專利名稱：：阿拉伯木聚糖降解酶的制作方法阿拉伯木聚糖降解酶本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及到編碼有阿拉伯木聚糖降解活性多肽的基因的克隆和表達。這些酶適用于工業(yè)加工，如烤面包、加工紙和紙槳和制備祠料及食物(添加劑)。植物細胞壁的組成是復(fù)雜和變化的。研究發(fā)現(xiàn)多糖主要以長鏈纖維素(植物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分)、半纖維素(含有各種(3—木聚糖鏈)和果膠的形式存在。植物細胞壁中多糖的存在、分布和結(jié)構(gòu)特性由以下因素決定(l)植物種類，(2)變種，(3)組織類型，(4)生長條件，(5)年齡，(6)喂養(yǎng)前植物材料的加工情況。單子葉植物(如谷類和禾本科植物)和雙子葉植物(如苜蓿屬植物、油菜子和豆科植物)之間、植物的種子和營養(yǎng)器官部分之間存在基本的差另'KChesson，1987;CarreandBrillouet，1986)。單子葉植物的特點是以阿拉伯木聚糖復(fù)合體為主要半纖維素骨架。雙子葉植物中半纖維素的主要結(jié)杓是木葡聚糖復(fù)合體。另外，還發(fā)現(xiàn)雙子葉植物中果肢的濃度比單子葉植物中的高。通常，種子內(nèi).的果膠類物質(zhì)量很高，而纖維素類物質(zhì)較少。.細胞壁中可區(qū)分出三種或多或少相互作用的多糖結(jié)枸(l)中間層形成外細胞壁。它還作為植物組織、基質(zhì)內(nèi)各個細胞間的連接點。中間層主要由高度酯化的果膠的鈣鹽組成；(2)初生壁就位于中間層的內(nèi)側(cè)。它是由包埋于果膠、半纖維素、酚酯和蛋白質(zhì)的無定形基質(zhì)中的纖維素微纖絲組成的有序結(jié)構(gòu)；(3)次生壁是在植物成熟時形成的。在植物生長和老化期期間，纖維素、微纖絲、半纖維素和木質(zhì)素沉積。成熟的代謝旺盛的植物細胞初生細胞壁比次生細胞壁對酶的水解作用更敏感，此時，次生細胞壁已經(jīng)高度木質(zhì)化了。細胞壁內(nèi)的纖維素、平纖維素和果膠間有著高度的相互作用。這些相當強地交鐠連接的多糖結(jié)構(gòu)的酶降解不是一個簡單的過程。例如，至少需要5種不同的S每來完全破坧阿拉伯木聚糖。內(nèi)切是用內(nèi)—卩(1-—D—木聚糖酶進行。外_(1—4)一D—木聚糖酶在多糖的非還原端釋放木糖單位。另三種酶(a—葡糖普酸酶、a—L一阿拉伯呋喃糖普峰和L酰酯酶)用于攻擊木聚糖骨架上的取代基。具體酶的選擇當然取決于要;jl皮降解的具休的半纖維素(McClearyandMath-eson，1986)。攻擊木聚糖側(cè)鏈的蜂可能有意義，因為它們改變聚合物的特性，使之更適于某些應(yīng)用。此外，這些酶可以與主鏈裂解酶一內(nèi)木聚糖酶協(xié)同作用(廣泛的綜述見Kormelink，1992，博士論文，UniversityofWageningerO。編碼一種阿拉伯木聚糖降解酶活性的一段DNA片段是已知的。在歐洲專利申請463,706中，給出了塔賓曲霉的內(nèi)木聚糖酶的分離、特性和基因克隆。這個酶不能攻擊阿拉伯木聚糖骨架的側(cè)鏈。能攻擊側(cè)鏈的酶活性也是從黑色曲霉得知的(Kormelink,1992，Supra，Chapters6和7)。一種;f皮稱為阿4立伯。夫喃糖普酶A(ArafurA)的S每，其特征是具有釋放從阿拉伯木聚糖獲得的寡糖結(jié)構(gòu)的阿拉伯糖殘基的能力。然而，ArafurA對高分子量物質(zhì)無活性。另外，黑色曲霉產(chǎn)生的一種叫ArafurB的峰，對寡糖有活性，對高分子量的阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)也有活性。ArafuirB的酶活性限于從末端單取代的木糖殘基釋放阿拉伯糖殘基。至今還不知其DNA片段?，F(xiàn)在已經(jīng)從泡盛曲霉中分離到了在寡糖和高分子量阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)中都能從非末端單取代的木糖殘基釋放阿拉伯糖殘基的酶。這個酶被命名為阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)。至今尚未得到DNA片段和/或序列數(shù)據(jù)。顯然，并不是所有的阿拉伯木聚糖降解中涉及的酶都已被發(fā)現(xiàn)(Kormelink，1990)。例如，還沒有發(fā)現(xiàn)攻擊阿拉伯糖雙取代的木糖分子的酶，其中的原因是這些酶的分泌量低。在適當?shù)乃拗髦蟹肿涌寺『瓦^量生產(chǎn)這些酶，雖然不容易，但也是一個獲得足夠量純酶的方法，這些錄反過來可以在各種應(yīng)用中估量它們的重要性。本發(fā)明提供含有編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或其多肽前體的DNA片段的重組DNA，其特征在于所迷DNA片段選自(a)編碼含SEQIDNO:5中氬基酸1至306所代表的氬基酸序列的多肽或氮基酸一27至306所代表的上迷多肽的前休的DNA片段；(b)編碼含SEQlDNO:7中氬基酸1至306所代表的氬基酸序列的多肽或氮基酸一27至306所代表的上述多肽的前休的DNA片段；(c)編碼仍然有阿拉伯木聚糖降解活性的、SEQIDNO:5或7中所示氛基酸殘基1至306所代表的多肽的變體或部分，及其多肽前體的DNA片段；(d)編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽并含SEQIDN0:5中核普酸784至1779或SEQIDNO:7中核普酸823至1818所代表的核普酸序列的DNA片段；(e)編碼有阿拉伯木聚糖降解活性的多肽或這種多肽的一個部分的DNA片段，該DNA片段能與SEQIDNO:5中核普酸784至1779或SEQIDNO:7中核普酸823至1818所代表的DNA片段雜交。本發(fā)明的重組DNA優(yōu)逸從一種的絲狀真菌，特別是從曲拿類獲得。特別優(yōu)逸的重組DNA序列包括源于黑色曲霉和塔賓曲霉、II碼AXDA的DNA片段。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的重組DNA包括該DNA片段在原核或真核宿主細胞(當存在于其中時)中表達所需的5，和3，DNA調(diào)控序列。此DNA調(diào)控序列與上述DNA片段的多肽編碼序列間優(yōu)選是異源性的，更優(yōu)選這樣的DNA調(diào)控序列與連接到它的同源性DNA調(diào)控序列上時，此DNA片段在宿主中的表達相比，該調(diào)控序列增強所述DNA片段在所述宿主中的表達。根據(jù)另一個實施方案，上迷重組DNA以載休的形式存在。本發(fā)明還提供了含本發(fā)明重組DNA的轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細胞(優(yōu)逸曲霉屬細胞)，以及通辻在轉(zhuǎn)化條件下用本發(fā)明重組DNA處理宿主細胞和篩選增強了阿拉伯木聚糖降解酶表達的細胞，獲得增強了表達所述阿拉伯木聚糖降解酶的宿主細胞的方法。本發(fā)明還提供了一種獲得阿拉伯木聚糖降解酶的方法，包括在對產(chǎn)酶有利的條件下，培養(yǎng)能產(chǎn)生上迷酶的宿主細胞并回收上述酶的步驟，其特征在于，上述宿主細胞或其上一代，已用本發(fā)明的重7組DNA轉(zhuǎn)化。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供一種有阿拉伯木聚糖降解活性的基本純的多肽，其特征在于SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中所示氮基酸序列，及其仍有上迷活性的遺傳變體和部分。本發(fā)明還包括含有權(quán)利要求14的基本純的多肽的組合物，配制該組合物用于祠料、食品、或紙和紙漿加工，其中酶被固定或不固定。本發(fā)明還提供一種使用本發(fā)明的多肽幫助阿拉伯木聚糖降解作為伺料或食品添加劑，在迻或紙漿的加工過程和面包烤制中的^f吏用方法。本發(fā)明還要求含本發(fā)明多肽的飼料或食品。另一個實施方案提供一種包括由SEQIDNO:5中1至783核普酸代表的、能調(diào)節(jié)連接到其上的DNA序列表達的DNA片段或它的亞片段的重組DNA，還有包括由SEQIDNO:7中1至822核普酸代表的、能調(diào)節(jié)連接到其上的DNA序列表達的DNA片段或它的亞片段的重組DNA。通過下列附圖的說明進一步說明本發(fā)明。附困的簡要說明困1.阿拉伯木聚糖降解S每的HPLC洗脫圖(OD280)困2.圖示AXDA對玉米的水不溶固體(WIS)活性做為PH值的函數(shù)圖3.作為粗AXDA酶量的函數(shù)，休外消化玉米WIS的百分率圖4.pIM3001的限制性位點困圖5.pIM3002的限制性位點困。本發(fā)明提供了純化和分離的包括阿拉伯木聚糖降解酶基因的DNA分子和它的遺傳變異體。此DNA分子可包括阿拉伯木聚糖降解酶編碼區(qū)和與它相鄰的5，和3，調(diào)節(jié)區(qū)。遺傳變異休包括編碼突變.阿拉伯木聚糖蛋白的DNA分子和所表達的酶仍保留目的活性的簡并DNA分子。本發(fā)明還提供了在目的表達宿主中表達阿拉伯木聚糖降解峰的DNA枸建物。這些表達構(gòu)建物包括含有與調(diào)節(jié)區(qū)可操縱性地相連的阿拉伯木聚糖降解酶編碼區(qū)的雜合DNA分子，調(diào)節(jié)區(qū)如為來源于同源或異源生物的啟動子、分泌和終止信號，在合適的宿i中這些調(diào)節(jié)區(qū)能指導(dǎo)由阿拉伯木聚糖降解酶編碼DNA分子編碼的S每的增強表達。更可取地，表達構(gòu)建物將整合到選擇的表達宿主的基因組中。本發(fā)明還提供了載體，特別是質(zhì)粒，用于通過將DNA枸建物引入微生物宿主中來克隆和/或轉(zhuǎn)化微生物宿主，以實現(xiàn)阿拉伯木聚糖降解酶的表達。另外，本發(fā)明提供了用含上述DNA枸建物的載體轉(zhuǎn)化的同源或異源宿主。異源宿主可以選自細菌、酵母或真菌。在本發(fā)明的上下文中，"同源的"一詞可以被理解為所有與編碼感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其調(diào)節(jié)區(qū))有天然聯(lián)系的。"同源"宿主定義為能從中分離到這種DNA分子的種類。因此"異源的"一詞定義為所有與編碼惑興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的DNA分子(包括其調(diào)節(jié)區(qū))無天然聯(lián)系的。"非同源"宿主定義為除了能從中分離到阿拉伯木聚糖降解S爭編碼基因外的所有微生物種類。在本發(fā)明的上下文中，"感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的增強表達"定義為感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表達水平高于同源野生型生物中的普通水平。同樣，增強表達也包括惑興趣的阿拉伯木聚糖降解酶在異源生物中的表達，該異源生物本身正常不能產(chǎn)生阿拉伯木聚糖降解酶，除非將編碼感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶的表達構(gòu)建物或DNA分子導(dǎo)入異源表達宿主。當然這些表達宿主的下一代也可以理解為包含在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明還包括與從上述真菌獲得的DNA序列雜交的DNA序列，但密碼序列可因遺傳密碼的簡并或種間變異而不同。因此，本發(fā)明包括從除曲霉以外種類得到的編碼阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。典型地獲得類似DNA片段的步驟包括篩選用含DNA片段(從一已知或預(yù)期能產(chǎn)生本發(fā)明的阿拉伯木聚糖降解酶的生物獲得)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細菌或噬菌紐。原位復(fù)制DNA后，DNA從細胞或噬菌眾中釋放，固定到濾膜上(通常為硝酸^i素膜)。然后，此濾膜可用于篩逸互補DNA片段，用基于任何決定曲霉AXDA基因之序列的標記核酸探針篩逸。依據(jù)要篩逸的生物間關(guān)系的遠或近，調(diào)整雜交和漂洗的條件，以便選出真正的陽性，減少假陽性的數(shù)量。濾膜固定化DNA雜交的典型步驟在《核酸雜交——實用方法》的第120和121頁第五章表3中有述(B.D.Hames和S.J.HigginsEds.，1985，IRLPress,Oxford)。雖然最適條件是由經(jīng)驗決定的，但也可對有密切或稍不密切相關(guān)的序列給出一些有用的重要原則。為了鑒別與探針密切相關(guān)的DNA片段，雜交如上述Hames和Higgins書中的表3中描述的方法進行(其主要內(nèi)容復(fù)述如下)，最后用0.IXSET緩沖液(20XSET:3MNaCl，20mMEDTA，0.4MTris—HCl，pH7.8，0.1%SDS)在68。C下進行高嚴格性漂洗。10鑒別與探針有限制同源性的序列要按上面提到的Hames和Higgins書中的表3中給出的步驟進行，但要降低雜交和漂洗的溫度。例如，最后2XSET緩沖液在55。C下漂洗，可允許鑒定約有70%的同源性的序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，同源性和雜交條件間的確切關(guān)系取決于探針的長度、堿基組成(G+C^)和鐠配的分布；隨機分布對Tm值降低作用比鐠配的非隨機或成簇形式要強。'