用于疫苗的草肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包括用于預(yù)防或治療房塵螨過敏癥的肽的組合物，并且特別涉及用于預(yù)防或治療所述過敏癥的肽的最佳組合。
【專利說明】用于疫苗的草肽
[0001] 本申請是申請日為2010年2月5日，申請?zhí)枮?01080006665.3，發(fā)明名稱為“用于疫苗的草肽”的申請的分案申請。
_2] 通過引用并入
[0003]以下優(yōu)先權(quán)申請的內(nèi)容在此通過引用并入:于2009年2月5日提交的英國專利申請第0901928.2號，于2009年2月5日提交的英國專利申請第0901927.4號，于2009年7月20日提交的英國專利申請第0912578.2號，于2009年8月14日提交的國際專利申請第PCT/GB09/01995號和于2009年10月12日提交的英國專利申請第0917871.6號。
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療草過敏癥的組合物。
_5] 發(fā)明背景
[0006]T細(xì)胞抗原識別需要抗原呈遞細(xì)胞(APC)在其細(xì)胞表面上呈遞與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的分子締合的抗原片段(肽)。T細(xì)胞使用其抗原特異性T細(xì)胞受體(TCR)來識別由APC呈遞的抗原片段。這樣的識別作為免疫系統(tǒng)的觸發(fā)器起作用來產(chǎn)生一系列應(yīng)答以根除已被識別的抗原。
[0007]生物體如人類的免疫系統(tǒng)對外部抗原的識別可在某些情況下造成疾病，其被稱作特應(yīng)性疾患。后者的實例是過敏性疾病，包括哮喘、特應(yīng)性皮炎和過敏性鼻炎。在這一組疾病中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對外源產(chǎn)生的抗原結(jié)合的IgE類抗體(在人類中)，所述抗原在本文稱為過敏原，因為這些分子引發(fā)過敏響應(yīng)。過敏原特異性IgE的產(chǎn)生依賴于也被過敏原活化(并對其有特異性)的T淋巴細(xì)胞。借助于諸如嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等細(xì)胞對IgE表面受體的表達(dá)，過敏原特異性的IgE抗體結(jié)合到這些細(xì)胞表面。
[0008]過敏原對結(jié)合在表面的IgE分子的交聯(lián)造成這些效應(yīng)細(xì)胞脫粒，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)諸如組胺、5-輕色胺和脂質(zhì)介質(zhì)如硫橋白三烯(sulphidoleukotriene)的釋放。除了 IgE依賴性事件，某些過敏性疾病諸如哮喘的特征為IgE獨(dú)立性事件。
[0009]目前用提供癥狀緩解或預(yù)防的劑來治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病。這種劑的實例是抗組胺劑、β 2激動劑和糖皮質(zhì)類固醇。此外，通過包括過敏原成分或提取物的定期注射的去敏化程序來治療一些IgE介導(dǎo)的疾病。去敏化治療可誘導(dǎo)與IgE競爭過敏原的IgG響應(yīng)，或可誘導(dǎo)阻斷針對過敏原的IgE的合成的特定抑制性T細(xì)胞。這種形式的治療不是總有效，并且具有激起嚴(yán)重副作用特別是一般過敏性休克的風(fēng)險。這可以是致命的，除非立即意識到并用腎上腺素治療。將減少或消除針對特定過敏原的不想要的過敏-免疫應(yīng)答而不改變對其它外來抗原的免疫反應(yīng)性或觸發(fā)本身過敏響應(yīng)的治療性處理將對過敏個體大有益處。
[0010]普遍認(rèn)為，草過敏原是包括哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮炎在內(nèi)的人類和動物過敏性疾病的主要原因。存在于草花粉中的蛋白是尤其重要的。例如，約90%的干草熱患者對草花粉過敏。干 草熱是一種形式的季節(jié)性過敏癥的統(tǒng)稱，其特征是打噴嚏、流鼻涕和眼睛發(fā)癢。術(shù)語“干草熱”源于該形式的變應(yīng)性疾病在“割干草季節(jié)”中最為流行，該季節(jié)與許多草的花期相應(yīng)，此時禾本植物釋放最大量的花粉。其在夏季尤其流行，通常從5月末到8月末(在北半球)。
[0011]在美國，據(jù)計算干草熱對于成人是第五位的主要慢性病并是缺勤的主要原因，這導(dǎo)致每年失去或減少近4百萬個工作日，導(dǎo)致總生產(chǎn)力損失方面超過$7億的總損失。過敏癥還是兒童中最常報道的慢性病癥，對于40%以上的兒童，限制了其活動。每年，過敏癥在美國導(dǎo)致了 17，000，000次以上的門診就診；這些過敏癥就診的一半以上是因諸如干草熱的季節(jié)性過敏癥導(dǎo)致的。
[0012]因此治療性或預(yù)防性治療將對患有草過敏癥的人或處于患草過敏癥的風(fēng)險的人具有極大益處。
[0013]發(fā)明概沭
[0014]通常將草花粉過敏原分組，在每一組中絕大多數(shù)物種表達(dá)至少一種花粉過敏原。組的例子包括:
[0015]-組I草花粉過敏原,其包括,例如,來自黑麥草(Loliumperenne)的蛋白Lol pi和來自貓尾草(Phleum pratense)的蛋白Phl pi ;和
[0016]-組5草花粉過敏原，其包括，例如，來自黑麥草的蛋白Lolp5a和蛋白Lol p5b，來自貓尾草的蛋白Phl p5,和來自狗牙根(Cynodon dactylon)的蛋白Cyn d5。
[0017]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，來源于草物種的花粉中的主要過敏原的某些肽片段在使得個體對這些過敏原的去敏化中尤其有用。已篩選了本發(fā)明的多肽組合結(jié)合許多MHC II類分子的能力，和以極小的組胺釋放引起T細(xì)胞增殖的能力。因此可將本發(fā)明的組合物、產(chǎn)物、載體和制劑提供給個體以通過免疫耐受作用(tolerisation)來預(yù)防或治療過敏癥。
[0018]通過使用預(yù)測肽-MHC相互作用的計算機(jī)模擬分析和MHC II類結(jié)合分析，選擇作為MHC II類-結(jié)合T細(xì)胞表位的本發(fā)明的肽。通過同源性來鑒定另外的表位。在體外T細(xì)胞響應(yīng)分析的基礎(chǔ)上對本發(fā)明的肽和肽組合進(jìn)行進(jìn)一步選擇。
[0019]然而，本發(fā)明的肽組合通過靶向多種不同MHC分子而提供對人類人群覆蓋面廣泛的效力。因此，以本發(fā)明的肽配制的疫苗將具有廣泛的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明人的工作產(chǎn)生了具有以下特征的肽組合:
[0021]-該組合結(jié)合許多不同MHCII類分子
[0022]-該組合在草過敏個體中顯著刺激細(xì)胞因子釋放
[0023]-該組合的肽不引起顯著的組胺釋放。
[0024]從廣泛分析的草表位序列中選擇肽組合物以鑒定在草過敏個體中具有特別良好的MHC結(jié)合性質(zhì)和細(xì)胞因子響應(yīng)特征的核心肽。該組合可包括三個這樣的肽的核心，其中每一個選自最普遍的草，貓尾草、黑麥草和狗牙根。該組合可包括四種這樣的肽的核心，這些肽中的每一種選自在肽的相互組合中表現(xiàn)為特別有效的肽。[0025]以這種方式提供肽的核心組，其包括代表三種最普遍的草的多肽的核心組，優(yōu)選同一組合中的四種或多種不同的單獨(dú)的多肽提供各種MHC結(jié)合表位，并從而構(gòu)建冗余性以允許MHC的多態(tài)性性質(zhì)。提供本發(fā)明的核心組，優(yōu)選具有特別良好的MHC結(jié)合性質(zhì)和細(xì)胞因子響應(yīng)特征的四種或多種不同的單獨(dú)的多肽提供了多種T細(xì)胞表位，允許為了誘導(dǎo)免疫耐受性而募集寬泛范圍的T細(xì)胞特異性。因此，本發(fā)明的組合物具有超越使用單獨(dú)多肽的有利額外作用。本發(fā)明人也已證明:通過細(xì)胞因子響應(yīng)測量，本發(fā)明的組合物能夠提供對多態(tài)性研究群體的極高覆蓋。[0026]因此，本發(fā)明第一方面提供了適用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，該組合物包括:
[0027](a )多肽 TM)7B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tinfl4A (WGAIWRIDIPDH,),Tiffl07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一種的變體中的至少一種；
[0028](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B (KDSDEFIPMKSSWGAIWR)、或其任何一種的變體中的至少一種；和
[0029](c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一種的變體中的至少一種，
[0030]其中所述變體是:
[0031]I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或
