一種葉酸和tat肽共修飾的載藥脂質體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體及其制備方法，該載藥脂質體包括脂質體、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材和藥物。同時本發(fā)明提供了該葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，該方法包括如下步驟：稱取磷脂、膽固醇、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材及藥物，用有機溶劑溶解，隨后在50℃條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜;向含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22μm膜，過濾10次，得到雙靶載藥脂質體。本發(fā)明借助不同重均分子量的PEG連接TAT肽與特異性配體，構建雙配體修飾的納米載體，制得的載藥脂質體可實現(xiàn)高效的藥物腫瘤細胞內輸送。
【專利說明】一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物載體領域，特別涉及一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]納米載體在化療藥物腫瘤選擇性遞送中顯示出巨大潛力，值得關注的是，這種借助納米技術治療的方式取得的抗腫瘤效果仍然非常有限，其原因很可能是由于納米載體不夠高效地將化療藥物輸送進入腫瘤細胞，限制了化療藥物抗腫瘤活性的發(fā)揮。納米載體透過血管進入腫瘤間質主要通過對流和擴散的方式。與此同時,腫瘤間質中較高的組織間隙壓(IFP)促使組織液反向流動到周圍組織中，從而妨礙了納米載體滲透到實體腫瘤內部。透過腫瘤血管間隙和窗孔的納米載體如能快速被腫瘤細胞攝取，那么IFP所引起的負影響將被緩解。有鑒于此，基于大多數(shù)腫瘤細胞表面高度表達一些特異性受體，配體修飾的策略已被廣泛采用，連接配體的納米載體可通過受體-配體介導的內吞被腫瘤細胞選擇性攝取。然而，腫瘤細胞表面受體的表達量并不恒定，另外受體-配體介導的細胞內吞存在飽和現(xiàn)象，導致配體修飾的納米載體改善腫瘤治療的效果依舊有限。
[0003]TAT肽為細胞穿透肽(Cell penetrating peptides, CPPs)中的一種，能夠攜帶多種不同大小和性質的生物活性物質進入細胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸、蛋白質、質粒DNA、siRNA、200 nm的脂質體、噬菌體顆粒和超順磁性粒子等，實現(xiàn)治療藥物的細胞跨膜轉運。雖然現(xiàn)有的細胞穿透肽跨膜轉運作用的確切機制尚不清楚，但許多研究已表明細胞穿透肽氨基酸序列中的堿性氨基酸發(fā)揮了主要作用。然而，由于細胞穿透肽缺乏足夠的細胞選擇性，一定程度上限制了它在藥物靶向輸送方面的應用。
【發(fā)明內容】
[0004]葉酸(Folic acid)是一種水溶性的維生素，為人體必需的微量元素，研究表明大多數(shù)實體瘤腫瘤細胞表面廣泛表達葉酸受體，因此葉酸常被用作腫瘤靶向的配體。為克服葉酸修飾的納米遞藥載體在藥物靶向遞送中存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體及其制備方法，以期實現(xiàn)抗腫瘤藥物的高效腫瘤細胞內遞送。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn):
一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，組分包括脂質體、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材和藥物，所述的脂質體主要成分為磷脂和膽固醇。
[0006]所述葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，包含以下重量份的組分制成:
脂質體1份；
長鏈祀向膜材1- 10份；
短鏈靶向膜材1-5份；
藥物0.01 -0.2份。
[0007] 所述長鏈靶向膜材為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-葉酸(DSPE-PEG-FA)，所述短鏈靶向膜材為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-TAT (DSPE-PEG-TAT)。
[0008]所述長鏈靶向膜材中的PEG重均分子量選自1000、2000、3400或5000 ;短鏈靶向膜材中的PEG重均分子量選自750、1000、2000或3400 ;所述長鏈靶向膜材中PEG重均分子
量大于短鏈祀向膜材中PEG重均分子量。
[0009]所述脂質體中磷脂選自磷脂豆磷脂、卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｒ掖及?、磷脂酰甘油、琥珀酸膽固醇酯和磷脂酰絲氨酸中的一種或一種以上。
[0010]所述藥物為紫杉醇、多西他賽、阿霉素、羥基喜樹堿、鹽酸阿霉素、順鉬、兩性霉素B、柔紅霉素、胞嘧啶、阿糖胞苷、長春新堿、依托泊苷和伊達比星中一種或幾種。
[0011]所述磷脂與膽固醇的質量比為4-5:1。
[0012]一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，該方法包括如下步驟:
