專利名稱：篩選用于預(yù)防感染或致病性的化合物的方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1997年5月8日的待批美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08/852,927的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而后者又是申請(qǐng)日為1995年5月28日的待批美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)08/411,560的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及鑒定用于抑制真核宿主生物中感染或疾病的化合物的篩選方法，或者該化合物能誘導(dǎo)或刺激宿主致病防御機(jī)制。本發(fā)明還涉及將所述化合物用作抗病原體。另外，本發(fā)明涉及鑒定致病性毒力因子的方法。
諸如細(xì)菌、原蟲、真菌、線蟲、和病毒的微生物病原體包括眾多各種各樣類型的能夠感染動(dòng)物和植物的生物。當(dāng)感染生物是致病性的，而且宿主對(duì)致病性入侵易感時(shí)，會(huì)開始發(fā)生感染。在與所述宿主的易感細(xì)胞或組織形成接觸時(shí)，所述病原體由其宿主獲取營(yíng)養(yǎng)，以利于其自身生長(zhǎng)。在所述感染過程中，所述病原體會(huì)激活一連串的分子、生化、和生理學(xué)過程，其結(jié)果是釋放出對(duì)宿主有害的物質(zhì)，并發(fā)生疾病(例如，參見美國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)，W.H.Freeman和Co.，加利弗尼亞，舊金山，1995；Agrios，J.N.，植物病理學(xué)，學(xué)術(shù)出版社，1988)。微生物的所述致病作用是以多種方式產(chǎn)生的。
某些病原體通過分泌的產(chǎn)物起作用。例如，白喉是由芽孢桿菌白喉棒桿菌(Cornynebacterium diptheriae)引起的。這種生物被宿主吸入，并在上呼吸道形成感染。盡管所述細(xì)菌本身不會(huì)侵入血液，但其強(qiáng)效的毒素會(huì)侵入血液。這些毒素隨后被身體的細(xì)胞吸收，酶的功能受到損害，并破壞宿主細(xì)胞。
其它疾病是身體對(duì)病原體的反應(yīng)的結(jié)果。例如，對(duì)肺炎來說(一種由肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)引起的疾病)，感染會(huì)導(dǎo)致體液和細(xì)胞瀉出進(jìn)入肺泡，影響呼吸。皮膚的真菌感染同樣是由這種炎性反應(yīng)所致。
另一種細(xì)菌是機(jī)會(huì)病原體。例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)會(huì)感染熱灼傷患者或免疫缺陷型或有其它免疫學(xué)損傷的患者。銅綠假單胞菌感染可以是急性的并可以如角膜潰瘍和中耳炎般的是局部的，在囊性纖維化患者的肺中是慢性的，或在侵入血液以后是系統(tǒng)性的。
植物病原性疾病同樣受到關(guān)注，因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)植物和植物產(chǎn)品造成破壞。植物病原體可通過多種方法中的任一種在植物中產(chǎn)生疾病，這些方法包括(1)消耗宿主細(xì)胞養(yǎng)分；(2)通過毒素、酶、或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殺滅或破壞宿主細(xì)胞代謝；(3)通過誘導(dǎo)缺氯癥影響光合作用(例如，通過降解葉綠體)；和(4)抑制導(dǎo)電組織并干擾正常生理學(xué)過程。
作物、觀賞植物、樹木和灌木特別易感由細(xì)菌、真菌、病毒和線蟲引起的疾病。植物病原性細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致許多病害癥狀的發(fā)生，包括葉斑病和葉枯病，軟腐病，枯萎病，過度生長(zhǎng)，斑點(diǎn)病，和潰瘍病。細(xì)菌性病害最常見發(fā)生在具有肉質(zhì)儲(chǔ)藏組織的蔬菜(和某些觀賞植物上)，如馬鈴薯、胡蘿卜、洋蔥、鳶尾、或風(fēng)信子。細(xì)菌性病害還可發(fā)生在具有肉質(zhì)果實(shí)的植物上(如黃瓜、南瓜、茄子、或番茄)以及發(fā)生在多葉植物上(如甘藍(lán)、芹菜、萵苣、或菠菜)。植物細(xì)菌性病害出現(xiàn)在世界范圍內(nèi)，并會(huì)在大田中、在運(yùn)輸中、和在儲(chǔ)存中對(duì)作物造成嚴(yán)重?fù)p害。
植物致病的機(jī)理是多種多樣各不相同的。例如，一種細(xì)菌性植物病原體歐文氏菌屬可通過由傷口或可進(jìn)入的天然開口滲透到植物中的方式導(dǎo)致諸如軟腐病和火疫病的植物病害。所述細(xì)菌一旦進(jìn)入植物，就會(huì)分泌能降解植物胞間層的酶，導(dǎo)致組織的浸解，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其它細(xì)菌，如假單胞菌屬的某些菌株可通過破壞植物里的木質(zhì)部干擾水的轉(zhuǎn)運(yùn)。假單胞菌能侵入根和莖的木質(zhì)部，一旦進(jìn)入木質(zhì)部，就會(huì)分泌能破壞植物的酶和毒素。諸如土壤桿菌屬和棒桿菌屬的其它植物病原性細(xì)菌會(huì)刺激受感染的組織中細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大。這一般會(huì)導(dǎo)致在根、莖、或其它器官上或者在受感染的器官的增殖中(例如由發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogemes)引起的毛根病)形成無(wú)定型過度生長(zhǎng)，冠癭、或腫瘤的形成(例如由根癌農(nóng)桿菌引起的冠癭)。
病原生物的快速鑒定對(duì)于抗病原劑的合適選擇與臨床和農(nóng)業(yè)感染的控制來說是至關(guān)重要的。不過，諸如氨磺酰、四環(huán)素、氨芐青霉素、頭孢菌素、和氨基糖苷的抗病原劑在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用十分有利于抗性微生物種的選擇。對(duì)于含有可傳遞的抗性質(zhì)粒的細(xì)菌菌株來說尤其如此。例如，由沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、和鏈球菌屬的高抗菌株引起的醫(yī)院感染的爆發(fā)業(yè)已成為重要的和復(fù)發(fā)的問題。篩選抗性菌株的一個(gè)結(jié)果是，在過去幾十年里，銅綠假單胞菌業(yè)已成為一種重要的并且會(huì)造成麻煩的臨床病原體，會(huì)在醫(yī)院中導(dǎo)致10-20％的感染。目前，有幾種氨基糖苷和第三代頭孢菌素能有效抗銅綠假單胞菌，但是，由于銅綠假單胞菌容易獲得抗性，使得有必要尋找新的化合物作為潛在的替代品或作為其它治療劑。
發(fā)明概述我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，常見的致病性毒力因子參與了植物和動(dòng)物宿主的感染和致病性。這種宿主獨(dú)立型毒力因子的鑒定有利于設(shè)計(jì)來評(píng)價(jià)和鑒定治療劑的篩選方法的改進(jìn)，所述治療劑可用于抑制動(dòng)物或植物宿主或二者的致病性。另外，我們的發(fā)現(xiàn)提供了用于鑒定多種新型毒力因子的篩選方法的基礎(chǔ)。所述毒力因子的鑒定還有利于開發(fā)抗病原體的定向制劑。
因此，第一方面，本發(fā)明公開了一種用于鑒定能夠抑制真核宿主生物上的病原體的化合物的方法。該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓至少兩種不同的真核宿主生物接觸(依次或同時(shí))一種病原體，至少一種生物是非嚙齒類；和(b)鑒定能在所述每一種真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病原體是細(xì)菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；所述真核宿主生物包括脊椎動(dòng)物(例如非嚙齒類動(dòng)物)和植物，脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物；或無(wú)脊椎動(dòng)物和植物。優(yōu)選地，所述無(wú)脊椎動(dòng)物是線蟲(例如，新桿線蟲屬的一員)或昆蟲(例如，鱗翅目或雙翅目)；而所述植物是十字花科(例如，擬南芥屬的一員)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真核宿主生物的每一種是植物；是脊椎動(dòng)物；或是無(wú)脊椎動(dòng)物。
第二方面，本發(fā)明公開了一種用于鑒定能在非嚙齒類真核宿主生物中抑制病原體的化合物的方法。該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種非嚙齒類真核宿主生物接觸一種病原體；和(b)鑒定能在所述真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病原體是細(xì)菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；所述非嚙齒類整合宿主生物是線蟲(例如，新桿線蟲屬的一員)；而所述植物是十字花科(例如，擬南芥屬的一員)。在第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病原體是細(xì)菌(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)；而所述非嚙齒類真核宿主生物是植物(例如，擬南芥屬的一員)。
在第三方面，本發(fā)明公開了一種用于鑒定致病性毒力因子的方法。該方法包括(a)鑒定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)制備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時(shí))所述突變型病原體；(d)測(cè)定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導(dǎo)致發(fā)病，在以上兩種生物中的發(fā)病相對(duì)由野生型病原體引起的發(fā)病的減輕表明在病原性毒力因子上發(fā)生了突變；和(e)將所述突變用作鑒定所述病原性毒力因子的標(biāo)記。
第四方面，本發(fā)明公開了一種用于誘變一種病原性毒力因子的方法。該方法包括(a)鑒定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)制備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時(shí))所述突變型病原體；和(d)測(cè)定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導(dǎo)致發(fā)病，在以上兩種生物中的發(fā)病相對(duì)由野生型病原體引起的發(fā)病的減輕表明在病原性毒力因子上發(fā)生了突變。
第五方面，本發(fā)明公開了一種減弱一種病原體的毒力的方法。該方法包括(a)鑒定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物的至少一種是非嚙齒類；(b)制備所述病原體的突變型；(c)讓所述生物的每一種接觸(依次或同時(shí))所述突變型病原體；和(d)測(cè)定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導(dǎo)致發(fā)病，以上兩種生物中的發(fā)病相對(duì)由野生型病原體引起的發(fā)病的減輕表明病原體毒力的減弱。
在本發(fā)明上述任何方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以使用線蟲快速殺滅分析。另外，所述分析可能包括使用對(duì)一種化合物具有高滲透性的線蟲，例如，具有P-糖蛋白突變的秀麗新桿線蟲。
第六方面，本發(fā)明公開了一種利用昆蟲(例如，蛾或蠅)鑒定病原性毒力因子的方法。該方法包括(a)選擇一種能夠感染昆蟲的病原體；(b)制備一種病原體的突變型；(c)讓所述昆蟲接觸所述突變的病原體；和(d)測(cè)定所述突變型病原體是否能在所述昆蟲上導(dǎo)致發(fā)病，在所述昆蟲上的發(fā)病相對(duì)由野生型病原體引起的發(fā)病的減弱表明在所述病原性毒力因子上有一個(gè)突變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變的鑒定被用作鑒定所述病原性毒力因子的標(biāo)記；而所述病原體是細(xì)菌(例如假單胞菌屬)或真菌(例如，鐮菌屬)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括計(jì)算一種病原體的LD50，在小鼠殺滅試驗(yàn)中試驗(yàn)所述突變型病原體，或同時(shí)包括這兩者。
“抑制病原體”是指一種候選化合物降低、抑制、減弱、減輕、或阻止由病原體介導(dǎo)的疾病或感染在真核宿主生物中發(fā)生或發(fā)展的能力。優(yōu)選地，與在任何合適的致病性試驗(yàn)(例如，本文所披露的試驗(yàn))中缺少候選化合物時(shí)的癥狀相比，所述抑制能降低致病性至少5％，更優(yōu)選至少25％，最優(yōu)選至少50％。在一種具體的例子中，可以通過監(jiān)測(cè)接觸一種試驗(yàn)化合物或提取物的宿主生物上的致病性癥狀測(cè)定抑制作用，癥狀水平相對(duì)未用所述化合物處理過的宿主生物上的致病性癥狀的水平降低表明了化合物介導(dǎo)的對(duì)所述病原體的抑制。
“非嚙齒類”是指除小鼠、大鼠、豚鼠、或倉(cāng)鼠之外的任何生物。
“快速殺滅”試驗(yàn)是指這樣的試驗(yàn)試驗(yàn)群體中超過50％的線蟲會(huì)在低于大約36小時(shí)內(nèi)殺滅。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述殺滅是在大約12-大約24小時(shí)內(nèi)完成的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，殺滅是在大約4小時(shí)內(nèi)完成的。
“致病性毒力因子”是指一種細(xì)胞成分(例如，一種諸如轉(zhuǎn)錄因子蛋白)，沒有這種成分，病原體就不能夠在真核宿主生物中導(dǎo)致發(fā)病或感染。
本發(fā)明提供了用于區(qū)別和評(píng)價(jià)一種化合物對(duì)微生物病原體的效力的多種標(biāo)準(zhǔn)篩選方法的長(zhǎng)期期待的優(yōu)點(diǎn)。例如，本文所披露的篩選方法可以通過簡(jiǎn)單的體內(nèi)篩選同時(shí)評(píng)價(jià)宿主毒性以及抗病原體效力。另外，本發(fā)明方法還可用于評(píng)價(jià)一種化合物抑制微生物致病性的能力，與此同時(shí)，可以評(píng)價(jià)該化合物促進(jìn)和加強(qiáng)宿主對(duì)致病性侵襲的反應(yīng)的能力。
因此，本發(fā)明的方法提供了一種鑒定能夠安全用于真核宿主生物(即不會(huì)對(duì)所述生物的正常發(fā)育和生理學(xué)造成不利影響)，并能有效抗致病性微生物(即，通過抑制一種病原體的毒力)的化合物的簡(jiǎn)便方式。另外，本發(fā)明的方法提供了一種用于分析實(shí)際上為任意數(shù)量的化合物的抗致病性作用的途徑，該途徑具有大的容積通過量，高靈敏性，和低復(fù)雜性。該方法實(shí)施起來還比較廉價(jià)，并能分析以純化或粗制提取物形式存在的少量活性物質(zhì)。另外，本文所述的方法提供了一種用于鑒定抗致病性化合物的方法，所述化合物具有穿過真核細(xì)胞膜的能力，并能在體內(nèi)給藥方法中保持其治療效力。