[0032]II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)、(b)或(c)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽；或
[0033]III)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相應(yīng)多肽的序列中至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)的多肽。
[0034]在一些實施方案中，所述組合物可包括:a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體，b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體，和 c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體。
[0035]在一些實施方案中，所述組合物還可包括以上先前未選擇的一種或多種多肽或其變體，所述多肽為如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一種。
[0036]在一些實施方案中，其中所述組合物:
[0037]-能夠使得群體中的一組草花粉過敏性個體的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或
[0038]-可包括至少一種另外的多肽，最多總共14種不同的多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括與SEQ ID NO:1至73的任何一種中的至少9個或更多個連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性、在以上未選擇的序列jP(b)長度為9至30個氨基酸。
[0039]在一些實施方案中，所述組合物可包括至少一種所述多肽，其長度為9-20個氨基酸或13-17個氨基酸。
[0040]在一些實施方案中，所述組合物可包括如表7中所列的組合I至10中的任何一個的多肽，其中任選地一種或多種所述多肽可被I (I)或(II)中所定義的其變體所替代。
[0041]在一些實施方案中，所述組合物可包括以下多肽:(a) Tim07Bl(KKIPAGELQIIDKIDA) ；(b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED) ；(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK) ；(d)Rye09BI(KPEVKYAVFEAALTKAIT)；(e)Ber02(FIPMKSSffGA)；(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)；和(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
[0042]在一些實施方案中，其中所述多肽的一種或多種可具有選自以下的一種或多種修飾:(i ) N末端乙?；?ii ) C末端酰胺化；(iii )精氨酸和/或賴氨酸的側(cè)鏈胺上的一個或多個氫被亞甲基基團(tuán)所取代；(iv)糖基化；和(0磷酸化。[0043]在一些實施方案中，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而其可包括:(i)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端緊接的兩個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)；和/或(ii)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的C末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端緊接的一個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端和C末端，選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸，其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T細(xì)胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
[0044]在一些實施方案中，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而可以另外地:(i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或(ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三個氨基酸中的、不包含在T細(xì)胞表位中的疏水性殘基；和/或(iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四個氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T細(xì)胞表位中的任何兩個連續(xù)氨基酸，和/或(iv)在N末端和/或C末端添加了一個或多個帶正電荷的殘基。
[0045]在一些實施方案中，其中每種多肽可具有0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范圍中的濃度。
[0046]本發(fā)明第二方面還包括適用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，該組合物包括至少四種不同的選自以下的多肽:
[0047](a) Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體；
[0048](b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體；
[0049](c) Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體；
[0050](d) Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其變體；
[0051](e) Ber02 (FIPMKSSffGA)或其變體；
[0052](f) Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其變體；
[0053](g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其變體；和
[0054](h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其變體；
[0055]其中所述變體是:
[0056]I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或
[0057]II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽；或
[0058]III)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列中至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)的多肽。
[0059]在一些實施方案中，所述組合物可包括:(a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體；(b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02 (FIPMKSSffGA)和 Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)、或其任何一種的變體中的至少一種；和(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、ye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR)和 Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、或其任何一種的變體中的至少一種；和(&)以上未選擇的b)或c)的至少一種另外的多肽。
[0060]在一些實施方案中，所述組合物可包括多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其變體、多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體、多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體，和以上未選擇的b)或c)的至少一種另外的多肽。
[0061]在一些實施方案中，所述組合物還可包括以上先前未選擇的一種或多種多肽或其變體，所述多肽為如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一種。
[0062]在一些實施方案中，其中所述組合物:
[0063]-能夠使得群體中的一組草花粉過敏性個體的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或
