標記的、識別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對硝基苯酯，并測量吸光度以評估樣品的抗原結(jié)合活性?？梢允褂秒牡钠?，諸如C-末端或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Pharmacia)來評估本發(fā)明抗體的活性。
[0373]上述方法允許通過下述方式檢測或測量本發(fā)明的肽:將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測或測量由抗體與肽形成的免疫復合物。
[0374]因為依照本發(fā)明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用于使用肽的各種實驗。
[0375]XI1.載體和宿豐細朐
[0376]本發(fā)明還提供了導入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明的載體可用于在宿主細胞中維持本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA，用于表達本發(fā)明的肽，或者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。
[0377]當宿主細胞為大腸桿菌且在大腸桿菌(例如JM109、DH5 a、HBlOl或XLlBlue)中大量擴增和生成載體時，載體應具有能在大腸桿菌中擴增的“(復制)起點”和用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標志基因(例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用Μ13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等。另外，除了上述載體，pGEM-T、pDIRECT 和 pT7 也可以用于亞克隆和提取cDNA。當使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，可使用表達載體。例如，要在大腸桿菌中表達的表達載體應具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當使用大腸桿菌諸如JM109、DH5 a、HBlOl或XLlBlue作為宿主細胞時，載體應具有能在大腸桿菌中高效表達所需基因的啟動子，例如 IacZ 啟動子(Ward et al., Nature341:544-6 (1989) ; FASEBJ6:2422-7 (1992))、araB 啟動子(Better et al.，Science240:1041-3 (1988))、T7 啟動子等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_l (Pharmacia)、“QIAexpress 系統(tǒng)”(Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況下，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體還可以包含用于多肽分泌的信號序列。指導肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列有pelB信號序列(Lei et al., J Bacteriol 169:4379 (1987))。用于將載體導入靶宿主細胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。
[0378]在大腸桿菌外，可以使用例如衍生自哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Resl8(17):5322(1990))、pEF、pCDM8)、衍生自昆蟲細胞的表達載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBC0 BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表達載體(例如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、衍生自動物病毒的表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表達載體(例如“畢赤酵母表達試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢桿菌的表達載體(例如PPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。
[0379]為了在動物細胞諸如CH0、C0S或NIH3T3細胞中表達載體，載體應具有在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.，Nature277:108 (1979))、MMLV-LTR 啟動子、EFl α 啟動子(Mizushima et al., Nucleic Acids Resl8:5322 (1990))、CMV啟動子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標志基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 p0P13。
[0380]描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實踐或測試本發(fā)明。本文通過提述并入本文中提及的所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻的全部內(nèi)容。如果有沖突，當以本說明書包括定義在內(nèi)為準。此外，所述材料、方法和實施例均只是例示的目的，而不意在構(gòu)成限制。
[0381]提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0382]實施例
[0383]材料和方法
[0384]cDNA微陣列分析