從以下對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的說明和權(quán)利要求書中可以了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
詳細(xì)說明首先說明附圖。
附1是表示由丁香假單胞菌和銅綠假單胞菌在擬南芥(生態(tài)型Llagostera(L1))葉片上引起的癥狀的彩色照片。Mock-接種(左)；丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326(中)；銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(右)。
圖2A-D是表示丁香假單胞菌和銅綠假單胞菌在擬南芥屬葉上生長(zhǎng)的曲線。圖2A是表示丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326(空心方框)、銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(空心圓形)，和銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA29(空心三角形)在生態(tài)型Llagostera中生長(zhǎng)的曲線。圖2B是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14在三種擬南芥屬生態(tài)型中生長(zhǎng)的曲線Columbia(實(shí)心方框)；Argentat(實(shí)心圓形)；和Bensheim(實(shí)心三角形)。圖2C是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(實(shí)心圓形)和同種型plcS(空心方框)，和toxA(空心菱形)突變體的生長(zhǎng)曲線。圖2D是表示銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14(實(shí)心圓形)，同種型gacA(空心菱形)，和degP(空心方框)突變型在生態(tài)型Llagostera中生長(zhǎng)的曲線。按本文披露的方法計(jì)數(shù)擬南芥屬葉片中的細(xì)菌數(shù)。示出了四個(gè)樣品的平均值±SD。三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到了類似結(jié)果。所述植株的培養(yǎng)條件與下文的表I中所給出的實(shí)驗(yàn)相同。
圖3是表示生長(zhǎng)在野生型銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14和同種型degP突變型上的秀麗新桿線蟲殺滅性比較的曲線。圖4是表示生長(zhǎng)在野生型銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14和同種型gacA突變型上的秀麗新桿線蟲殺滅性比較的曲線。
圖5表示線蟲快速和緩慢殺滅試驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)。生長(zhǎng)在低磷蛋白胨-葡萄糖(PG)瓊脂上的銅綠假單胞菌比生長(zhǎng)在NGM瓊脂上的銅綠假單胞菌能更快地殺滅L4蠕蟲。讓40條L4蠕蟲接觸生長(zhǎng)在PG(圓形)或NGM(方形)上的PA14，所示出的殺滅蠕蟲的百分比是三次重復(fù)的平均值。
圖6A-6H是表示利用不同機(jī)制快速和緩慢殺滅的曲線。比較銅綠假單胞菌突變型lasR(圖6A和6B)，gacA(圖6C和6D)，degP(圖6E和6F)和49H2(圖6G和6H)和親代野生型PA14的快速(左圖)和慢速(右圖)殺滅作用。在緩慢殺滅方面(圖6B和6D)，lasR(三角形)和gacA(圓形)突變型殺滅蠕蟲的能力較其野生型PA14(三角形)弱，但在快速殺滅條件下其致病性未受損害(圖6A和6C)。相反，發(fā)現(xiàn)degP基因上的突變(菱形)能延遲緩慢殺滅(圖6F)并減弱快速殺滅(圖6E)。突變型49H2(倒三角形)起著與gacA和lasR突變型相反的作用；在緩慢殺滅方面它與野生型無(wú)法區(qū)分(圖6H)，但在快速殺滅方面急劇下降(圖6G)。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三次重復(fù)的平均值±SD。對(duì)于快速殺滅實(shí)驗(yàn)而言，細(xì)菌生長(zhǎng)在PGS(圖6A和6G)或PG(圖6C和6E)瓊脂上。所有的緩慢殺滅實(shí)驗(yàn)是在NGM瓊脂上進(jìn)行的。
圖7A-7C是表示快速殺滅的效力是種和菌株決定型的。圖7A比較了密切相關(guān)的熒光假單胞菌的快速殺滅。熒光假單胞菌菌株2-79(空心菱形)是與銅綠假單胞菌PA14(空心方框)具有相同的致病性，但丁香假單胞菌丁香變種菌株4326是無(wú)致病性的。圖7B比較了不同銅綠假單胞菌菌株的毒力。PA14在試驗(yàn)過的菌株中是毒性最大的接觸PA14的蠕蟲80％在12小時(shí)以后死亡。在12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上菌株P(guān)AK、PAO1-R、PA37和PA29占不到20％的蠕蟲殺滅。圖7C比較了PAO1變體的致病性。在PAO1的不同實(shí)驗(yàn)室收集物之間無(wú)明顯差別。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三次重復(fù)的平均值±SD。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次得到類似的結(jié)果。
圖8A-8F是表示影響銅綠假單胞菌介導(dǎo)的秀麗新桿線蟲殺滅的因素的曲線蠕蟲發(fā)育階段(圖8A)和環(huán)境因素(圖8B-8F)。除非另有說明，所有試驗(yàn)是使用生長(zhǎng)于20℃下的L4階段野生型N2秀麗新桿線蟲的同步培養(yǎng)物進(jìn)行的。殺滅蠕蟲的百分比是4次重復(fù)的平均值±SD。所有平板均接種40個(gè)蠕蟲，并保持在25℃下。圖8A是表示接觸生長(zhǎng)在PGS瓊脂上的PA14的L4(方形)或1日齡成體(菱形)的殺滅動(dòng)力學(xué)的曲線。圖8B是表示滲透壓摩爾對(duì)快速殺滅反應(yīng)的影響的曲線。接觸生長(zhǎng)在含有0.15M山梨醇(實(shí)心方形)，0.1M山梨醇(實(shí)心三角形)，或無(wú)山梨醇(實(shí)心圓形)的蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基上的PA14的L4蠕蟲的殺滅動(dòng)力學(xué)。與0.1M或無(wú)山梨醇相比，添加0.15M山梨醇可明顯提高殺滅速度。測(cè)定4次重復(fù)的平均值±SD。圖8C是表示鐵濃度對(duì)快速殺滅反應(yīng)的影響的曲線。在PGS上試驗(yàn)L4蠕蟲，所述PGS不添加鐵(實(shí)心方形)，添加100μMFeCl3(空心圓形)，或添加400μM的鐵螯合劑EDDA(空心方形)。與不添加鐵或添加鐵螯合劑的平板相比，在添加了鐵的平板上的殺滅速度明顯降低。該試驗(yàn)共進(jìn)行三次，得到類似的結(jié)果。圖8D是表示溫度對(duì)快速殺滅反應(yīng)的影響的曲線。在添加1日齡成體蠕蟲之前，在PGS瓊脂平板上在20℃(空心方形)，25℃(空心菱形)，30℃(空心圓形)，或37℃(空心三角形)的溫度下培養(yǎng)PA14 36小時(shí)。與較低溫度相比，發(fā)現(xiàn)在37℃下生長(zhǎng)可降低殺滅速度。讓PA14在上述溫度下生長(zhǎng)24小時(shí)的第二個(gè)試驗(yàn)表現(xiàn)出類似趨勢(shì)。圖8E和8F是表示碳源對(duì)快速殺滅反應(yīng)的影響的曲線。用1％的甘油(實(shí)心方形)取代PGS培養(yǎng)基中的1％的葡萄糖(半實(shí)心的方形)，會(huì)導(dǎo)致野生型PA14的殺滅速度的降低(圖8E)。不過，當(dāng)甘油被用作取代葡萄糖的碳源時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株rpn7-lasR(實(shí)心圓型)能比野生型PA14更迅速地殺滅(圖8F)。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘油被用作碳源時(shí)，rpn7-lasR能比野生型PA14產(chǎn)生更多的綠膿素。
圖9A-9B是表示由熱穩(wěn)定性擴(kuò)散因子介導(dǎo)的快速殺滅的直方圖。在實(shí)驗(yàn)處理之前，讓PA14培養(yǎng)物在PGS瓊脂平板上生長(zhǎng)24小時(shí)。將生長(zhǎng)于20℃下的L4階段野生型N2動(dòng)物的同步培養(yǎng)物用于所有實(shí)驗(yàn)。所示出的蠕蟲殺滅百分比是三次重復(fù)的平均值±SD。圖9A表示快速殺滅反應(yīng)不需要活的細(xì)菌。在處理之后4小時(shí)(HPE)測(cè)定含有活的PA14細(xì)菌的平板和含有死細(xì)菌的平板上的L4蠕蟲的殺滅率。將活的或氯仿殺滅大腸桿菌DH5α用于控制氯仿處理的效果。含有活的PA14或氯仿殺滅的PA14的平板表現(xiàn)出相同的殺滅效力。在活的或氯仿殺滅的大腸桿菌平板上沒有蠕蟲是殺滅死亡的。圖9B表示介導(dǎo)蠕蟲殺滅的主要因素是熱穩(wěn)定性。將未加熱平板(0分鐘)的4小時(shí)HPE的殺滅效力與在65℃下加熱30分鐘或60分鐘的含有PA14的平板加以比較。在添加蠕蟲之前，讓以上兩種加熱處理的平板冷卻至室溫。在三種處理中未發(fā)現(xiàn)殺滅效力方面的明顯差別，這表明決定殺滅的因子在65℃下穩(wěn)定至少1小時(shí)。


圖10A-10B是表示P-糖蛋白蠕蟲突變型對(duì)快速殺滅高度敏感，而對(duì)緩慢殺滅不敏感的曲線。在快速殺滅PG培養(yǎng)基(圖10A)和慢速殺滅NGM培養(yǎng)基(圖10B)上L4階段P-糖蛋白雙缺失菌株NL130[pgp-1(pk17)；pgp-3(pk18)](圓形)與其親代N2菌株(方形)的存活率加以比較。在以上兩種實(shí)驗(yàn)中，使用生長(zhǎng)于20℃下的L4階段蠕蟲的同步培養(yǎng)物。所示出的蠕蟲的殺滅百分比是三次重復(fù)的平均值±SD。向每一個(gè)平板上添加大約40個(gè)L4蠕蟲，并在25℃下培養(yǎng)所有的平板。在二組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得了類似結(jié)果。
圖11A-11B是表示藻酸鹽對(duì)快速殺滅不重要的曲線。在快速殺滅條件(圖11A)和慢速殺滅條件(圖11B)下比較degP插入突變型PA14degP(實(shí)心方形)，algD框內(nèi)缺失突變型PA14 algDΔ4(實(shí)心圓形)，和雙突變型PA14degP algDΔ4(實(shí)心三角形)與野生型PA14(空心方形)的殺滅速度。向每一個(gè)平板上添加大約40個(gè)L4 N2蠕蟲。將PGS瓊脂用于快速殺滅，而將NGM瓊脂用于慢速殺滅。殺滅蠕蟲的百分比是三次重復(fù)的平均值±SD。
圖12是表示磷酸鹽降低快速殺滅的速度的曲線。比較生長(zhǎng)在添加了20mM無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)的PYS瓊脂上(菱形)或生長(zhǎng)在不添加Pi的PYS瓊脂上(方形)上的PA14的殺滅速度。在磷酸鹽限制的條件下，在接觸PA14 8小時(shí)之后殺滅L4蠕蟲的百分比(三次重復(fù)的平均值±SD)較高。兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果。
圖13A-13B是表示對(duì)快速殺滅的抗性的曲線，所述抗性與對(duì)百草枯的抗性相關(guān)。在快速殺滅條件下，比較秀麗新桿線蟲株系TJ1052，age-1(hx546)II；TK22，mev-1(kn1)III；PH13；和rad-8(mn163)I與野生型N2株系的抗性或易感性。所示存活百分比為三次重復(fù)的平均值±SD。圖13A表示發(fā)生在age-1基因上的一個(gè)突變可產(chǎn)生對(duì)PA14快速殺滅的抗性。L4 age-1(hx546)(空心三角形)蠕蟲的存活率明顯高于N2(空心方形)的。圖13B表示發(fā)生在mev-1和rad-8基因上的突變可導(dǎo)致PA14快速殺滅敏感性的提高。在PA14和OP50上試驗(yàn)成體mev-1(kn1)和rad-8(mn163)的存活率。將OP50對(duì)照用于控制由于氧的毒性導(dǎo)致的所有死亡率；業(yè)已證實(shí)以上突變型對(duì)氧的敏感性增強(qiáng)。兩種株系在OP50上的死亡(實(shí)心菱形和圓形)可忽略不計(jì)。與其親代野生型N2株系相比(空心方形)發(fā)現(xiàn)mev-1(kn1)(空心菱形)和rad-8(mn163)(空心圓形)突變型成體更容易快速殺滅。
圖14是表示尖鐮胞(F.oxysporum)在蠟螟上的殺滅曲線的曲線圖。
圖15是表示OrR果蠅被PA14殺滅的曲線。
下面我們將說明證實(shí)一種細(xì)菌病原體能在植物、動(dòng)物、和線蟲中導(dǎo)致發(fā)病的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，在決定導(dǎo)致植物、動(dòng)物、和線蟲上的微生物病原性疾病的毒力因子方面存在著重疊。這些實(shí)驗(yàn)實(shí)施例是用于說明目的的，而不是用于限定本發(fā)明的范圍。鑒定銅綠假單胞菌在植物和動(dòng)物中的致病性所需的共同的毒力因子為了鑒定多宿主毒力因子，我們首先在植物和動(dòng)物致病模型中尋找能致病的細(xì)菌病原體。用擬南芥葉片致病滲透系統(tǒng)篩選一種銅綠假單胞菌提取物。然后將能在擬南芥屬中誘導(dǎo)發(fā)病癥狀的提取物用于在小鼠完整厚度皮膚灼傷模型和線蟲采食試驗(yàn)中檢驗(yàn)致病力。
具體地講，我們首先篩選了一組銅綠假單胞菌菌株，其中包括30個(gè)人類臨床提取物，20個(gè)土壤提取物，和25個(gè)植物提取物(獲自加利弗尼亞大學(xué)伯克萊分校，植物病理學(xué)系)。將以上提取物分別注射到4種不同擬南芥屬生態(tài)型(陸地小種或野生發(fā)病)的葉片中，以測(cè)定該提取物是否是植物病原體。試驗(yàn)了幾種擬南芥屬生態(tài)型，以提高鑒定到合適的病原體的可能性，因?yàn)榘〝M南芥屬病原體在內(nèi)的植物病原體通常表現(xiàn)出高水平的宿主載培種或生態(tài)型專一性。還要進(jìn)行多個(gè)宿主試驗(yàn)，因?yàn)榫哂猩鷳B(tài)型專一性的銅綠假單胞菌菌株更有可能是真實(shí)的植物病原體(而不是假象病原體，這種病原體僅能在試驗(yàn)室創(chuàng)造的人工環(huán)境下感染植株)。