[0064]-可包括至少一種另外的多肽，最多總共14種不同的多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括與SEQ ID NO:1至73的任何一種中的至少9個或更多個連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性、在以上未選擇的序列jP(b)長度為9至30個氨基酸。
[0065]在一些實施方案中，所述組合物可包括至少一種所述多肽，其長度為9-20個氨基酸或13-17個氨基酸。
[0066]在一些實施方案中，所述組合物可包括如表7中所列的組合I至10中的任何一個的多肽，其中任選地一種或多種所述多肽可被I (I)或(II)中所定義的其變體所替代。
[0067]在一些實施方案中，所述組合物可包括以下多肽:(a) Tim07Bl(KKIPAGELQIIDKIDA) ；(b) BerOl (SGKAFGAMAKKGQED) ；(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK) ；(d)Rye09BI(KPEVKYAVFEAALTKAIT)；(e)Ber02(FIPMKSSffGA)；(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)；和(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
[0068]在一些實施方案中，其中所述多肽的一種或多種可具有選自以下的一種或多種修飾:(i) N末端乙?；?；(ii) C末端酰胺化；(iii)精氨酸和/或賴氨酸的側(cè)鏈胺上的一個或多個氫被亞甲基基團(tuán)所取代；(iv)糖基化；和(0磷酸化。
[0069]在一些實施方案中，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而其可包括:(i)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端緊接的兩個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)；和/或(ii)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的C末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端緊接的一個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端和C末端，選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸，其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T細(xì)胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
[0070]在一些實施方案中，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而可以另外地:(i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或(ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三個氨基酸中的、不包含在T細(xì)胞表位中的疏水性殘基；和/或(iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四個氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T細(xì)胞表位中的任何兩個連續(xù)氨基酸，和/或(iv)在N末端和/或C末端添加了一個或多個帶正電荷的殘基。
[0071]在一些實 施方案中，其中每種多肽可具有0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范圍中的濃度。[0072]本發(fā)明第三方面提供了一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，所述組合物包括至少一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列在表達(dá)時導(dǎo)致如前述所定義的組合物的產(chǎn)生。
[0073]本發(fā)明第四方面提供了一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的載體，所述載體包括四種或多種多核苷酸序列，每種所述多核苷酸序列編碼如前述所定義的不同的多肽。
[0074]本發(fā)明第五方面提供了一種產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括:(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A (WGAIffRIDTPDKL), Tim07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一種的如本發(fā)明第一方面(I)或(II)中所定義的變體；(b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02 (FIPMKSSffGA), Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一種的如本發(fā)明第一方面(I)或(II)中所定義的變體中的至少一種；和((3)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)和Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一種的如本發(fā)明第一方面(I)或(II)中所定義的變體中的至少一種，其中每種不同的多肽是供同時地、分別地或順序地用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥。
[0075]本發(fā)明第六方面提供了一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的藥物制劑，所述藥物制劑包括前述的組合物；本發(fā)明第四方面所述的載體；或本發(fā)明第五方面所述的產(chǎn)物；和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。
[0076]在一些實施方案中，所述組合物、載體或產(chǎn)物可被配制為用于口服施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、皮下施用、舌下施用、皮內(nèi)施用、口腔施用、表皮或貼劑施用、或用于通過吸入或通過注射施用。
[0077]在一些實施方案中，前述組合物或本發(fā)明第五方面所定義的產(chǎn)物可另外地包括另外的多肽過敏原，用于使個體免疫耐受所述另外的多肽過敏原。
[0078]本發(fā)明第七方面提供了一種確定T細(xì)胞是否識別如本發(fā)明第一和第二方面所定義的組合物的體外方法，所述方法包括將所述T細(xì)胞與所述多肽接觸并檢測所述T細(xì)胞是否被所述多肽刺激。
[0079]在一些實施方案中，可進(jìn)行所述方法以確定個體是否患有草花粉過敏癥或處于患草花粉過敏癥的風(fēng)險中。
[0080]本發(fā)明的組合物通常能夠使得群體中一組草花粉過敏性個體的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或包括至少一種另外的多肽，最多總共14種多肽，其中所述另外的多肽:(a)包括與以下所描述的SEQ ID NO:1至73的任何一種中的至少9個或更多個連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性的序列；和(b)長度為9至30個氨基酸。
[0081]本文提及的序列的描述
[0082]SEQ ID NO:1至73提供如表2至4列出的本發(fā)明的多肽序列。SEQ ID N0.1至27對應(yīng)于來自組I草過敏原的肽。SEQ ID N0.28至73對應(yīng)于來自組5過敏原的肽。
[0083]發(fā)明詳沭
[0084]本發(fā)明涉及可用于免疫耐受作用的肽。這樣的肽可來源于本文所描述的任何草過敏原或是如以下所描述的其變體。與基于肽免疫作用的去敏化方法相關(guān)的困難是:如何選擇過敏原的適當(dāng)?shù)拇笮『蛥^(qū)域以作為用于免疫作用的肽的基礎(chǔ)。選擇的肽的大小是關(guān)鍵的。如果肽過小，疫苗可能不會有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。如果肽過大，或如果將全抗原導(dǎo)入到個體中，存在誘導(dǎo)有害反應(yīng)的風(fēng)險，比如過敏性反應(yīng)，這可能是致命的。
[0085]已經(jīng)選擇本發(fā)明的肽以保留T細(xì)胞特異性，而同時尺寸足夠小以不具有顯著的三級結(jié)構(gòu)，這將使其能夠保留完整分子的IgE結(jié)合表位的構(gòu)象。因此本發(fā)明的多肽不會引起細(xì)胞上鄰近特異性IgE分子的顯著性交聯(lián)且因此不會導(dǎo)致顯著的組胺釋放，所述細(xì)胞比如肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。