[0385]如前人所述(NakamuraT et al., 0ncogene2004; 23:2385-400, Taniwaki M etal., Int J 0ncol2006 ;29:567-75)利用cDNA微陣列分析生成了基因表達譜。微陣列分析的原始數(shù)據(jù)可從Y.Nakamura教授(東京大學醫(yī)學研究所)處索取。從手術(shù)標本獲取了來自肺癌和鄰近非癌性正常肺組織的組織樣品，且所有的患者均提供了參與該項研究的知情同意書。
`[0386]小鼠
[0387]六周齡雌性不肥胖糖尿病(NOD)/重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠購自CharlesRiver Laboratories Japan。該小鼠在熊本大學動物資源與開發(fā)中心飼養(yǎng),其操作符合熊本大學的動物照看規(guī)范。
[0388]細胞系和HLA表達
[0389]CDC45L 和 HLA_A*2402 陽性人肺癌細胞系 EBC-1 和 Lu99 由 Health ScienceResearch Resources Bank(Tsukuba, Japan)惠贈。C1R-A2402 細胞，即表達痕量內(nèi)在HLA I類分子的類人B淋巴細胞母細胞系ClR的HLA-A*2402轉(zhuǎn)染子(KarakiS，Kariyone A,Kato N，Kano K, Iwakura Y，Takiguchi M.HLA-B51transgenicmice as recipients for production of polymorphic HLA-AjB—specificantibodies.1mmunogenetics1993;37:139-42)26 由 Masafumi Takiguchi 博士 (Kumamoto University, Kumamoto, Japan)惠贈。CDC45L 陽性人胰腺癌細胞系PANCl (HLA-A*0201+，HLA-A*2402_)和 TAP 缺陷且 HLA_A*0201 陽性細胞系 T2 購自 RikenCell Bank0 分別使用抗 HLA-A2 單克隆抗體(單抗)，BB7.2 (One Lambda, Inc.，CanogaPark, CA)和抗HLA-A24單抗(One Lambda, Inc.)進行流式細胞術(shù)來檢查HLA-A2和HLA-A24的表達，以選擇HLA-A24和HLA-A2陽性的供血者用于測定。將這些細胞在添加了 10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37°C、5%C02氣氛中體外保持。[0390]患者、血液樣品和腫瘤組織
[0391]用于收集和使用來自供體的PBMC的研究方案得到了熊本大學機構(gòu)評審委員會(Institutional Review Board of Kumamoto University)的批準。在熊本大學醫(yī)院，在獲得了知情同意書后，在常規(guī)診斷程序中自患者獲取了血液樣品或癌性組織以及鄰近的非癌性組織。還在獲得了知情同意書后從健康供體獲取了血液樣品。所有樣品隨機編號以掩飾其身份，并將血液樣品儲存于_80°C直到使用。
[0392]逆轉(zhuǎn)錄-PCR和Northern印跡分析
[0393]如前人所述(NakatsuraT et al., Biochem Biophys ResCommun2001; 281:936-44)對細胞系和正?；虬┬越M織進行了逆轉(zhuǎn)錄-PCR (RT-PCR)分析。CDC45L 引物序列為 5，-CTGGTGTTGCACAGGCTGTCATGG-3’ (SEQ ID NO: 19)(有義)和5’-CGCACACGGTTAGAAGAGGAG-3’ (SEQ ID N0:20)(反義)。利用 β -肌動蛋白 mRNA 作為對照進行標準化后，我們對組織和細胞系中的⑶C45L mRNA的表達進行了比較。如前人所述(Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun2003; 306:16-25)使用 CDC45L基因特異性cDNA探針(對應于1245至1867bp)進行了 Northern印跡分析。 [0394]免疫組織化學染色
[0395]人⑶C45L的免疫組織化學檢查如前人所述(Nakatsura T et al., BiochemBiophys Res Commun2001; 281:936-44)加一些更改進行。簡言之，在組織切片脫石蠟和脫水后，將內(nèi)源過氧化物用含0.3%過氧化氫的甲醇淬滅15分鐘，并通過與蛋白質(zhì)封閉無血清試劑(Dako) —起溫育10分鐘來降低非特異性結(jié)合。用緩沖溶液(含0.l%Tween20和
0.5M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液)清洗后，將在Can Get Signal (R)免疫染色溶液A (Toyobo C0., Osaka, Japan)中稀釋的一抗(在家兔中生成的抗人⑶C45L抗體，1:100稀釋，HPA000614，親和純化的，Sigma-Aldrich)與樣品一起于4°C溫育過夜。此后，將切片用緩沖溶液仔細漂洗，并與二抗(LABLED-POLYMER-HRP，抗小鼠和抗家兔抗體，Dako) 一起于室溫溫育。用緩沖溶液清洗三次后，通過與3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺溶液(液體DAB+底物色原體系統(tǒng)，Dako) —起溫育來進行染色反應。然后將載玻片用蘇木精輕度復染色，在乙醇中脫水，并在二甲苯中透明。使用已知表達⑶C45L的睪丸的切片作為抗人⑶C45L抗體的陽性對照。對于陰性對照，我們用普通家兔IgG替換一抗。
[0396]肽
[0397]利用BIMAS 軟件程序(Bioinformatics and Molecular AnalysisSection, Center for Information Technology, NIH, Bethesda, MD)選出攜帶針對HLA-A*2402編碼的分子的結(jié)合基序的人Q3C45L衍生肽,并合成(AnyGen, Gwangju, Korea)了 16種肽(10種九聚物和6種十聚物，純度>95%)(表1)。將肽以20 μ g/mL的濃度溶解在二甲亞砜中并保存于_80°C。使用兩種HIV肽，即HLA-A24限制性RYLRDQQLL(SEQ IDN0:21)肽(HIV-A24)和 HLA-A2 限制性 SLYNTYATL(SEQ ID NO:22)肽(HIV-A2)，作為陰性對照(Komori H et al., Clin Cancer Res2006 ; 12:2689-97)。