(1)稱取磷脂、膽固醇、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材及藥物，用有機溶劑溶解，隨后在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜；
(2)向含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到雙靶載藥脂 質體。
[0013]一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，該方法包括如下步驟:
(1)稱取磷脂、膽固醇及藥物，用有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜；
(2)向含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到載藥脂質體；
(3)稱取長鏈靶向膜材和短鏈靶向膜材，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，靶向膜材溶液逐滴滴入步驟(2)中的載藥脂質體中，保溫，冷卻，得到雙靶載藥脂質體。
[0014]一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，該方法包括如下步驟:
(1)稱取磷脂及膽固醇，用有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到不含藥脂膜；
(2)向不含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，加壓過0.22 μπι膜10次，得到空白脂質體，進一步用磷酸氫二鈉水溶液調節(jié)pH至7.6，加入藥物，700C下，混合30 min，冷卻至室溫，透析除去游離藥物，制得載藥脂質體；
(3)隨后，稱取長鏈靶向膜材及短鏈靶向膜材，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，逐滴滴入步驟(2)的載藥脂質體中，55°C下保溫lh，冷卻，制備得到雙靶載藥脂質體。
[0015]所述有機溶劑為氯仿:乙醇=2:1 ;所述磷脂為0.8-0.83重量份；所述膽固醇為
0.17-0.2重量份；所述長鏈靶向膜材為1- 10重量份；所述短鏈靶向膜材為1-5重量份；所述藥物為0.01 -0.2重量份；所述磷脂與膽固醇的質量比為4-5:1。
[0016]所述的葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體在治療卵巢癌、肺癌、結腸癌、子宮內膜癌、腦癌、乳腺癌和腎腫瘤疾病中的用途。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果為:
(I)本發(fā)明借助不同重均分子量的PEG連接TAT肽與特異性配體，構建雙配體修飾的納米載體，將有望同時發(fā)揮非特異性和特異性配體在細胞內轉運藥物的優(yōu)勢，提升化療藥物的腫瘤細胞內轉運效率。[0018](2)本發(fā)明的雙靶載藥脂質體易于制備，同時其表面配體密度易于控制。
[0019](3)本發(fā)明用長鏈聚乙二醇(PEG)將葉酸分子連接到脂質體表面，用短鏈聚乙二醇(PEG)連接非特異性的TAT肽，通過靜脈注射給藥后，在血液循環(huán)中TAT肽的非選擇性被長鏈PEG所限制，到達腫瘤部位后，暴露在脂質體最外端的FA可特異識別腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體，并與葉酸受體結合，縮短了 TAT肽和細胞膜間的距離，進而發(fā)揮TAT肽的穿膜作用，有效將脂質體帶入細胞內。
[0020](4)長鏈PEG連接特異性配體FA可使其充分暴露在脂質體表面而有效地識別腫瘤細胞表面過度表達的受體，通過柔性的短鏈PEG連接TAT肽，可降低長鏈PEG產(chǎn)生的空間位阻,使TAT肽可自由與細胞膜作用。
[0021](5)本發(fā)明的雙靶載藥脂質體在細胞內，其藥物遞送效率高度依賴于腫瘤細胞表面過度表達的受體，不同于通過化學敏感鍵連接的納米載體，不需要任何外加刺激或人為操作，即可實現(xiàn)高效的藥物腫瘤細胞內輸送。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實施例1的雙靶載藥脂質體的粒徑分布圖。
[0023]圖2為阿霉素脂質體和本發(fā)明實施例1的雙靶載藥脂質體的透射電鏡(TEM)形態(tài)圖，其中A為阿霉素脂質體，B為實施例1的雙靶脂質體。
[0024]圖3為本發(fā)明實施例1的雙靶載藥脂質體與阿霉素脂質體、PEG脂質體和單靶脂質體I在不同阿霉素濃度 下的細胞存活率圖。
[0025]圖4為流式細胞儀的測試結果圖,其中A為PEG脂質體,B為單祀脂質體I,C為單靶脂質體2，D為本發(fā)明實施例1的雙靶載藥脂質體。
【具體實施方式】
[0026]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0027]測試方法:
粒徑與Zeta電位測試方法:取樣品用純水稀釋后，采用粒徑與Zeta電位儀分別測定粒徑及電位，每種樣品平行測定三份，測試結果見表1，粒徑分布見圖1。
[0028]包封率的測定:采用超濾離心法測定包封率，分別取0.5ml的樣品，置于IOkD超濾離心管中，10000 rpm，離心15 min，將濾液稀釋，采用HPLC進行分析，結果見表1。