[0086]本發(fā)明的優(yōu)勢是肽能夠?qū)挿旱匕邢蛑饕M織相容性復(fù)合物(MHC)分子的能力。T細(xì)胞受體(TCR)的特異性是高度可變的。如抗體分子一樣，通過細(xì)胞內(nèi)的基因重組事件產(chǎn)生了可變性。TCR識別與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的基因編碼的分子結(jié)合的短肽形式的抗原。這些基因產(chǎn)物是同樣的分子，產(chǎn)生用于移植的“組織類型”，且還被稱為人類白細(xì)胞抗原分子(HLA)，這些術(shù)語可被互換地使用。單獨(dú)的MHC分子具備肽結(jié)合溝，由于它們的形狀和電荷其只能夠結(jié)合有限的一組肽。被一個MHC分子結(jié)合的肽可能不一定被其它MHC分子結(jié)合。
[0087]當(dāng)?shù)鞍追肿又T如抗原或過敏原被抗原呈遞細(xì)胞諸如B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸收時，該分子在細(xì)胞中被酶促降解。降解過程產(chǎn)生所述分子的肽片段，如果它們具有合適的大小、電荷和形狀，則可能結(jié)合到某些MHC分子的肽結(jié)合溝之內(nèi)，并隨后展示在抗原呈遞細(xì)胞表面上。如果肽/MHC復(fù)合物以足夠數(shù)量呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上，則它們可能活化帶有合適的肽/MHC特異性T細(xì)胞受體的T細(xì)胞。
[0088]由于MHC的多態(tài)性質(zhì)，遠(yuǎn)系繁殖群體諸如人類中的個體將在其細(xì)胞表面上表達(dá)不同組合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、電荷和形狀而結(jié)合來自同一分子的不同肽，不同個體將展示與其MHC分子結(jié)合的不同庫的肽。鑒定遠(yuǎn)系繁殖群體諸如人類中的通用MHC-結(jié)合肽表位比在近親繁殖的動物(諸如實驗小鼠的某些品系)中更困難?；趥€體之間MHC的差異表達(dá)以及其帶來的肽結(jié)合與呈遞的固有差異，不太可能鑒定可用于人類去敏化治療的單種肽。
[0089]如以下所討論的，本發(fā)明通過提供基于一種以上的肽的組合物，即肽組合，而解決該問題。這些組合以肽的核心組為基礎(chǔ)，這些肽當(dāng)被單獨(dú)檢驗時，實驗上鑒定為在草過敏性患者中表現(xiàn)出令人驚奇地強(qiáng)的響應(yīng)，且當(dāng)以組合來提供時，響應(yīng)尤其強(qiáng)。當(dāng)肽的這些核心亞組被包括在草肽疫苗中時具有有利的性質(zhì)。
[0090]核心組可包括至少一種來源于貓尾草的肽，至少一種來源于黑麥草的肽和至少一種來源于狗牙根的肽，每種肽顯示了特別良好的單獨(dú)的響應(yīng)特性。將這些肽包括在組合中允許覆蓋三種最普遍的草，并且如以下所進(jìn)一步討論地，通過同源性另外擴(kuò)及覆蓋其它的草。
[0091]另外，核心組可包括至少四種肽，該肽選自在檢驗的組中具有高等級的單獨(dú)響應(yīng)特性且被進(jìn)一步證明當(dāng)一起組合來提供時為草疫苗提供最優(yōu)響應(yīng)特性的肽。
[0092]這樣的肽組合優(yōu)選地包括至少一種來源于組I草過敏原的肽或其變體和至少一種來源于組V草過敏原的肽或其變體。草過敏原分類為組I草過敏原和組V草過敏原是技術(shù)人員所熟知的，且在本文中被進(jìn)一步討論。優(yōu)選的組I草過敏原是狗牙根過敏原，Cyndl。優(yōu)選的組V過敏原是黑麥草過敏原，Lol p5。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包括至少一種來源于Cyn dl的肽或其變體和至少一種來源于Lol p5的肽或其變體?；贑yn dl肽和Lol p5肽或它們的變體的組合的組合物在以下被進(jìn)一步討論。
[0093]本發(fā)明的優(yōu)選的肽可包括SEQ ID NO:1至73的任何一個中所示的序列，可由SEQID NO:1至73的任何一個中所示的序列組成，或可基本上由SEQ ID NO:1至73的任何一個中所示的序列組成。這些特定肽的變體也可被使用。變體可包括作為SEQ ID N0:1至73的任何一個的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一個的同源物的序列，可由作為SEQ ID NO:1至73的任何一個的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一個的同源物的序列組成，或可基本上由作為SEQ ID NO:1至73的任何一個的片段或SEQ ID NO:1至73的任何一個的同源物的序列組成。
[0094]這樣本發(fā)明提供了適用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，該組合物包括:
[0095]Ca)多肽 TimO7B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A(WGAIffRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一種的變體中的至少一種；
[0096](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一種的變體中的至少一種；
[0097](c )多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)、Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一種的變體中的至少一種，
[0098]其中所述變體是:
[0099]I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或
[0100]II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)、(b)或(c)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽；或
[0101]III)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相應(yīng)多肽的序列中至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)的多肽。
[0102]a)至c)的其它優(yōu)選的變體是:
[0103]i)具有9至30個氨基酸的長度且包括由以下組成的區(qū)域的多肽:
[0104]-a)至c)的對應(yīng)序列中的任何一種，或
[0105]-與a)至c)的對應(yīng)序列中的任何一種具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使個體免疫耐受a)至c)的序列中的任何一種，或
[0106]ii)具有9至30個氨基酸的長度且包括由代表以下任何一種的序列組成的區(qū)域的多肽:
[0107]-a)至c)的序列中的任何一種的片段，或
[0108]-a)至c)的序列中的任何一種的片段的同源物，
[0109]所述序列能夠使個體免疫耐受a)至c)的序列中的任何一種，且具有至少9個氨基酸的長度，且其中所述同源物與a)至 c)的序列中的任何一種中的任何9個連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性；其中任選地，四個多肽中無一是由a)至c)的任何一個所定義的同一原始序列的變體。[0110]因而組合物至少包括三種多肽，第一多肽是a)的多肽或其變體，第二多肽是b)的多肽或其變體，第三多肽是c)的多肽或其變體。這樣，例如組合物可包括Tim07B的變體、BerOl、和Rye09B的變體。優(yōu)選地，以上組合物除核心三種多肽之外包括a)、b)或c)或其任何一個的變體的第四多肽。組合物可包括a)、b)或c)或其變體的四種、五種、六種、七種、八種或以上的多肽。
[0111]在一些方面，組合物可包括a)或其變體的兩種、三種、四種或更多種多肽。在另外的方面，組合物可包括b)或其變體的兩種、三種、四種或更多種多肽。在其它的方面，組合物可包括c)或其變體的兩種、三種、四種、五種、六種或更多種多肽。這些選擇以組合物包括a)或其變體的至少一種多肽、b)或其變體的至少一種多肽為條件。選自組a)、b)和c)的三種多肽的優(yōu)選的組合是多肽Tim07B或其變體、多肽BerOl或其變體、和多肽Bio04A或其變體。
[0112]組合物可包括至少兩種選自組a)或其變體的多肽，至少兩種選自組b)或其變體的多肽和至少兩種選自組c)或其變體的多肽。
[0113]優(yōu)選的組合物可包括多肽Tim07B或其變體、和至少兩種、三種或四種選自組b)或其變體的多肽。該優(yōu)選的組合物可包括兩種或三種選自組c)或其變體的多肽，優(yōu)選地包括Bio04A或其變體。另一個優(yōu)選的組合物可包括多肽Tim07B或其變體、和至少兩種、三種或四種選自組c)或其變體的多肽。該優(yōu)選的組合物可包括兩種或三種選自組b)或其變體的多肽，優(yōu)選地包括BerOl或其變體。
[0114]基于a)至c)的以上所有組合物可包括選自SEQ ID NOl至74的任何一個或其變體、且先前根據(jù)a)至c)未選擇的另外的多肽。
