專利名稱：新鮮秸稈壁蛋白促進(jìn)秸稈纖維素酶解、發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素的酶解、發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用新鮮玉米秸稈 中的細(xì)胞壁蛋白對秸稈酶解、發(fā)酵的促進(jìn)作用，構(gòu)件的新型秸稈酶解、發(fā)酵的新 工藝。新鮮秸稈不僅作為酶解、發(fā)酵的底物，還作為纖維素酶及其協(xié)同蛋白的來 源，促進(jìn)纖維素的轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
秸稈類木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，有效利用秸稈也是緩解 人類所面臨的糧食短缺、能源危機(jī)和環(huán)境污染等問題的有效方法之一。木質(zhì)纖維 素原料轉(zhuǎn)化燃料乙醇是發(fā)展可再生能源的重要途徑之一，在世界范圍內(nèi)日益得到 重視。秸稈酶解成可發(fā)酵糖是轉(zhuǎn)化的中心環(huán)節(jié)，但目前的酶解工藝仍然存在酶 解效率低、可發(fā)酵糖濃度低、纖維素酶成本高等問題。目前國內(nèi)外在纖維素乙醇 方面也進(jìn)行了深入的研究，并取得了階段性的進(jìn)展，但迄今仍然難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、 經(jīng)濟(jì)、清潔的工業(yè)化生產(chǎn)。同歩糖化發(fā)酵乙醇具有設(shè)備簡單、節(jié)約時(shí)間、提高效 率、減少雜菌污染等優(yōu)點(diǎn)，因此是目前纖維素轉(zhuǎn)化乙醇最有效的途徑之一。然而 在酶解、發(fā)酵溫度不一致，酶成本等方面仍然存在很多問題。
木質(zhì)纖維素具有極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，天然纖維素聚集態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且結(jié)晶度高， 分子內(nèi)和分子間存在氫鍵；纖維素同時(shí)與半纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)相互纏 繞，形成致密的三維結(jié)構(gòu)。這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)降低了纖維素的可及性和反應(yīng)活性， 增加了水解的難度。
除了纖維素以外，植物細(xì)胞壁中存在比較豐富的內(nèi)源性的纖維素酶及其增效 因子，在植物生長的各個(gè)階段，酶蛋白參與了細(xì)胞壁的松弛、合成、分解等過程。 與其它來源的纖維素酶相比，植物內(nèi)源性細(xì)胞壁酶蛋白對細(xì)胞壁的作用具有高效、基因調(diào)控復(fù)雜等特點(diǎn)。在玉米秸稈尤其在新鮮秸稈中也存在比較豐富的細(xì)胞 壁蛋白，其中包括內(nèi)源性纖維素酶及其增效因子。
植物內(nèi)源性的纖維素酶及其增效因子具有來源豐富、高效等優(yōu)點(diǎn)，將其作為 纖維素降解的添加劑應(yīng)用于秸稈的轉(zhuǎn)化，也為幅度降低纖維素酶的成本、提高酶 解效率提供了契機(jī)。本發(fā)明從對纖維素降解具有促進(jìn)作用的秸稈細(xì)胞壁蛋白入 手，從經(jīng)濟(jì)、高效利用植物內(nèi)源性纖維素酶及其增效因子的角度出發(fā)，探索秸稈 的酶解和發(fā)酵新工藝。在工藝路線中，新鮮玉米秸稈不僅作用酶解的底物，還作 為酶源促進(jìn)纖維素的轉(zhuǎn)化。植物秸稈資源豐富，將秸稈細(xì)胞壁蛋白應(yīng)用于木質(zhì)纖 維素的降解，不僅提高了纖維素的酶解效率，也為降低纖維素酶的成本開辟了嶄 新的方向，而且實(shí)現(xiàn)了資源的高值化利用，達(dá)到了利用植物自身資源高效降解的 目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新鮮秸稈壁蛋白促進(jìn)秸稈纖維素酶解、發(fā)酵的方法，將新鮮秸稈 中豐富的細(xì)胞壁蛋白其作為纖維素酶添加劑應(yīng)用于秸稈酶解、發(fā)酵，從而降低纖 維素酶的成本、提高酶解效率，達(dá)到利用秸稈自身資源促進(jìn)纖維素降解的目的。
本發(fā)明的構(gòu)思如下在新鮮玉米秸稈(FCS)中，仍然有豐富的細(xì)胞壁蛋白， 它們參與了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化的調(diào)節(jié)，在纖維素酶解中能夠促進(jìn)纖維素的轉(zhuǎn)化。將 新鮮玉米秸稈中的細(xì)胞壁蛋白通過簡單方法進(jìn)行提取，然后將混合物與汽爆玉米