[0029]包封率％=(投入的總藥量一游離的藥量)/投入的總藥量X 100%
透射電鏡(TEM)形態(tài)觀察:將待測樣品滴加至專用銅網(wǎng)上，干燥后進行TEM掃描，結果見圖2。
[0030]脂質體細胞毒性考察:KB細胞用不含葉酸的DMEM培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中，37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期KB細胞用0.25%胰酶消化后，以5X IO4 cells/mL接種于96孔板中，每孔100 μ L，將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度(0.01,0.1,0.5、1、2、2.5、5、10、20 μ g/mL)不同類型阿霉素脂質體溶液及相應游離DOX溶液100 μ L，每組設五復孔，37°C、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時后去除板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，加入100 μ L Folate-free DMEM (10% 5 mg/mL MTT)的混合液，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100 uL DMS0，輕輕振蕩5 min，使結晶充分溶解，在酶標儀上測492 nm處吸光度(0D492)，由OD值計算細胞存活率，公式為:細胞存活率(Cell Viability) =(實驗組OD值一空白組OD值)/ (對照組OD值一空白組OD值)X 100% ;細胞存活率見圖3，計算IC50值，如表2。
[0031] 脂質體細胞攝取考察:取對數(shù)生長期KB細胞以濃度為IXlO5 cells/mL接種于6孔板中，每孔接種2 mL,貼壁培養(yǎng)24 h后，更換為含各種脂質體的培養(yǎng)液100 μ L培養(yǎng)I h后，棄去培養(yǎng)液，用冷的PBS清洗三次；胰酶消化后離心，棄上清液，加入0.5 mLPBS吹打成細胞懸液，置于流式細胞儀中進行分析。
[0032]實施例1
(1)稱取磷脂豆磷脂0.Sg及膽固醇0.2g，用氯仿:乙醇=2:1 (體積比)的有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到不含藥脂膜；
(2)向不含藥脂膜中加入pH7.6磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，加壓過0.22 μπι膜10次，得到空白脂質體，進一步用磷酸氫二鈉水溶液調節(jié)PH至7.6，加入阿霉素0.15g，70°C下，混合30 min，冷卻至室溫，制得載藥脂質體；
(3)隨后，稱取DSPE-PEG5_-FAIOg及DSPE-PEG2Q(i(1-TAT 5g，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，逐滴滴入步驟(2)的載藥脂質體中，55°C下保溫lh，冷卻，制備得到雙靶載藥脂質體。
[0033]對實施例1所得的雙靶載藥脂質體進行測試，粒徑如圖1所示，可看出雙靶載藥脂質體粒徑分布均勻且均小于200nm，可有效的實現(xiàn)EPR效應；用透射電鏡得到形態(tài)圖，如圖2所示，可看出該雙靶載藥脂質體形態(tài)圓整、粒徑均一，且配體成功的插入載藥脂質體中，同時TAT肽的正電荷被完全屏蔽；圖3可看出雙靶載藥脂質體與PEG脂質體及各單靶脂質體相比，在各個濃度下均表現(xiàn)出較強的細胞毒性；圖4可看出雙靶載藥脂質體與PEG脂質體、單靶脂質體1、單靶脂質體2相比，其熒光強度最強，證明經(jīng)雙靶修飾后能顯著提高細胞攝取，表現(xiàn)出更強的腫瘤殺傷活性，有利于發(fā)揮抗癌藥物的細胞毒作用。
[0034]實施例2
(1)稱取氫化大豆卵磷脂0.8g、膽固醇 0.2g、DSPE-PEG34QQ-FA lg、DSPE-PEG3(l(l(l-TAT Ig及羥基喜樹堿0.2g，用氯仿:乙醇=2:1 (體積比)的有機溶劑溶解，隨后在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜；
(2)向含藥脂膜中加入pH7.6磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到雙靶載藥脂質體。
[0035]實施例3
(1)稱取卵磷脂0.Sg、膽固醇0.2g及紫杉醇0.01 g，用氯仿:乙醇=2:1 (體積比)的有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜；
(2)向含藥脂膜中加入pH7.6磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到載藥脂質體；
(3)稱取DSPE-PEGiqqq-FAIOg和DSPE-PEG75(l-TAT5g，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，逐滴滴入步驟(2)中的載藥脂質體中，保溫，冷卻，得到雙靶載藥脂質體。
[0036]對比例
PEG脂質體、單靶脂質體I和單靶脂質體2的制備方法如下:
分別取 DSPE-PEG5cicic1-FA、DSPE-PEG2000-TAT 和 DSPE_PEG5__NH2 靶向膜材，分別溶于 pH