上述條件適用于長度至少為300bp，優(yōu)選500bp，更優(yōu)逸lkbp左右的探針，要探測的DNA的GC含量約為50±10%。如果給定生物的GC含量是已知的，那么反應(yīng)條件可以考慮下列方程經(jīng)驗性優(yōu)化(在1MNaCl中(G+C)^介于35%和75%之間時)Tm=81.5。C十0.41X(G+C)^。這大略的意思是如果GC含量即(G+C)^比平均值高10%，雜交條件(嚴格的)可通過提高4"C雜交和漂洗的溫度調(diào)節(jié)。為了公開目的，上述與本發(fā)明的DNA片段雜交的片段被定義為在與SEQIDNO:5或7所述任何序列的至少300bp、優(yōu)選500bp，更優(yōu)選lkbp左右的探針雜交，并按Hames和Higgins書中第五章中表3提供的步驟(在下文中給出)在50"C下用2XSET緩沖液(即0.3MNaCl)進行漂洗后，在固定的DNA上給出了陽性信號。Hames和Higgins書中第五章表3的主要內(nèi)容如下(1)無探針時濾膜的預(yù)雜交，(2)50—68"C下在下列緩沖液中雜交0.1—4XSET緩沖液(由嚴格性決定)，lOXDenhardt氏溶液(100XDenhardt氏;容液包括2%牛血清白蛋白，2%Ficoll，2%聚乙烯吡咯烷酮)，0.1%SDS，0.1%焦磷酸鈉，50jug/ml的桂魚精子DNA，聲處理成200—500bp長度，置水浴中20分鐘，加水稀釋，終濃度為lmg/ml);雜交時間不十分嚴格，可以在1一24小時間任一值，優(yōu)逸16小時(辻夜)；探針通常通過切口平移法用"P為放射性標記來標記，達比活性5X107—5X108c.p.m//ig;(3)用3XSET，0.1%SDS，0.1%焦磷酸鈉于溫度68°C(50—68"C間，由設(shè)計的嚴格性而定)下(重復(fù))漂洗濾膜，重復(fù)漂洗同時SET濃度降為0.1%，4XSET中室溫漂洗一次20分鐘，在3MM紙上千燥濾膜，一70"C下在暗盒中將濾膜瀑光于X—光膠片上l一96小時(由信號的強度決定)，沖膠片。通常，預(yù)雜交和雜交混合物的休積應(yīng)保持最小。所有"濕潤"步驟應(yīng)在一預(yù)熱的水浴中的小封閉包中進行。上述方法是為定義按本發(fā)明能雜交的DNA片段。顯然，鑒定和分離本發(fā)明DNA片段的方法可做許多修改。需要明確的是這樣獲得的DNA片段屬于本權(quán)利要求范圍，只要它們可以用上述方法檢查出來，不論它們實標上是否已用上述方法鑒定和/或分離。適合用于鑒定和分離本發(fā)明DNA片段的許多方法已經(jīng)描述在文獻和手冊(包括上面引用的Hames和Higgins的書)中了。上述方法是用于多核苷酸探針的。當用于寡核苷酸探針時，Td(在此溫度下完全配對的雜合休半解離)由以下關(guān)系式估算Td-4^/GC堿基對+2'C/AT堿基對。在現(xiàn)有方法和這一重要原則的基礎(chǔ)上，可設(shè)計寡核爺酸探針來從相關(guān)的和更遠些的生物中有效地分離編碼本發(fā)明阿拉伯木聚糖降解酶的DNA片段。如果一個酶已經(jīng)從一不同的來源純化，而且其部分氮基酸序列已經(jīng)確定，用寡核苷酸的方法更有用。利用此序列，可制出許多簡并探針用于篩選DNA文庫或做Southern雜交，基本上如上所述。用于篩逸的好候逸生物是其他絲狀真菌類，如木霉屬、青霉屬、Dichotomitussqualus、Disporotrichumdimorphosporum，禾口細菌類，如芽孢桿菌類等等。如果最初的篩逸獲得了似乎含有雜交片段的克隆，可分離這樣的片段，必要時測序以確定序列相似性。一旦鑒定了某一感興趣的阿拉伯木聚糖降解酶，編碼這個酶的DNA序列可按如下從天然產(chǎn)生該酶的絲狀真菌中獲得，在含阿拉伯木聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該真菌，用已知的方法(如實施例1中所示方法)分離目的阿拉伯木聚糖降解酶，并測定純化蛋白的至少部分氯基酸序列。然后，根據(jù)推斷的部分氨酸酸序列設(shè)計寡核苷酸序列可得到DNA探針。氬基酸序列可以由全蛋白的N—末端和/或利用蛋白酶解或化學消化的全蛋白的內(nèi)部多肽片段的N—末端測定。得到后，DNA探針用于篩逸基因組或cDNA文庫。基同組文庫可以通過用識別4個連續(xù)核爺酸的DNA序列的限制酶(如Sau3A)部分消化真菌染然休DNA，并將得到的、片段克隆到速當?shù)馁|(zhì)?；騒—噬菌休載體(如入一GEM—11)中而制得?；蛘撸琧DNA文庫可以通過克隆cDNA到一合適的噬菌體載體，如XgtlO中制各，從被誘導(dǎo)合成阿拉伯木聚糖降解酶的真菌細胞分離的mRNA合成cDNA。然后，倒平板生長出足量的菌落或p藍菌邇，基因組或cDNA文庫可以用合適的DNA探針歸逸。如果這個方法不奏效，基因組或cDNA文庫可能要用從非誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)細胞中的mRNA所獲得cDNA探針進行示差篩選。誘導(dǎo)mRNA是從生長在含阿拉伯木聚糖為碳源的培養(yǎng)基上的細胞制備的，而非誘導(dǎo)mRNA必需從生長在不以阿拉伯木聚糖碳源的培養(yǎng)基(如以葡萄糖為碳源)上的細胞制備。在只與誘導(dǎo)cDNA探針雜交的克隆當中，可以找到含有目的阿拉伯木聚糖降解酶編碼基因的克隆?；蛘撸梢詫⒗揪厶墙到饷富蚺c相關(guān)的序列進行交叉雜交來鑒別。優(yōu)逸寡核苷酸探針從由黑色曲霉培養(yǎng)物的濾液所純化的、表現(xiàn)分子量為32kDa的阿拉伯木聚糖降解酶N—末端氬基酸序列(見實施例1.5.1)和/或從酶用溴化氰消化得到的內(nèi)部肽片段的氬基酸序列(見實施例l.5.2)獲得。這樣得到的寡核爺酸混合物可用于與基因組和cDNA文庫雜交?；蛘呔拖筮@里描述的這樣，純化的AXDA酶可用來激發(fā)抗體。抗體用于表達文庫的免疫舜選。這樣來鑒定AXDA表達克隆。需要指出的是該蛋白質(zhì)是從黑色曲霉塔賓變種分離的，cDNA是從黑色曲霉N400分離的，說明不同的曲霉有AXDA活性。隨著新DNA擴增技術(shù)(如直接或反向PCR)的出現(xiàn)，已知道編碼區(qū)的末端序列，就可以在體外克隆DNA片段。有了編碼阿拉伯木聚糖降解酶的DNA序列，使得用定點誘變構(gòu)建突變蜂分子成為可能。如果已知阿拉伯木聚糖降解酶的三級結(jié)構(gòu)，而且它的催化和底物結(jié)合區(qū)已定位，就可以逸出發(fā)生最可能影響催化和/或底物結(jié)合功能的氱基酸，例如借助于計算機模型。如果不知道蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，可在整個密碼序列產(chǎn)生隨機突變，或者可以與從其他微生物分離到的已知的類似酶進行比較來預(yù)測蛋白質(zhì)14的三級結(jié)枸。為了利用含AXDA編碼序列的DNA片段插入到包括一個或幾個異源調(diào)節(jié)區(qū)的表達拘建物中，可以用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR，《PCR技術(shù)；DNA擴增的原則和應(yīng)用》，(1989)H.A.Ehrlich，ed.，StocktonPress,NewYork)在AXDA編碼序列的5，和3，端引入適當?shù)南拗菩脏饲形稽c。限制性位點的逸擇由表達載體的DNA序列而定，如DNA分子內(nèi)其他限制性位點的存在。為了在原始(同源的)生產(chǎn)生物種，或者在異源真菌菌株中獲得AXDA蛋白的增強表達，AXDA的DNA編碼區(qū)(包括其控制區(qū))要導(dǎo)入選擇的表達宿主中以提高基因的拷貝數(shù)，結(jié)果提高蛋白質(zhì)表達。如果優(yōu)選異源表達宿主，逸擇了一個酵母或細菌菌株，用一不間斷的(無內(nèi)含子的)DNA分子來構(gòu)建異源表達載休，以避免異源宿主不識別基因組片段上存在的剪接信號的可能性。這種不間斷的DNA分子可以從由引導(dǎo)AXDA合成的細胞分離的m8NA構(gòu)建的cDNA文庫獲得。該文庫可以用按上面提到的方法獲得的寡核苷酸或cDNA探針來篩選。或者在從阿拉伯木聚糖引導(dǎo)的細胞RNA合成的cDNA第一鏈上用適當?shù)?，和3，寡核苷酸進行聚合酶鏈式反應(yīng)，得到不間斷的DNA分子。目的AXDA的增強表達可以通過選擇異源調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動子、分沁前導(dǎo)序列和終止區(qū))來獲得，它們用于提高表達，如果需要的話，還可以提高所逸表達宿主中目的蛋白的分泌水平和/或提供目標AXDA表達的誘導(dǎo)性調(diào)控。除了目標AXDA本身的啟動子，其它啟幼子也可用于指導(dǎo)AXDA的表達。啟動子可以根據(jù)它在指導(dǎo)目標AXDA在目的表達宿主中的效率進行選擇。在另一個實施方案中，可以逸擇一個組成型啟動子來指導(dǎo)目標AXDA的表達，而基本無其它酶表達。這樣的表達構(gòu)建物的另一優(yōu)點是避免了對在含阿拉伯木聚糖為誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達宿主的需要。優(yōu)選用于真菌表達宿主的強組成型和/或誘導(dǎo)型啟動子的例子是ATP—合成酶，亞單位9(oliC)，丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)，L醇脫氳酶(adhA)，a—淀粉酶(amy)，葡糖淀粉酶(gam)，乙酰臉酶(amdS)和甘油醛一3—磷酸脫氳酶啟動子。強酵母啟動子的例子是乙醇脫氳酶、乳糖酶、3—磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子。強細菌啟動子的例子是a—淀^^爭啟幼子、Spo2啟動子和細胞外蛋白酶基因啟動子。雜合啟動子也可有利地用于提高表達構(gòu)建物的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)。通常，希望目標AXDA從表達宿主中分泌到培養(yǎng)液中。根據(jù)本發(fā)明，目標AXDA自身的分泌前導(dǎo)序列可用于實現(xiàn)所表達AXDA的分泌。但酶表達的增加有時會導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量水平高于表達宿主能夠加工、分泌的水平而產(chǎn)生瓶頸，結(jié)果蛋白產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累。相應(yīng)地，本發(fā)明還給出了異源引導(dǎo)序列以使S每從選擇的表達宿主最有效地分泌。根掂本發(fā)明，分泌前導(dǎo)序列可以在目標表達宿主的基礎(chǔ)上選擇。可逸擇與表達枸建物的其他調(diào)節(jié)區(qū)同源的l異源分泌前導(dǎo)序列。例16如，高分泌性葡糖淀粉酶蛋白的前導(dǎo)序列可與它自己的葡糖淀粉酶啟動子結(jié)合，也可以與其他啟動子結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中，也可有利地應(yīng)用雜合信號序列。優(yōu)逸的異源分泌前導(dǎo)序列的例子是那些來源于葡糖淀粉酶基因(真菌類的)，a—因子基因(酵母類的)或a—淀粉酶基因(芽胞桿菌屬的)的序列。一般地，不認為終止子是基因增強表達的重要元件。如果需要，可以從與啟動子一樣的基因中選擇終止子，或者用同源終止子。除了上面提到的基因組片段，轉(zhuǎn)化DNA可含一個選擇標記，來從非轉(zhuǎn)化細胞堆中區(qū)分出結(jié)合了目標基因的細胞。這個選擇標記，帶有逸當?shù)?'和3"周節(jié)序列，可能在含有目標基因的同一DNA分子上或者在另外的分子上。在后一情況下，必需進行共轉(zhuǎn)化。以適當方式調(diào)節(jié)表達載休與選擇載體之比，使高百分比的所逸轉(zhuǎn)化子同時摻入了含目的AXDA表達構(gòu)建物的載體。最逸合于工業(yè)徵生物的選擇系統(tǒng)是由在宿主生物中不需要突變的一組逸擇標記組成的。真菌類的選擇標記的實例為L酰M"酶基因(amdS)、ATP合成酶基因、亞單位9基因(oliC)和benomyl抗性基因(benA)。非真菌類逸擇標記的例子是細菌G418抗性基因(也可用于酵母，但不能用于真菌)、氮辛青霉素抗性基因(大腸桿菌)和新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)。一旦目的表達構(gòu)建物裝配好了，就轉(zhuǎn)化到合適的克隆宿主(如大腸桿菌)中以增殖構(gòu)建物。然后，將表達構(gòu)建物引入適當?shù)谋磉_宿主中，在那里表達構(gòu)建物就優(yōu)選整合到基因組中。象芽孢桿菌類的宿主可作為克隆宿主又可作為表達宿主，因此避免了額外的轉(zhuǎn)化步驟。根據(jù)本發(fā)明，多種生物可用作產(chǎn)生目的AXDA的宿主。在一個實施方案中，可以用同源表達宿主。這包括表達枸建物導(dǎo)回分離到AXDA編碼DNA序列的菌株，提高基因拷貝數(shù)，或在上述異源調(diào)節(jié)區(qū)的控制下，或兩者均有。在另一個實施方案中，目的AXDA的產(chǎn)生是通過在異源宿主(如細菌、酵母或真菌)中，在適當調(diào)節(jié)區(qū)的控制下，導(dǎo)入并表達編碼阿^粒伯木聚糖降解酶的DNA構(gòu)建物而實現(xiàn)的。為此，編碼目的AXDA的DNA序列優(yōu)逸在來源于異源宿主的啟動子和終止子序列控制下表達。另外，為了獲得產(chǎn)物的最大表達和分泌效率，有必要用與表宿主同源的前導(dǎo)序列取代原來的分泌前導(dǎo)序列。