專利名稱：高致病性藍(lán)耳病的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測(cè)技術(shù)，確切講是一種檢測(cè)豬是否患有高致病性藍(lán)耳病 的方法。
背景技術(shù)：
高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高
致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30 %以上，育肥豬也可發(fā)病死亡。其病理特征為脾臟邊緣或表面出現(xiàn)梗死灶，顯 微鏡下見出血性梗死；腎臟呈土黃色，表面可見針尖至小米粒大出血點(diǎn)斑，皮 下、扁桃體、心臟、膀胱、肝臟和腸道均可見出血點(diǎn)和出血斑。顯微鏡下見腎 間質(zhì)性炎，心臟、肝臟和膀胱出血性、滲出性炎等病變；部分病例可見胃腸道 出血、潰瘍、壞死。豬是PRRSV的唯一自然宿主，各種品種、年齡和各種飼養(yǎng) 條件下的豬只均可感染。急性爆發(fā)期可持續(xù)2-4個(gè)月，急性期過后轉(zhuǎn)為慢性或亞 臨床感染。自臨床上首次發(fā)現(xiàn)后，高效傳染就是PRRS的一個(gè)標(biāo)志。由于缺乏有 效控制或疫苗，不能阻止病毒的排出，對(duì)攜帶動(dòng)物亦不能消除其感染，預(yù)防控 制PRRSV的方法必須建立在對(duì)傳染方式的透徹把握。豬可以通過口腔、鼻內(nèi)、 肌肉、腹膜和陰道感染PRRSV。病毒具有高度感染性，通過肌肉或鼻內(nèi)接種IO 個(gè)或更少的病毒粒子即可感染發(fā)病，通過腹腔或尾軟骨注射其最小感染劑量為 近l個(gè)病毒粒子。相反，通過粘膜表面接種如眼、陰道或口腔途徑，最小感染量 為10" -1053個(gè)病粒子，其劑量有賴于特定的解剖部位。
感染PRRSV的豬在臨床癥狀消失8周后仍排毒，且PRRSV可在豬上呼吸道和 扁桃體存活約5個(gè)月以上的時(shí)間，因此帶毒豬是病毒的主要來源。仔豬可成為自 然帶毒者。病毒在豬群中生存、循環(huán)及再次傳播。造成感染及未感染豬之間的 直接或間接接觸傳播。尤其是引進(jìn)帶病毒血癥的后備種豬與原豬群的平行和垂 直傳播為其主要傳播途徑，不同的豬群還可通過感染公豬精液傳播。含有PRRS 病毒的糞、尿等排泄物也是潛在的污染源。空氣傳播是PRRS的又一重要傳播途 徑，特別是在短距離內(nèi)(〈km)傳播更具有重要的作用。以發(fā)病點(diǎn)為原點(diǎn)，半徑 500米以內(nèi)的區(qū)域，有45%的豬場(chǎng)可感染，而距暴發(fā)點(diǎn)l-2km的區(qū)域僅2y。的豬場(chǎng)感染。此外，病毒在低溫潮濕條件下容易存活，因此氣溫低，濕度高，風(fēng)速大 和紫外線照射強(qiáng)度下降等皆可加快該病的傳播。
PRRS臨床表現(xiàn)的顯著特征是產(chǎn)前一周發(fā)生流產(chǎn)或分娩提前，生產(chǎn)成績顯著 下降。在同一豬場(chǎng)內(nèi)爆發(fā)本病停息后，還易再度暴發(fā)，其發(fā)病率顯著增高。潛 伏期因飼養(yǎng)環(huán)境不同有很大差異，該病的潛伏期在仔豬為2-4天，孕豬為4-7天。 不同毒株致病性的差異或許會(huì)造成不同的潛伏期。 一般流行期為70-100天，最長 可達(dá)4-6個(gè)月。青年豬感染后癥狀較為溫和，母豬和仔豬癥狀較嚴(yán)重，母豬的死 亡率較低，乳豬的死亡率很高。本病在仔豬之間的傳播比成年豬之間的傳播更 為容易。流行后隱性感染病例增多，無臨床癥狀的豬也能傳播本病，并持續(xù)數(shù) 月。
高致病性藍(lán)耳病在我國的廣泛傳播給養(yǎng)豬業(yè)帶來的嚴(yán)重危害，世界各國對(duì) 本病給予了高度重視，并投入了大量的人力物力對(duì)其進(jìn)行研究。鑒于高致病性 藍(lán)耳病的生物學(xué)特性和流行病學(xué)特征，.要在一個(gè)高致病性藍(lán)耳病流行的國家和 地區(qū)消滅該病幾乎無法完成，從長遠(yuǎn)觀點(diǎn)看，這也將是一項(xiàng)非常艱巨的任務(wù)。
現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)豬高致病性藍(lán)耳病多采用ELISA法或RT-PCR法，但這些 方法檢測(cè)需時(shí)較長，檢測(cè)要求的儀器條件較高，而且檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，具有快速、簡便、靈敏和經(jīng)濟(jì)的用 于檢測(cè)豬高致病性藍(lán)耳病的方法，這種方法不僅既適用于檢測(cè)死豬，也適用于 活豬檢測(cè)。
本發(fā)明的檢測(cè)方法是采集被檢死豬的腦或腸內(nèi)容物或肺或腎或腸或脾或肝 或心組織，或者采集被檢活豬的血液或口拭子或糞便，從所采樣品中提取RNA， 以提取的RNA為模板，以外側(cè)上、下游引物和內(nèi)側(cè)上、下游引物進(jìn)行RT-LAMP 反應(yīng)，RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所用的外側(cè)上、下游引物和內(nèi)側(cè)上、下游引物分別