[0115]本發(fā)明還提供了適宜于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，該組合物包括至少四種不同的選自以下的多肽:
[0116](a) Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體；
[0117](b) BerOI (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體；
[0118](c) Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體；
[0119](d) Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其變體；
[0120](e) Ber02 (FIPMKSSffGA)或其變體；
[0121](f) Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其變體；
[0122](g) Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其變體；和
[0123](h) Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其變體；
[0124]其中所述變體是:
[0125]I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或
[0126]II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽；或
[0127]III)長度為9至30 個氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列中的至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)的多肽。
[0128]a)至h)的其它優(yōu)選的變體是:[0129]i)具有9至30個氨基酸的長度且包括由以下組成的區(qū)域的多肽:
[0130]-a)至h)的對應(yīng)序列中的任何一種，或
[0131]-與a)至h)的對應(yīng)序列中的任何一種具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使個體免疫耐受a)至h)的序列中的任何一種，或
[0132]ii)具有9至30個氨基酸的長度且包括由代表以下任何一種的序列組成的區(qū)域的多肽:
[0133]-a)至h)的序列中的任何一種的片段，或
[0134]-a)至h)的序列中的任何一種的片段的同源物，
[0135]所述序列能夠使個體免疫耐受a)至h)的序列中的任何一種，且具有至少9個氨基酸的長度，且其中所述同源物與a)至h)的序列中的任何一種中的任何9個連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性；其中任選地，四種多肽中無一是由a)至h)的任何一種所定義的同一原始序列的變體。
[0136]因而組合物至少包括四種多肽，所述四種多肽中的每一種選自a)至h)的多肽或其變體。以上組合物可包括a)至h)或其任何一種的變體的另外的多肽，比如a)至h)或其變體的五種、六種、七種、八種或更多種多肽。
[0137]在一些方面，組合物可包括a)或其變體的多肽，至少一種選自b)、e)或f)或其任何一種的變體的多肽，和至少一種選自c)、d)、g)或h)或其變體的多肽?？蛇x地，組合物可優(yōu)選地包括a)或其變體的多肽、和至少兩種或三種選自b)、e)或f)或其任何一種的變體的多肽。該組合物可優(yōu)選地包括多肽BerOl或其變體。在另一個實施方案中，組合物可包括a)或其變體的多肽和至少兩種、三種或四種選自c)、d)、g)或h)或其任何一種的變體的多肽。該組合物可優(yōu)選地包括多肽Bio04A或其變體。
[0138]所有這些組合物可優(yōu)選地包括多肽Tim07B或其變體，多肽BerOl或其變體，和多肽Bio04A或其變體。
[0139]以上選自a)至h)的組合物優(yōu)選地包括a)至h)的至少四種不同的多肽或包括至少四種變體，所述變體的每一種對應(yīng)于a)至h)的不同的原始或基線序列。這樣，該組合物通常以起源的四種不同的表位序列為基礎(chǔ)來選擇。優(yōu)選地，該組合物包括狗牙根起源的至少一種表位序列，黑麥草起源的至少一種表位序列和貓尾草起源的至少一種表位序列。相關(guān)表位序列可選自SEQ ID NOl至74中的任何一種或其變體。
[0140]基于a)至h)的以上所有組合物可因而包括選自SEQ ID NOl至74的任何一種或其變體、且先前根據(jù)a)至h)未選擇的另外的多肽。所有選擇以該組合物包括至少四種選自a)至h)或其變體的多肽為條件。
[0141]任選地，本文所描述的特定多肽的任何組合物可包括另外的多肽而最多總共14種獨(dú)特的多肽。另外的多肽通常與不在已選擇的多肽中的其它序列，即SEQ ID NO:1至73相關(guān)(即，通常為其同源物和/或其片段)。另外的肽通常是SEQ ID NO:1至73的肽中其一的功能性變體。另外的肽可以與SEQ ID NO:1至73中的任何一種相同。因此該組合物可包括最多十四種不同的多肽，所述多肽如SEQ ID NO:1至73中任何一種所提供的，以至少一種多肽選自如上所定義的(a)和(b)的每種為條件。然而，任選的另外的多肽不需要與SEQ ID NO:1至73的任何一種100%相同。它們優(yōu)選地與SEQ ID NO:1至73的任何一種中的至少9個(例如至少10、11、12或13個)或更多個連續(xù)氨基酸至少65%相同，而非在選自(a)和(b)的每一種的至少一種多肽中已選擇的。這些連續(xù)氨基酸可包括MHC II類表位，例如其與本文所述的MHC分子中的任何一種相結(jié)合。
[0142]本發(fā)明還提供了用于通過免疫耐受來預(yù)防或治療草過敏癥、包括本發(fā)明的多肽的產(chǎn)物和制劑，和包括能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽的多核苷酸的組合物、產(chǎn)物和載體。所述免疫耐受通常將針對SEQ ID NO:1至74中任何一種中存在的表位(例如MHC II類-結(jié)合的T細(xì)胞表位)。
[0143]草物種
[0144]草物種黑麥草(Loliumperenne)、貓尾草(Phleum pratense)和狗牙根(Cynodondactylon)在世界范圍造成高比例的草過敏癥，尤其是與草花粉相關(guān)的過敏癥，比如干草熱。其它重要的草物種包括絨毛草(Holcus Ianatus)、鴨茅(Dactylis glomerata)、加那利草(Phalaris canariensis)和草地早熟禾/肯塔基藍(lán)草(草地早熟禾(Poa pratensis))。
[0145]黑麥草是世界上最常見的草之一，并廣泛用作動物飼料的來源。其原產(chǎn)于歐洲，但已被引進(jìn)到世界所有大陸上，并且在所有溫帶都是常見的。其花期可貫穿整個夏季，但在北半球通常在5月到7月之間。黑麥草良好適應(yīng)于溫和、濕潤的溫帶氣候，并且在相對粘重、肥沃、滋潤的土地上生長得最好。其在充分施肥的具有足夠水分的輕質(zhì)土壤上也生長良好。其不喜陰且需要排水良好的土壤。黑麥草通常生長于土壤PH在從約6到約7的范圍內(nèi)的位置處，但其可耐受從約4.5到約8.5的范圍,優(yōu)選地年降水量在約21到約180cm的范圍。
[0146]貓尾草是世界上另一種最常見的草，并且是動物飼料的首要來源。其原產(chǎn)和分布于歐洲、北非和亞洲北部的大部分。其已被引進(jìn)到北美和南美、南非和澳洲并在那里廣泛分布。貓尾草通常生長于年降水量在約35到約180cm的范圍、年平均溫度在約4到約22°C的范圍和土壤pH為約4.5到約8的位置。其良好適應(yīng)于涼的、濕潤的溫帶氣候，在粘重的、深層的和濕潤的土壤或甚至濕地上生長得最好。生長的最佳溫度在18-21°C間變化，且晝/夜溫度為15/10°C和21/15°C。貓尾草花期通常限于初夏且貓尾草花粉是這個季節(jié)中草過敏癥的主要原因。在研究中，已發(fā)現(xiàn)達(dá)21%的患有過敏性鼻炎或其它癥狀的患者對貓尾草花粉響應(yīng)。
[0147]狗牙根通常生長于年降水量為約9至約429cm、年平均溫度范圍為約5到約28°C和土壤pH在約4到約8.5，優(yōu)選地約6到約7的范圍的位置。狗牙根花期通常在夏末(北半球的8月到10月)。狗牙根植物產(chǎn)生大量的花粉且因此是干草熱的主要原因。還已報道狗牙根植物導(dǎo)致接觸性皮炎。狗牙根在世界范圍廣泛生長，主要在溫暖的氣候中，且通常發(fā)現(xiàn)于約北緯30°到約南緯30°的緯度之間。
[0148]組I和組5草花粉過敏原的肽片段
[0149]主要的草過敏原包括組I草花粉過敏原和組5草花粉過敏原。將來自不同物種的蛋白根據(jù)氨基酸序列同源性分組。例如，組I主要草花粉過敏原包括貓尾草蛋白Phl Pl和黑麥草蛋白Lol pl，組5主 要草花粉過敏原包括貓尾草蛋白Phl p5和黑麥草蛋白Lol p5。
[0150]本發(fā)明人已鑒定了某些草花粉過敏原蛋白中包括MHC II類結(jié)合T細(xì)胞表位的區(qū)域。本發(fā)明人也已證明，主要草花粉過敏原中對應(yīng)于MHC II類結(jié)合T細(xì)胞表位的區(qū)域在給定的組中的代表之間是高度保守的，參見，例如，實施例2。基于該信息，來源于給定的組中的蛋白的相關(guān)區(qū)域的肽適宜于通過免疫耐受該組中的草過敏原而預(yù)防或治療草過敏癥。例如，來自，例如貓尾草的Phl pl或黑麥草的Lol pl的相關(guān)區(qū)域適用于通過免疫耐受組I草過敏原而預(yù)防或治療草過敏癥。