篩選實(shí)驗(yàn)是按如下方法用擬南芥屬葉片致病滲透系統(tǒng)進(jìn)行的。在37℃下讓銅綠假單胞菌菌株生長(zhǎng)于Luria Broth(LB)培養(yǎng)基中，在10mM MgSO4洗滌2次，以光密度600[OD600]＝0.2的密度重新懸浮于10mM MgSO4中，以1∶100的比例稀釋(相當(dāng)于細(xì)菌密度為103cfu/cm2)，并注射到6周齡擬南芥屬植株的葉片中。在實(shí)驗(yàn)過程中，將植株以28-30℃的溫度和90-100％的相對(duì)濕度保持在生長(zhǎng)箱中。每天監(jiān)測(cè)發(fā)病癥狀和生長(zhǎng)，共監(jiān)測(cè)5天。注射后5天所誘發(fā)的癥狀被規(guī)定為“無(wú)”，無(wú)癥狀；“弱”，所述注射位點(diǎn)周圍組織的局部弱的水浸和缺氯(黃化)；“中度”，中度水浸和缺氯，接種部位周圍的大部分組織軟化；或“嚴(yán)重”，整個(gè)接種葉片嚴(yán)重軟腐，其特征是在注射之后2-3天，在注射部位周圍出現(xiàn)水浸反應(yīng)區(qū)和缺氯。在注射后4-5天，軟腐癥狀蔓延到整個(gè)葉片。在第5天收獲含有細(xì)菌的葉片胞間液，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定細(xì)菌數(shù)(例如，參見Dong等(1991)植物細(xì)胞361)。采集4種不同樣品，每個(gè)樣品用2個(gè)葉片。3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果。用10mM MgSO4接種的對(duì)照植株在實(shí)驗(yàn)期間未表現(xiàn)出癥狀。在其它對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，遺傳學(xué)上限定的銅綠假單胞菌菌株P(guān)AK，PAO1，或PO37中任一個(gè)都沒有在試驗(yàn)過的任一種擬南芥屬生態(tài)型上導(dǎo)致明顯的癥狀。這種菌株被證實(shí)在試驗(yàn)過的生態(tài)型上是非致病性的，但在培養(yǎng)物中是致病性的。
盡管篩選過的75種銅綠假單胞菌菌株的大部分不會(huì)在擬南芥屬葉片上產(chǎn)生癥狀，但有幾種菌株能誘發(fā)弱的至中等軟腐癥狀，其特征是在注射部位周圍組織上出現(xiàn)缺氯和水浸。有兩個(gè)菌株UCBPP-PA14(人類臨床提取物)和UCBPP-PA29(植物提取物)能在試驗(yàn)過的某些生態(tài)型上引起嚴(yán)重軟腐癥狀，這是高毒力植物細(xì)菌病原體的典型癥狀。表I表示在感染5天后銅綠假單胞菌UCBPP-PA14和UCBPP-PA29的生長(zhǎng)，以及由這些銅綠假單胞菌菌株在不同擬南芥屬生態(tài)型上引發(fā)的發(fā)病癥狀。具體地講，菌株UCBPP-PA14能在Llagostera(L1)和Columbia(Co1)擬南芥屬生態(tài)型上引起嚴(yán)重軟腐，但在生態(tài)型Argentat(Ag)上不會(huì)出現(xiàn)癥狀，在生態(tài)型Bensheim(Be)上僅能產(chǎn)生中度癥狀。表I還表明菌株UCBPP-PA29能在L1上導(dǎo)致嚴(yán)重癥狀，在Co1上引起弱的癥狀，但在Ag或Be上不會(huì)引起癥狀。
表I銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌UCBPP-PA14 UCBPP-PA29<
如圖1所示，由UCBPP-PA14引起的嚴(yán)重癥狀(最右邊)以水浸反應(yīng)區(qū)和缺氯為特征，在感染后4-5天可導(dǎo)致葉片的完全浸解和萎縮(與最左邊的對(duì)照比較)。這些癥狀與由高毒力擬南芥屬病原體丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326引起的癥狀基本上是無(wú)法區(qū)分的(中圖)。
為了證實(shí)發(fā)病癥狀的嚴(yán)重程度與細(xì)菌增殖相關(guān)，在為期數(shù)日的時(shí)間內(nèi)，按上述方法在擬南芥屬葉片上測(cè)定菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29中每一種的的生長(zhǎng)。如圖2A所示，在生態(tài)型L1中，在第5天上菌株UCBPP-PA14(空心圓形)和UCBPP-PA29(空心三角形)達(dá)到大約為107細(xì)胞/cm2葉面積的最大細(xì)菌密度，這相當(dāng)于比原始接種物增加了104倍。所述菌株在L1上的生長(zhǎng)特征類似于毒性擬南芥屬病原體丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326的生長(zhǎng)特征(圖2A，空心方形)，UCBPP-PA14在生態(tài)型Co1中也增殖了104倍(圖2B，實(shí)心方形；表I)。相反，菌株UCBPP-PA14在Be和Ag葉片中分別增加了103和102倍(圖2B，分別為實(shí)心三角形和實(shí)心圓形；表I)，菌株UCBPP-PA29在生態(tài)型Co1、Ag、Be中僅增加了102-6×102倍(表I)。在每一種情況下，葉片中細(xì)菌數(shù)量的減少反映了較輕癥狀的形成。因此，所述銅綠假單胞菌菌株的每一種在其以生態(tài)型專一方式導(dǎo)致發(fā)病的能力方面與其它植物病原體細(xì)菌相似。
然后在小鼠完整厚度皮膚灼傷試驗(yàn)中檢驗(yàn)被證實(shí)能在擬南芥屬中引起發(fā)病癥狀的UCBPP-PA14和UCBPP-PA29提取物。該試驗(yàn)涉及5％的鼠類體表面積，形成于腹部皮膚的伸展部分(Stevens等(1994)燒傷護(hù)理和恢復(fù)雜志15232)。在該模型中受損傷的表皮和真皮凝固壞死，但下面的腹直肌(RA)未受損傷。在沒有感染的情況下，所有動(dòng)物均存活下來。
為了進(jìn)行該致病試驗(yàn)，通過皮內(nèi)方式將銅綠假單胞菌接種物注射到燒傷結(jié)痂的中線皺折中。所述細(xì)菌在燒傷的傷口中增殖，某些菌株可以侵入正常的下部RA肌。高致病性菌株還能侵入維管結(jié)構(gòu)。24小時(shí)之后存在于所述燒傷下部和接近該燒傷部位的RA肌中的細(xì)菌數(shù)提供了一種局部侵襲力的定量指標(biāo)，而殺滅率同時(shí)表明了局部和系統(tǒng)性侵襲率。
按如下方法進(jìn)行小鼠完整厚度皮膚灼傷研究。在所有實(shí)驗(yàn)中均使用體重為25-35克的6周齡雌性CD-1小鼠(Charles River動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng))，按照動(dòng)物燒傷模型進(jìn)行(Stevens等，同上)。用大約5×103細(xì)胞注射小鼠。從剛注射過細(xì)菌之后的下部RA肌或在其它研究中接收了假傷害的動(dòng)物中未挽救到活的細(xì)菌細(xì)胞。在死亡率研究中，在燒傷之后馬上給小鼠注射102細(xì)胞，每天監(jiān)測(cè)因膿毒而死亡的動(dòng)物數(shù)量，共監(jiān)測(cè)10天。兩組對(duì)照動(dòng)物包括(i)燒傷的小鼠，但不注射，和(ii)注射熱殺滅UCBPP-PA14的小鼠，導(dǎo)致0％的死亡率。
表II所示數(shù)據(jù)(見下文)表明，銅綠假單胞菌菌株能在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中增殖。表II表明菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29在增殖和侵入RA肌方面與業(yè)已鑒定過的銅綠假單胞菌人類提取物PO37、PAK、PAO1相當(dāng)。在直接從燒傷和感染部位下面采集的RA肌活組織樣品的每克組織中所有菌株均達(dá)到1.8×108-3.6×108cfu的滴度。另外，在從接近燒傷部位采集的RA肌活組織樣品的每克組織中所有菌株均達(dá)到4.0×107-8.2×107cfu的滴度。另外，組織樣品的常規(guī)組織學(xué)處理揭示了菌株UCBPP-PA14侵入肌肉的程度與菌株P(guān)O37相同。
表II平均滴度±SD 平均滴度±SD在活組織檢查中 在活組織檢查中銅綠假單胞菌菌株在燒傷之下 接近燒傷
通過按上述方法在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中進(jìn)行死亡率研究試驗(yàn)菌株UCBPP-PA14和UCBPP-PA29與PO37的毒力比較。在燒傷和感染之后第10天，菌株UCBPP-PA14、UCBPP-PA29、和PO37分別能導(dǎo)致77％(17/22)、6％(1/16)、和22％(2/9)的死亡率(表III)。其它實(shí)驗(yàn)表明，菌株P(guān)AO1和PAK在該模型中引起的死亡率明顯低于UCBPP-PA14。
然后選擇菌株UCBPP-PA14用于其它研究，因?yàn)樗芨腥局参锖蛣?dòng)物致病模型，其中，可以對(duì)致病結(jié)果進(jìn)行定量，還由于在這些模型中的毒力水平與已知植物和動(dòng)物病原體的相當(dāng)。具體地講，我們?cè)噲D確定是否在菌株UCBPP-PA14存在在以上兩種宿主中致病所需的共同的毒力決定子。我們的策略是利用一種標(biāo)記交換方法制備在4個(gè)不同基因上帶有插入突變的UCBPP-PA14突變體，已知其中的兩個(gè)在動(dòng)物宿主中是銅綠假單胞菌的毒力決定子，已知一種在植物宿主中是植物病原性細(xì)菌的毒力決定子，已知一種在動(dòng)物宿主中是若干動(dòng)物細(xì)菌病原體的毒力決定子。銅綠假單胞菌的兩個(gè)動(dòng)物毒力基因是分別編碼外泌蛋白磷脂酶C和外毒素A的plcS和toxA(Ohman等(1990)感染與免疫28899；Ostroff等(1987)細(xì)菌學(xué)雜志1694597)。外毒素A核糖基化G蛋白和磷脂酶C優(yōu)先降解真核細(xì)胞的磷脂(Iglewski等(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.722284；Berka等(1982)細(xì)菌學(xué)雜志152239)。植物病原體毒力決定子是gacA，它被鑒定為非致病性土壤桿菌熒光假單胞菌的外泌抗真菌因子的全球性調(diào)節(jié)物(Laville等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891562；Gaffney等(1994)分子植物-微生物相互作用7455)。在植物病原體丁香假單胞菌丁香變種和菊苣假單胞菌(P.cichorii)中，gacA似乎起著編碼與致病性有關(guān)的胞外產(chǎn)物的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的作用(Rich等(1994)細(xì)菌學(xué)雜志1767468)。其它動(dòng)物毒力決定子degP(也被稱為htrA)業(yè)已被證實(shí)為一種脅迫反應(yīng)蛋白酶，它決定在布魯氏菌屬和沙門氏菌屬中不正確折疊的周質(zhì)蛋白的降解(Elzer等(1994)感染與免疫學(xué)624135；Johnson等(1991)分子微生物學(xué)5410)。
用相當(dāng)于銅綠假單胞菌菌株P(guān)AK的plcS和toxA基因的克隆DNA片段作為雜交探針在菌株UCBPP-PA14的基因組粘粒文庫(kù)中鑒定plcS和toxA的UCBPP-PA14同系物。按照標(biāo)準(zhǔn)方法在粘?？寺≥d體pJSR1中制備菌株UCBPP-PA14的基因組文庫(kù)，而載體pJSR1本身是通過將一個(gè)含有源于pHC79的噬菌體λcos位點(diǎn)的1.6kb BglII片段(例如，參見Hohn等(1980)基因11291)連接到pRR54的BglII位點(diǎn)上而構(gòu)建的(例如，參見Roberts等(1990)細(xì)菌學(xué)雜志1726204)。將一個(gè)從質(zhì)粒pMS150中分離的含有toxA基因的1.7kb BamHI片段(例如，參見Lory等(1983)基因2295)和一個(gè)從質(zhì)粒pSL2(例如，參見Lory等(1988)細(xì)菌學(xué)雜志170714)中分離的含有plcS基因的3.0kb BamHI-PstI片段用于檢測(cè)在pJSR1中構(gòu)建的UCBPP-PA14基因組文庫(kù)。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法用相當(dāng)于熒光假單胞菌gacA基因的保守區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在相同的粘粒文庫(kù)中鑒定gacA的UCBPP-PA14同系物。根據(jù)gacA基因的序列(Laville等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891562)設(shè)計(jì)寡核苷酸5’-GCTAGTAGTCGATGACC-3’(序列1)和5’-GCTGGCATCAACCATGC-3’(序列2)，并用于擴(kuò)增一種含有熒光假單胞菌gacA基因的625個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物，在將該寡核苷酸用于檢測(cè)上述構(gòu)建于pJSR1中的UCBPP-PA14基因組文庫(kù)。用丁香假單胞菌斑生致病變種的degP基因作為探針在UCBPP-PA14粘粒文庫(kù)中鑒定degP基因的UCBPP-PA14同系物。
對(duì)所有4個(gè)基因進(jìn)行亞克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法通過插入編碼慶大霉素抗性的框進(jìn)行誘變。
另外將從含有菌株UCBPP-PA14的plcS基因的粘?？寺≈蟹蛛x的6kb BamHI片段由pJSR1衍生的粘粒亞克隆到pBR322的BamHI位點(diǎn)。通過將一個(gè)慶大霉素編碼DNA框插入plcS基因的XohI位點(diǎn)誘變所得到的克隆pLGR101，以構(gòu)建pLGR201。所述慶大霉素抗性基因框是一個(gè)源于質(zhì)粒pH1JI的1.8kb BamHI片段(例如，參見Rubin(1987)質(zhì)粒18，84)。將一個(gè)含有toxA基因的1.6kb BamHI片段由pJSR1衍生的粘?？寺〉絧BR322，以構(gòu)建pLGR102，隨后通過將所述慶大霉素框插入toxA基因的BglII位點(diǎn)進(jìn)行誘變，構(gòu)建質(zhì)粒pLGR202。將一個(gè)含有銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14 gacA基因的2.5kbHindIII-EcoRI片段由pJSR1衍生的粘粒亞克隆到pBR322中，構(gòu)建pLGR103。對(duì)推測(cè)的gacA基因進(jìn)行部分測(cè)序，以證實(shí)UCBPP-PA14 gacA業(yè)已被克隆。通過將所述慶大霉素框插入gacA基因的SalI誘變pLGR103，以構(gòu)建質(zhì)粒pLGR203。將含有部分degP基因的1.6 PstI片段由菌株UCBPP-PA14的粘?？寺H126的衍生物pPY201亞克隆到pUC19的PstI位點(diǎn)，構(gòu)建pNAS。將含有所述慶大霉素框的1.6kb SalI片段插入pNAS上的degP基因的XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建pNASGm。接著，從pNASGm載體中分離一個(gè)3.2kb的SphI/XhoI片段，并亞克隆到pCVD442的SphI/XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建pPY206，它含有突變的degP基因。
用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記交換技術(shù)將所述突變基因轉(zhuǎn)移到UCBPP-PA14基因組，通過DNA印跡分析證實(shí)所得到的標(biāo)記交換突變的結(jié)構(gòu)，因此，通過Rahme等所披露的方法(細(xì)菌學(xué)雜志170575，1991)將質(zhì)粒pLGR201、pLGR202、pLGR203和pPY206用于置換基因plcS、toxA、gacA和degP，用濃度為30mg/ml的慶大霉素篩選雙交換事件，濃度為300mg/ml的羧芐青霉素用于篩選所述載體的丟失。在加富或基本培養(yǎng)基中，與野生型相比，以上4種突變對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)都沒有任何可檢測(cè)的影響。