象大小(分子量)、適當?shù)奶腔蚰康腁XDA細胞外分泌的需要等因素，在逸擇表達宿主中起重要的作用。革蘭氏陰性菌——大腸桿菌廣泛用作異源基因表達的宿主。但是大量的異源蛋白傾向于在細胞內(nèi)累積。從大腸桿菌細胞內(nèi)蛋白中純化目的蛋白有時不容易。與大腸桿菌不同，芽孢桿菌屬細菌非常適合于作為異源宿主，因為它們有將蛋白分泌到培養(yǎng)基中的能力。根據(jù)AXDA編碼DNA分子本身的性質(zhì)，和/或者對表達蛋白進一步加工的需要，可以優(yōu)選象酵母、真菌這樣的真核宿主。一般來說，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，因為它們?nèi)菀撞僮?。但一些蛋白從酵母細胞中分泌的量少?或者有時加工不正確(如在酵母內(nèi)過多地糖基化)。在這樣的條件下，應(yīng)該逸擇真菌類宿主。通過選擇正常不能產(chǎn)生該酶的宿主(如乳克魯維氏酵母)，異源宿主也可選來用于表達基本無其他多糖降解酶的目的AXDA。本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)逸的表達宿主，例如是真菌類，如曲霉種(在EP.184,438和284,603中有述)和木霉種，細茵，如芽孢桿茵種(在EP.134,048中有述)和酵母類，如克魯維氏菌種(在EP.96,430和EP.301,670中有述)和糖酵母類。特別優(yōu)逸的表達宿主可逸自,f、色曲霉，黑色曲霉泡盛變種、棘孢曲霉、米曲霉、木霉、枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、乳克魯維氏酵母和畔酒糖酵母。目的AXDA錄的表達受用適當?shù)谋磉_枸建物轉(zhuǎn)化的表達宿主在常規(guī)的營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的培養(yǎng)情況影響。發(fā)酵培養(yǎng)基由含有碳源(如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜等)、氮源(如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)，有機氮源(如酵母膏，麥芽提取物、蛋白胨等)和無機營養(yǎng)源(如磷、鎂、鉀、鋅、鐵等)的普通培養(yǎng)基組成?？扇我莸匕环N誘導(dǎo)物(如阿拉伯木聚糖)。合適培養(yǎng)基的選擇是基于表達宿主的選擇和/或基于表達構(gòu)建物的調(diào)控要求而定的。這樣的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如果需要，培養(yǎng)基中可含對轉(zhuǎn)化的表達宿主有利而對其他潛在的污染微生物不利的附加成分。發(fā)酵可用分批或補料分批工藝進行0.5—20天，溫度0—45"C，pH2—10。優(yōu)逸的發(fā)酵條件是溫度20—37'C，pH3—9。最適條件依據(jù)選擇的表達宿主而定。發(fā)酵結(jié)束后，用離心或過濾法從發(fā)酵液中移出細胞。去除細胞后就可回收酶，如果需要，用常規(guī)方法純化和分離。產(chǎn)物可以穩(wěn)定地配制成液體或固體的形式，對某些應(yīng)用，優(yōu)選將酶固定在固體基質(zhì)上。用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的酶可單獨或與逸擇的基他酶一起應(yīng)用于需要阿拉伯木聚糖降解酶作用的各種加工工藝中。本發(fā)明的阿拉伯木聚糖降解酶可用于處理或制各食物(如面包)、伺料和飲料(如呌酒和果汁)。阿拉伯木聚糖降解酶也可有利也用于制各和處理紙和紙漿，尤其是與內(nèi)木聚糖酶結(jié)合使用。正如本發(fā)明中所述，將阿拉伯木聚糖降解酶加到富含阿拉伯木聚糖的動物飼料中。當加到喂單胃動物(如家禽或豬)的飼料(包括青貯飼料，其中含有象大麥、小麥、玉米、黑麥和燕麥等谷類植物或谷類植物的副產(chǎn)品，如小麥結(jié)或玉米錄)中時，該酶可以顯著改善植物細胞壁的破壞情況，使動物能更好地利用植物營養(yǎng)。最終，生長率和/或食物轉(zhuǎn)化率提高。另外，阿拉伯木聚糖降解S每可以用于降低含阿拉伯木聚糖的伺料的粘度。如果優(yōu)選預(yù)浸或濕飼料，阿拉伯木聚糖降解酶可以提前加到祠祠料或青貯飼料中。更有利的是，通過本發(fā)明產(chǎn)生的AXDA可在體內(nèi)繼續(xù)水解飼料中的阿拉伯木聚糖。阿拉伯木聚糖降解酶還可用于制作面包(如實施例8所述)。實驗—菌抹大腸f茵B(yǎng)BS(Silvavetal.,1984):el4(mcrA)hsdR514,supE44,supF58,lacYl,orCi(laclZY)6galK2,galT22,metBl,trpR55,O(argF-lac)U1SS[F',proABlacIqZCiM15,TnlO,(te亡"〕大腸桿萄DH5o;(Hanahan,1983):supE44,iCdacU169,(<!>80〗scZCiM15),hsdR17,recAl,endAl,gyrA96thi-l,大腸桿菌LE392(Murray,1977):el4(mcrA)hsdR514,supE44,supF58,lacYl,orO(laclZY)SgalK2,galT22,metBl,trpR55大腸桿菌XL1-BlueMRF'(Jerpsethetal.,1392):O(mcrA)183,0(mcrCB-hsdSMR-mrr)173,endAl,supE44,thi-1,recAl,gyrA96,relAl,lac,[F',proAB,lacIqZ<2iM15,TnlO,(tet"].黑色曲霉N徹(CBS120.49)N402(cspAl)Gooseneta丄.，IS87)黑色曲霉NW219(leuAl,_nicAl,pyrA6)載體pBluescriptSK+/-(Short,J.M.,etsipUC19(Yanish-Perroneta工.，1985)按Sambrook等(1989)制備了下列溶液1988緩沖液TE'50*TAE'20*SSC;Denhardts,SM,DNA力a樣培養(yǎng)基NZYCM,LB和基本培養(yǎng)基雜交按Visnkc和Santer(1957)制備Visniac;容液實施例實施例1:酶的分離實施例1.1:黑色曲霉泡盛變種的阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的純化與特征黑色曲霉泡盛變種DS16813的培養(yǎng)按照EPA0463706中的描述進行，但不用酵母膏并用2%的粗制小麥阿拉伯木聚糖部分代替斯保耳特燕麥木聚糖，細胞通過過濾、去除，上清通過超濾干燥。為了純化AXDA，將5g粗酶制備物稀釋到100ml10mMTris/HCKpH8.0)中。過濾酶溶液(Seitz/suprono250和Sekz/S寧oEKS)并稀釋到蛋白終濃度為5.2g/KBiorad蛋白測定)。粗酶通過HPLC(WatersPreparative650AdvancedProteinPurificationSystem)在DEAETSK650(M)陰離子交換柱(600mD上進行分部分離(速度25ml/min)。柱子用25mMTris/HCl(pH8,O)平衡，樣品(3g蛋白)上柱并用含lOOmMNaCl的平衡緩沖液梯度洗脫。AXDA酶在53mMNaCl濃度處被洗脫下來，如固1所示。實施例1.2:最適pH為了確定AXDA粗酶制品的最適pH，用玉米的水不溶固體(WIS)聚合物部分作為底物。將1.6mg粗酶制品加入0.5gWIS并用從3.40到7.65的不同pH的緩沖液(100mMNaAc)稀釋到5ml。樣品在39。C保溫60分鐘并離心15分鐘(2800g)，上清液中還原糖用Sumner試劑測定。Sumner試劑的制備10g苯酚加入到22ml10%NaOH.中，隨后用去礦質(zhì)水將休積調(diào)至106ml并加10gNaHS03。70ml該溶液依次加入300ml4.5%NaOH，255g酒石酸鉀或酒石酸鈉和800ml1%3.5—二碎基水楊酸，混和物隨后在室溫下欖拌直到化學試劑溶解。200^1樣品中加入0.5mlSumner試劑并煮滯10分鐘，冷卻后加入5ml去礦質(zhì)水，在515mn測定.消光值。樣品的還原糖含量利用木糖標準曲線計算。該酶的最適pH為5.0，如困2所示。實施例1.3:氮基酸組成來自DEAE柱的AXDA部分的氬基酸組成在PICO—TAG150MM柱上測定(在254nm檢測)，發(fā)現(xiàn)下列組成'。氛基酸:,'-:威;:計算的摩爾百分數(shù):ASP1.1113.43GLU0.8.13SER1.0012.13GLN0.000，00GL>Y0，8410.25HIS0.121.30ARG/ASN0182.12THR0718.48ALA0748.83PRO0.344.00TYR0.465.54VAL0.435.06MET0.111.30工LE0.293.42LEU0.526.12PHE0.435.18LYS0.384.5923表l:AXDA的氮基酸組成HPLC泵CM4000;檢測M440,254nm;加樣4filGilson232;柱PICO—TAG150MM;數(shù)據(jù)系統(tǒng)Maxima實施例1.4:生化特征(等電點和分子量)AXDA的等電點(IEP)在Pharmacia微型凝膠(minigel)pH3—9上測定。蛋白用Pharmacia銀染溶液染色。AXDA酶的等電點約為3.6。AXDA的分子量在Pharmacia微型梯度SDS凝膠(10—15%)上測定，蛋白用銀染(Pharmacia)檢測。AXDA的分子量約為32kDa。實施例1.5:黑色曲霉泡盛變種阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的蛋白測序?qū)嵤├?.5.1:黑色曲霉泡盛變種阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的N末端氮基酸測序大約lnmol(&30Mg)AXDA在15%SDS—聚丙烯酰臉凝膠中進行電泳，而后根據(jù)Matsudaiza(1987)所描述的方法電轉(zhuǎn)印到Im-mobilon—P膜(Millipore)上。含有具有32kDa表現(xiàn)分子量(SDS—PAGE)的主帶的膜片段在氣相測序儀(SONfacility，Leiden)中進行序列分析(Amons，1987)，確定出下列序列:ILys--Ala-Leu-Pr。-ser〈er,rI(SEQIDNO:1)實施例1.5.2阿拉伯木聚糖降解酶活性A(AXDA)的CNBr肽段的氮基酸序列測定大約2nmo1AXDA用CNBr進行化學裂解將大約2nmol("60pg)AXDA冷凍千燥并重新懸浮在含125fxgCNBr的60pil70%甲酸(2.5mg/ml)中，該反應(yīng)混和物黑暗中室溫下保溫48小時。液體在Speedvac中蒸發(fā)，用無菌雙蒸水清洗并再次蒸發(fā)。該清洗步驟重復(fù)兩次。然后反應(yīng)混和物在15%SDS—聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，隨后根據(jù)Matsudaira(1987)所描述的方法電轉(zhuǎn)印列Immobilon一P膜(Millipore)上，含有具有大約9kDa表現(xiàn)分子量(SDS—PAGE)的主帶的膜片段在氣相測序儀(SONfacility，Leiden)中進行序列分析(Amons，1987)，確定出下列序列CNBr肽段Ile-Val-Glu-Ala-Ile-Gly-SenG^His,-,Phe-(Arg/Asn)-(Ser)-(Phe)-(Thr)(SEQI聽2)不明確的氬基酸在括號中給出。實施例2:AXDA的酶特征用對確基苯阿拉伯呋喃糖爺為底物(Sigma)測定《—阿拉伯呋喃糖爺酶的活性。在lml底物中加300^1酶溶液。30"C溫育15分鐘后用5mlNa2C03(5M)中止反應(yīng)。測402nm處的消光度。計算a—阿拉伯呋喃糖苷酶活性(休積X消光度)/(Ex時間)。制備的粗酶中含0.3pNPAFU/mg的a—阿拉伯呋喃糖普酶活性。測定從DEAE柱所得流份的活性。阿拉伯呋喃糖普酶活性部分含3.0pNPAFU/mg活性(見困1)。其他部分未發(fā)現(xiàn)有a—阿拉伯呋喃糖普峰活性。然后在玉米的水不溶性聚合物部分上測試a—阿拉伯呋喃糖普酶活性合并液，沒有測到對此底物的活性。這表明AXDA對對辟基苯類底物無a—阿拉伯呋喃糖苷酶活性。為了進一步測定AXDA的S每活性，在含小麥阿拉伯木聚糖的底物上歸選用塔賓曲霉axdA—基因轉(zhuǎn)化的黑色曲霉的培養(yǎng)物濾液的活性。塔賓基因被置于丙酮酸激酶(一種糖酵解酶)啟動子控制之下，逸擇生長條件以利于轉(zhuǎn)基因的表達，而避免內(nèi)源性阿拉伯糖降解酶的表達。相應(yīng)地測出了AXDA對大分子量阿拉伯木聚糖底物有釋放阿二粒伯糖的活性。用Sedmak的方法測蛋白質(zhì)含量。AXDA活性的測定取lOO/il培養(yǎng)物濾液的不同釋液(在10mML酸鈉緩沖液中pH5.O)加到150^1的50mM乙酸鈉(pH5.O)和250^10.4%小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme)混合液中，40"C溫育1小時。10b"C加熱此混合物IO分鐘以終止反應(yīng)。用HPAEC(高故陰離子交換層析)來跟蹤阿拉伯木聚糖降解產(chǎn)物，用熱滅活的培養(yǎng)物作為樣品。結(jié)果如下表0塔賓曲霉AXDA對小麥阿拉伯木聚糖的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>1個單位的阿拉伯呋喃糖水解酶活性定義為每分鐘從阿拉伯木聚糖釋放l/^mole阿拉伯糖所需酶的量。