7.6的磷酸鹽緩沖液中，按靶向膜材與磷脂的摩爾比分別為5%、2.5%及5%，分別吸取靶向膜材溶液滴入等量的阿霉素脂質體中，55°C下保溫lh，冷卻，分別得到單靶脂質體1、單靶脂質體2及PEG脂質體。
[0037]單靶脂質體3 的制備方法為:將 5% 的 DSPE-PEG5qqq-NH2 及 2.5% 的 DSPE-PEG2(I(I(1-TAT的膜材水溶液滴入等量的阿霉素脂質體中，55°C下保溫lh，冷卻，得到單靶脂質體3。
[0038]表1不同類型脂質體粒徑、電位及包封率(/7=3)
【權利要求】
1.一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，其特征在于，組分包括脂質體、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材和藥物，所述的脂質體主要成分為磷脂和膽固醇。
2.根據(jù)權利要求1所述葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，其特征在于，包含以下重量份的組分制成: 脂質體1份； 長鏈祀向膜材 1-10份； 短鏈靶向膜材 1-5份； 藥物0.01 -0.2份。
3.根據(jù)權利要求1所述葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，其特征在于，所述長鏈靶向膜材為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-葉酸，所述短鏈靶向膜材為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-TAT ;所述長鏈靶向膜材中的PEG重均分子量選自1000、2000、3400或5000 ;短鏈靶向膜材中的PEG重均分子量選自750、1000、2000或3400 ;所述長鏈靶向膜材中PEG重均分子量大于短鏈靶向膜材中PEG重均分子量。
4.根據(jù)權利要求1中所述葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體，其特征在于，所述脂質體中磷脂選自磷脂豆磷脂、卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、琥珀酸膽固醇酯、磷脂酰絲氨酸中的一種或一種以上；所述藥物為紫杉醇、多西他賽、阿霉素、羥基喜樹堿、鹽酸阿霉素、順鉬、兩性霉素B、柔紅霉素、胞嘧啶、阿糖胞苷、長春新堿、依托泊苷和伊達比星中一種或幾種；所述磷脂與膽固醇的質量比為4-5:1。
5.一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)稱取磷脂、膽固醇、長鏈靶向膜材、短鏈靶向膜材及藥物，用有機溶劑溶解，隨后在50°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜； (2)向含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到雙靶載藥脂質體。
6.一種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)稱取磷脂、膽固醇及藥物，用有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到含藥脂膜； (2)向含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，用0.22 ym膜，過濾10次，得到載藥脂質體； (3)稱取長鏈靶向膜材和短鏈靶向膜材，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，靶向膜材溶液逐滴滴入步驟(2)中的載藥脂質體中，保溫，冷卻，得到雙靶載藥脂質體。
7.—種葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)稱取磷脂及膽固醇，用有機溶劑溶解，在40°C條件下減壓旋干有機溶劑，得到不含藥脂膜； (2)向不含藥脂膜中加入磷酸鹽緩沖溶液中溶解，超聲2分鐘，加壓過0.22 ym膜10次，得到空白脂質體，進一步用磷酸氫二鈉水溶液調節(jié)PH至7.6，加入藥物，70°C下，混合.30 min，冷卻至室溫，透析除去游離藥物，制得載藥脂質體； (3)隨后，稱取長鏈靶向膜材及短鏈靶向膜材，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，逐滴滴入步驟(2)的載藥脂質體中，55°C下保溫lh，冷卻，制備得到雙靶載藥脂質體。
8.根據(jù)權利要求5-7中任一項所述的葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑為氯仿:乙醇=2:1 ;所述磷脂為0.8-0.83重量份；所述膽固醇為0.17-0.2重量份；所述長鏈靶向膜材為1- 10重量份；所述短鏈靶向膜材為1-5重量份；所述藥物為0.01 -0.2重量份；所述磷脂與膽固醇的質量比為4-5:1。
9.權利要 求1-4中任一項所述的葉酸和TAT肽共修飾的載藥脂質體在治療卵巢癌、肺癌、結腸癌、子宮內膜癌、腦癌、乳腺癌和腎腫瘤疾病中的用途。
【文檔編號】A61K9/127GK103976954SQ201410214337
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權日:2014年5月21日
【發(fā)明者】程亮, 朱亞勤, 李玲, 程麗芳, 陳大為 申請人:蘇州大學