通過將所述突變型菌株滲透到擬南芥屬生態(tài)型Ll中試驗(yàn)plcS、toxA、gacA和degP突變對(duì)UCBPP-PA14在擬南芥屬模型中的致病性的影響。與野生型UCBPP-PA14不同，所述突變型無(wú)一能導(dǎo)致葉片浸解或萎縮。具體地講，等基因toxA突變型能引起減弱的軟腐和缺氯癥狀，沒有伴隨的UCBPP-PA14所特有的受影響組織的浸解。plcS、gacA和degP突變能引起更弱的癥狀，僅僅會(huì)導(dǎo)致缺氯。與減弱的癥狀一致，5天之后toxA、plcS、gacA和degP突變型的生長(zhǎng)分別比野生型的生長(zhǎng)低大約10倍、102倍、5×103倍和102(圖2C和2D)。
當(dāng)為所述突變型補(bǔ)充攜帶在質(zhì)粒上的相應(yīng)的野生型基因時(shí)，3種試驗(yàn)過的突變型(plcS、toxA、和gacA)在植物中的生長(zhǎng)和癥狀完全恢復(fù)到野生型水平。這一目的是通過將一個(gè)6kb BamHI片段由含有菌株UCBPP-PA14的plcSR操縱子的基因組文庫(kù)的粘?？寺B85亞克隆到質(zhì)粒pRR54的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建pLGR301而實(shí)現(xiàn)的。然后將質(zhì)粒pLGR301用于plcS突變型的遺傳互補(bǔ)研究。將從含有菌株P(guān)AK的toxA基因的質(zhì)粒pMS150中分離的2.4kb的EcolRI/EcolRV片段亞克隆到質(zhì)粒pBR322的EcolRI/EcolRV位點(diǎn)，構(gòu)建pLGR106。將來自pLGR106的一個(gè)含有toxA的SphI/PstI片段克隆到pRR54的SphI/PstI位點(diǎn)，構(gòu)建pLGR206。從粘?？寺H106中分離含有g(shù)acA基因的1.2kbHindIII/XhoI片段，并亞克隆到pRR54的HindIII/SalI位點(diǎn)上，構(gòu)建pLGR204。然后將pLGR206和pLGR204用于toxA和gacA突變型的遺傳互補(bǔ)研究。
表III表示相當(dāng)于以上3種銅綠假單胞菌菌株突變型在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中的死亡率研究。在該死亡率研究中，燒傷并感染plcS或toxA突變型的小鼠與感染野生型菌株的小鼠(77％)相比表現(xiàn)出明顯較低的死亡率(兩種突變型均為40％)。gacA和degP突變型不會(huì)導(dǎo)殺滅亡(表III)。突變型和野生型之間的死亡率差別在從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講是顯著的，其置信水平為95％或者更高。通過用卡方測(cè)試和Yates’校正測(cè)定死亡率數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P≤0.05的組被示為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。所有突變型均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平(plcS和toxA，P＝0.05gacA，P＝0.00005)。
表III
以上結(jié)果表明，plcS、toxA、gacA、和degP參與了植物和動(dòng)物致病，并表明了發(fā)病所需要的一部分病原體機(jī)制在動(dòng)物和植物宿主中是共同的或共有的。一種共有的毒力因子gacA在調(diào)控水平上是有活性的，表明了調(diào)控毒力因子的機(jī)制在植物和動(dòng)物病原體之間是保守的。plcS和toxA基因產(chǎn)物是特殊的毒力決定子，它們有可能攻擊細(xì)胞膜，并抑制植物和動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白合成。
為了將以上結(jié)果擴(kuò)展到第三種宿主系統(tǒng)，在線蟲采食試驗(yàn)中測(cè)定銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的致病性。所述采食試驗(yàn)的設(shè)置如下。首先，將銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的5μl過夜培養(yǎng)物或攜帶degP或gacA突變的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的等基因菌株接種到NGM瓊脂平板的中央，并在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。在室溫下冷卻數(shù)小時(shí)之后，用8個(gè)秀麗新桿線蟲L4-期蠕蟲接種所述平板。然后在黑暗中在25℃下培養(yǎng)平板，每隔6小時(shí)統(tǒng)計(jì)死去的蠕蟲。具有以下癥狀的蠕蟲為死亡它不再活動(dòng)，不再表現(xiàn)出任何咽泵活動(dòng)，不再表現(xiàn)出排糞行為。
圖3和4表示分別使用野生型UCBPP-PA14及其degP和gacA等基因突變型進(jìn)行的線蟲采食殺滅試驗(yàn)結(jié)果。圖3和圖4所示結(jié)果表明，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能殺滅秀麗新桿線蟲。以上結(jié)果還表明，攜帶能從功能上使degP或gacA基因失效的插入的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的等基因突變型能明顯降低在線蟲和小鼠完整厚度皮膚燒傷試驗(yàn)中的毒力(圖3和4；表III)。已知gacA基因是丁香假單胞菌在植物宿主中的毒力決定子，degP是丁香假單胞菌和鼠傷寒桿菌的毒力因子。如下文所述，我們業(yè)已將所述篩選方法用于鑒定在線蟲和擬南芥屬中具有減弱的致病性的若干突變型；發(fā)現(xiàn)我們所分離到的三種突變型在小鼠中的致病性較弱。
本文所披露的多宿主動(dòng)物/植物病原體系統(tǒng)具有若干實(shí)際分歧。例如，以上結(jié)果表明致病的分子基礎(chǔ)在植物和動(dòng)物中是明顯相似的。因此，如下文所述，所述多宿主系統(tǒng)可用于新型毒力因子的鑒定和研究。具體地講，可以通過在不同宿主生物中試驗(yàn)單一的誘變銅綠假單胞菌篩選整個(gè)銅綠假單胞菌基因組中的致病相關(guān)基因，例如使用本文所披露的擬南芥屬或線蟲試驗(yàn)。然后可將以這種方式鑒定的基因在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型中進(jìn)行試驗(yàn)。該系統(tǒng)還有利于闡明細(xì)菌病原體的宿主專一性的分子基礎(chǔ)。用該模型系統(tǒng)鑒定的毒力因子，提供了新一代化學(xué)治療劑的開發(fā)目標(biāo)，所述治療劑可用于臨床和農(nóng)業(yè)微生物疾病。鑒定共同毒力基因的篩選系統(tǒng)根據(jù)以上結(jié)果表明，一系列銅綠假單胞菌毒力因子參與了三種不同宿主的致病，并且這些共同的毒力決定子確定了細(xì)菌致病性的功能特征，它是不依賴于宿主的，我們業(yè)已開發(fā)了一種用于鑒定對(duì)植物和動(dòng)物致病性重要的毒力決定子。所述篩選使用多宿主動(dòng)物/植物病原體(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)并利用其便于在實(shí)際上任何宿主生物中篩選數(shù)以千計(jì)的隨機(jī)產(chǎn)生的微生物突變型的能力。有用的真核宿主生物包括，但不限于線蟲(例如秀麗新桿線蟲)、植物(例如擬南芥屬的種子或葉片)、酵母或其它真菌、魚(例如，蓑魷)、蠅(例如，黑尾果蠅)、小鼠等。一般，按照本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法誘變微生物病原體，然后評(píng)價(jià)其在宿主生物中誘發(fā)疾病的能力。將發(fā)現(xiàn)其具有減弱的致病性的誘變病原體或已變成無(wú)致病性的病原體用于本發(fā)明方法。然后按照本領(lǐng)域公知方法將所述突變型病原體用于鑒定決定致病性的宿主依賴型或宿主非依賴型毒力因子。
以下是毒力因子線蟲篩選系統(tǒng)的工作實(shí)例，該系統(tǒng)使用人類臨床提取物銅綠假單胞菌UCBPP-PA14，發(fā)現(xiàn)其能感染三種不同模型小鼠皮膚完整厚度燒傷模型，秀麗新桿線蟲采食模型，和擬南芥葉片滲透模型。將線蟲用作研究諸如假單胞菌屬的人類或植物病原體的優(yōu)點(diǎn)是，在線蟲中鑒定非致病性假單胞菌屬突變型相對(duì)簡(jiǎn)單。例如，秀麗新桿線蟲篩選包括將兩個(gè)L4階段蠕蟲放置在銅綠假單胞菌突變體的菌苔上，并在5天后觀察存活的蠕蟲。按照任何標(biāo)準(zhǔn)方法誘變諸如銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的病原體，例如標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)或體外插入誘變方法(例如，參見Kleckner等(1977)分子生物學(xué)雜志116125)。還可使用其它方法，例如化學(xué)誘變。在第5天，在接種野生型病原體細(xì)菌的平板上很少有或沒有活的蠕蟲，而在接種大腸桿菌或非致病性突變體的平板上存在以上兩個(gè)起始兩性蠕蟲的數(shù)以百計(jì)或千計(jì)的活的后代。因此，在有突變型銅綠假單胞菌的條件下生長(zhǎng)的蠕蟲是決定致病性的基因業(yè)已失活的證據(jù)。對(duì)失活突變的位置進(jìn)行作圖，導(dǎo)致了突變毒力因子的克隆和鑒定(例如，通過核苷酸測(cè)序)。
為了鑒定參與致病的基因，我們用轉(zhuǎn)座子誘變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備了銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的突變體(例如，參見Manoil等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.8129；Taylor等(1989)細(xì)菌學(xué)1711870)；制備了8000以上的突變體。然后利用上述秀麗新桿線蟲采食試驗(yàn)評(píng)價(jià)上述突變體中1900個(gè)的致病性。如表IV所示，我們分離到了在秀麗新桿線蟲中表現(xiàn)出減弱的致病性的8個(gè)UCBPP-PA14突變體。
另外，我們還檢查了另一類突變體的致病性，這類突變體是用標(biāo)準(zhǔn)方法在萵苣葉致病試驗(yàn)中通過轉(zhuǎn)座子誘變制備的(例如，參見Cho等(1975)植物病理學(xué)65425)。利用該試驗(yàn)，我們分離到了2900個(gè)在萵苣葉上具有減弱的致病性的UCBPP-PA14突變體。然后按照上述方法在擬南芥屬葉片致病分析試驗(yàn)中試驗(yàn)這些突變體。如表IV所示，我們分離到了在擬南芥屬中具有減弱的致病性的12個(gè)UCBPP-PA14突變體。
表IV
然后在秀麗新桿線蟲采食試驗(yàn)和小鼠完整厚度皮膚燒傷試驗(yàn)中試驗(yàn)在擬南芥屬滲透試驗(yàn)中鑒定的一個(gè)UCBPP-PA14突變體的致病性。我們發(fā)現(xiàn)與野生型UCBPP-PA14菌株相比，該UCBPP-PA14突變體在以上兩種系統(tǒng)中的致病性都較低。另外，我們還試驗(yàn)了在擬南芥屬生物活組織檢查中鑒定的兩種突變體在小鼠完整厚度燒傷試驗(yàn)中的致病性。還發(fā)現(xiàn)這些突變體與野生型UCBPP-PA14菌株相比在小鼠中具有較低的致病性。與這些結(jié)果一起還提供了用于證實(shí)在植物和動(dòng)物中決定致病性的共同毒力因子存在的證據(jù)。
上述結(jié)果表明，在銅綠假單胞菌UCBPP-PA14和秀麗新桿線蟲之間存在致病性相互作用。菌株UCBPP-PA14能殺滅秀麗新桿線蟲。在擬南芥葉滲透試驗(yàn)中(圖1和2；表I)和在小鼠完整厚度皮膚燒傷模型(表2和3)中，UCBPP-PA14也具有感染力。另外，我們業(yè)已證實(shí)在UCBPP-PA14 degP和gacA基因中發(fā)生的無(wú)效突變可顯著降低在所有三種模型中的致病性。因此，我們業(yè)已提供了在植物和動(dòng)物中存在決定致病性的其同毒力因子的第一個(gè)證據(jù)。所述毒力因子使得分離能影響毒力因子的功能的化合物成為可能(例如，通過直接降低致病性或增強(qiáng)宿主的反應(yīng))，還有可能在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(例如，Caenorhabitis)中鑒定這些化合物。利用線蟲“快速殺滅”試驗(yàn)鑒定共同毒力基因的篩選系統(tǒng)上述證據(jù)表明，當(dāng)PA14菌株生長(zhǎng)在NGM瓊脂上時(shí)，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能在為期2.5-5天的時(shí)間內(nèi)殺滅秀麗新桿線蟲。在這種條件下觀察到的殺滅速度被定義為“慢速殺滅”。簡(jiǎn)單地講，在慢速殺滅條件下，將5μl PA14的過夜液體培養(yǎng)物展開到一個(gè)NGM(或M9)瓊脂平板的中央，并在37℃下生長(zhǎng)24小時(shí)。然后用數(shù)小時(shí)將這些平板冷卻到室溫。將第四幼蟲期(L4)的蠕蟲加到所述瓊脂上，但不接觸所述菌苔。所述蠕蟲通常會(huì)向著所述菌苔移動(dòng)并開始采食。相反，當(dāng)PA14蠕蟲生長(zhǎng)在蛋白胨-葡萄糖-山梨醇(PGS(一種具有較高滲透摩爾數(shù)的加富培養(yǎng)基))上時(shí)，獲得了不同結(jié)果。當(dāng)L4蠕蟲被放置在PGS平板上時(shí)，所述蠕蟲變得遲緩、然后麻痹、接著在4-24小時(shí)內(nèi)死亡(圖5)。某些蠕蟲甚至在與所述菌苔發(fā)生直接接觸之前就已死亡。這種在PGS瓊脂上的較快速的殺滅被稱為“快速殺滅”。為了證實(shí)快速和慢速殺滅之間動(dòng)力學(xué)的差別是否是由于內(nèi)在機(jī)制的差別引起的，或者快速殺滅僅僅是在慢速殺滅中出現(xiàn)的過程的一種加速，在以上條件下試驗(yàn)PA14細(xì)菌突變體的效果。篩選的殺滅曲線示于圖6A-6H中，并將數(shù)據(jù)歸納于表V中。
表V在以下條件下殺滅秀麗新桿線蟲的能力菌株 快速 慢速基因PA14 + +在快速和慢速殺滅中的致病性PA14plcS + + PlcSPA14algDΔ4 + + algD16G12+ + 無(wú)匹配25A12+ + 無(wú)匹配33A9 + + 無(wú)匹配33C7 + + 無(wú)匹配僅在慢速殺滅中延遲PA14toxA + ± toxA35A9 + ± 無(wú)匹配44B1 + ± 未測(cè)序25F1 + ± 無(wú)匹配41A5 + ± 無(wú)匹配41C1 + ± 未測(cè)序34H4 無(wú)匹配僅在慢速殺滅中受傷害PA14gacA + - gacA50E12+ - invA的dst*rpn7-lasR+ - lasR僅在快速殺滅中受傷害49H2 - + 未測(cè)序在快速殺滅中受傷害并在在慢速殺滅中受延遲PA14degP - ± egPpho15- ± dsbA34B12- ± phnB的dst*在快速和慢速殺滅中受傷害pho23- - 無(wú)匹配如圖6A-6H所示，發(fā)生在PA14的gacA或lasR基因上的突變能完全消除慢速殺滅，但對(duì)快速殺滅沒有影響(圖6A-6D)，以上兩個(gè)基因是胞外毒力因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(Galbello等(1993)感染與免疫611180-1184；Rahme等(1995)，科學(xué)2681899-1902)。相反，發(fā)生在編碼周質(zhì)蛋白酶的PA14degP基因上的突變以及TnphoA插入未鑒定的基因(TnphoA突變型49H2)明顯減弱快速殺滅，但僅能延緩慢速殺滅(圖6E-6H)。6A-6H和表V所示數(shù)據(jù)與以下假說最為一致PA14采用不同的機(jī)制殺滅秀麗新桿線蟲，這取決于細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