[0151]本發(fā)明的肽來源于組I (SEQ ID NO:1至27)和組5 (SEQ ID NO: 28至73)草過敏原。術(shù)語“肽”和“多肽”在本文中可互換使用。以上的蛋白在本文中還被稱作“過敏原”。
[0152]表2至4列出了本發(fā)明的肽的序列，指明了每種肽所來源的母體蛋白質(zhì)。
[0153]當(dāng)本發(fā)明的組合物包括四種或更多種選自a)至h)的多肽或其變體的多肽時，該組合物通常包括選自a) SEQ ID NO:1至27 ;和b) SEQ ID NO: 28至73的每一種的至少一種多肽或其變體(例如功能性變體)。該組合物可包括選自a)SEQ ID N0:l至27;和b)SEQID NO:28至73的每一種的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或至少七種多肽或其變體(例如功能性變體)。在一些實施方案中，該組合物可包括選自a)SEQ ID NO:1至10 ;和b)SEQ ID NO:28至52的每一種的至少一種多肽或其變體(例如功能性變體)。該組合物可包括選自a) SEQ ID NO:1至10 ;和b) SEQ ID NO: 28至52的每一種的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或至少七種多肽或其變體(例如功能性變體)。
[0154]如以上概述，因此，基于a)至h)的多肽或其變體的優(yōu)選的組合物包括組合物中包括至少一種來源于Cyn dl或其變體的肽和至少一種來源于Lol p5或其變體的肽的那些組合物。特別優(yōu)選的組合物是包括至少一種來源于Cyn dl或其變體的肽、至少一種來源于Lol p5或其變體的肽和至少一種來源于Phl p5的肽的那些組合物。在一些實施方案中，a)至h)的組合物可包括來源于Cyn dl或其變體的兩種、三種、四種或更多種肽和/或來源于Lol p5或其變體的兩種、三種、四種或更多種肽。在一些實施方案中，該組合物可由來源于Cyn dl和Lol p5或其變體的肽組成，或基本上由來源于Cyn dl和Lol p5或其變體的肽組成。在另一些實施方案中，該組合物任選地不包括來源于Lol pl或其變體的肽。
[0155]如上所討論的，基于Cyn dl和Lol p5肽的組合物在草過敏癥的治療中特別有用。
[0156]本發(fā)明的特別優(yōu)選的組合物包括:包括以下、由以下組成或基本上由以下組成的那些組合物:
[0157]a)如本文所定義的SEQ ID NO: 1、2和5的多肽或其變體中的至少一種；
[0158]b)如本文所定義的SEQ ID N0:28、29、31和46的多肽或其變體中的至少一種；和任選地
[0159]c)如本文所定義的SEQ ID NO:69的多肽或其變體。
[0160]這些組合物提供了特別優(yōu)選的Cyn dl肽、特別優(yōu)選的Lol p5肽、和任選地，特別優(yōu)選的Phl p5肽。更優(yōu)選地，該組合物包括如a)中所定義的至少兩種或所有三種多肽，和如b)中所定義的至少兩種或至少三種多肽。仍為優(yōu)選地，該組合物包括如c)中所定義的多肽。特別優(yōu)選地，組合物包括i) SEQ ID NO:1, ii) SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5中的一種；和 iii) SEQ ID NO:46。
[0161]具體的優(yōu)選的組合物包括組合I至10，如表7中所列。在所述組合物中，SEQ IDNO: 1、2、5、28、29、31、46和69的單獨(dú)的多肽的一種或多種可任選地替代其變體。在一些實施方案中，存在于組合I至10的SEQ ID N0:l、2、5、28、29、31、46和69的多肽中的兩種、三種、四種、五種或更多種可被其變體替代。被其變體替代的多肽的數(shù)目通常取決于該組合物中所包括的多肽的總數(shù)目。例如，在基于四種多肽的組合(即，組合6、8、10)中，優(yōu)選地僅有一種或兩種多肽被其變體替代。可選地，包括選自SEQ ID N0:l、69、31、46、2、5、29、28、43、53、35、27、4和70的任何一種或其變體的四種或更多種多肽的任何組合物也是優(yōu)選的。[0162]更優(yōu)選的組合物包括SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93或其變體的多肽，由SEQID N0:l、2、5、28、31、91和93或其變體的多肽組成，或基本上由SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93或其變體的多肽組成。其它優(yōu)選的組合物包括SEQ ID NO: 1、2、5、28、31、91和93、或替代這些多肽的一種、兩種或三種、四種或更多種的它們的變體。在一些實施方案中，以上7種肽組合物不包括任何其它的多肽或不包括任何其它的來源于草過敏原的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，組合物包括SEQ ID N0:l、2、5、28、31、91和93或其變體，且不包含與本文所述的任何草物種的蛋白具有超過20%的同源性的任何另外的蛋白。以上組合物可包括另外的非肽組分，比如載體或佐劑。
[0163]本發(fā)明還提供了產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括以下:
[0164](a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim04A(WGAIffRIDTPDKL), Tim07G (FKVAATAANAAPANDK)、或如本文所描述的其任何一種的變體；
[0165](b)多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED),Ber02 (FIPMKSSffGA),Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR中的至少一種、或如本文所描述的其任何一種的變體;和
[0166](C)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLIMIT)和 Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C (NAGFKAAVAAAANAPPK)中的至少一種、或如本文所描述的其任何一種的變體，其中每種不同的多肽是供同時地、分別地或順序地用于通過免疫耐受預(yù)防或治療草花粉過敏癥。
[0167]本發(fā)明的產(chǎn)物中的四種或更多種多肽可按照與通過免疫耐受作用而用于草過敏癥的預(yù)防或治療的本發(fā)明的組合物有關(guān)的以上所述的相同標(biāo)準(zhǔn)來選擇。
[0168]變體
[0169]因此，本發(fā)明的組合物或產(chǎn)物可包括SEQ ID NO:1至73的任何一種的變體。變體通常包括存在于SEQ ID NO:1至73的相應(yīng)的肽中的MHC II類表位的I個、2個、3個或更多個。
[0170]本文提到了功能性變體。該變體可能能夠使個體免疫耐受存在于SEQ ID NO:1至59的相應(yīng)的肽中的MHC II類表位，并因而其將通常包括與同樣的MHC II類分子結(jié)合和/或被識別SEQ ID NO:1至73的多肽中相應(yīng)的表位的T細(xì)胞所識別的序列。該序列因此能夠使得免疫耐受天然多肽中相應(yīng)的序列。因此變體多肽可使得免疫耐受相應(yīng)的天然多肽。
[0171]SEQ ID N0:1至73的變體可以是通過截短衍生的片段，例如，通過從多肽的N末端和/或C末端去除一個或多個氨基酸。片段還可以通過一個或多個內(nèi)部缺失來生成，條件是組成T細(xì)胞表位的核心9個氨基酸基本上不被破壞。
[0172]例如，SEQ ID NO:1的變體可包括SEQ ID NO:1的片段，即，較短序列。這可包括從SEQ ID NO:1的N-末端或從SEQ ID NO:1的C-末端缺失一個、兩個、三個或四個氨基酸。這樣的缺失可從SEQ ID NO:1的兩端進(jìn)行。SEQ ID NO:1的變體可包括延伸超出SEQID NO:1的末端的另外的氨基酸(例如來自衍生肽的親本蛋白的序列)。變體可包括以上討論的缺失和添加的組合。例如，可從SEQ ID NO:1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO:1的另一端添加來自全長親本蛋白序列的另外的氨基酸。以上變體的相同討論還適用于SEQID NO:2 至 73。
[0173]變體肽可包括SEQ ID NO:1至73任一種或其片段的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸取代。變體肽可包括與SEQ ID NO:1至73任一種中至少9個或更多個連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性的序列。更優(yōu)選地，合適的變體可包括與SEQ ID NO:1至73任一種的至少9個連續(xù)氨基酸至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸同一性。這一水平的氨基酸同一性可見于肽的任何區(qū)段，盡管它優(yōu)選地是核心區(qū)域。氨基酸同一性的水平是超出至少9個連續(xù)氨基酸，但它可以是至少10、11、12、13、