為______
引物名稱 引物序列
F 5'- GCTCCGCGCAGGAAGGTCA -3B 5'- GTGCGTCAGCGTTGTTGTC -3
5'- GGATGGTGTCGGAAAATTG TTTTT CCTAACGGTTCGG'AAGAAA -3'
FIP
5'- CGTCGCGACGTGTCCCCAA TTTTT CCACTCAAAGGTGTCATCA -3'
B1P
本發(fā)明是利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即RT-LAMP技術(shù)。這一技術(shù)是從豬病 料中提取核酸，利用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物是否含有特異性 的梯狀條帶，以確定豬是否感染高致病性藍(lán)耳病的快速檢測(cè)技術(shù)。
本發(fā)明的方法用于高致病性藍(lán)耳病的檢測(cè)具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 對(duì)靶基因的6個(gè)部位設(shè)定4種引物，利用鏈置換反應(yīng)在恒溫下使靶基因 高效擴(kuò)增，由于其反應(yīng)是由多個(gè)引物共同啟動(dòng)的，所以比RT-PCR更特異。
2. RT-LAMP技術(shù)比現(xiàn)多采用的RT-PCR具有更高的靈敏度，但所需設(shè)備卻 十分簡單，僅需一臺(tái)能提供6(TC左右的水浴鍋即可，其試驗(yàn)成本可極大降低。
3. RT-LAMP技術(shù)一般一個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成，比RT-PCR節(jié)省時(shí)間。 一般情 況下RT-PCR檢測(cè)需時(shí)要超過2個(gè)小時(shí)。
本發(fā)明方法的具體步驟如下
(1) 檢測(cè)試樣提取及核酸提取
無菌取病豬血液、口拭子或糞便，或者死豬的器官組織，最好是豬的腦、 脾和肺等器官組織，用滅菌生理鹽水研磨成乳懸液，并每毫升加入青、鏈霉素各 2 000IU,分裝入小瓶貼好標(biāo)簽-80。C保存?zhèn)溆?；分別按照試劑盒說明采用Trizol 方法或MiniBEST病毒RNA提取試劑盒，從血液、口拭子以及組織中提取包 括病毒基因在內(nèi)的全基因組RNA;同時(shí)，無菌提取健康咽喉拭子中的RNA，以
用作陰性對(duì)照。
(2) 進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)
RT-LAMP反應(yīng)體系如下終濃度分別為2.0 的FIP禾B BIP引物，0.2 piM的F和B引物，1.0 mM dNTP， 8U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)， lOxbuffer (containing 2 mM of MgS04, 0.8 M betaine ) and 1 pi提取的模 板cDNA，反應(yīng)終體積為50W，反應(yīng)在0.2ml PCR管中進(jìn)行。
RT-LAMP反應(yīng)程序?yàn)楹銣厮″?3。C條件下反應(yīng)45 min，然后在80°C 加熱lOmin終止反應(yīng)。RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)和結(jié)果判定反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳， 10V/cm， 30分鐘后溴化乙啶染色后260nm波長觀察。


圖1為高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性比較的電 泳圖。圖中(A)從左至右依次為M， DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000; 1泳道，陰 性對(duì)照;2-6泳道，不同拷貝數(shù)的模板進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)，分別為每管1、 10、 102、 103、 104和105拷貝。(B) 1-6泳道，RT-LAMP反應(yīng)中每管中含有不同拷 貝數(shù)的模板，分別為每管l、 10、 102、 103、 104和105拷貝；7泳道，陰性對(duì)照。 由圖可見，RT-PCR對(duì)高致病性藍(lán)耳病的檢出限為100拷貝，而RT-LAMP的檢 出方法為10拷貝。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例分成兩部分完成，即實(shí)施例一高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方 法的建立；實(shí)施例二高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法的特異性和敏感性試驗(yàn)， 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例<一> 高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法的建立