秸稈(SECS)混合，調(diào)節(jié)底物濃度和pH，然后分別進(jìn)行酶解和發(fā)酵。新鮮玉米 秸稈不僅作為酶解的底物，內(nèi)源性的細(xì)胞壁蛋白還能夠促進(jìn)纖維素的酶解。將新 鮮秸稈和汽爆秸稈進(jìn)行混合發(fā)酵，不僅提高了酶解效率，降低了纖維素酶的成本， 還省去了底物的預(yù)處理過程，減少了酶解、發(fā)酵的步驟。
新鮮秸稈壁蛋白促進(jìn)秸稈纖維素酶解、發(fā)酵的方法，其特征在于包括以下歩
驟
1. 玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白的提取:將粉碎至40-100目的新鮮玉米秸稈置于 細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4-1/10加入蛋白提取液，4°C靜 置12-24 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。
42. 新鮮秸稈和汽爆秸稈的混合利用醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0，按照新鮮和蒸 汽爆破玉米秸稈按照干重比1/3-3/1混合，加入醋酸緩沖液(50 mM, pH 5.0)調(diào)整底物濃度至20-100 mg/ml。
3. 酶解在調(diào)整新鮮和汽爆玉米秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上， 按照10-30FPU/ (g底物)加入纖維素酶進(jìn)行酶解，溫度45-5(TC， 時(shí)間48-72 h。
4. 同步糖化發(fā)酵乙醇在調(diào)整新鮮和汽爆玉米秸稈比例、底物濃度和pH 的基礎(chǔ)上，按照10-40 FPU/(g底物)加入纖維素酶，加入活化酵母， 溫度30-37。C，時(shí)間72-96 h。
為了分析通過工藝優(yōu)化后的效果，分別以新鮮、蒸汽爆破玉米秸稈，以及兩 者混合的直接發(fā)酵為對照，對乙醇產(chǎn)量進(jìn)行了分析。分別以新鮮和蒸汽爆破玉米 秸稈為底物時(shí)，乙醇的產(chǎn)量分別為1.50和1.34 mg/ml。蒸汽爆破和新鮮玉米秸 稈按照干重比V1 (FCS&SECS)直接混合發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生了 1.56mg/ml的乙醇, 分別比蒸汽爆破和新鮮玉米秸稈單獨(dú)發(fā)酵提高了 16.4%和4%。而新鮮玉米秸稈 先進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取，然后與汽爆玉米秸稈按照1/1混合發(fā)酵時(shí)(FCS & SECS(N))，乙醇的產(chǎn)量為2.85 mg/ml，比兩者的直接混合發(fā)酵提高了 82.7% (表 1)。
表1不同發(fā)酵體系中的乙醇產(chǎn)量
FCSSECSFCS & SECSFCS & SECS (N)
Ethanol production1.501.341.562.85
(mg/ml)
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1) 秸稈細(xì)胞壁蛋白與纖維素酶具有協(xié)同作用，可以大幅度提高纖維 素的轉(zhuǎn)化率，節(jié)約纖維素酶的用量，達(dá)到利用自身資源促進(jìn)轉(zhuǎn)化 的目的。
2) 在酶解、發(fā)酵等轉(zhuǎn)化過程中，新鮮秸稈不僅作為底物，而且作為 纖維素酶的添加劑，秸稈不經(jīng)過預(yù)處理過程，節(jié)約了預(yù)處理成本。
3) 新鮮秸稈來源豐富，這既保證了充足的原料供應(yīng)，又實(shí)現(xiàn)了秸稈資源的高效利用。
4)新鮮秸稈內(nèi)源性纖維素酶的最佳溫度與酵母菌一致， 一定程度上 解決了酶解和發(fā)酵溫度不一致的問題。


圖1為不同玉米秸稈發(fā)酵體系中乙醇產(chǎn)量
分別以新鮮和蒸汽爆破玉米秸稈為底物時(shí)，酶解72h，葡萄糖的產(chǎn)量為4.87 和5.15 mg/ml;兩者按照干重比1/1直接混合酶解時(shí)(FCS & SECS)，葡萄糖生 成了5.21mg/ml;而新鮮玉米秸稈先進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取，然后與汽爆玉米秸 稈按照1/1混合時(shí)(FCS&SECS(N))，葡萄糖生成了 8.3 mg/ml;分別以新鮮 玉米秸稈和蒸汽爆破玉米秸稈為底物酶解時(shí)，纖維二糖分別產(chǎn)生了 0. 76和3.61 mg/ml;當(dāng)兩者按照1/1混合直接酶解時(shí)，產(chǎn)生了2.1mg/ml;通過酶解工藝轉(zhuǎn)化 后，產(chǎn)生了 0.45mg/ml纖維二糖(圖l)。說明在提取新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白， 然后混合酶解時(shí)，卩-葡萄糖苷酶的作用得到了有效的發(fā)揮。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例l利用新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白提高玉米秸稈的酶解、發(fā)酵效率