[0398]表1:自人CDC45L衍生的預測結(jié)合HLA-A24 (A*2402)的候選肽
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合HLA抗原且具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力的分離的肽，其中該肽衍生自由氨基酸序列SEQ ID NO: 18組成的多肽或其免疫學活性片段。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
3.權(quán)利要求1或2的分離的肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列:
(a)SEQ ID NO: 4，2，3，7 和 12 ;和 (b)SEQID N0:4，2，3，7和12，其中替換、插入、刪除和/或添加了 I個、2個、或幾個氨基酸。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的分離的肽，其中所述的肽具有下列特征之一或二者: (a)N端起第二個氨基酸為或修飾為選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和 (b)C端氨基酸為或修飾為選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。
5.權(quán)利要求1至3中任一項的分離的肽，其中所述的肽具有下列特征之一或二者: (a)N端起第二個氨基酸為或修飾為選自亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和 (b)C端氨基酸為或修飾為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
7.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1至6中任一項的肽。
8.一種用于誘導CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1至6中任一項所述的肽或者一種或多種權(quán)利要求7所述的多核苷酸。
9.一種用于治療和/或預防癌癥和/或防止其手術(shù)后復發(fā)的藥物組合物，其中該組合物包含一種或多種權(quán)利要求1至6中任一項所述的肽,或一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其配制為用于對HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的受試者施用。
11.權(quán)利要求9或10的藥物組合物，其配制為用于治療癌癥。
12.一種用于誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞(APC)的方法，其中該方法包括選自下組的步驟: (a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸權(quán)利要求1至6中任一項的肽；和 (b)將編碼權(quán)利要求1至6中任一項的肽的多核苷酸導入APC。
13.一種用于誘導CTL的方法，其中該方法包括選自下組的步驟: (a)共培養(yǎng)CD8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1至6中任一項的肽的復合物的APC ； (b)共培養(yǎng)CD8-陽性T細胞與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1至6中任一項的肽的復合物的外來體；和 (c)將包含編碼能夠結(jié)合權(quán)利要求1至6中任一項的肽的T細胞受體(TCR)亞基多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細胞。
14.一種分離的APC，該APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1至6中任一項的肽的復合物。
15.權(quán)利要求14的APC，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導的。
16.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1至6中任一項的肽。
17.權(quán)利要求16的CTL，其是通過權(quán)利要求13的方法誘導的。
18.一種在受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法，其中該方法包括對所述受試者施用包含一種或多種權(quán)利要求1至6中任一項的肽、一種或多種其免疫學活性片段、或一種或多種編碼所述肽或片段的多核苷酸的組合物。
19.一種抗體或其片段，其針對權(quán)利要求1至6中任一項的肽。
20.—種載體,其包含編碼權(quán)利要求1至6中任一項的肽的核苷酸序列。
21.一種宿主細胞，其經(jīng)過依照權(quán)利要求20的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
22.—種診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1至6中任一項的肽、權(quán)利要求7的多核苷酸或權(quán)利要求19的抗體。
【文檔編號】A61P35/00GK103694315SQ201310610796
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2009年5月26日
【發(fā)明者】西村泰治, 富田雄介, 中村佑輔, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司