假單胞菌屬的其它種和菌株的致病性業(yè)已發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌類似，熒光假單胞菌(菌株55，2-79和WCS365)和丁香假單胞菌斑生致病變種菌株ES4326在上述慢速殺滅條件下不能殺滅秀麗新桿線蟲；菌苔被完全消耗，而線蟲發(fā)育和繁殖正常。然而大腸桿菌、丁香假單胞菌斑生致病變種菌株E4326和熒光假單胞菌55在快速殺滅條件下也是非致病性的，但熒光假單胞菌2-79(圖7A)和熒光假單胞菌WCS365(數(shù)據(jù)未顯示)在快速殺滅條件下具有與銅綠假單胞菌PA14相同的毒力。有趣的是，銅綠假單胞菌2-79和WCS365是有效的根部寄居菌，并對(duì)其抑制真菌感染的能力作了深入的研究(Mazzola等(1992)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)582616-2624)。
由于不同的銅綠假單胞菌菌株能產(chǎn)生不同量的胞外毒力因子(Hamood等(1992)感染與免疫60510-517)，還要在所述快速殺滅條件下試驗(yàn)不同銅綠假單胞菌菌株的毒力，如圖7B所示，在快速殺滅條件下，試驗(yàn)過的其它銅綠假單胞菌菌株無(wú)一與PA14一樣有毒。Preston等(感染與免疫633497-3501，1995)證實(shí)，在不同實(shí)驗(yàn)室保持的相同親代PAO1的變體在小鼠角膜感染的毒力方面表現(xiàn)出顯著差異，因此，我們還試驗(yàn)了PAO1菌株的不同實(shí)驗(yàn)室收集物。不過，所有試驗(yàn)過的PAO1變體的毒力均低于PA14，并且在它們之間沒有明顯差別(圖7C)。由于其它銅綠假單胞菌菌株的毒力不如PA14，我們提出將PA14用于下述所有其它試驗(yàn)。
影響銅綠假單胞菌介導(dǎo)的秀麗新桿線蟲快速殺滅的因素蠕蟲的發(fā)育時(shí)期。我們已經(jīng)證實(shí)，在慢速殺滅條件下，成體蠕蟲的死亡快于L4蠕蟲。因此，我們?cè)囼?yàn)了蠕蟲發(fā)育時(shí)期對(duì)快速殺滅的敏感性的影響。如圖8A所示，L4蠕蟲比1日齡兩性成體更容易被快速殺滅。例如，在接觸銅綠假單胞菌PA14 12小時(shí)之后，超過90％的L4蠕蟲死亡，而相同條件下僅有不到10％的1日齡成體(圖8A)。
細(xì)菌因素。細(xì)菌具有另人難以置信的根據(jù)環(huán)境刺激變化調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力。這種類型的調(diào)節(jié)對(duì)于適應(yīng)物理環(huán)境和/或毒力因子的表達(dá)的改變可能是必須的。在細(xì)菌中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的某些已知因素有滲透性、溫度、鐵和磷酸的濃度，和碳源。慢速殺滅培養(yǎng)基(NGM或M9)的磷酸含量高，而快速殺滅培養(yǎng)基的磷酸含量低。我們?cè)囼?yàn)了改變M9瓊脂的滲透壓、生長(zhǎng)溫度、鐵濃度、和碳源對(duì)慢速殺滅動(dòng)力學(xué)的影響。除了生長(zhǎng)培養(yǎng)基的鐵濃度之外，其它參數(shù)無(wú)一能明顯影響慢速殺滅，鐵濃度的提高會(huì)導(dǎo)致微弱的殺滅延遲。這并不奇怪，因?yàn)槁贇缡羌?xì)菌在蠕蟲腹腔建立并繁殖的結(jié)果，并且體內(nèi)條件比體外生長(zhǎng)條件更能影響銅綠假單胞菌的致病性。
滲透壓。在蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基(PS)上的殺滅速度明顯高于在干燥平板上的殺滅速度。為了證實(shí)這種在殺滅速度方面的提高是否是由較高滲透壓引起的，用山梨醇提高滲透壓，而不提高電解質(zhì)濃度。在缺少(PG)或存在0.1M和0.15M山梨醇(PGS)的條件下使用蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基。在PG和PGS培養(yǎng)基上，PA14的生長(zhǎng)速度相同。不過，如圖8B所示，隨著培養(yǎng)基滲透壓的提高，觀察到了明顯較高的秀麗新桿線蟲死亡率，和更快的殺滅速度，這表明了滲透壓-調(diào)節(jié)的毒力因子的生產(chǎn)的增加。與所述假設(shè)一致，即滲透壓能影響細(xì)菌毒力因子的分泌，業(yè)已在另一種人類機(jī)會(huì)病原體嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)上證實(shí)，在高滲透壓下生長(zhǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出比較低滲透壓的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞較高的溶解性、細(xì)胞毒性、和解酪蛋白活性，并且在魚和小鼠致病模型中毒性更大(Aguilanr等(1997)感染與免疫651245-1250)。另一種假說是，在高滲透壓培養(yǎng)基中快速殺滅的加強(qiáng)是由于線蟲耐受力的降低。事實(shí)上，我們觀察到當(dāng)把L4秀麗新桿線蟲放置在含有大腸桿菌或非致病性PA14菌株的高滲透壓瓊脂培養(yǎng)基(PG含有0.15M山梨醇)上時(shí)，線蟲首先變得麻痹，但然后恢復(fù)。
鐵。鐵的可得性是被許多致病性細(xì)菌用于誘導(dǎo)毒力因子表達(dá)的一個(gè)重要刺激物。鐵限制的條件能促進(jìn)毒素A、堿性蛋白酶、和彈性蛋白酶合成的增加(Bjorn等(1978)感染與免疫19785-791；Bjorn等(1979)細(xì)菌學(xué)雜志138193-200)。很多這些胞外產(chǎn)物產(chǎn)生銅綠假單胞菌致病性的毒力。與該結(jié)果一致，與生長(zhǎng)在高鐵培養(yǎng)基中時(shí)產(chǎn)生的損傷相比，生長(zhǎng)在低鐵培養(yǎng)基中的銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO1能產(chǎn)生明顯更大的角膜損傷(Woods等(1982)感染與免疫35461-464)，然而，有關(guān)的毒力因子尚未披露，為了證實(shí)是否所有參與秀麗新桿線蟲快速殺滅的毒力因子是由鐵調(diào)節(jié)的，在鐵限制和含鐵條件下試驗(yàn)PA14的殺滅效力。如圖8C所示，添加鐵螯合劑(400μM的EDDA)不會(huì)明顯影響快速殺滅，而添加100μM的FeCl3可明顯減弱殺滅。從以上發(fā)現(xiàn)可以得出若干結(jié)論。首先，由于PGS培養(yǎng)基可能是鐵限制的，添加鐵螯合劑對(duì)可利用的鐵的濃度沒有明顯影響。其次，在含鐵條件下殺滅的減弱表明，一小類參與秀麗新桿線蟲殺滅的因子的產(chǎn)生是鐵抑制的(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié))，或者在高鐵濃度下一種或幾種因子的活性被減弱(翻譯后調(diào)節(jié))。
溫度。通過讓野生型PA14的菌苔分別在20、25、30和37℃下生長(zhǎng)36小時(shí)試驗(yàn)生長(zhǎng)溫度對(duì)PGS培養(yǎng)基上快速殺滅的影響。在接種1日齡成體蠕蟲之后，將所有平板在25℃下培養(yǎng)。如圖8D所示，對(duì)于生長(zhǎng)在20、25、或30℃下的細(xì)菌來說未發(fā)現(xiàn)蠕蟲死亡率方面有明顯差別；不過，在以上三種溫度下生長(zhǎng)的PA14比在37℃下生長(zhǎng)的PA14明顯更有毒性。當(dāng)使用更易感L4期時(shí)，溫度的差別對(duì)死亡率的影響不明顯(數(shù)據(jù)未示出)。還報(bào)導(dǎo)了嗜水氣單胞菌在毒力方面的類似的提高。與在37℃下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在20℃下生長(zhǎng)對(duì)魚和小鼠的毒力更大，并表現(xiàn)出較高的胞外活性(Merino等(1992)感染與免疫604343-4349)。在銅綠假單胞菌菌株P(guān)A103中已知至少一種毒力因子是由溫度調(diào)節(jié)的。在用整合到PA103染色體的toxA基因座上的toxA-lacZ啟動(dòng)子融合體進(jìn)行的研究中，β-半乳糖苷酶的最大產(chǎn)量出現(xiàn)在25℃，并且隨著溫度的提高而降低(Vasil等(1989)分子微生物學(xué)3371-381)。不過，一般，尚有待于證實(shí)銅綠假單胞菌的特定毒力因子在20-30℃下的產(chǎn)量是否高于在37℃下的產(chǎn)量。對(duì)于秀麗新桿線蟲模型來說，在37℃下生長(zhǎng)的細(xì)胞的毒性降低的機(jī)制的闡明，可以提供令人困惑的事實(shí)的線索，盡管人類和其它最適體溫為37℃的哺乳動(dòng)物具有許多毒力因子，但銅綠假單胞菌仍然是一種機(jī)會(huì)感染者。
碳源。由許多致病性細(xì)菌表達(dá)的毒力決定子是由用于生長(zhǎng)的碳源控制的。在試驗(yàn)碳源對(duì)PA14毒力的影響時(shí)，通過用相同濃度的甘油(PYS)取代總的最終體積為1％的葡萄糖(PGS)改進(jìn)PGS培養(yǎng)基。如圖8E所示，當(dāng)PA14生長(zhǎng)在用葡萄糖(PGS)取代甘油(PYS)作為碳源的蛋白胨-山梨醇上時(shí)，PA14對(duì)秀麗新桿線蟲的快速殺滅更加有效。殺滅效力的差別并非由于在不同碳源上細(xì)菌生長(zhǎng)速度的不同造成的，因?yàn)樵趦煞N培養(yǎng)基條件下PA14生長(zhǎng)的同樣好(數(shù)據(jù)未顯示)。
盡管野生型PA14在葡萄糖培養(yǎng)基上的殺滅比在甘油培養(yǎng)基上的殺滅更有效，但在用甘油而不是用葡萄糖作為碳源的PYS上，在lasR基因上含有TnphoA插入片段的PA14突變型(菌株rpn7-lasR)能比其親代PA14更迅速地殺滅(圖8F)。在PGS上，菌株rpn7-lasR和野生型PA14之間的殺滅動(dòng)力學(xué)無(wú)法分辨。有趣的是，生長(zhǎng)在PYS上的rpn7-lasR表現(xiàn)出加強(qiáng)了的瓊脂藍(lán)-綠色素生成。我們?cè)赑YS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)rpn7-lasR和PA14，并證實(shí)了rpn7-lasR的綠膿素產(chǎn)量相對(duì)野生型PA14的3-5倍的提高。盡管我們不排除其它色素或化合物過量產(chǎn)生的可能性，這一結(jié)果建立了提高了的殺滅速度與提高了的綠膿素產(chǎn)量之間的關(guān)系。
參與PA14介導(dǎo)的快速殺滅的細(xì)菌因子所述快速殺滅以及某些蠕蟲甚至在直接接觸細(xì)菌之前死亡的發(fā)現(xiàn)促使我們?cè)囼?yàn)可擴(kuò)散的毒素是否在快速殺滅中起著重要作用。在與上述試驗(yàn)類似的條件下讓銅綠假單胞菌生長(zhǎng)在PGS瓊脂培養(yǎng)基上，所不同的是，生長(zhǎng)之后，將菌苔從瓊脂表面上刮掉，并通過讓其與氯仿蒸汽接觸殺死其余的細(xì)菌。在添加蠕蟲之前，通過在通風(fēng)櫥中對(duì)所述平板進(jìn)行1小時(shí)的通風(fēng)，除去殘留的氯仿。將大腸桿菌菌株DH5α用于控制對(duì)蠕蟲的處理效果。如圖9A所示，有或沒有活的PA14細(xì)菌的殺滅效力相同。氯仿處理對(duì)線蟲沒有不利影響，因?yàn)樵诼确绿幚淼腄H5α平板上蠕蟲無(wú)一死亡。通過用UV輻射殺滅PA14獲得了類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。以上結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)菌在PGS瓊脂上生長(zhǎng)一段時(shí)間之后，業(yè)已擴(kuò)散到瓊脂中的一種或幾種化合物足以支持快速殺滅。用生長(zhǎng)在慢速殺滅培養(yǎng)基NG瓊脂上的細(xì)菌進(jìn)行相同的氯仿試驗(yàn)，蠕蟲無(wú)一死亡。這表明可擴(kuò)散的毒素如果在NGM瓊脂中存在的話，其濃度是如此之低，以至于在慢速殺滅條件下對(duì)蠕蟲的殺滅沒有作用。
為了測(cè)定高溫是否能使決定快速殺滅的化合物失活，我們?cè)?5℃下對(duì)含有PA14菌苔的平板加熱30分鐘或60分鐘。如圖9B所示，在加熱過的平板或未加熱過的對(duì)照之間殺滅沒有明顯差別，這表明決定快速殺滅的主要因子的熱穩(wěn)定性較高。
為了進(jìn)一步支持所述假說，即可擴(kuò)散的毒素與快速殺滅有關(guān)，我們?cè)囼?yàn)了秀麗新桿線蟲P-糖蛋白突變型(株系NL130[pgp-1(pk17)；pgp-3(pk18)])對(duì)PA14介導(dǎo)的快速殺滅的易感性。P-糖蛋白屬于ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的進(jìn)化上的保守家族，并且被認(rèn)為能通過將外源毒素從細(xì)胞中有效排除而保護(hù)細(xì)胞免受外源毒素?fù)p傷(Higgins(1995)細(xì)胞82693-696)。株系NL130缺失了pgp-1和pgp-3基因，并且業(yè)已證實(shí)對(duì)細(xì)胞毒性劑秋水仙素和抗瘧/抗原生動(dòng)物劑氯喹更敏感(Broeks等(1995)EMBO雜志141858-1866)。NL130還對(duì)真菌毒素串珠鐮胞菌素B1更敏感。比較株系NL130的L4期蠕蟲對(duì)生長(zhǎng)在PGS瓊脂上的PA14的易感性和親代野生型株系N2的易感性。與此同時(shí)，我們還在慢速殺滅條件下試驗(yàn)了NL130和N2。如圖10A所示，與快速殺滅是由可擴(kuò)散的毒素介導(dǎo)的假說一致，在快速殺滅條件下，在接觸PA14四小時(shí)之后，70％的N2蠕蟲仍然存活，而只有不足5％的NL130蠕蟲存活。相反，在慢速殺滅條件下沒有發(fā)現(xiàn)NL130在易感性方面的明顯提高，而殺滅的機(jī)制似乎與細(xì)菌在蠕蟲腹腔的寄居和繁殖相關(guān)(如圖10B)。
藻酸鹽對(duì)于快速殺滅來說不重要如上文所述，PA14 degP突變型在其導(dǎo)致快速殺滅的能力方面受到明顯損傷。除了減弱的致病性表現(xiàn)型之外，由于胞外多糖藻酸鹽的過量產(chǎn)生，在PGS瓊脂上PA14 degP突變型明顯比野生型更粘。與粘性表型一致，UCBPP-PA14 degP基因的DNA測(cè)序以及由Boucher等在不同的銅綠假單胞菌菌株中進(jìn)行的獨(dú)立DNA序列分析(細(xì)菌學(xué)雜志178511-523，1996)證實(shí)了degP與其它4個(gè)業(yè)已證實(shí)為與藻酸鹽調(diào)節(jié)有關(guān)的基因?yàn)榫o密相關(guān)的一簇。為了解釋PA14 degP突變型的減弱的致病性表型是否是由于藻酸鹽的過量產(chǎn)生，構(gòu)建了PA14 degPalgD雙突變型，并在快速和慢速秀麗新桿線蟲殺滅條件下試驗(yàn)。algD基因編碼GDP甘露糖脫氫酶，這種酶能催化藻酸鹽生物合成的早期步驟(Deretic等(1987)核酸研究154567-4581；Lightfoot和J.L.(1993)分子微生物學(xué)8771-782)。通過讓algD框內(nèi)缺失與PA14上的野生型algD基因進(jìn)行標(biāo)志交換構(gòu)建菌株P(guān)A14algDΔ4。PA14algDΔ4在假單胞菌屬分離瓊脂(PIA)上不是粘性的，證實(shí)了藻酸鹽的缺乏(Yorgey和Ausubel，未發(fā)表)。如圖11A和11B所示，在快速和慢速殺滅試驗(yàn)中，PA14algDΔ4殺滅秀麗新桿線蟲的速度與野生型PA14相同，這表明快速或慢速殺滅都不需要藻酸鹽。而且，PA14algDD4雙突變?cè)诳焖俸吐贇缭囼?yàn)中與degP突變型具有相同的減弱的致病性表型，這表明degP有可能參與除了在藻酸鹽之外的其它毒力相關(guān)因子的調(diào)節(jié)。