將粉碎至60目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/5 加入蛋白提取液，4°C靜置12 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。利用醋酸調(diào)節(jié)混合物 pH至4.8。按照新鮮和蒸汽爆破玉米秸稈按照干重比1/1混合，加入醋酸緩沖液 (50mM,pH4.8)調(diào)整底物濃度至50 mg/ml;在調(diào)整新鮮和汽爆玉米秸稈比例、 底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照20 FPU/ (g底物)加入纖維素酶進(jìn)行酶解，溫 度45。C，時(shí)間48h。在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按 照30 FPU/ (g底物)加入纖維素酶，溫度37。C，時(shí)間72h。
實(shí)例2利用新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白提高汽爆小麥秸稈的酶解、發(fā)酵效率
將粉碎至40目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/6 加入蛋白提取液，4'C靜置15 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。利用醋酸調(diào)節(jié)混合物 pH至4. 8。然后將新鮮玉米秸稈和汽爆小麥秸稈按照千重比1/2混合，加入醋酸緩沖液(60mM, pH4.8)調(diào)整底物濃度至80 mg/ml;在調(diào)整新鮮玉米秸稈和汽 爆小麥秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照15 FPU/ (g底物)加入纖維 素酶進(jìn)行酶解，溫度5(TC，時(shí)間48 h。在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度 和pH的基礎(chǔ)上，按照30 FPU/ (g底物)加入纖維素酶，溫度37r，時(shí)間72h。
實(shí)例3利用新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白提高汽爆稻草的酶解、發(fā)酵效率
將粉碎至80目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/7 加入蛋白提取液，4°C靜置20 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。利用醋酸調(diào)節(jié)混合物 pH至4. 5。然后將新鮮玉米秸稈和汽爆稻草按照干重比1/3混合，加入醋酸緩沖 液(50mM,pH4.5)調(diào)整底物濃度至60 mg/ml;在調(diào)整新鮮玉米秸稈和比例、 底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照12 FPU/ (g底物)加入纖維素酶進(jìn)行酶解，溫 度45。C，時(shí)間48h。在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按 照25 FPU/ (g底物)加入纖維素酶，溫度35"C，時(shí)間72 h。
實(shí)例4利用新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白提高高梁秸稈的酶解、發(fā)酵效率
將粉碎至100目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4 加入蛋白提取液，4'C靜置20 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。利用醋酸調(diào)節(jié)混合物 pH至5.0。按照新鮮和蒸汽爆破玉米秸稈按照干重比1/3混合，加入醋酸緩沖液 (50mM,pH4.5)調(diào)整底物濃度至80 mg/ml;在調(diào)整新鮮玉米秸稈和高粱秸稈 比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照20 FPU/ (g底物)加入纖維素酶進(jìn)行酶 解，溫度5(TC，時(shí)間48h。在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ) 上，按照30 FPU/ (g底物)加入纖維素酶，溫度37'C，時(shí)間72 h。