14、15或至少16或17個氨基酸，這取決于比較的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整長度。
[0174]以與本發(fā)明的特別優(yōu)選的肽的序列同一性為基礎(chǔ)選擇的優(yōu)選變體的例子是:
[0175]BerOl (SEQ ID NO:1)的變體:SGKAFGAMAKKGEED (SEQ ID NO:74)，絨毛草 Hol11 ;草地早熟禾 Poa pl ；SGHAFGSMAKKGEED (SEQ ID NO: 75)，鴨茅 Dac gl ;黑麥草 Lol pl ；SGIAFGSMAKKGDED (SEQ ID NO: 76)，貓尾草 Phl pI, SGTAFGAMAKKGEEE (SEQ ID NO: 77)，玉米(Zea mays)Zea ml。
[0176]Bio02A (SEQ ID NO: 28)的變體:KYDAYVATLTESLR (SEQ ID NO: 78)，大麥(Hordeumvu I gar e) Hor v5 ；KYDAYVATLSEALR (SEQ ID NO: 79)，貓尾草 Phl p5;草地早熟禾 Poa p9 ；KYDAFVAALTEALR (SEQ ID NO:80)，鴨茅 Dac g5 ；KYDAFVTTLTEALR (SEQ ID NO:81)，絨毛草Hol 15。
[0177]BioO3A (SEQ ID NO:29)的變體:KFIPTLEAAVKQAYAA (SEQ ID NO:82)，鴨茅 Dacg5 ;薦草(Phalarus aquatica) Pha a5 ；KFIPALEAAVKQAYAA (SEQ ID NO:83)，貓尾草 Phlp5。
[0178]Tim07B(SEQ ID NO:69)的變體:KIPAGELQIVDKIDA (SEQ ID N0:84)，鴨茅 Dac g5 ；薦草 Pha a5 ；KIPTGELQIVDKIDA (SEQ ID NO:85)，黑麥草 Lol p5 ；KIPAGEQQIIDKIDA (SEQID NO:86)，草地早熟禾Poa p5。Tim07B在絨毛草Hol 15b中也是保守的。
[0179]Bio04A(SEQ ID N0:31)的變體:LKKAITAMSEAQK(SEQ ID NO:87)，貓尾草 Phl p5 ；絨毛草 Hol 15b ；LKKAITAMSQAQK (SEQ ID NO:88)，草地早熟禾 Poa p5。
[0180]Ber02C (SEQ ID NO:5)的變體:KESWGAIWRIDTPDK (SEQ ID N0:89)，薦草 Pha al ；貓尾草Phl pl。
[0181]Rye09B(SEQ ID N0:46)的變體:PQVKYAVFEAALTKAIT(SEQ ID NO:90)，貓尾草 Phlp5。
[0182]這樣，SEQ ID NO:74至90是可作為以上天然肽的替代物用于本發(fā)明的組合物中的優(yōu)選的變體。用于本發(fā)明的天然肽的其它優(yōu)選變體來源于玉米過敏原。玉米過敏原與草花粉過敏原具有很近的同源性，且因此來源于玉米的序列可包含用于免疫耐受草花粉過敏原的交叉反應(yīng)性表位。
[0183]關(guān)于氨基酸序列，“序列同一'丨生”是指當(dāng)使用ClustalW (Thompson等人，1994,同前)用以下參數(shù)評價時具有指定值的序列:成對的比對參數(shù)-方法:準(zhǔn)確，矩陣:PAM，缺口開放罰分:10.00，缺口延伸罰分:0.10 ;多比對參數(shù)-矩陣:PAM，缺口開放罰分:10.00，％延遲同一性:30，處罰末端缺口:開，缺口間距:0，負(fù)矩陣:不，缺口延伸罰分:0.20，殘基特異性缺口罰分:開，親水缺口罰分:開，親水殘基:GPSNDQEKR。在特定殘基的序列同一性意在包括僅僅被衍生化的相同殘基。
[0184]變體肽可包括SEQ ID NO:1至73任一種中的1、2、3、4、5或更多個或者多達(dá)10個氨基酸取代。取代變體優(yōu)選地包括用相同數(shù)目的氨基酸代替一個或多個氨基酸并進(jìn)行保守的氨基酸取代。例如，可用具有相似特征的替代性氨基酸例如，另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電荷氨基酸、另一親水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸來取代氨基酸?？捎糜谶x擇合適的取代基的20種主要氨基酸的一些特征如下:
[0185]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，所述組合物包括:
(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE),Tim04A (WGAIWRIDTPDKL),Tim07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一種的變體中的至少一種；
(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一種的變體中的至少一種；和
(c )多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK), Rye09B (PEVKYAVFEMLTKAIT )、Bio02A (KYDAYVATLTEALR)、Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ),Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY),Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一種的變體中的至少一種，其中所述變體是: I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)、(b)或(C)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或 II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)、(b)或(c)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性，且能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽的序列；或 III)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相應(yīng)多肽的序列中至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包括: a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體， b )多肽 BerO I (SGKAFGAMAKKGQED )或其變體，和 c)多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體。
3.一種適用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，所述組合物包括至少四種不同的選自以下的多肽: (a)Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體； (b)BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體； (c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體； (d)Rye09B (PEVKYAVFEAALTKAIT)或其變體； (e)Ber02 (FIPMKSSffGA)或其變體； (f)Ber02C (KSSffGAIffRIDPKKPLK)或其變體； (g)Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其變體；和 (h)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)或其變體； 其中所述變體是: I)長度為最多30個氨基酸的較長的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列，或 II)長度為9至30個氨基酸的多肽，其包括與(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列具有至少65%同源性，且能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽的序列；或 III)長度為9至30個氨 基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相應(yīng)多肽的序列中至少9個連續(xù)氨基酸的序列，或與所述至少9個連續(xù)氨基酸具有至少65%同源性的序列，所述至少9個連續(xù)氨基酸的序列或同源性序列能夠使得免疫耐受所述相應(yīng)多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，所述組合物包括:(a)多肽 Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)或其變體；
(b )多肽 BerO I (SGKAFGAMAKKGQED )、Ber02 (FIPMKSSffGA)和 Ber02C( KSSffGAIffRIDPKKPLK)、或其任何一種的變體中的至少一種；和