除了以上數(shù)據(jù)之外，在快速殺滅試驗(yàn)中，兩種其它的PA14突變型toxA和plcS同樣無(wú)法與野生型區(qū)分(表5)。因此，溶血磷脂酶C(由plcS編碼)和外毒素A(由toxA編碼)也不是快速殺滅所必須的。
吩嗪造成的快速殺滅過程正如在下文的材料和方法部分所詳細(xì)講述的，我們進(jìn)行了一種篩選，以便分離PA14TnphoA轉(zhuǎn)座子插入突變型，該突變型在快速殺滅中是無(wú)效的。這導(dǎo)致了從篩選過的總共2400個(gè)菌株中鑒定到5個(gè)突變型(頻率為0.21％)，這些突變型表現(xiàn)出相對(duì)野生型PA14親代對(duì)照的減弱的快速殺滅表型。對(duì)這些以及若干其它PA14突變型進(jìn)行的分析表明，由PA14實(shí)現(xiàn)的快速殺滅是多因素的，這些因素之一屬于總體上被稱為吩嗪的一類色素。
業(yè)已克隆并測(cè)定了獲自800bp IPGR產(chǎn)物的DNA序列，該產(chǎn)物位于所述突變型之一3E8的TnphoA插入片段的3’末端。對(duì)所述DNA序列的初步分析表明，突變型3E8在一個(gè)phzB-樣基因中形成一個(gè)TnphoA插入片段；緊接著TnphoA插入片段下游的177bp的序列在核苷酸水平上表現(xiàn)出與phzB基因具有69％的同源性，phzB基因是參與密切相關(guān)的熒光假單胞菌菌株2-79(NRRLB-15132)中吩嗪生物合成的基因之一。銅綠假單胞菌也是一種吩嗪生產(chǎn)菌，并且由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鑒定得最清楚的吩嗪綠膿素業(yè)已被證實(shí)在動(dòng)物致病中起著重要作用(Sorensen和Joseph(1993)銅綠假單胞菌感染中的吩嗪色素。參見作為機(jī)會(huì)病原體的銅綠假單胞菌，Campa，Bendenelli和Friedman著(紐約Plenum出版社)，pp.43-57)。重要的是，在快速殺滅方面減弱了的PA14突變型3E8在綠膿素生產(chǎn)方面也是缺陷的，僅能合成50％的野生型水平(表VI)。
表VI菌株 突變基因 綠膿素a殺滅蠕蟲％b(PA14比例)PA14野生型 1.00 87PA14phnAphnB phnAphnB 0.50 503E8 phzB-樣0.50 1034B12 不知道 0.03 5049H2 不知道 0.11 0a綠膿素定量基于在酸性溶液中，在520nm下測(cè)定的吸收值(OD520)，根據(jù)Essar等1990年披露的方法(具體參見第2章方法)改進(jìn)而來。給出的值是在校正每毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)之后OD520讀數(shù)相對(duì)野生型PA14的比例；3次測(cè)定的平均值。b殺滅蠕蟲％是3次重復(fù)的平均值?？焖贇鐥l件詳細(xì)披露于所述方法中。
有關(guān)吩嗪參與快速殺滅過程的數(shù)據(jù)進(jìn)一步來自對(duì)另外兩種PA14TnphoA突變型34B12和49H2的分析。在篩選PA14突變型中分離到的PA14 TnphoA突變型34B12所能產(chǎn)生的綠膿素僅為野生型水平的3％，它在植物致病性方面減弱，并且在快速殺滅方面明顯受損(表V)。突變型34B12能在PGS培養(yǎng)基上形成特有無(wú)色素菌落。能產(chǎn)生野生型水平的11％的綠膿素的TnphoA突變型49H2是通過以下事實(shí)鑒定的它也能在萵苣上產(chǎn)生無(wú)色素的菌落并表現(xiàn)出減弱的癥狀。重要的是，49H2也能損害快速殺滅(表V)在接觸3E8、34B12、49H2和野生型PA14之后12小時(shí)死亡蠕蟲的平均百分比分別為10％、5％、0％和87％(表VI)。
為了進(jìn)一步證實(shí)綠膿素(以及其它吩嗪)在快速殺滅中起著重要作用的結(jié)論，構(gòu)建菌株P(guān)A14 phnAphnB，它具有一個(gè)插入共轉(zhuǎn)錄的phnA和phnB基因的重疊區(qū)的慶大霉素框。所述phnA和phnB基因編碼氨茴酸合酶的α和β亞基，這種酶是綠膿素合成所必需的(Essar(1990)細(xì)菌學(xué)雜志172884-900)。PA14phnAphnB能產(chǎn)生中等水平的綠膿素，并且也表現(xiàn)出中等快速殺滅表型(表VI)。
最后，還了解到磷酸缺陷能引發(fā)銅綠假單胞菌的綠膿素合成，而高濃度的磷酸能抑制綠膿素的產(chǎn)生(Ingledew和Campbell(1969)加拿大微生物學(xué)雜志15595-598)。因此，我們?cè)谟谢驔]有添加20mM磷酸(Pi)的PY瓊脂中試驗(yàn)了PA14快速殺滅。在兩種培養(yǎng)基中PA14的生長(zhǎng)速度沒有差別。與以前的報(bào)導(dǎo)一致，在含磷酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生較少的綠膿素，這相應(yīng)于快速殺滅的減弱；在16HPE，生長(zhǎng)在Pi-缺乏的培養(yǎng)基上的PA14的死亡率為62％，與此對(duì)應(yīng)的是在含Pi的培養(yǎng)基上的PA14的死亡率為24％(圖13A和13B)。對(duì)快速殺滅的宿主反應(yīng)對(duì)快速殺滅的抗性與對(duì)氧化脅迫的抗性相關(guān)我們業(yè)已用以前已知的對(duì)氧化脅迫有抗性或更易感的秀麗新桿線蟲突變體提供吩嗪是PA14介導(dǎo)的快速殺滅中的重要毒素的其它證據(jù)。諸如綠膿素和吩嗪-1-羧酸的某些吩嗪是氧化還原活性化合物。例如，在需氧條件下，綠膿素能自發(fā)進(jìn)行一個(gè)電子的還原和以復(fù)合單價(jià)還原的形式將O2再氧化成·O2-(超氧陰離子)(Hassan和Fridovich(1990)細(xì)菌學(xué)雜志1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)。因此，在有合適的還原源的條件下，綠膿素能在宿主組織中產(chǎn)生連續(xù)流通的細(xì)胞毒性·O2-和H2O2。在有鐵載體-鐵復(fù)合物高鐵綠膿菌螯鐵蛋白的條件下，這種類型的活性氧(ROS)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成毒性大的羥基基團(tuán)(Coffman等(1990)臨床研究雜志861030-1037；Britigan等(1992)臨床研究雜志902187-2196)。若干研究(Hassan和Fridovich(1980)細(xì)菌學(xué)雜志1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)但不是所有的研究(參見Baron等(1989)現(xiàn)代微生物學(xué)18223)業(yè)已表明，綠膿菌素通過其在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS形成的能力產(chǎn)生細(xì)胞毒性，與另一種超氧化物發(fā)生劑百草枯(甲基紫精)的細(xì)胞毒性作用屬于同類。
秀麗新桿線蟲的age-1(hx546)突變型因?yàn)槠溟L(zhǎng)的生命表型而首先得到鑒定(Johnson，1990，科學(xué)249908-912)，隨后證實(shí)其對(duì)H2O2有抗性，因?yàn)檫^氧化氫酶和超氧化物歧化酶的產(chǎn)量提高(Larsen(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908905-8909；Vanfleteren(1993)生物化學(xué)雜志292605-608)。業(yè)已鑒定了對(duì)甲基紫精高度敏感的突變型，其中包括mev-1和rad-8(Ishii等(1990)突變研究237165-171；Ishii等(1993)老化和發(fā)育機(jī)制681-10)。我們推測(cè)，如果銅綠假單胞菌快速殺滅是由綠膿素或其它氧化還原活性吩嗪介導(dǎo)的話，age-1突變型應(yīng)當(dāng)由于其對(duì)氧化脅迫耐受性的提高而具有抗性。如圖13A所示，age-1(hx546)對(duì)PA14的殺滅力的耐受性明顯高于其親代N2菌株。相反，甲基紫精敏感突變型mev-1(kn-1)和rad-8(mn163)對(duì)PA14殺滅高度敏感(圖13B)。以上結(jié)果證實(shí)，對(duì)銅綠假單胞菌的殺滅敏感的線蟲與抗產(chǎn)ROS化合物的線蟲高度相關(guān)?？焖贇缭囼?yàn)結(jié)果的概述銅綠假單胞菌具有給人以深刻印象的宿主范圍，并且在單一的宿主內(nèi)，它可以根據(jù)所感染的組織導(dǎo)致多種疾病。在人類中，銅綠假單胞菌可以感染燒傷或手術(shù)創(chuàng)口，尿道，胃腸道，呼吸道，眼，耳和腦膜(Baltch和Smith(1994)銅綠假單胞菌感染和治療。紐約MarcelDekker公司)。要在任何特定組織中表現(xiàn)疾病，需要許多不同的毒力決定子，不過不同組織類型之間的毒力因子的類型可以不同。例如，溶血磷脂酶C是導(dǎo)致燒傷的小鼠死亡的一個(gè)重要毒力因子(Rahme等(1995)科學(xué)2681899-1902)，但并不是小鼠中角膜感染所必需的(Preston等(1995)感染與免疫633497-3501)。分析不同的細(xì)菌突變體，表明銅綠假單胞菌對(duì)秀麗新桿線蟲的殺滅也是多因素的?？焖贇缢枰蜃拥谋磉_(dá)似乎是由鐵、碳源、溫度和滲透壓調(diào)控的。
對(duì)于快速殺滅來說，上述數(shù)據(jù)表明，至少某些毒力決定子是熱穩(wěn)定性的可擴(kuò)散毒素。不過，通過試驗(yàn)PA14的同基因toxA、plcS和algD突變型，證實(shí)了兩種已知毒素溶血磷脂酶C和外毒素A以及胞外多糖藻酸鹽在快速殺滅條件下并不是殺滅蠕蟲所必需的。另外，由于證實(shí)了lasR上攜帶突變的菌株在快速殺滅條件下仍然具有充分的毒力(所述基因是胞外毒力表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子)，這表明堿性蛋白酶(Jambello等(1993)感染與免疫611180-4)，溶葡萄球菌蛋白酶(Toder等(1991)分子微生物學(xué)52003-10)和彈性蛋白酶(Jambello和Iglewski(1991)細(xì)菌學(xué)雜志1733000-9)對(duì)于快速殺滅來說也不是必需的，以上酶是由lasR正調(diào)控的。另外，已證實(shí)通過在65℃下加熱60分鐘，使用氯仿，或通過UV輻射都不能使所述毒力因子失活，這表明與小的非蛋白類分子相關(guān)。吩嗪參與快速殺滅的證據(jù)上述結(jié)果表明，參與快速殺滅的毒素之一是吩嗪。所述結(jié)果如下。
PA14突變體影響綠膿素產(chǎn)生。分析在快速殺滅方面減弱了的突變型之一菌株3E8，證實(shí)在phzB-樣基因的中間插入了一個(gè)TnphoA。所述phzB基因被認(rèn)為編碼一種在銅綠假單胞菌菌株2-79中參與吩嗪生物合成的酶。與此一致，我們證實(shí)了在菌株3E8的phzB-樣基因中插入TnphoA會(huì)導(dǎo)致綠膿素產(chǎn)量降低50％，綠膿素是在銅綠假單胞菌中鑒定得最清楚的吩嗪。類似地，將TnphoA插入菌株34B12上的一個(gè)不連鎖的基因上，可同時(shí)導(dǎo)致快速殺滅的減弱，和綠膿素產(chǎn)量的明顯降低。還在菌株49H2上證實(shí)了綠膿素缺陷和快速殺滅減弱之間的關(guān)系；不過，尚未排除在49H2上發(fā)生的突變是與34B12或3E8中的突變等位的可能性。
磷酸鹽影響綠膿素生產(chǎn)和快速殺滅。除了證實(shí)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的高濃度磷酸鹽可抑制綠膿素產(chǎn)生之外，還證實(shí)了在含磷酸鹽的培養(yǎng)基中快速殺滅相對(duì)磷酸鹽限制培養(yǎng)基的減弱。
毒素的熱穩(wěn)定性。快速殺滅所需要的可擴(kuò)散化合物是熱穩(wěn)定的并且不能被氯仿或UV失活這一事實(shí)與所述毒素是一種吩嗪成分或具有一種吩嗪成分的結(jié)論一致。吩嗪是耐熱的(Dakhama等(1993)應(yīng)用藻類學(xué)雜志5297-306)。
秀麗新桿線蟲突變型。綠膿素被認(rèn)為能通過誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生而導(dǎo)致細(xì)胞毒性(Hassan和Fridovich(1980)細(xì)菌學(xué)雜志1411556-163；Hassett等(1992)感染與免疫60328-336)。如上文所述，蠕蟲突變型age-1(hx546)對(duì)超氧化物發(fā)生劑百草枯的抗性更強(qiáng)，同樣它對(duì)由PA14導(dǎo)致的快速殺滅的抗性也更強(qiáng)。相反，在不連鎖的秀麗新桿線蟲基因mev-1(kn-1)或rad-8(mn163)上發(fā)生的突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)百草枯的敏感性加強(qiáng)(Ishii等(1990)突變研究237165-171；Ishii等(1993)老化和發(fā)育的機(jī)制681-10)，并能增強(qiáng)PA14快速殺滅。除綠膿素之外的吩嗪在快速殺滅中的作用總而言之，以上歸納的結(jié)果提供了令人信服的證據(jù)，即至少一種吩嗪綠膿素在快速殺滅中起著重要作用。不過，綠膿素是在銅綠假單胞菌中吩嗪生物合成的最終產(chǎn)物(Byng等(1979)細(xì)菌學(xué)雜志138846-852)。除了綠膿素之外，由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的其它吩嗪有氧氯菌素、吩嗪-1-羧酸、氯菌素、1-羥基吩嗪、和膿玉紅素(或銅綠菌素A和B)(Turner和Messenger(1986)微生物生理學(xué)進(jìn)展27211-273)。業(yè)已報(bào)導(dǎo)多種銅綠假單胞菌的菌株能產(chǎn)生一種以上的吩嗪(Byng等(1979)細(xì)菌學(xué)雜志138846-852)，并且所產(chǎn)生的相對(duì)數(shù)量受生長(zhǎng)條件的影響(Chang和Blackwood(1969)加拿大細(xì)菌學(xué)雜志15439-444)。由于在上述所有試驗(yàn)中都未能測(cè)定由PA14產(chǎn)生的其它吩嗪和其數(shù)量，其它吩嗪獨(dú)立或與綠膿素一起參與蠕蟲殺滅是可能的。另外，對(duì)綠膿素的所有測(cè)定都是在KA培養(yǎng)基中進(jìn)行的，但用于殺滅蠕蟲的培養(yǎng)基是PGS。由于所產(chǎn)生的綠膿素和其它吩嗪的數(shù)量是受多種因素影響的，培養(yǎng)基的變化有可能導(dǎo)致以上結(jié)果。
對(duì)于秀麗新桿線蟲來說其它吩嗪可能也是重要的。首先，如上文所述，除了綠膿素之外銅綠假單胞菌能產(chǎn)生其它吩嗪。前面已經(jīng)證實(shí)，在快速殺滅條件下，銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO1的毒力顯著低于PA14，但它所產(chǎn)生的綠膿素和膿玉紅素的量與PA14類似。由于已知銅綠假單胞菌能產(chǎn)生幾種其它吩嗪，如吩嗪-1羧酸和1-羥基吩嗪，PA01的減弱了的毒性可能是由于缺少或具有較少量的其它吩嗪。另外，證實(shí)熒光假單胞菌菌株2-79和WCS365能殺滅秀麗新桿線蟲，但這些菌株不能產(chǎn)生綠膿素。這些菌株是抗鐮孢屬枯萎病和小麥全蝕病(分別由尖鐮孢(S.oxysporum F.sp.lini)和禾頂囊鞘小麥變種(Gaeumannomyces graminis var.tritici))的有效生物控制劑。熒光假單胞菌菌株2-79作為生物控制劑的效果是由于所述吩嗪抗生素吩嗪-1羧酸(Thomashaw和Weller(1988)細(xì)菌學(xué)雜志1703499-3508)，它是由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的吩嗪之一。有趣的是，吩嗪-1羧酸與綠膿素一樣也具有氧化還原循環(huán)能力(Turner和Messenger(1986)微生物生理學(xué)進(jìn)展27211-273)，并因此可能對(duì)于針對(duì)秀麗新桿線蟲的細(xì)胞毒性有重要作用。