推論塔賓曲霉的AXDA酶有阿拉伯呋喃糖水解酶(AXH)活性。用Megazyme的阿拉伯聚糖峰檢測試劑盒并按其說明進行操作，測定阿拉伯聚糖酶活性。實驗中，DEAE柱的AXDA合并液對線性阿拉伯聚糖無活性。這表明AXDA不是阿拉伯聚糖酶。用燕麥斯拜耳特木聚糖測定內(nèi)阿拉伯木聚糖酶活性。將10ml5^的木聚糖懸液(100mMNaAc，pH3.5)煮淬10分鐘。冷卻后，39"C溫育10分鐘。加0.5ml蜂溶液開始反應(yīng)。幾次溫育(5，10，15，20，25分鐘)后，取在39"C溫育的樣品1.5ml，加到1.5ml脫礦質(zhì)水中，煮沸10分鐘。離心(2800g)樣品15分鐘。用Sumner試劑(見實施例1.2)檢查上清液中的還原糖。在AXDA合并液中，發(fā)現(xiàn)了399.0U/mg的內(nèi)木聚糖酶活性。然后在休外消化系統(tǒng)中(見實施例6)測定內(nèi)木聚糖酶和AXDA。由此得出結(jié)論在AXDA合并液中的內(nèi)木聚糖酶活性是與不同的多肽活性相關(guān)的活性。Kormelink(1992，phD論文，第6章，P107最后二段和P108)發(fā)現(xiàn)了與類似AXDA的酶共洗脫具有內(nèi)木聚糖酶活性多肽的進一步"i正據(jù)。因此推斷AXDA本身無內(nèi)木聚糖酶活性。實施例3:cDNA表達文庫的構(gòu)建實施例3.1:mRNA的誘導(dǎo)和分離按EPA0463706中所述，分別培養(yǎng)黑色曲霉N40069和81小時，但無酵母膏，2%的粗制小麥阿拉伯木聚糖部分代替燕麥斯拜耳特木聚糖，然后辻濾收集菌絲體，用無菌鹽水漂洗。然后在液氮中冷凍菌絲體，再用微脫膜器(Braun)磨成粉。按照Sambrook等人(1989)提出的異疏氰酸胍/氯化銫法從菌絲體粉中分離總RNA，只是用氯化絕梯度離心RNA兩次。帶polyA的mRNA是用oligo(dT)—纖維素層析法從5mg的總RNA中分離的(Aviv和Leder，1972，Sambrook等，1989)，并做如下修改所有的溶液中均無SDS，載樣緩沖液用9^(V/V)的二甲基亞砜補充。實施例3.2:cDNA文庫的構(gòu)建用ZAP—cDNA合成試劑盒(Stratagene)按照廠商說明從7ygpolyA十mRNA合成cDNA，并連接到i菌體入一Uni—ZAPXR中。cDNA連到Uni—ZAPXR的載體臂后，根據(jù)操作說明用Packa-geneTMextracs(Promega)包裝喧菌體DNA。將120ngcDNA連接到1.2pg載體臂上，然后包裝反應(yīng)混合物，產(chǎn)生包括3.5X104重組噬菌體的初級文庫。用大腸桿菌XLl—BlueMRF，擴增此初級文庫，滴定并在4"C保存。實施例4:用抗AXDA的抗休篩選黑色曲霉N400cDNA文庠并分離cDNA克隆實施例4.1:在兔體中制備抗AXDA的抗體對pH7.0的lmM石岸酸緩沖液中透析500pgAXDA并冷凍千燥。重懸蛋白質(zhì)于lml無菌PBS(O.136MNaCl，2.7mMKC1，8mMNa2HP〇4，1.75mMKH2P04，pH7.4)中。向此蛋白質(zhì)混合物中加入28lml福氏完全佐劑，渦旋30分鐘，得到穩(wěn)定的乳狀液。將此混合物注入家兔皮下。第六周，加強注射加入O.5ml福氏不完全佐劑的溶于0.5ml無菌PBS的250MgAXDA。在第七周取家兔血并檢查血清。第13周進行第二次加強注射250pg，第十四周取血。這一間隔6周取血的加強注射過程可重復(fù)兒次。收集的血樣置于37"C保持30分鐘，然后在4。C保存16小時。在Sorvall高速離心機中5000irpm離心收集血清。實施例4.2:用抗AXDAtub的抗體免疫f|選黑色曲霉N400的cDNA文庫為了篩逸按實施例3.2所述枸建的黑色曲霉N400的cDNA文庫，如已述(Maniatis等，1982，pp64)的方法在直徑85mmNZYCM(含1.5%琮脂)平板(其頂層琮脂中含0.7%琮脂糖)上，每板鋪5X103pfu的axdA克隆，用E.codiBB4為鋪板細菌。按Sambrook等人(1989，ppl2.16—12.17)的方法，每個平板用硝酸纖維素濾膜(SchleicherandSc磁l，BA85)印兩份。用歐洲專利申請91205994.5(公布號0463706Al)描述的免疫染色法染色后，可用高抗純化AXDATUB的抗休(實施例4.l)顯現(xiàn)AXDANIG。鑒定出重復(fù)出現(xiàn)在復(fù)制膜上的免疫染色的噬菌磁，篩逸了8個陽性噬菌斑。每個^菌免都用巴斯德吸管從平板中吸出，在含2(Vl氯仿的lmlSM緩沖液中使噬菌體從碌脂塊中擴散出來(Mnaiatis等人，1982，pp64)。用從含50—100個所分離噬菌體噬菌斑的平板得到的濾膜復(fù)制品，重復(fù)上述方法，純化得到的噬菌體。純化以后，將噬菌休(5X103個)鋪在NEYCM培養(yǎng)基中增殖噬菌體。37。C辻夜培養(yǎng)，得到鋪滿的平板，加5mlSM緩沖液從中洗脫噬菌休，平板置4"C、4000xg保存2小時，間斷搖動。用吸管取上清后，4。C離心10分鐘從溶液除去細菌。在上清液中加入0.3%氯仿，測定滴度pfu。此噬菌休儲液的滴度約為10"pfu/ml。實施例4.3:axdAcDNA克隆的限制酶切分析根據(jù)廠商說明，利用與絲狀輔助噬菌體ExAssistTM(包括在Stratagene的ZAPTM—cDNA合成試劑盒中)雙重感染，將含axdAcDNA的重組Uni—ZAPXR克隆轉(zhuǎn)到Bluescript噬菌粒中。然后按Sambrook等人(1989，ppl.25—1.28)的方法分離-藍菌粒DNA。8個axdAcDNA克隆的分離DNA用下列限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol進行限制酶切分析。DNA在由下列溶液組成的反應(yīng)混合物中在37"C消化2小時2卩1(=l;ig)DNA溶液；2^1適當?shù)?0X反應(yīng)緩沖液(BRL);10U的各種限制性內(nèi)切酶(BRL)和無菌蒸餾水，終體積為20W。加DNA載樣緩沖液后，加樣于0.7%TAE—碌脂糖凝膠。80伏電泳分離DNA片段1.5小時。限制性酶切分析表明axdAcDNA克隆的分子大小約為1.2kb。實施例4:,f、色曲霉axdAcDNA克隆的序列分析用序列分析結(jié)合在測序反應(yīng)中用物異的寡核普酸作引物來測定cDNA克隆的一級結(jié)構(gòu)。用雙脫氣寡核爺酸鏈終止法(Sanger等，1977)用PharmaciaT7DNA聚合酶測序試劑盒測定寡核普酸序列。用PC/GENE程序進行計算機分析。實施例4.5:片段的"P標記,f、色曲霉axdAcDNA克隆片段的分離和標記按照歐洲專利申請91205944.5(公布號0463706Al，實施例2.2和7.1，并入本文作為參考)描述的方法進行。實施例4.6從黑色曲霉黑色變種的基因組文庫篩逸axdA基因，并分離該基因。為了歸逸按照Hamisen等人(1990)的方法構(gòu)建的黑色曲霉黑色變種文庫，每個平板鋪3X103pfu的axdA基因，平板為5個Ma-niatis等(1982，pp64)所述的85mm直徑的NZYCM(含1.5%^脂)，頂層碌脂為含0.6%琮脂糖的NZYCM，.用大腸桿菌LE392為鋪板細菌。37。C過液培養(yǎng)，按照Maniatis等人的方法(1982，pp320—321)每個平板在HybondN濾膜(Amersham)上印二份。用3XSSC濕潤濾膜后，室溫下用3:XSSC沖洗60分鐘。濾膜在65"C下預(yù)雜交二小時，預(yù)雜交緩沖液含有6XSSC，0.5%SDS，10XDenhardt氏溶液，0.01MEDTA和100pg/ml熱變性的緋魚精子DNA(BoerhingerMannheim)。預(yù)雜交二小時后，用雜交緩沖液代替預(yù)雜交緩沖液。雜交緩沖液與預(yù)雜交緩沖液相同，只是含有按實施例4,5制備的"P標記的含黑色曲霉axdAcDNA克隆(見實施例4.3)的1.2kb片段。濾膜在65。C溫度下雜交18小時。雜交后濾膜先在65"C下用5XSSC/0.1%SDS漂洗30分鐘，再于2XSSC/0.1%SDS中65"C漂冼30分鐘。然后于0.1XSSC/0.1%SDS中65T漂洗30分鐘，最后在0.1XSSC中65。C漂洗30分鐘。風千的濾膜置于一張3MMWhatman紙上，用放射性墨水做標記，用SaranWrap蓋上Whatman紙和濾膜。用KodakXARX—光膠片在一7(TC時放置72小時，用增敏屏鑒定雜交噬菌論。31找到了出現(xiàn)在復(fù)制濾膜上的10個陽性雜交噬地。用巴斯德吸管吸出4個陽性噬紐。按Maniatis等人的方法(1982，pp64)在含20^x1氯仿的lmlSM緩沖液中，使噬菌體從碌脂塊中擴散出來。用含分離的噬菌休的50—100個噬菌&的平板濾膜復(fù)制物重復(fù)上述方法，純化得到的噬菌休。純化以后，^菌休(5X103個)鋪于NZYCM培養(yǎng)基中增殖。37。C培養(yǎng)過夜，得到鋪滿的平板。加5mlSM緩沖液洗脫噬菌體，平板置4。C保存2小時，間斷搖動。用吸吸管取上清液后，4"C、4000Xg離心IO分鐘從溶液中除去細菌。在上清液中加0.3%氯仿，測滴定度。此噬菌體儲存液的滴度約為107pfu/ml。實施例4.7:從入噬菌體中分離DNA在300/ilSM緩沖液中，5X109E.coliLE329和2X106嗜菌體一起在37'C培養(yǎng)15分鐘來增殖每個分離的噬菌休。然后將被感染的細菌接種到100ml預(yù)熱的(37"C)NZYCM培養(yǎng)基中，置于NewBrunswick旋轉(zhuǎn)振蕩器上(轉(zhuǎn)速250rpm)37"C培養(yǎng)9—12小時。然后裂解細菌，用Sorvall高速離心機，4"C，10，000rpm離心10分鐘去除細菌碎片。加入10g聚L二醇一6000和11.7gNad于上面得到的上清液(100ml)中并將溶液置于4"C過夜，以沉淀噬菌休。沉淀的噬菌體經(jīng)4"C、14，OOOXg離心20分鐘收集。吸出上清液，最后泉量液體用紙巾吸出。小心地重懸噬菌體于4mlSM緩沖液中并用等體積的氯仿抽提一次。在從^菌體顆粒中提DNA之前，先在37"C用DNaseI和RNaseA(都是100/ig/ml)溫育噬菌體懸液30分鐘，以除去來自裂解細菌的DNA和RNA。然后加入EDTA達終濃度20mM，使噬菌休DNA從峻菌休中釋放出來，同時用等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提兩次去蛋白質(zhì)。用Sorvall離心機(1400Xg，10分鐘)離心使液相分層后，水相用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提一次。離心分離噬菌體，然后加入0.1倍體積的5M高聚酸鈉和0.1倍體積的異丙醇，冰上溫育30分鐘使DNA從水相中沉淀。4'C離心(14000Xg)10分鐘回收DNA。吸去上清，重懸DNA于400/jiITE緩沖液中。加入0.1倍體積的3M乙酸鈉和2倍休積的L醇再沉淀一次DNA。4。C離心(14000Xg)10分鐘收集DNA。吸去上清.，真空千燥留下的固休物，然后在含0.lyg/mlRNaseA的125pdTE緩沖液中重懸DNA。這樣的純化步驟可從每一噬茵體中分離大約50—lOOpgDNA。實施例4.8:含黑色曲霉黑色變種axdAcDNA噬菌體的Southern分析。用下列限制性內(nèi)切酶對Xnigaxd1至入nigaxd4喧菌體的分離DNA進行Southern分析Kpnl，Sail,Sstl，Xbal和Xhol及S每組合kpnl+Xbal，kpnl+Sstl及Kpnl+Xhol，在37"C下反應(yīng)5小時，反應(yīng)混合物中包括下列溶液5fxl("lpig)DNA溶液，2yl適當?shù)?0X反應(yīng)緩沖液(BRL)，10U限制性內(nèi)切酶(BRL)和無菌蒸餾水，調(diào)節(jié)終休積為20/^1。消化后，加入0.1倍體積3MNaAc和2倍休積的L醇來沉淀DNA。室溫下離心(14000Xg)10分鐘收集DNA。吸去上清液，真空下迅速千燥留下的因體物，重懸在無菌蒸餾水中。加入4ylDNA載樣緩沖液后65"C保溫10分鐘，迅速在冰上冷卻，之后加樣到TAE緩沖液中的0.6%碌脂糖凝膠中。25V下電泳15—18小時分離DNA片段。電泳后，用堿性真空印跡法(VacuGeneXL，PharmaciaLKB)變性并轉(zhuǎn)移DNA至尼龍膜(HybondN，Amersham)上，(按指導(dǎo)手冊中的方法，pp25—26)，然后如實施例4.6所述，用標記的黑、色曲霉axdAcDNA克隆預(yù)雜交和雜交，雜交條件如實施例3.3中所迷。雜交固用增敏屏在一7(TC下用KodakXAR—5X光膠片曝光而獲得。從所得的結(jié)果推斷全部4個分離克隆的DNA與黑色曲霉ax-dAcDNA雜交。在全部4個克隆中，找到了來源于同一基因組區(qū)域的片段。、實施例4.9:黑色曲霉黑色變種的axdA基因的亞克隆用冷凍擠壓法從0.7%的琮脂糖凝膠中分離來自Xnigaxdl的3.7kb的Xhol片段電泳后，切出合適的帶，在lmlFSl溶液(0.3MNaAc，pH7，0，lmMEDTA)中輕輕搖蕩30分鐘。將碌脂糖膠條轉(zhuǎn)移至一個0.5ml的eppendorf管中(其中有一個小的砝烷化的玻璃棉塞，底部有一小孔)，在液氮中冷藏。從此O.5ml管移至一只1.5ml的eppendorf管中，然后離心10分鐘。在上清液中加入1/50體積的FS2溶液(O.5MMgCl2，5%乙酸)和2.5倍體積的100%乙醇。一7(TC保存20分鐘，4"C(U000Xg)離心15分鐘收集DNA。移去上清液后，用SavantSpeedvac真空離心機千燥DNA沉淀。將此DNA溶于1(^1TE緩沖液中，用碌脂糖電泳測定其濃度，用已知濃度的XDNA作為參照，溴化L錠染色檢測DNA。載體PBluescriptSK—用Xhol消化，用堿性磷酸酶去磷酸化。