(c )多肽 Bio04A( LKKAVTAMSEAEK)、ye09B( PEVKYAVFEMLTKAIT )、Bio02A( KYDAYVATLTEALR)和Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、或其任何一種的變體中的至少一種；和 Ca)以上未選擇的b)或c)的至少一種另外的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，所述組合物包括多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其變體、多肽 BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)或其變體、多肽 Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)或其變體，和以上未選擇的b)或c)的至少一種另外的多肽。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物還包括以上先前未選擇的一種或多種多肽或其變體，所述多肽為如表2至4中所示的SEQ ID NOl至73中的任何一種。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物: -能夠使得群體中的一組草花粉過敏性個體的至少50%或至少60%免疫耐受，和/或 -包括至少一種另外的多肽，最多總共14種不同的多肽，其中所述另外的多肽: (a)包括與SEQID NO:1至73的任何一種中的至少9個或更多個連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一'丨生 、在以上未選擇的序列；和 (b)長度為9至30個氨基酸。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物包括至少一種所述多肽，其長度為9-20個氨基酸或13-17個氨基酸。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物包括如表7中所列的組合I至10中的任何一個的多肽，其中任選地一種或多種所述多肽可被I (I)或(II)中所定義的其變體所替代。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，所述組合物包括以下多肽:
(a)Tim07Bl (KKIPAGELQIIDKIDA)；
(b)BerOl (SGKAFGAMAKKGQED)；
(c)Bio04A (LKKAVTAMSEAEK)；
(d)Rye09Bl (KPEVKYAVFEAALTKAIT)；
(e)Ber02 (FIPMKSSffGA)；
(f)Ber02C (KSSWGAIWRIDPKKPLK);和
(g)Bio02A (KYDAYVATLTEALR)o
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述多肽的一種或多種具有選自以下的一種或多種修飾: (i)N末端乙酰化； (ii)C末端酰胺化； (iii)精氨酸和/或賴氨酸的側(cè)鏈胺上的一個或多個氫被亞甲基基團(tuán)所取代； (iv)糖基化；和 (V)磷酸化。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而其包括:(i)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端緊接的兩個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)；和/或 (ii)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的C末端:一個至六個連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端緊接的一個至六個連續(xù)氨基酸相對應(yīng)；或 (iii)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的肽的殘基的N末端和C末端，選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸， 其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T細(xì)胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述肽的至少一種已被改造為可溶的，從而另外地: (i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或 (ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三個氨基酸中的、不包含在T細(xì)胞表位中的疏水性殘基；和/或 (iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四個氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T細(xì)胞表位中的任何兩個連續(xù)氨基酸，和/或 (iv)在N末端和/或C末端添加了一個或多個帶正電荷的殘基。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求 中任一項所述的組合物，其中每種多肽具有0.03至200nmol/ml、0.3 至 200nmol/ml、50 至 200nmol/ml 或 30 至 120nmol/ml 的范圍中的濃度。
15.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的組合物，所述組合物包括至少一種多核苷酸序列，該多核苷酸序列在表達(dá)時導(dǎo)致如權(quán)利要求1至13中任一項所定義的組合物的產(chǎn)生。
16.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的載體，所述載體包括四種或多種多核苷酸序列，每種所述多核苷酸序列編碼如權(quán)利要求1至13中任一項所定義的不同的多肽。
17.—種產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括:
(a)多肽Tim07B (KIPAGELQIIDKIDA)、TimlOB (KYTVFETALKKAITAMSE),Tim04A (WGAIWRIDTPDKL),Tim07G (FKVMTMNAAPANDK)、或其任何一種的如權(quán)利要求1 (I)或(II)中所定義的變體；
(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一種的如權(quán)利要求1 (I)或(II)中所定義的變體中的至少一種；和
(c)多肽Bio04A (LKKAVTAMSEAEK),Rye09B (PEVKYAVFEMLTKAIT)和 Bio02A (KYDAYVATLTEALR),Bio03A (KFIPTLVAAVKQAYAAKQ), Rye08A (ETYKFIPSLEAAVKQAY), Rye05C (NAGFKAAVMMNAPPK)、或其任何一種的如權(quán)利要求1 (I)或(II)中所定義的變體中的至少一種， 其中每種不同的多肽是供同時地、分別地或順序地用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥。
18.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療草花粉過敏癥的藥物制劑，所述藥物制劑包括根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的組合物；根據(jù)權(quán)利要求16所述的載體；或根據(jù)權(quán)利要求17所述的產(chǎn)物；和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物、載體或產(chǎn)物，所述組合物、載體或產(chǎn)物被配制為用于口服施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、皮下施用、舌下施用、皮內(nèi)施用、口腔施用、表皮或貼劑施用、或用于通過吸入或通過注射施用。
20.如權(quán)利要求1-15中任一項所定義的組合物，或如權(quán)利要求17中所定義的產(chǎn)物，所述組合物或產(chǎn)物另外地包括另外的多肽過敏原，用于使個體免疫耐受所述另外的多肽過敏原。
21.一種確定T細(xì)胞是否識別如權(quán)利要求1至14中任一項所定義的組合物的體外方法，所述方法包括將所述T細(xì)胞與所述多肽接觸并檢測所述T細(xì)胞是否被所述多肽刺激。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)行所述方法以確定個體是否患有草花粉過敏癥或處于患草花粉過敏癥的風(fēng)險中。
【文檔編號】A61K38/04GK103784952SQ201410056647
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2009年2月5日
【發(fā)明者】羅德·哈夫納, 保羅·萊德勒, 蓋伊·雷頓, 馬克·拉爾什 申請人:切爾卡西亞有限公司