實(shí)例5利用新鮮玉米秸稈細(xì)胞壁蛋白提高黃竹草的酶解、發(fā)酵效率
將粉碎至100目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4 加入蛋白提取液，4°C靜置20 h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取。利用醋酸調(diào)節(jié)混合物 pH至5. 0。然后將新鮮玉米秸稈和蒸汽爆破黃竹草按照干重比1/3混合，加入醋 酸緩沖液(50mM,pH4.5)調(diào)整底物濃度至80 mg/ml;在調(diào)整新鮮玉米秸稈和 黃竹草比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照20 FPU/ (g底物)加入纖維素酶 進(jìn)行酶解，溫度5CTC，時(shí)間48h。在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH 的基礎(chǔ)上，按照30 FPU/ (g底物)加入纖維素酶，溫度37'C，時(shí)間72 h。
權(quán)利要求
1.新鮮秸稈壁蛋白促進(jìn)秸稈纖維素酶解、發(fā)酵的方法，其特征在于包括以下步驟1)秸稈細(xì)胞壁蛋白的提取將粉碎至40-100目的新鮮玉米秸稈置于細(xì)胞壁蛋白提取液中，按照固液比1/4-1/10加入蛋白提取液，4℃靜置12-24h進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白的提取；2)新鮮秸稈和汽爆秸稈的混合利用醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，按照新鮮和蒸汽爆破玉米秸稈按照干重比1/3-3/1混合，加入醋酸緩沖液(20-100mM，pH 4.0-5.0)調(diào)整底物濃度至20-100mg/ml；3)酶解在調(diào)整新鮮秸稈和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照10-30FPU/(g底物)加入纖維素酶進(jìn)行酶解，溫度45-50℃，時(shí)間48-72h；4)同步糖化發(fā)酵乙醇在調(diào)整新鮮和汽爆秸稈比例、底物濃度和pH的基礎(chǔ)上，按照10-40FPU/(g底物)加入纖維素酶，溫度30-37℃，時(shí)間72-96h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于秸稈細(xì)胞壁蛋白的來源包括 玉米秸、稻草、豆秸、高梁秸和麥秸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于的提取緩沖液為15-30 mM 磷酸緩沖液，0.5-1.5 M NaCl， 0.5-2 mM苯甲基磺酰氟，pH 4.5-7.0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于秸稈包括玉米秸稈、稻草、 麥秸、高梁秸、豆秸、龍須草以及茅草。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用新鮮秸稈細(xì)胞壁蛋白促進(jìn)秸稈類木質(zhì)纖維素酶解、轉(zhuǎn)化的方法。針對新鮮秸稈細(xì)胞壁蛋白的特點(diǎn)，開發(fā)了新型秸稈酶解、發(fā)酵工藝，將其中豐富、廉價(jià)的內(nèi)源性纖維素酶及其協(xié)同因子應(yīng)用于秸稈轉(zhuǎn)化。在基于新鮮秸稈細(xì)胞壁蛋白應(yīng)用的秸稈轉(zhuǎn)化新工藝中，首先通過新鮮秸稈細(xì)胞壁蛋白的高效、經(jīng)濟(jì)提取，然后與蒸汽爆破預(yù)處理的秸稈進(jìn)行混合酶解、發(fā)酵。工藝的實(shí)施不僅提高了纖維素轉(zhuǎn)化效率、降低了纖維素酶成本、也節(jié)省了新鮮秸稈的預(yù)處理環(huán)節(jié)成本。新鮮玉米秸稈不僅作為酶解和發(fā)酵的底物，也作為纖維素酶及協(xié)同因子的來源，達(dá)到了利用秸稈自身資源促進(jìn)纖維素轉(zhuǎn)化的目的。
文檔編號C12P7/10GK101633939SQ200810134420
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者王玉美, 邱衛(wèi)華, 陳洪章, 韓業(yè)君 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所