按下述方法制各lpl(WMl)pBl薦ript與10X反應(yīng)液2(BRL)，lptKlU/pd)Xho1和無菌蒸餾水混合。DNA在37。C下消化2小時，然后加入0.5^1堿性磷酸酶(lU/yl，Pharmacia)，再繼續(xù)在37。C溫育30分鐘。如上所述線性化的載休用0.7%碌脂糖凝膠分離。按下述步驟將3.7kbXhol片段連接到Xhol消化的去褲酸化的pBluescriptSK-載體中將40ngpBluescript片段與300ng3.7kbXhol片段混合，再加入4^15X連接緩沖液(500mMTri—H￡l，pH7.6;lOOmMMgCl2，100mMATP，10mM二硫蘇糖醇，25%PEG—6000)和lfil(lU/(il)T4DNA連接酶(BRL)，最終休積為20pl。得到的質(zhì)粒被稱為pIM3002。、混合物在16"C溫育16小時后，用Ca—HEPESpH7.0的緩沖液稀釋到100^1。取10pl所稀釋的混合物來轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細胞。該細胞的制備方法如下200;i1的預(yù)生長在LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基/lOOml:10g胰蛋白酶胨(BBL)，5g酵母膏(BBL)，10gNaCl，0.5mMTris—HCl，pH7.5)的E.colipH5a過夜培養(yǎng)物。此培養(yǎng)物在定軌搖床上37"C培養(yǎng)，直至其濃度達到OD.600介于0.15—0.2之間。4"C、5000rpm離心收集細菌。棄上清，迅速置細胞于冰上。用100ml的100mMMgCl2、5mMTris—HClpH7.4漂洗細菌沉淀，懸浮細胞，再如上離心。用100ml的100mMCaCl2、5mMTris—HClpH7.4重復(fù)該操作。最后將細胞懸浮在2ml的100mMCaCl2、5mMTris—HClpH7.4，14%甘油的混合液中。各等份可以立即用于轉(zhuǎn)化，也可于一70'C冷藏。E.coliDH5a感受態(tài)細胞用于轉(zhuǎn)化實驗50^1的細胞懸液與4.5^1的連接混合物混合，冰育30分鐘后，42"C溫育細胞2分鐘。然后加入lmlLB培養(yǎng)基，在37"C溫育1小時。14000g離心30秒收集細菌。棄上清，將細胞重懸于200W的LB增培養(yǎng)基中。形成的細菌懸液鋪在含1000/ul/ml氮芐青霉素、50jLtgX—(Gal)半乳糖和60ptg/mlIPTG的LB培養(yǎng)基平板上。.從形成的菌落中挑出12個，在含100pg/ml氮芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。用Maniatis等人(1982，pp368—369)的堿裂解.法從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，它可用于如實施例4.3所述的限制性酶切分析以選出帶有目的質(zhì)粒的克隆。根據(jù)廠商的操作說明，用NuckobondPC—500試劑盒(Nagel)從250ml含質(zhì)粒pIM3002的E.coliDH5a培養(yǎng)物(生長在含100fil/ml氬節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中)中大量分離質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒pIM3002進一步用限制性內(nèi)切酶分析，得到的限制性酶切困見圖4。一個含pIM3002的E.codiDH5a樣品于1995.8.28日保藏在荷蘭Baarn的CBS，保藏號為CBS637-95。實施例4.10:克隆基因在黑色曲霉NW219中的超量表達。實施例4.10.1:利用共轉(zhuǎn)化法將黑色曲霉黑色變種的axdA導(dǎo)入黑色曲霉NW219中。在實施例4.9得到的質(zhì)粒pIM3002通過黑色曲霉NW219的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入果色曲霉中，用黑色曲霉pyrA基因作為質(zhì)粒PGW635(Goosen等，1987)上的逸擇性標記，質(zhì)粒plM3002為共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。黑、色曲霉NW219的一個樣品于1995,8,25保藏在荷蘭Baarn的CBS，保藏參為CBS635.95。用生長在補加了5%酵母膏0.2%酪蛋白氛基酸，50mM葡萄糖、10mM煙酰膾和10mM尿普的基本培養(yǎng)基中18小時(3(TC下)的黑色曲霉NW219的菌絲體制各原生質(zhì)體，并按照Goosen等人(1987)的方法進行轉(zhuǎn)化操作。得到的PYR+轉(zhuǎn)化子用Westernblot分析法分析黑色曲霉黑色變種axdA基因的表達。實施例4.10.2:篩選表達黑色曲霉黑色變種的axdA基因的轉(zhuǎn)化子。對實施例4.10.1獲得的轉(zhuǎn)化子進行黑色曲霉黑色變種axdA基因產(chǎn)物(AXDA,蛋白質(zhì))的形成分析。在一個生長實驗中，，用19個這樣的轉(zhuǎn)化子來分析AXDA^g的表達。黑色曲霉N402抹用作野生型對照。按實施例3.1所述，轉(zhuǎn)化子分別生長了24、40、48和68小時。然后，過濾去除菌絲休，培養(yǎng)物濾液用從家兔中獲得的抗AXDAtub抗休(實施例4.1)進行Western印跡分析。用此方法檢測發(fā)現(xiàn)，分析的19個轉(zhuǎn)化子中有8個超量產(chǎn)生AXDAnk蛋白。實施例4.11:黑色曲霉黑色變種axdA基因的序列分析和描述。在測序反應(yīng)中用來自pBluescriptSK-中pIM3002和pUC19的亞克隆片段結(jié)合特異寡核普酸作為引物，測定黑色曲霉黑色變種的axdA基因的序列，它的啟動子/調(diào)節(jié)區(qū)，基因的結(jié)構(gòu)部分和終止區(qū)。核酸序列的測定如實施例4.4中所述(SEQIDNO:5)。得到的序列包括2101個bp，783個bp在5'端非編碼區(qū)，332個bp在3'端非編碼區(qū)。在5'非編碼區(qū)的665—670位置，發(fā)現(xiàn)了一個TATA盒。黑色曲霉axdA基因的編碼部分有996bp長，未被內(nèi)含子打斷。該基因編碼一個有332個氬基酸的蛋白質(zhì)。N—末端序列(象在實施例1.5.1中根據(jù)黑色曲霉塔賓變種的AXDA蛋白質(zhì)那樣測定)之前有一段長度為26個氬基酸的前肽。成熟蛋白質(zhì)大小為306個氬基酸，預(yù)測其分子量為33.OlkDa，理論等電點為4.07。實施例5.1:PCR所得含黑色曲霉塔賓變種axdA基因序列的cDNA片段的克隆37實施例5.1.1:利用PCR法生成cDNA片段內(nèi)部CNBr片段(SEQIDNO:2)的部分氬基酸序列(見AX-DAxuB的測定)用于設(shè)計寡核普酸混合物。由此得到下面的混合物5'—ATGATKGTIGARGCTATKGG—31(20個堿基)(SE-QIDNO:3)，其中，I代表次黃嚯呤核普，K代表A、T或C，R代表A或G。這個寡核普酸是從上迷實施例1.4.2中所述的AXDAtub的內(nèi)部氱基酸序列(氱基酸l(I)到6G)推演出來的。ATG是從甲硫氛酸推出的，如人們所知因為CNBr裂解機制，甲硫氮酸出現(xiàn)在肽片斷N—末端。這個寡核苷酸混合物與寡核苷酸T7(Stratagene)51—AATACGACTCACTATAG—31(17個堿基)(SEQIDNO:4)起用于如實施例4.7中分離的cDNA的PCR反應(yīng)。為進行PCR反應(yīng)，將2^1的入一cDNA與5/LtllOX反應(yīng)緩沖液(100mMTris—HC1，pH8.3，500mMKC1，15mMMgCl2，0.01%明膠)、4.0^11.25mM四種脫氣核苷三磷酸，和0.5yg的寡核苷酸混合，終體積為50pl。混合反應(yīng)混合物，加入0.5fxlTAQ聚合酶(5U/pd，HTBiotechnology,Cambridge,UK)。DNA置于95"C溫育3分鐘熱變性，然后進行25次循環(huán)，95。Cl分鐘,42'Ct分鐘，72"C1分鐘。25次循環(huán)后，混合物置于72X:溫育5分鐘。對反應(yīng)產(chǎn)物的分析揭示了兩個分立的產(chǎn)物:'500bp和600bp。根據(jù)AXDA的表現(xiàn)分子量32kDa和CNBr肽的表現(xiàn)分子量9kDa，此片段在預(yù)計范圍內(nèi)。實施例5.1.2:500bp和600bpPCR片段的克隆和分析實施例5.1.2.1:500bp和600bpPCR片段的克隆依照廠商操作說明，兩個500bp和6.00bp的PCR片段都連到一個pGEMTM—T(Pomega)載休上。U"C溫育16小時后取4.5yl的連接混合物轉(zhuǎn)化E.codiDH5a感受態(tài)細胞。每個連接反應(yīng)選出6個菌落在含100pg/ml氬爺青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。按照Ma-niatis等人(1982，pp368—369)的堿裂解法分離培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA。實施例5.1.2.2:500bp和600bpPCR片段的序列分析按照實施例4.4的方法測定片段序列確定500bp和600bpPCR片段的一級結(jié)枸。兩個PCR片段的核爺酸序列的計算機分析表明600bp的PCR片段與已知的阿拉伯木聚糖降解基因無相似性，因此被看成是一個PCR反應(yīng)的假相。500bpPCR反應(yīng)片段的核普酸序列與困4所示的cDNA克隆的核爺酸序列，從706至1204很相近。實施例5.2:500bpPCR片段的"P標記PCR反應(yīng)得到的500bp片段按歐洲專利申請91205944.5(公布號0463706Al，實施例2.2和7.1并入本文中作為參考)中所述方法進行分離和才示記。實施例5.3:從黑色曲霉塔賓變種基因組文庠篩選axdA基因為了篩選黑色曲霉塔賓變種的基因組文庠(按照歐洲專利申請91205944.5，公布號0463706Al實施例2的方法構(gòu)建)，按實施例4.6的方法鋪平板，每板鋪3X103pfuaxdA基因，用"P標記的500bpPCR片段(按實施例5.1.1的方法制備)作為探針。出現(xiàn)在復(fù)印膜上的重復(fù)的三個雜交噬地被鑒別并定名為入tubaxM到入tubaxh3。按實施例4.6的方法分離和擴增噬菌休。實施例5.4:含黑色曲霉塔賓變種axdADNA的喧菌體的Southern分析按實施例4.7的方法分離入噬菌休的DNA。用下列限制性內(nèi)切酶對從噬菌休Xtubaxdl.至Xtubaxd3分離的DNA進行Southern分析BamHI、EciRI、Hind邁、KpnI、SalI、Sstl和Xhol。按實施例4.8的方法進行Southern分析。從得到的結(jié)果推斷全部三個分離克隆的DNA與黑色曲霉塔賓變種的axdAcDNA雜交。在全部三個克隆中都發(fā)現(xiàn)了來自相同基因組區(qū)的片段。實施例5.5:黑色曲霉塔賓變種axdA基因的亞克隆來自入tubaxds的5.5kbSstl片段被分離并連到按實施例4.9的方法用Sstl消化并去磷酸化的pBluescriptSk—載休上，產(chǎn)生一個被稱為pIM3001的質(zhì)粒。進一步用限制性內(nèi)切酶分析質(zhì)粒pIM3001，得到的限制性S每切固示于困6中。一份含pIM3001的E.coldiDH5a樣品于1995，8.28保藏荷蘭Baarn的CBS，保藏號為CBS636.95。實施例5.6，黑色曲霉塔賓變種的axdA基因在黑色曲霉NW219中的表達。實施例5.6.1:通過共轉(zhuǎn)化將黑色曲霉塔賓變種axdA基因引入黑色曲霉NW219中。按實施例5.5得到的質(zhì)粒pIM3001，按實施例4.10.1的方法對黑色曲霉NW219共轉(zhuǎn)化，引入黑色曲霉中。然后用Western印跡分析法分析得到的PYR+轉(zhuǎn)化子的黑色曲霉塔賓變種axdA基因的表達o實施例5.6.2:篩選表達黑色曲霉塔賓變種axdA基因的轉(zhuǎn)化子。實施例5.6.1獲得的轉(zhuǎn)化子被用于分析,f、色曲霉塔賓變種ax-dA基因產(chǎn)物(AXDAruB蛋白)的形成。在生長實驗中用了19個轉(zhuǎn)化子來分析AXDAtub的表達。黑色曲霉N402株被用作野生型對照。轉(zhuǎn)化子按實施例3.1的方法分別培養(yǎng)20、41、60和86小時。然后辻濾，去除茵絲體，用從家兔中獲得的抗AXDATue的抗體(實施例4.l)用Western印跡法分析培養(yǎng)物濾液。分析的19個轉(zhuǎn)化子中有12個產(chǎn)生能用此方法檢查到的AXDAtub蛋白盾。實施例5.7:黑色曲霉塔賓變種axdA基因的序列分析及描述在測序反應(yīng)中，用來自pBluescriptSK—中pIM3001和pUCl9的亞克隆片段結(jié)合用特異的寡核苷酸作為引物，測定黑色曲霉塔賓變種axdA基因的序列，它的啟動子/調(diào)節(jié)區(qū)、基因的結(jié)構(gòu)部分和終止區(qū)。核酸序列的測定如實施例4.4中所述(SEQIDNO:7)。得到的序列包括2859個bp，823個bp在5，端非編碼區(qū)，1041.個bp在3'端非編碼區(qū)。在5'端非編碼區(qū)的651—655位置發(fā)現(xiàn)了一個CAAT盒，在713—720的位置發(fā)現(xiàn)了一個TATA盒。