秀麗新桿線蟲和細(xì)菌之間的相互作用是拮抗型的。由于秀麗新桿線蟲使用細(xì)菌作為食物，某些細(xì)菌種進(jìn)化出保護(hù)自身免受該捕食者捕食的機(jī)制并不令人吃驚。上述結(jié)果表明，一般來講吩嗪，具體地講綠膿素是被銅綠假單胞菌用于對(duì)付秀麗新桿線蟲的某些可擴(kuò)散的毒素。吩嗪作為化學(xué)武器的形成可能進(jìn)化的更早一些，以便對(duì)付其它微生物和對(duì)付諸如變形蟲的原生動(dòng)物。綠膿素的抗微生物作用可能還有助于消除其天然環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)性微生物(Hassan和Fridovich(1980)細(xì)菌學(xué)雜志1411556-163)。由產(chǎn)生吩嗪所獲得的選擇性優(yōu)勢(shì)是如此之大，以至于在某些種中以犧牲生長(zhǎng)為代價(jià)而得以保持。例如，與其非生產(chǎn)突變型相比，生產(chǎn)吩嗪的吩嗪假單胞菌能形成較小的菌落和較低的最大細(xì)胞密度(但不具有較低的生長(zhǎng)速度)。另外，在營(yíng)養(yǎng)限制環(huán)境中，非生產(chǎn)突變型與其生產(chǎn)親本相比具有更大的存活率。而且，當(dāng)它們生長(zhǎng)在一起時(shí)，所述生產(chǎn)親本競(jìng)爭(zhēng)不過其非生產(chǎn)突變型(Messenger和Turner(1981)社會(huì)遺傳微生物學(xué)季刊82263-264)，并且推而廣之，也競(jìng)爭(zhēng)不過其它種的其它非生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)者。使用能產(chǎn)生綠膿素和其它吩嗪的銅綠假單胞菌菌株所作的若干研究證實(shí)了吞食了所述細(xì)菌的變形蟲要么包囊化要么死亡。在某些情況下，所述吩嗪細(xì)菌不被吞食(Singh(1945)不列顛試驗(yàn)病理學(xué)雜志46316-325；Groscop和Brent(1964)加拿大微生物學(xué)雜志10579-584)。通過本文所披露的結(jié)果，即殺線蟲作用需要吩嗪還表明由熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的吩嗪可能有助于抗細(xì)菌采食線蟲的存活。有可能一種次級(jí)代謝物最初是為了對(duì)付簡(jiǎn)單的真核生物生存而發(fā)明的，隨后支配著進(jìn)化過程，以保護(hù)銅綠假單胞菌免受諸如秀麗新桿線蟲的細(xì)菌采食線蟲的侵害并在哺乳動(dòng)物感染期間避免吞食細(xì)胞的侵害。事實(shí)上綠膿素缺陷突變型49H2、34B12和3E8在小鼠燒傷感染模型中的致病性也被減弱。材料和方法菌株和質(zhì)粒。所使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列于表VII
表VII菌株或質(zhì)粒相關(guān)特征 來源或參考文獻(xiàn)銅綠假單胞菌PA14 Rifr野生型Rahme等，1995PAO1-R野生型 Rahme等，1995PAO1-G野生型 J.GoldbergPAO1-V野生型 M.PrestonPAO1-I野生型 M.PrestonPAO1-J野生型 K.JargerPAK 野生型 S.LoryPA29 野生型 Rahme等，1995PO37 野生型 Stevens等，1994PA14toxA PA14的GmrtoxA插入突變型 Rahme等，1995PA14plcS PA14的GmrplcS插入突變型 Rahme等，1995PA14gacA PA14的GmrgacA插入突變型 Rahme等，1995PA14degP PA14的GmrdegP插入突變型 本研究PA14algDΔ4 PA14的algD框內(nèi)缺陷突變型 本研究PA14degPalgDΔ4 PA14的algD框內(nèi)缺失和degP 本研究插入雙突變型PA14phnAphnB Kmr，PA14的氨茴酸合酶突變 L.Rahme熒光假單胞菌 型2-79(NRRL E.SchottB15132) Phz+野生型55E.SchottWCS365野生型 G.O’Toole丁香假單胞菌斑生致野生型 Davis等，1991病變種ES4326 Smr野生型線蟲菌株和培養(yǎng)條件。在以大腸桿菌OP50作為食物來源的NG瓊脂上保持并處理菌株(Sulston和Hodgkin(1988)方法。參見線蟲秀麗新桿線蟲，Wood著(冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，pp.587-606；Lewis和Fleming(1995)基本培養(yǎng)方法。參見秀麗新桿線蟲生物的現(xiàn)代生物學(xué)分析，48卷，Epstein和Shakes著(圣迭戈，加州學(xué)術(shù)出版社)，pp.4-31)。遺傳命名按照由Horvitz等所披露的原則進(jìn)行(分子和普通遺傳學(xué)175129-133，1979)。本發(fā)明所使用的Bristol線蟲株系包括野生型株系N2(Brenner(1974)遺傳學(xué)7771-94)和以下株系TJ1052，age-1(hx546)II；TK22，mev-1(kn1)III；PH13，rad-8(mn163)I。以上株系是由Caenolhabditis遺傳學(xué)中心提供的。
培養(yǎng)基和抗生素。用于細(xì)菌培養(yǎng)和保持的完全培養(yǎng)基有Luria培養(yǎng)液(LB)和King’s培養(yǎng)液(KB)(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志44301-307；Miller，1972，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室))，而基本培養(yǎng)基是M9(Miller(1972)分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室))。假單胞菌分離瓊脂(PIA)獲自Difco。所述NGM培養(yǎng)基是由Sulston和Hodgkin披露的(1988，線蟲秀麗新桿線蟲方法，Wood著(冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，pp.587-606)。除非另有說明，蛋白胨-山梨醇(PGS)是用于快速殺滅的培養(yǎng)基；它包括1％的細(xì)菌用蛋白胨(Difco)，1％氯化鈉，1％的葡萄糖，0.15M山梨醇(Fischer Scientific)和1.7％的細(xì)菌用瓊脂(Difco)。用于銅綠假單胞菌PA14的抗生素濃度為利福平100μg/ml，新霉素200μg/ml，和羧芐青霉素300μg/ml。
線蟲殺滅試驗(yàn)。在平板試驗(yàn)中進(jìn)行銅綠假單胞菌殺滅蠕蟲。對(duì)于快速殺滅試驗(yàn)來說，將5μl PA14或試驗(yàn)菌株的過夜King’s B(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志301-307)培養(yǎng)物展開在含有PGS或PG瓊脂的3.5cm直徑的平板上。在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)之后，在所述平板的中央長(zhǎng)出大約2cm直徑的菌苔。冷卻至室溫(在從37℃的培養(yǎng)箱中取出之后4-12小時(shí))，然后將40個(gè)蠕蟲加入所述瓊脂中。除非另有說明，所有蠕蟲菌株是在20℃下培養(yǎng)的，并使用第四幼蟲(L4)期。每個(gè)菌株進(jìn)行3-4次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。將Bristol N2用作野生型菌株，并將大腸桿菌OP50用作負(fù)對(duì)照。在25℃培養(yǎng)接種了蠕蟲的平板。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上統(tǒng)計(jì)蠕蟲的死亡率。在用睫毛針輕輕觸動(dòng)蠕蟲時(shí)不再有可檢測(cè)的運(yùn)動(dòng)，即視為死亡。大體上按上述方法進(jìn)行慢速殺滅試驗(yàn)。影響殺滅的因素。
A.滲透壓的影響。將PA14的過夜培養(yǎng)物鋪平板于含有蛋白胨-葡萄糖(PG)培養(yǎng)基的瓊脂平板上或含有添加了0.1M和0.15M山梨醇(Fisher)的高滲透壓PG培養(yǎng)基上。
B.鐵的影響。對(duì)于鐵限制條件來說，將400μM EDDA(Ankenbauer等(1986)細(xì)菌學(xué)雜志1677-11)添加到PGS中，以便螯合仍然可以利用的游離鐵，而在含鐵條件下將100μM的三氯化鐵(Meyer等(1996)感染與免疫64518-523)作為鐵添加劑添加。用PGS作為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。
C.生長(zhǎng)溫度的影響。將PA14的過夜培養(yǎng)物鋪平板于PGS瓊脂上，并在20、25、30和37℃下生長(zhǎng)36小時(shí)，在接種蠕蟲之后將所有平板放置在25℃下。
D.碳源的影響。PGS含有1％葡萄糖(v/v)。僅僅用1％(v/v)的甘油取代該培養(yǎng)基中的葡萄糖成分，以形成蛋白胨-甘油-山梨醇瓊脂(PYS)。
篩選在快速殺滅中無(wú)效的PA14TnphoA突變型。在大腸桿菌菌株SM101pri中用寬宿主范圍羧芐青霉素抗性(Cbr)自殺載體pRT733(Taylor(1989)細(xì)菌學(xué)雜志1711870-1878)制備兩個(gè)獨(dú)立的PA14TnphoA突變型文庫(kù)，所述載體攜帶TnphoA(它能產(chǎn)生新霉素抗性，Nmr)。利用該菌株將TnphoA轉(zhuǎn)移到PA14中。在KB培養(yǎng)基上進(jìn)行接合(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志301-307)，得到高于LB培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)接合頻率。為了試驗(yàn)候選突變型，使用類似于快速殺滅試驗(yàn)的條件，但以下不同。將單一的PA14TnphoA突變型克隆鋪平板，并向每一個(gè)平板上添加5只L4蠕蟲。將野生型PA14用作正對(duì)照。在24小時(shí)之后仍然含有3-5個(gè)存活蠕蟲的突變型被確定為推測(cè)的減弱突變型，并進(jìn)行上文所述的快速殺滅試驗(yàn)。選擇一致地得到明顯低于野生型親代PA14的殺滅力的突變株用于進(jìn)一步的鑒定。線蟲快速殺滅試驗(yàn)的使用線蟲快速殺滅試驗(yàn)與慢速殺滅試驗(yàn)一樣被用于鑒定導(dǎo)致疾病的微生物毒力因子。另外，所述試驗(yàn)可用于鑒定能夠抑制致病性或增強(qiáng)生物對(duì)病原體的抵抗能力的治療劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，快速殺滅試驗(yàn)是用一種對(duì)諸如秋水仙素的毒素的化合物具有較大滲透性的線蟲菌株進(jìn)行的。具有這種增強(qiáng)的滲透性的線蟲的例子包括，但不限于在P-糖蛋白上具有突變的動(dòng)物，例如PGP-1，PGP-3或MRP-1。所述突變型線蟲可用于快速殺滅試驗(yàn)，因?yàn)槠渚哂袑?duì)毒素的較高的敏感性，這種敏感性是由于膜滲透性的提高所致。這一特點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致一種在對(duì)毒性化合物的完全易感性和完全抗性之間的差別提高的試驗(yàn)。
在一種工作實(shí)施例中，利用一種F2誘變篩選鑒定在秀麗新桿線蟲基因中的突變，該突變能產(chǎn)生對(duì)快速殺滅的抗性。通過篩選大約5000個(gè)單倍體基因組鑒定了6個(gè)突變型。所述突變體不僅可用于提供有關(guān)快速殺滅的機(jī)制的信息，還可用于提供有關(guān)秀麗新桿線蟲免疫的信息。
用于鑒定致病性毒力因子的其它宿主蠟螟(Greater Wax Moth)我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)蠟螟(Greater Wax Moth)的幼蟲也可用于鑒定代表性生物銅綠假單胞菌和尖鐮孢的致病毒力因子，用于單獨(dú)使用或與上述篩選試驗(yàn)的任一種組合進(jìn)行。銅綠假單胞菌為了測(cè)定銅綠假單胞菌在蠟螟上的致病性，按如下方法將細(xì)菌注射到蠟螟幼蟲體內(nèi)，讓銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物在KB培養(yǎng)基(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志301-307)上生長(zhǎng)過夜。然后以1100的比例將該培養(yǎng)物稀釋在相同培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)。在生長(zhǎng)2小時(shí)之后，通過離心收集培養(yǎng)物，并將細(xì)胞重新懸浮在等體積的10mM硫酸鎂中。然后將每一種培養(yǎng)物稀釋到OD600為0.1(大約108細(xì)胞/ml)。用Hamilton注射器將5μl體積的一系列10倍稀釋液(100-10-6)注射到蠟螟的腹部側(cè)足之一中(Lysenko(1963)昆蟲病理學(xué)雜志578-82)。通過按照標(biāo)準(zhǔn)方法鋪平板測(cè)定細(xì)菌數(shù)。蠟螟幼蟲購(gòu)自Van derHorst Wholesale，St.May’s，OH。
在注射細(xì)菌之后，將蠟螟幼蟲放置在培養(yǎng)皿中并在25℃下培養(yǎng)。48小時(shí)之后通過監(jiān)測(cè)每一個(gè)幼蟲的顏色變化(由白變黑)，并通過確定幼蟲活動(dòng)性目測(cè)確定殺滅率。每一個(gè)不運(yùn)動(dòng)的黑色幼蟲被統(tǒng)計(jì)為死亡。48小時(shí)之后仍然活著的幼蟲一般不會(huì)死亡，即使延長(zhǎng)試驗(yàn)時(shí)間也是如此。
為了測(cè)定LD50，用一系列細(xì)菌稀釋液注射10條幼蟲。測(cè)定幼蟲死亡數(shù)，并將測(cè)得的數(shù)據(jù)繪制在一條曲線上(殺滅幼蟲百分比與注射的細(xì)菌數(shù)量)。用Systat 5.2版計(jì)算機(jī)程序?qū)⑺鰯?shù)據(jù)代入下列形式的曲線殺滅百分比＝A+(1-A)/(1+exp(B-G×log(細(xì)菌數(shù)量)))，其中A是采用對(duì)照注射的幼蟲死亡分?jǐn)?shù)，而B和G是為了適應(yīng)所述曲線而變化的參數(shù)(Systat 5.2版，用于Macintosh計(jì)算機(jī)，Systat公司，1992，Evanston，Illinois)。使用該程序利用計(jì)算機(jī)計(jì)算的推導(dǎo)最佳適合度確定B和G，然后用以下公式計(jì)算LD50LD50＝exp(B/G)×(1-2×A)^(1/G)。
我們業(yè)已將突變型銅綠假單胞菌(是用上述植物和線蟲篩選分離的，或者是用預(yù)先克隆的基因構(gòu)建的)注射到蠟螟幼蟲體內(nèi)，并計(jì)算了LD50值。所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表VIII(見下文)中給出，該表比較了蠟螟中的LD50值，以及兩種不同的細(xì)菌濃度對(duì)小鼠的殺滅百分比。