1、 高致病性藍(lán)耳病的核酸提取
無菌采集感染高致病性藍(lán)耳病的豬外周血液，對(duì)豬組織樣品加入少量pH 7.4， 0.05M的磷酸鹽緩沖液(PBS)然后用組織粉碎機(jī)勻漿處理。處理后的樣品按照 寶生物工程(大連)有限公司提供的病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。被檢豬 取血后也可以在血中加入適量抗凝劑，
2、 高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP反應(yīng)
參照GenBank登錄的高致病性藍(lán)耳病病毒的A^/^基因的序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引 物。本發(fā)明采用引物的序列如下 外側(cè)引物
上游F: 5'畫GCTCCGCGCAGGAAGGTCA畫3 下游B: 5'-GTGCGTCAGCGTTGTTGTC-3
內(nèi)側(cè)引物
FIP: 5'-GGATGGTGTCGGAAAATTG TTTTTCCTAACGGTTCGGAAGAAA隱3'BIP: 5'-CGTCGCGACGTGTCCCCAA TTTTTCCACTCAAAGGTGTCATCA-3'
以提取的高致病性藍(lán)耳病的RNA為模板，在50pL反應(yīng)體系中加入高致病性 藍(lán)耳病的RNAlpL， 10(amol/L外側(cè)上、下游引物各lpl， lnmol/L內(nèi)側(cè)上、下游引 物各l(il， 2.5mmol/LdNTPs2pL， BstDNA聚合酶8U， 10x緩沖液5jxL，力口ddH20 至50pL。 RT-LAMP反應(yīng)程序如下63。C45min，然后8(TC10min。
結(jié)果檢測(cè)RT-LAMP結(jié)束后取樣進(jìn)行2.5。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件 為7V/cm，30分鐘，結(jié)果出現(xiàn)RT-LAMP反應(yīng)特異的梯狀條帶，見圖l。
實(shí)施例<二> 高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法的特異性和敏感性試驗(yàn)
1、 高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP的敏感性試驗(yàn)
1.1高致病性藍(lán)耳病病毒的定量及不同稀釋度模板的確定。 按照高致病性藍(lán)耳病基因組的大小和提取的病毒RNA的濃度測(cè)算，按照 RT-LAMP和RT-PCR每管1， 10, 102， 103， 104， 105拷貝數(shù)進(jìn)行稀釋。
1.2高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP方法檢出限與RT-PCR方法的對(duì)比 高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP反應(yīng)組成及反應(yīng)程序按照實(shí)施例O進(jìn)行，高 致病性藍(lán)耳病的RT-PCR反應(yīng)組成如下50 pl反應(yīng)體系中包括1.5 mM的dNTP, 5 pl的10x buffer, 5U的Taq polymerase (Nippon Gene)， 1 pM上下游引物F禾口 B， 1.0 pi模板cDNA.擴(kuò)增程序?yàn)?4。C， 5 min，然后是循環(huán)程序94°(3變性1 min, 55 QC退火30s,72Gc延伸lmin,30個(gè)循環(huán)。最后72°(:延伸5 min。 RT-PCR反應(yīng) 在MJ Research Minicycler擴(kuò)增儀中進(jìn)4亍。 1.3結(jié)果檢測(cè)
RT-PCR產(chǎn)物和RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在同一塊上瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。然 后進(jìn)行溴化乙啶染色，BIO-RAD凝膠成像儀中照相并分析，電泳結(jié)果見圖l，從 圖中可以看出高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法的檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)10個(gè)拷貝，而 RT-PCR反應(yīng)的檢出限為每個(gè)反應(yīng)100拷貝，RT-LAMP反應(yīng)比RT-PCR反應(yīng)的敏感 性高10倍。
2、 高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP的特異性試驗(yàn)
2.1FMDV、 PCV2、 PRX、 JEV和CSFV病毒核酸的提取和RT-LAMP反應(yīng) 分別用經(jīng)過RT-PCR鑒定過的田間分離株FMDV、 PCV2、 PRX、 JEV和CSF 中提取的RNA后，RNA作為的高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP反應(yīng)的模板，以健康豬組織中提取的RNA作為陰性對(duì)照模板。然后按照實(shí)施例<一>中高致病性藍(lán)耳病 的RT-LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 2.2特異性反應(yīng)結(jié)果分析
FMDV、 PCV2、 PRX、 JEV和CSF均與高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法無交 叉性反應(yīng)。健康豬組織中提取的RNA作模板的RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果也為陰性。上 述結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP檢測(cè)方法與上述四種在臨 床癥狀表現(xiàn)相似的病毒無交叉反應(yīng)。
3、高致病性藍(lán)耳病的RT-LAMP的臨床樣品檢測(cè)
3.1臨床樣品的準(zhǔn)備
分別被RT-PCR和測(cè)序或病毒分離診斷為高致病性藍(lán)耳病病毒陽性臨床樣 品由外周血、口拭子和肺所組成。 3.2 RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果 對(duì)上述高致病性藍(lán)耳病病毒陽性臨床樣品用所建立的RT-LAMP方法進(jìn)行 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2，從表中可以看出，RT-LAMP方法對(duì)臨床樣品的檢出率總 體上比RT-PCR的檢出率高。其中對(duì)咽喉拭子和全血樣品適合生前診斷。 表2.RT-LAMP和RT-PCR方法對(duì)高致病性藍(lán)耳病臨床樣品的分析
組織樣品毒株名稱(陽性數(shù))RT-IAMP陽性數(shù) RT國PCR
全血JXA1 (12)1212
GD (13)1313
HPBEDV (12)1212
腎JXA1 (13)1313
GD (12)1212
HPBEDV(19)1919
肺HPBEDV (41)4141
4、結(jié)論
上述試驗(yàn)證明所建立的高致病性藍(lán)耳病RT-LAMP方法具有敏感性高、特異 性強(qiáng)、快速、所需設(shè)備簡單、操作容易等特點(diǎn)，適合于實(shí)驗(yàn)室和田間對(duì)高致病 性藍(lán)耳病病毒的快速診斷。
權(quán)利要求
1、高致病性藍(lán)耳病的檢測(cè)方法，其特征是采集被檢死豬的腦或腸內(nèi)容物或肺或腎或腸或脾或肝或心組織，或者采集被檢活豬的血液或口拭子或糞便，從所采樣品中提取RNA，以提取的RNA為模板，以外側(cè)上、下游引物和內(nèi)側(cè)上、下游引物進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
2、 權(quán)利要求l所述的高致病性藍(lán)耳病的檢測(cè)方法，其特征是所用的外側(cè)上、下游引物和內(nèi)側(cè)上、下游引物分別為:_引物名稱 引物序列F 5'- GCTCCGCGCAGGAAGGTCA -3B 5'-GTGCGTCAGCGTTGTTGTC-35'- GGATGGTGTCGGAAAATTG TTTTT CCTAACGGTTCGGAAGAAA -3'FIP5'- CGTCGCGACGTGTCCCCAA TTTTT CCACTCAAAGGTGTCATCA -3'BIP
全文摘要
本發(fā)明公開了一種關(guān)于高致病性藍(lán)耳病的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，通過使用特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)平臺(tái)擴(kuò)增靶序列的特定區(qū)域，在一系列質(zhì)控和陰性、陽性對(duì)照的輔助下，從分子水平對(duì)包括高致病性藍(lán)耳病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明的方法具有簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和特異的特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101319253SQ20081013389
公開日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日
發(fā)明者劉永生, 孫德惠, 杰 張, 陳豪泰, 馬麗娜 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所