，f、色曲霉塔賓變種axdA基因的編碼部分長度為996個bp，未被內(nèi)含子打斷。該基因編碼的蛋白質(zhì)有332個氨基酸。按實施例1.5.l測定的N—末端序列之前有一個長26個氬基酸的前肽。成熟的蛋白質(zhì)有306個氛基酸大小，預(yù)計其分子量大小為33.250kDa，理論等電點為4.20。實施例6:用AXDA休外消化玉米。實施例6.1:水不溶性固體(W1S)的分離分離用于體外消化系統(tǒng)的玉水的不溶于水的聚合物部分。用Retsch研磨機磨玉米(3mm大小)，用己烷(索氏蒸餾裝置)脫脂6小時，然后在105"C千燥，再磨碎(lmm，Retsch研磨機)。在脫脂的400g玉米中加1.5升1.5%SDS/0.05^卩一玟基L醇，室溫攪拌1小時(以破壞蛋白質(zhì))，然后24000g離心15分鐘。蛋白質(zhì)變性后，用1升SDS/P—統(tǒng)基乙醇洗沉淀三次，再用1升脫礦質(zhì)水洗二次。沉淀重懸在4升的脫礦質(zhì)水中，舜濾(32pm)。.重復(fù)漂洗和篩濾過程。粗WIS沉淀部分(大于32ptm)溶于1升的馬來酸緩沖液中(pH6.5)90。C保存50分鐘。再加2mga—淀粉酉|(MaxamylTMGist—brocades),30"C下保存16小時。然后24000g離心15分鐘。65"C脫礦質(zhì)水洗三次后，重復(fù)酶消化。冷凍干燥沉淀(WIS)。WIS含30%木糖，29%阿拉伯糖、23%葡萄糖和7%半乳糖。測定的葡萄糖不來自淀粉(BoeringerMannheim，淀粉測定試劑盒)。實施例6.2家禽休外消化系統(tǒng)120"C烘千前后分別測定WIS的千物質(zhì)含量(95.73%)在家禽體外消化系統(tǒng)中向lg的WIS中加入200yNaN3(Merck)和1ml內(nèi)標(山梨醇35mg/ml，Sigma)。為進行谷物的酶消化(含200)Mg蛋白質(zhì)或不含酉每)，用緩沖液(NaAc，pH5.5)調(diào)節(jié)樣品休積至15ml，39"C溫育1小時，對胃消化，加5ml的胃蛋白睡(5.28g/L，pH3.0，Merck)，39"C溫育1小時。對腸道消化，加入2.5ml的胰酶制劑/膽汁鹽(濃度分別為16g/l，0.lg/l，Merck),39€溫育1.5小時。離心樣品(2800g)15分鐘。取上清測在S每消化過程中被釋放出來的單糖(HPLC，SpectraPhysics;HPX—87P柱，Biorad)。12(TC千燥沉淀，并稱重。計算千物質(zhì)的百分率。作為對照，在體外系統(tǒng)中加入不同劑量粗酶制品(結(jié)果見困3)。與空白對照相比，AXDA酶(加入了200/agAXDA蛋白)對干物質(zhì)42消化率有很大的提高。對玉米WIS部分的千物質(zhì)消化率(15.8%)比對照的提高了4.1%。實施例7:玉米WIS的,體外消化率實驗實施例7.1:玉米WIS的分離按實驗例6的方法分離玉米WIS，由于SDS/硫基L醇不適于溫育動物飼料而做一些改動。用lkg脫脂玉米進行分離。在lkg脫脂的玉米中，每100g玉米蛋白力a4g木瓜蛋白酶(Gist-brocades)，3CrC懸浮2小時。然后，用Maxamyl(Gist—brocades)(2ml/l)在100"C消化，再離心(24000g)15分鐘。棄上清，沉淀再次用酶消化。再離心懸浮液，用脫礦質(zhì)水(1L)洗三次。然后冷凍千燥沉淀(水不溶固體物)。用三氟L酸(TFA)分析法測定玉米WIS中的單/寡糖類含量。在0.3gWIS中，加入lml35mg/ml山梨醇(內(nèi)標)，2ml脫礦質(zhì)水和450fxlTFA，然后，12(TC水解1小時。冷卻后，加入20ml脫礦質(zhì)水，繼續(xù)在120。C水解1小時。冷卻后，將樣品冷凍千燥，重懸于3ml脫礦質(zhì)水中。在HPLC系統(tǒng)中(SpectraPhysics)用HPX—87P柱(Bio-rad)除去單糖。玉未的WIS聚合物部分含有124.8mg/g木糖；96.6mg/g阿拉伯糖；28.2mg/g半軋?zhí)呛?56.0mg/g葡萄糖。由于葡萄糖含量高，分析WIS部分的淀粉(淀粉測定試劑盒，BoehringerMannheim)，發(fā)現(xiàn)WIS部分不含淀粉。實施例7.2，小雞消化率試驗為測定AXDA酶對一種食物(其中加入了20%的玉米WIS)的實標可代謝能量含量的影響，進行了一種試驗。所用方法是改進的"同胞分析"。雄雞(三周齡)分別養(yǎng)在人工調(diào)節(jié)室的籠子里禁食48小時，然后用試管喂進準確定量的飼料。為校正含內(nèi)源性能量成分的損耗，試驗還包括一對照組。喂這些雞10gD—葡萄糖，其他的喂10g飼料。每份銅料分喂給,6只雞。葡萄糖對照.組有5只雞。再禁食48小時，其間定量收集其排泄物。排泄物存放在一2(TC條件下，直到用于分析。此間喂一次水(也用試管喂)。冷凍千燥所收集的消化物，空氣中平衡后稱重。分析伺料和消化物千物質(zhì)樣品中的氮和能量含量。對照組動物的試驗結(jié)果用于校正哏試驗祠料的動物的結(jié)果。所用方法是McNab和Blair(1988)的方法做適當調(diào)節(jié)。此文中給出了分析和計算方法的描述。根據(jù)實施例6.2的方法還測定了干物質(zhì)的休外消化率。試驗處理如下I玉米基礎(chǔ)飼料(見表2)I玉米基礎(chǔ)飼料+10%玉米WIS皿玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WISW玉米基礎(chǔ)飼料+20^玉米WIS+100mg/kgAXDAV玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WlS+45mg/kg粗酶VI玉米基礎(chǔ)飼料+20%玉米WlS+90mg/kg粗酶VE玉米基礎(chǔ)飼料+20^玉米WlS+200mg/kg內(nèi)木聚糖酶?；A(chǔ)祠料的組成見表2。表2:實驗中基礎(chǔ)飼料的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*每千克伺料中的維生物/礦物質(zhì)預(yù)混物中含核黃素4mg，煙酸40mg，d—泛酸12mg，膽堿一氯化物500mg，維生素B1215ng，維生素E，15mg，維生素K35mg，視黃基L酸3.44mg，膽鈣化醇50pg，生物素0.lmg，葉酸0.75mg，F(xiàn)eS047H20300mg，Mn02100mg，CuS045H2〇10。mg，ZnS047H2〇150mg，Na2Se030.15mg，抗氧化劑lOOmg和佛吉尼亞霉素20mg。試驗結(jié)果(氮校正的實標可代射能量TMEn)和休外分析的結(jié)果)見表3。表3:實標可代謝能量(氮量校正，TMEn)和千物質(zhì)體外消化率。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*)殘余才示準誤差0.42LSD(5%):0.76根據(jù)LSD—檢驗，用不同字母標出的TMEn值有顯著性差異，(p<0.05)。隨著玉米一WIS的增加，TMEn水平顯著下降。所有酶制品都提高了TMEn—值，只是內(nèi)木聚糖酶(+7.0%)和AXDA(+10.7%)的提高有顯著性。根據(jù)平均值，AXDA將能量值提高到加10%玉米WIS的基礎(chǔ)銅料的水平。在體外模型中(模仿小雞中消化過程)，AXDA大大提高了千物質(zhì)的消化率(+24.5%)。此模型中的內(nèi)木聚糖酶和粗酶制品不如AXDA有效。實施例8:AXDA用于烤面包用模制面包在P叩loaf烤制試驗中測試AXDA。用150g生面團烤puploaf面包。生面團經(jīng)混合200g面粉(Robijn""/Columbus""80/20)，104ml水，1.4g干烤制酵母(Fermipan"")，4g鹽，3g糖，400mgCaCl22H2〇，3mg(15ppm)抗壞血酸和5mg(25ppm)真菌a一淀粉酶(Fermizyme加P200)和25卩g純化的AXDA制成。在絞式和面機中以52卬m轉(zhuǎn)速混合6分鐘15秒，切分生面團，30"C發(fā)45分鐘，用力按揉，再發(fā)25分鐘，放入模子中。最后在30"C再發(fā)70分鐘后，在225。C烤20分鐘。用油菜子置換法測面包的體積。面包體積因為含有AXDA由490ml(對照)增加到535ml，即增加了9%。參考文獻Amons,R.(1987),FEBSlett.,212:68-72.Carre,B.andBrillouetJ.M.(1986〉，J.SpienceandFoodAg:ric.37:341-351.Chesson,A.(1987),RecentAdvancesinAnimalFoodNutrition.Goosen,—T.et.(IL387)Curr.Genet.11:499-503.Hanahsn,D.(1983)J.Mol.Biol.1S6:557.Harmsen,J.A.M.eta_l.,(1990)Curr.Genet.18:161-16SHaresign,W.andColeD.J.A.,eds.Butterworth,London,71-89.Jerpseth,B.,etal(1992),Strategies5:81-83ManiatisT.,E.F.Fritsch,J.Sambrook(1982):Molecularcloning,alaboratorymanual;ColdSpringHarborLaboratory,NewYork.Matsudaira,P.(1987),J.Biol.Chem.,262:10035-10038.McCleary,B.V,andMatheson,N.K.(1986),Adv.Carb.Chem.andBiochem.44:147-276.47McNab,J.M.andBlairJ.C.(1988),BritishPoultryScience2S:697-707.Murray,N.(1977),Mol.Gen.Genet.150:S3-58SaikiR.K.et.(1988),Science,239,487-491Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1389).In:MolecularClonincr:aLabatorvManual,2ndedn.,ColdSpringHarborLabatoryPress,NY.Sanger,F.,Nickelen,S.andCoulson,A.R.(1S77),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol,74:5463-54S7Silvay,T.J.,Berman,M丄.，andEriquist,Ii.W.(1984)Experimentswithgenefusions,ColdSpringHarborLabatory:NewYork.pp.xi-xiiShort,J.M.e仁aJ.,(1988)NucleicAcidsRes.IS:7583-7S00.Visniac,W.andSanter,M.(1957),Bact.Rev.21:195-213Yanishjerron,C.etal.(1985)Gene33,103-113序列表(l)一般信息(1)申請人:(A)名字Gist—brocadesB.V.(B)街道-Wateringseweg1(C)城市Delft(D)國別:荷蘭(F)郵編(ZIP):2611XT(U)發(fā)明名稱阿拉伯木聚糖降解酶(iii)序列號8(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)搡作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件:PatentlnRelease#1.0，版本ttl.25(EPO)(2)SEQIDNO:1的信息(i)序列特點:(A)長度8個氮基酸(B)類型氛基酸(C)拓樸結(jié)構(gòu):線型(ii)分子類型:肽(iii)假擬無(iv)反義:無(v)片段類型N—末端(vi)最初來源:(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌株DS16813Xaa=cys(xi)序列描迷:SEQIDNO:1LysXaaAlaLeuProSerSerTyr(2)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征:(A)長度17個氛基酸(B)類型氛基酸(C)拓樸結(jié)構(gòu):線型(iO分子類型:肽(iii)假擬:無Gii)反義無(V)片段類型內(nèi)部(vi)最初來源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌抹DS16813(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞氮基酸殘基(B)位置14(D)其他信息Arg或Asn(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞氬基酸殘基(B)位置15(D)其他信息殘基=未確定(ix)特點:(A)名字/關(guān)鍵詞氬基酸殘基(B)位置16(D)其他信息殘基=未確定(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞氨基酸殘基(B)位置17(D)其他信息殘基=未確定(xi)序列描述:SEQIDNO:2lieValGluAlaHeGlySerThrGlyHisArgTyrPheXaaSerPhe(2)SEQIDNO:3的信息(i)序列特點(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬:無(iii)反義無(iv)最初來源(A)生物，f、色曲霉塔賓變種51(B)菌抹DS16813(xi)序列描述:SEQIDNO:3ATGATKGTIGARGCIATKGG(2)SEQIDNO:4的信息(1)序列特點(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬:無(iii)反義-無(iv)最初來源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌珠DS16813(xi)序列描述:SEQIDNO:4AATACGACTCACTATAG(2)SEQIDNO:5的信息(i)序列特點(A)長度2101個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu):線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬:無(iii)反義無(vi)最初來源(A)生物黑色曲霉(B)菌株CBS120.49(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞TATA—信號(B)位置665..670(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置784..1779(D)其他信息/產(chǎn)物="阿拉伯木聚糖降解酉每"/基因-"axdA"標準一名稱="阿拉伯木聚糖降解酶"(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞Sig—肽(B)位置784..861(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵mat—肽(B)位置862..1779(xi)序列描述:SEQIDNO:5C丁GATTGGGATTCTGCAGGAATTCTCTGGGGTATGCCAAAAAAGTATACCGACC丁GTAAA60AGTCCAACCAGTTCGAAA丁TACTAACAATATGTTTT丁GATCAGGATATCTTTGGCATCTATGG丁GAGAGCCATATCATCATCTCT丁CTTCCGGCAGC丁GTCAACTGCCTGCCGAAAGTAC180TGGAAGCCATTG丁GTTT丁AAGGTGAAACAAGA丁CAGGGCGGCTATGTGTCAGGGTAGAAC240CAGTTTGCTTAGCGCCATCAGGGTCCACGTCTAGACTTTCGATGCCCGGAGTTATTCGCC300TTCCCACAGCAGTCATTTCCCCGAATCTAAACCGATGGACGGATATTGTGGTGTAATGAT360AGAACAACACGGTGTAGTGTAGTTTTAAGTGCCGTGCTAGACACGGCAACGTTCCGGTGG420GCGATTGT丁TCTGGCTAATGTAC丁CCGTAGTT了AGGCAACAGGCCGA丁CATCl"TCCCCCA480TAGGAAAGGACCCTGAATAGTGCGTCAAAAAGAGCTTGAGGCAAAGGAGGAC丁GCACTTT540CCAAGGCCGAAGTGGGGGGGGGGGATAACCAAGO^GCCCAACTTTTATCCGAAACC丁TTC600AGGTGTCATCTAATTTGGATAAATCCGGATTGTTCTTCGGCATATGTGGATGTCACCATGSSOAGCCATAAATACAAATATCTGGACAAGCTGTTGCCCTTTGTTCAAGT丁ATTCGTTCTCTG720TGGACCACGATCCCAACCATTGATCTCT"TT丁GTTTG丁TCCTCAGCGGATAAAGTCATACG780AAAATGAAATTCCTCAAAGCCAAGGGTAGCTTGCTGTCGTCTGGCATA828MetLiysPheLeuLysAlaLysGlySerLeuLeuSerSerGly工le_25-20-ISTACCTCATTGCATTGGCCCCCTTTGTCAACGCAAAATGCGCTCTTCCG87STyrLeu工leAlaLeuAlaProPheValAsnAlaLysCysAlaL^uPro-10-515TCGACATATAGTTGGACTTCGACCGATGCTCTTCGCCACCCCAAAGTCC324SerThrTyrSerTitdThrSerThrAspAlaLeuAlaThrProLysSerlb1520GGATGGACTGCACTCAAGGACTTCACCGATGTCGTCTCTAACGGCAAA372GlyTrpThrAlaLeuLvsAs。PheThrAspValValSerAsnGlyLys25—_3035CATATTGTCTATGCGTCCACTACCGACACACAGGGAAATTACGGCTCCH丄s工leValTyrAlaSerThr丁hrAspThrGinGlyAsnTyrGlySer4045501020ATGGGCTTTGGCGCCTTTTCGGACTGGTCGGACATGGCATCCGCTAGTMetGlyPheGlyAlaPheSerAspTrpSerAspMetAlaSerAlaSer5SSOS51068CAAACGGCCACAAGCTTCAGCGCCGTAGCTCCAACCTTGTTCTACTTCGinThrAlaThrSerPheSerAlaValAlaProTtirL*euPheTyrPhe707580851116CAGCCAAAGAGTATCTGGGTTCTGGCCTACCAATCGGGCTCCAGCACTGinProLysSerlieTrpValLeuAlaTyrGinTrpGlySerSerThr303510011"TTCACCTACCGCACCTCT-CAACjATCCCACCAATGTCAACGGCTGGTCAPheThrTyrArgThrSerGinAsdProThrAsnValAsnGlyTrpSer105110IISTCCGAGCAAGCTCTT丁TCACGGGCAAAATCAGCGGCTCAAGTACCGG丁SerGluGinAlaLeuPheThrGlyLys工leSerGlySerSerThrGly120125130GCCATTGATCAGACTGTGATTGGTGATGATACGAATATGTATCTTTTCAla工leAspGinThrVallieGlyAspAspTtirAsnMetTyrLeuPhe13S140145TTTGCCGGCGACAATGGCAAGATCTACCGATCCAGCATGTCTA"TCAATPheAlaGlyAspAsnGlyLys工leTyrArgSerSerMe仁SerlieAsn150155ISO1"GACTTCCCCGGAAGCTTCGGCAGCCAGTACGAGGAGATCCTCAGCGGCAspPheProGlySerPheGlySerGinTyrGluGlulieLeuSerGly170175180GCGACCAACGATTTGTTCGAGGCGGTCCAAGTG丁ACACCGTCGACGGCAlaThrAsnAspLeuPheGluAlaValGinValTyrThrValAspGly185190195GGCGAGGGTGACAGCAAGTACCTCATGATCGTCGlyGluGlyAspSerLysTyrLeuMetlieVal200205ACCGGACATCGTTATTTCCGCTCCTTCACGGCCThrGlyHisArgTyrPheArgSerPheThrAla215220GAGTGGACAGCCCAGGCGGCAAGTGAAGATCAAGluTrpThrMaGinMaAlaSerGluAspGin230235240GCCAACAGTGGCGCCACCTGGACCGACGACATCAlaAsiaSerGlyAlaThrTrpThrAspAsplie250255GTTCGCAACAACCCTGATCAAACCValArgAsnAsnProAspGinThrCAGCTTCTCTACCAGGGCCATGACGinLeuLeuTyrGinGlyHisAsp2S02"CTCTTGCCCTGGAAGCCAGGAGTTLeuLeuProTrpLysProGlyVal295300ATGACGGTCMetThrVal270CCCAACAGCProAsnSerCTTACCTTGlieuThrLeuATCATTTGGTTGCAGACCGGGGTTTTCTTCCCCTTCCTTGACAGCGGGATGGGGAGTGAATACTATCTTGGGCTCAATTGGTCTACATAGGCTACATGCGAATGATTTGGTTTATTCACATAGTATACACCTCTGTATTCACAGGTGATAGCCTGTCTACGAGATGACTGCACGTGATGATCACATCATCATCATCGCAGGACACACACATAGAGGCGATCGGTTCCGluAla工leGlySer210AGCAGTCTCGGCGGASerSerLieuGlyGlyCCCTTCGCGGGCAAAProPheAlaGlyLys245AGTCATGGTGACTTGSerHisGlyAspLeuGATCCTTGCAACCTCAspProCysAsnLeu275AATAGTGACTACAACAsnSerAspTyrAsnAAGCAG丁GAAAGGCT丁LysGin305AGTAGTATTGTTGGTGGAAGAGGTGGAATCC丁GTCAGACTAATAGTATTAACAGATAGTGTAGTAGTAGAGATGTGGCTCTCGCTCACGCGACAGTCTCA12121308135614041452-150015481SS2174017891843190920292083210155<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>AlaGlyPheProThrGluGly215TrpThrAsnSsrAspAsnGlyGly200HisSer170Gly155PheAsp185AspArgAlaGlyLeuPheSerTyrGinAla250LysPheAla23SThrArgAsnAsnPro2S5LeuLeu2S5AspTyrGinGlyProTrpLysProLeu280LyslieTyrArgSerGlySerGinTyrGlu175GluAlaValGinValISOTyrLeuMet工leVal205ArgSerPheThxAla220AlaSerGluAspGin240TrpThrAspAs。工le*25_5GinThrMetThrVal270HisAspProAsnSer285GlyValLeuThrLeu300SerMetSer工leGlu工leLeuTyrThrGluAla210SerSer225Val工leLeuProPheAlaSer180AspGlyGlyGlyAsn1S5GlyGlyLysGin305AspAlaGlySerThrGlyLys245Glu230AlaSerHisGlyAspLeuVal2S0AspProCysAsnLeuGin275AspTyrAsnLeu57(2)SEQIDNO:7的情況(i)序列特征(A)長度2859個堿基對(B)類型核酸(C)鏈:單鏈(D)括樸結(jié)枸:線型(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假擬:無(iii)反義無(vi)最初來源(A)生物黑色曲霉塔賓變種(B)菌種DS16813(bc)特點:(A)名字/關(guān)鍵詞CAAT—信號(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞TATA—信號(B)位置713..720(ix)特點.(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置823..1818(D)其他信息/產(chǎn)物="阿拉伯木聚糖降解酶"/基因-"axdA"/標準名稱="阿拉伯木聚糖降解酶"Gx)特點(A)名字/關(guān)鍵詞Sig—肽(B)位置:823..901(ix)特點(A)名字/關(guān)鍵詞mat—肽(B)位置:901..1818(xi)序列描述:SEQIDNO:7CATACTGGG丁GTGGTACTGTAGGGAACCTGCAGATGCTCTGCCGAAGGTCTGCAAATAGTSOCCCTGGAGTTTGGTAGTAAAGAG丁ACCAACTCGTAAAAGTAGTATGTCCAACCAATTTCA120AAGTACAAACTTTTAGTTTGATTGATTAAAATACTTTTGGTGTG丁ACAG丁GACAGCCAAA180ATATCATCTCTTCAGCCGATAGATGTCAACTGCCCGCCGAAAGTACCGGAAGGTCGTGGT240GTTTTAAGGTGAAACACTATCAGGGCGGCAATGTGTCAAAGTAGAACCAGTTTGCTTAGC300GCCATTAGGGTCCACGCCTAGACCCCTCGATGCCCGGGAGTCATCCGTCCTGTCACAGCA3S0ATTATTTCCCCGAGTCTACTGCCGAAGAAGAGCTATTGTGGCGTAATCATGGAATTACCC420TCTGTGTAGGGTAGTCTTGAACGCCGTTCTAGACACGGCAACGTTCCGGTGGACGATCGT480TTCTGGCTAATGTACTCCGTAGTTTAGGCAGCTAGCTGATCATCTTCCCCCTAGGGAAAG540GACCTGAATA-GTGCGCCAAAATGAGCTTGA.GCAAAGGAATGTTCTTTCTAAGCCAAAGTG600GGGGAAATAACCAAGCAGCCCACTTTTATCCGAAACGTTTCTGGTG丁CATCCAATATGGA"0TAAATCCCGATTGTTCTTCTGCACGTATCAGTATTGCCA丁CAACGTAACTACATATATTT720GAACATGGTCTGGTCCTCCGTTCGATTTATTCGTTCTCCGTGGCCAACGACTTCAGCCAT780TGATCTCTTTTGTTTCTTTCCTGCGGCTAAACCCATTCGAAGATGAAGTTCTTC834MetLysPhePhe-25AAAGCCAAAGGCAGCTTGCTGTCATCAGGCATCTACCTCATTGCATTA882LysAlaLysGlySerLeuLeuSerSerGly工leTyrLeulieAlaLeu-20-15-IOACCCCCTTTGTCAACGCCAAATGTGCTCTTCCGTCGTCCTATAGTTGG930ThrProPheValAsnAlaLysCysAlaLeuProSerSerTyrSerTrp-51510AGTTCAACCGATGCTCTCGCAACTCCAAAGTCAGGATGGACCGCACTG978SerSerThrAspAlaLeuAlaThrProLysSerGlyTrpThrAlaLeu1520253540102STCCACTACTGATGAAGCGGGAAACTATGGCTCGSerThrThrAspGluAlaGlyAsnTyrGlySer4550ATGACC'TTT.GGCGCCMetThrPheGlyAla1074TTCTCAGAGTGGTCGAACATGGCATCCGCTAGCPheSerGluTrpSerAsnMetAlaSerAlaSer6065CAGACAGCCACCCCCGinThrAlaThrPro701122TTCAATGCCGTGGCTCCTACCCTGTTCTACTTCPheAsnAlaValAlaProThrLeuPheTyrPhe758085AAGCCGAAAAGTLysProLysSer*ATClie901170TGGGTTCTGGCCTACCAATGGGGCTCCAGCTrpValLeuAlaTyrGinTroGlySerSer35100ACATTCACCTACCGCACCThrPheThrTyrArgThr10S1218TCCCAAGATCCCACCAATG丁CAATGGCTGGSerGinAspProThrAsnValAsnGlyTrp110115TCGTCGGAGCAGGCGCTTSerSerGluGinAlaLeu12012"TTCACCGGCAAAATCAGCGACTCAAGCACCAATGCCATTGACCAGACGPhe丁hrGlyLvs工leSerAspSerSerThrAsnAla工leAspGinThr125"1301351314GTGATTGGCGATGATACGAATATGTATCTCTTCTTCGCCGGCGACAACVal工leGlyAspAspThrAsnMetTyrLeuPhePheAlaGlyAspAsn140—14515013S2GGCAAGATCTACCGATCCAGCATGTCCATCGlyLys工leTyrArgSerSerMetSerlie155ISOAATGACTTCCCCGGAAGCAsnAspPheProGlySer1S51701410TTCGGCAGCCAGTACGAGGTGATCCTGAGTGGCGCCCGCAACGATCTAPheGlySerGinTyrGluVal工leLeuSerGlyAlaArgAsnAspLeu17518018*51458T丁CGAGGCGGTCCAAGTATACACCGTCGACGGCGG丁GAGGGCGACACGPheGluAlaValGinValTyrThrValAspGlyGlyGluGlyAspThr19019S2001506AAGTATCTC-ATGATCGTTGAGGCGATCGGGTCCACCGGACATCGTTATLysTyrLeuMet:工leValGluAlalieGlySerThrGlyHisArgTyr20S2102151554TTC'CGCTCCT丁CACGGCCAGCAGTCTGGGTGpAGAGTGGACAGCCCAGPheArgSerPheThrAlaSerSerLeuGlyGlyGluTrpThrAlaGin2202252301602GCGGCAAGTGAGGATCAACCCTTCGCAGGCAAAGCCAACAGTGGTGCCAlaAlaSerGluAspGinProPheAlaGlyLysAlaAsnSerGlyAla2352402452501S50ACCTGGACCGAAGACATTAGCCATGGTGACTTGGTTCGCAACAACCCT1638ThrTrpThrGluAsplieSerHisGlyAspLeuValArgAsnAsnPro2552S02S5GATCAAACGATGACTG丁CGATCCTTGCAACCTCCAGTTGC丁CTATCAG1746AspGinThrMetThrValAspProCysAsnLeuGinLeuLeuTyrGin270275280GGCCATGACCCCAACAGCAGTGGCGACTACAACCTCTTGCCGTGGAAG1794GlyHisAspProAsnSerSerGlyAspTyrAsnLeuLeuProTrpLys285290235CCGGGCGTCC了TACCTTGAAGCAGTGAAGGTAT丁A丁AATTAGTTGCAGATTG丁G1848ProGlyValLeuThrLeuLysGin300305TTTTCATTCCTTCTTCAAGAGTGCTTAGTGGTGGAAGACAGCAGAAGGTGGTCACTATCT1308TAGGCTCAGTTGGGGTGGGCTTGTGTCCATAGGCTAGTAATGTGCGCATAATTCAGTTCATTGGCAAGGAGTGCGGTATAAATACCTGTTCTCACAAAAAAAAATAGGCCCGGTGOTCAT'2023ACTCCGTATTGGGATAGAGATCTCGTAGTAGTAGGATTGTGGGCCTCAGAGGATGACCGA2088CACGTGAGCAGTCTCCTTCTACGGCTAGTCGCGTTCTACATAAGAAATAGTCAGCTCAGA2148GTTTGTTTTTTGGCTACTTTGAAGGATGGCCTATCGAATCGCACGTCTCCTCAATTGGCC2208AGGTATTGGCATTCACTCTCCGCGCTTTGCGGGTGCCGGCACGAGATGTCTCCTGGAGAA2268ACTGGGCAACGAGCAGACTACGGATATGGGAGATTGTTGACGACGTTCTTCT丁GGTAAAT2328TTGAACCCTTCAGGGGCTCTATAAAGGCGGAAATCTAAATCTCATGTGCCC丁AACGTGTC2388CGACCACGGTGTTGATCAGCACCTATTAGATCAGACAACAACCTTTGGCTCGGAAATTGA2443ACAGGTAGCTCTTGAATGACACTCTGGATCCTGAT丁CAATTTATAATGCG'TCACTTGAGC2508GTGCAAGGGGTGCTATATTCACATCTTGCCCCAATCCAAGGGGCGTCGGATCCCATTGTG2568CTCGACAGCCTGGAACTTCGCCGACAGTATTCTTACGACGTCGATACTGAAATAGTCCAC2628CTGGTGTCCATTCGTACGCCGGAAAGACCCTCGTCCGACCGCGTCGCCTTGATTCTGACG2688AGATGCTTCAACAAGCGGCCAATTCGATGCCAGCTGTTCATCGGTTAGATGTGCTACACA2743GTCACCTGATTCCAGGAAACATATTCTGGAACGAAGGAAATGGCCGCGTCAATTTTCATT2808GACTTTGAGTG丁GCAATAACCCAAATAACGAAATAATGAACGACCGCTGT2859(2)SEQIDNO:8的情況(i)序列特征(A)長度332個氛基酸(B)類型氮基酸(D)拓撲結(jié)枸線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述:SEQIDNO:8MetLys-25PhePheLysAlaLys-20GlySerLeuLeuSerSerGlylieTyrLeu-IO工leAlaThrProPheValAlaLysCysAlaLeuProSerSerTyrSerTrp10SerSerThrAspAlaLeuAlaThrProLys20SerGlyTrpThrAla25LeuLysAspPheThr30AspValValSerAsp35GlyLysHis工leVal40TyrAlaSerThr丁hrAspGluAlaGlyAsn50TyrGlySerMetGlyAlaPheSerSOGluTrpSerAsnMet65AlaSerAlaSerGin70ThrAlaThrProPhe75AsnAlaValAlaPro80ThrTyrPhe85LysProL>ysSer工leTrpValJLeuAlaTyrGinTrpGlySer100ThrPheThrTyrArg105ThrSerGinAspPro110ThrAsnValAsnSerSerGin120AlaLeuPheThrGly125Lys工leSerAspSer130SerThrAsnAla工le135AspGinThrVal工le140GlyAspAspThrAsn14SMetTyrLeuPhe150AlaGlyAspAsnGly155LyslieTyrArgSerISOSerMetSer工leAsn1S5AspPheProGlySerPheGlySerGinTyrGluVal工leLeuSerGlyAla17017518062ArgAsnAspLeuPheGluAlaValGinValTyrThrValAsp130195GluGlyAspThrLysTyrLeuMetlieValGluAla工leGly206205210GlyHisArgTyrPheArgSerPheThrAlaSerSerLeuGly215220225TrpThrAlaGinA工aAlaSerGluAspGinProPheAlaGly235240Cys275AsnSer.GlyAlaThrTrpThrGluAsplieSerH丄sGly250255ArgAsnAsnProAspGinThrMetThrValAspPro2S5*"270LeuLeuTyrGinGlyHisAspProAsnSerSerGlyAsp280285230LeuProTrpLysProGlyValLeuThrLeuLysGin2S5_300305AspGlyGlySerThrGlyGluLysAla245LeuValLeuGinTyrAsnLeu權(quán)利要求1.基本純的多肽，其具有阿拉伯木聚糖降解活性，所述多肽包含a)SEQIDNO6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其是SEQIDNO6或SEQIDNO8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性；d)SEQIDNO5或SEQIDNO7的等位變體編碼的氨基酸序列；或e)氨基酸序列，其由下述核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列在下述雜交條件下與SEQIDNO5中核苷酸784-1779或SEQIDNO7中核苷酸823-1818所代表的DNA片段或其互補片段雜交，所述雜交條件包括在5xSSC/0.1％SDS中于65℃第一次洗30分鐘，接著在2xSSC/0.1％SDS中于65℃第二次洗30分鐘，接著在0.1xSSC/0.1％SDS中于65℃第三次洗30分鐘，接著在0.1xSSC中于65℃第四次洗30分鐘。2.根據(jù)權(quán)利要求l的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；c)氨基酸序列，其是SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性；或d)SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的等位變體編碼的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；或c)氨基酸序列，其是SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列的部分，并且所述部分保持阿拉伯木聚糖降解活性。4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其包含a)SEQIDNO:6中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列；或b)SEQIDNO:8中氨基酸1-306所代表的氨基酸序列。5.包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的食品。6.包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的飼料組合物。7.包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的飲飼料組合物。8.包含根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的紙漿加工組合物。9.被固定的根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。全文摘要本發(fā)明提供了在選擇的微生物宿主細胞中克隆和過量表達真菌來源的阿拉伯木聚糖降解酶的方法和表達構(gòu)建物。該酶對從玉米中獲得的水不溶固體物表現(xiàn)出降解活性。該酶可以用于動物飼料組分、人類食物制備和工業(yè)加工中。文檔編號C12N1/00GK101525605SQ200810134919公開日2009年9月9日申請日期1995年8月28日優(yōu)先權(quán)日1994年8月26日發(fā)明者A·J·J·萬奧詹,J·威瑟爾,L·H·德格拉夫,M·J·A·萬德伍,M·M·C·吉爾肯斯申請人:吉斯特-布羅卡迪斯股份有限公司