表VIII銅綠假單胞菌在蠟螟中的LD50PA14菌株蠟螟中的LD50在所述劑量下的小鼠死亡率％突變型來源5×1035×105PA141 53 100野生型41A51 NT1100秀麗新桿線蟲41C11 NT 85 秀麗新桿線蟲35A91 NT 55 秀麗新桿線蟲16G12 2 20 100植物篩選34H42 0 33 植物篩選toxA2 40 NT 構(gòu)建34B12 3 0 56 植物篩選lasR4 NT 50 秀麗新桿線蟲49H28 NT 50 秀麗新桿線蟲3E8 10 NT 6 秀麗新桿線蟲25A12 10 11 87 植物篩選degP10 0 63 構(gòu)建35H710 NT NT 秀麗新桿線蟲36A420 NT NT 秀麗新桿線蟲ID7(gacA) 20 0 50 植物篩選23A230 NT NT 秀麗新桿線蟲33A940 0 0 植物篩選13C980 NT NT 秀麗新桿線蟲gacA100 0 50 秀麗新桿線蟲44B1500 NT 70 秀麗新桿線蟲50E12 600 NT NT 植物篩選33C72,000 0 0 植物篩選25F12,000 0 20 植物篩選dsbA6,000 0 62 植物篩選pho23 50,000 0 10 植物篩選1NT-未測(cè)定表VIII中所示的結(jié)果揭示了在較高的蠟螟LD50和小鼠模型系統(tǒng)的較低殺滅力方面存在著明顯相關(guān)性。
觀察到的銅綠假單胞菌在蠟螟和小鼠上的毒力之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性表明，通過篩選在蠟螟中具有減弱的LD50的細(xì)菌分離物可以鑒定哺乳動(dòng)物毒力決定子，這種篩選可以由銅綠假單胞菌擴(kuò)展到包括其它在昆蟲和哺乳動(dòng)物中有毒性的病原體。兩種可能的候選病原體是沙雷氏菌屬和變形桿菌屬的細(xì)菌，它們不僅是醫(yī)院感染的重要原因，而且還是蠟螟的高效病原體(Chadwick(1967)FederationProceedints261675-1679)。在粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的臨床提取物中，在對(duì)人上皮細(xì)胞粘附的降低和在蠟螟中的LD50提高之間存在著相關(guān)(Chadwick等(1990)非脊椎動(dòng)物病理學(xué)雜志55133-134)。
與上文所述的線蟲和植物篩選系統(tǒng)相似，可將蠟螟幼蟲篩選系統(tǒng)用于鑒定銅綠假單胞菌的毒力因子，該因子是感染哺乳動(dòng)物所必需的。在一種工作實(shí)施例中，用上述注射方法鑒定了在蠟螟中具有減弱的毒力的銅綠假單胞菌突變型分離物。按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備了具有減弱的毒力的突變型細(xì)菌的文庫(kù)，然后將突變型分離物的培養(yǎng)物稀釋到在5μl體積中含有100-1000個(gè)細(xì)菌。然后將該體積的細(xì)菌注射到蠟螟幼蟲體內(nèi)。如果特定突變型分離物在該濃度下不能殺滅蠟螟，再進(jìn)行其它注射，以確定所述突變型菌株蠟螟中的LD50。在所述昆蟲模型系統(tǒng)中具有減弱的毒力的細(xì)菌分離物被用作進(jìn)一步研究的候選物，以便鑒定銅綠假單胞菌的哺乳動(dòng)物毒力因子。
還可將蠟蛾篩選系統(tǒng)用于其它能感染昆蟲和哺乳動(dòng)物的病原體。例如，在蠟螟中測(cè)定一種特定病原體的野生形式的LD50。然后將該病原體的誘變分離物以明顯高于其野生型分離物的LD50的濃度注射。在較高劑量下不能殺滅的突變型是鑒定病原體毒力因子的候選者。尖鐮孢將蠟螟幼蟲用作銅綠假單胞菌感染模型的成功促使我們又試驗(yàn)了真菌尖鐮孢在該系統(tǒng)中的感染性。
按如下方法測(cè)定尖鐮孢在蠟螟上的致病性。將單一的尖鐮孢孢子用于按照標(biāo)準(zhǔn)方法在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上(Difco)上開始尖鐮孢的培養(yǎng)。用2ml Armstrong鐮孢屬培養(yǎng)基(Armstrong和Armstrong(1948)植物病理學(xué)38808-826)洗滌所述平板的表面，并將這2ml培養(yǎng)基與25ml其它相同培養(yǎng)基一起加入小的燒瓶中。在室溫下培養(yǎng)2天之后，形成了尖鐮孢的渾濁孢子培養(yǎng)物，并將其用于注射實(shí)驗(yàn)。在離心機(jī)中沉淀該孢子培養(yǎng)物的樣品，然后將孢子重新懸浮在含有5mg/ml羧芐青霉素的10mM硫酸鎂中。添加羧芐青霉素是為了使蠟螟在感染尖鐮孢之前因?yàn)榧?xì)菌感染而死亡。用相同培養(yǎng)基制備所述孢子培養(yǎng)物的10倍系列稀釋液，并用Hamilton注射器將該稀釋液的5μl樣品(100，10-1，10-2，和10-3)注射到蠟螟體內(nèi)。用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定每一種稀釋液中的孢子數(shù)，例如，通過將所述稀釋液系列的一個(gè)等分試樣鋪平板于Armstrong鐮孢屬培養(yǎng)基上，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)孢子的數(shù)量。作為對(duì)照，將含有5mg/ml羧芐青霉素的10mM硫酸鎂同樣注射到另一組幼蟲體內(nèi)。將注射的幼蟲放置在培養(yǎng)皿中(每個(gè)培養(yǎng)皿10條)。在25℃下放置7天之后，統(tǒng)計(jì)死亡幼蟲。死亡的幼蟲其顏色變黑，并且通常具有模糊的白色真菌包衣。
通過用Systat程序?qū)⒂紫x殺滅數(shù)據(jù)的曲線代入上述公式計(jì)算尖鐮孢在蠟螟中的LD50。將兩個(gè)獨(dú)立注射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于下面的表IX中，并將典型的殺滅曲線示于圖14中。將所述Systat計(jì)算機(jī)程序用于使一個(gè)曲線適合所述數(shù)據(jù)點(diǎn)，如上文所述(其中b＝4.51，g＝1.11)，并計(jì)算得到尖鐮孢在蠟螟中的LD50為60個(gè)孢子。
表IX注射的孢子數(shù)殺滅幼蟲(占20條中的比例)170020(100％)170 13(650％)17 2(10％)1.7 1(5％)0 0(0％)180020(100％)180 18(90％)18 6(30％)1.8 2(10％)0 0(0％)在以上實(shí)驗(yàn)中所測(cè)定的尖鐮孢在蠟螟中的LD50(大約為60個(gè)孢子)表明，該系統(tǒng)可用于為了鑒定尖鐮孢毒力因子而設(shè)計(jì)的篩選中。在一種工作實(shí)施例中，通過用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的限制酶介導(dǎo)的整合(REMI)誘變尖鐮孢(Kuspa和Loomis(1994)遺傳學(xué)138665-674；Tang等(1992)分子微生物學(xué)61663-1671，1992；Lu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9112649-12653，1994；和Bolker(1995)分子基因遺傳學(xué)248547-552)。然后通過注射到蠟螟幼蟲體內(nèi)篩選用上述方式誘變的真菌文庫(kù)的減弱的毒力，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定影響毒力的真菌基因，例如通過用插入的DNA進(jìn)行反向PCR，然后再對(duì)相鄰的真菌DNA進(jìn)行測(cè)序。然后試驗(yàn)在蠟螟中具有減弱的毒力的尖鐮孢在植物和高等動(dòng)物中的減弱的毒力，并鑒定共同的毒力因子。用蠟螟作為篩選系統(tǒng)可以較快速地并且花費(fèi)較少地鑒定重要的真菌毒力因子。蠟螟篩選系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)將蠟螟用作鑒定銅綠假單胞菌、尖鐮孢、和其它病原體的哺乳動(dòng)物毒力因子的宿主系統(tǒng)是有利的，如上文所述，該系統(tǒng)所具有的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是可以快速并低投入地篩選出突變型病原體分離物。在各種實(shí)驗(yàn)中，每小時(shí)為多達(dá)250個(gè)蠟螟注射銅綠假單胞菌樣品。這種快速處理使得有可能在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)大量的突變型病原體。另外，還有可能用蠟螟測(cè)定一種病原體的LD50。這種測(cè)定有利于評(píng)價(jià)不同病原體分離物的相對(duì)毒力。在另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)中，銅綠假單胞菌對(duì)小鼠的殺滅表現(xiàn)出在蠟螟中與毒力的相關(guān)性好于使用過的其它模型生物。因此，用該系統(tǒng)篩選病原體突變體很有可能鑒定哺乳動(dòng)物(例如人)毒力決定子。最后，使用蠟螟有可能鑒定不存在于其它多宿主篩選中的毒力因子。
菜蛾(Plutella xylostella)我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)菜蛾的幼蟲可用于鑒定銅綠假單胞菌的致病性毒力因子。
利用幼蟲芥菜綠色采食試驗(yàn)測(cè)定銅綠假單胞菌對(duì)菜蛾的致病性。按如下方法用由銅綠假單胞菌滲透過的芥菜葉喂飼菜蛾幼蟲。在King’s B培養(yǎng)基(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志301-307)中培養(yǎng)銅綠假單胞菌。在離心機(jī)中沉淀過夜培養(yǎng)物，然后用10mM硫酸鎂洗滌2次，然后將細(xì)胞重新懸浮在10mM硫酸鎂中，并稀釋至OD600為0.1。按照標(biāo)準(zhǔn)方法將菜蛾幼蟲保持在半合成小麥胚乳基食物上(Shelton等(1991)環(huán)境科學(xué)雜志2617-26)。
將綠色芥菜(獲自劍橋天然食品，劍橋MA)切成大約10cm2的碎片，并浸泡在含有銅綠假單胞菌的10mM硫酸鎂中。將浸泡過的葉片放在真空下，并突然解除真空，以使細(xì)菌溶液滲透到葉片中。作為對(duì)照，僅用10mM硫酸鎂滲透葉片。在培養(yǎng)皿中將滲透過的葉片材料與20個(gè)菜蛾幼蟲一起在23℃下培養(yǎng)，讓這些幼蟲自由采食。48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)死亡的幼蟲。在用移液管頭觸動(dòng)之后不再活動(dòng)的幼蟲被統(tǒng)計(jì)為死亡。
野生型銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14和PA01導(dǎo)致的死亡率接近100％殺滅菜蛾幼蟲。不過，PA14的三種突變型分離物表現(xiàn)出大大減弱了的殺滅力。這些結(jié)果表明(1)銅綠假單胞菌在由昆蟲幼蟲攝取之后是殺滅性的，(2)在該模型系統(tǒng)中銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14的突變型分離物具有減弱的毒力。在下面的表X中給出了以上結(jié)果的總結(jié)(將下文)。
表X菌株N 48小時(shí)死亡幼蟲數(shù)PA1480 79(99％)PAO180 76(95％)PA14 dsbA 40 10(25％)PA14 pho23 40 3(8％)PA14 lasR 40 8(20％)MgSO4對(duì)照 80 2(3％)黑尾果蠅在另一種實(shí)施方案中，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)黑尾果蠅可用于評(píng)價(jià)銅綠假單胞菌的致病性。
用以下腹部穿刺試驗(yàn)測(cè)定銅綠假單胞菌在黑尾果蠅上的致病性。在標(biāo)準(zhǔn)條件下在玉米粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)黑尾果蠅原種OregonR或標(biāo)記株黃白(yw)株。之所以試驗(yàn)兩種不同的遺傳背景，是因?yàn)闃I(yè)已證實(shí)某些株系對(duì)細(xì)菌攻擊更敏感(Lemaitre等(1996)細(xì)胞86973-983)。讓銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14和對(duì)照大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)物在King’s B培養(yǎng)基(King等(1954)實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志301-307)中生長(zhǎng)過夜。在培養(yǎng)過夜之后，以1/10的比例稀釋所述細(xì)胞，并再生長(zhǎng)4-5小時(shí)。然后將所述細(xì)胞洗滌2次，重新懸浮在蒸餾水中，并用于以以下4種濃度進(jìn)行腹部穿刺未稀釋，稀釋1/10，濃縮10倍，以及濃縮100倍。
用浸泡在不同濃度的PA14或DH5α中的細(xì)針穿刺麻醉過的成體果蠅的腹部，進(jìn)行細(xì)菌接種。在細(xì)菌接種之后，將果蠅放置在28℃下，并通過運(yùn)動(dòng)的缺乏監(jiān)測(cè)果蠅的死亡。用每一種濃度的細(xì)菌試驗(yàn)18-20只果蠅，并計(jì)算果蠅死亡的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。我們發(fā)現(xiàn)PA14能以劑量依賴方式有效殺滅黑尾果蠅成體。在用對(duì)照DH5α菌株進(jìn)行的試驗(yàn)中觀察到了較小的殺滅力。用OrR菌株進(jìn)行的所述試驗(yàn)的結(jié)果歸納于圖15中。在yw遺傳背景中觀察到了類似結(jié)果。
如上文所述，在涉及通過簡(jiǎn)單的針頭穿刺將銅綠假單胞菌導(dǎo)入成體果蠅的腹部的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能有效殺滅黑尾果蠅。用于導(dǎo)入特定量的銅綠假單胞菌的其它方法包括，但不限于直接注射和攝食(例如，通過將銅綠假單胞菌添加到果蠅生長(zhǎng)培養(yǎng)基中)。如果需要，可將果蠅幼蟲用于致病試驗(yàn)。
使用黑尾果蠅的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以用該模型生物適應(yīng)的多種分子和遺傳方法研究細(xì)菌致病性。黑尾果蠅是用于研究天然免疫反應(yīng)的良好模型，并且參與該反應(yīng)的很多基因業(yè)已由這種昆蟲中得到克隆(Hoffmann(1995)現(xiàn)代生物學(xué)74-10)。以上基因上的突變可用于與細(xì)菌毒力因子上的突變進(jìn)行組合，以便提供有關(guān)這些毒力因子作用模式的有價(jià)值的信息，所述細(xì)菌毒力因子是從各種銅綠假單胞菌的宿主篩選中分離得到的。
用于鑒定治療劑或植物保護(hù)劑的篩選系統(tǒng)如上文所述，我們的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)一類銅綠假單胞菌毒力因子參與了在三種不同宿主中的致病性，并且這些共同的毒力因子構(gòu)成了細(xì)菌致病性的基本特征，即其致病性是不依賴于宿主的。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，我們業(yè)已開發(fā)了一種用于鑒定治療化合物的(例如，抗致病性藥物)方法，所述化合物可用于抑制能獨(dú)立地感染動(dòng)物(例如，人類患者)或植物(例如，商品作物)的病原體。一般，所述方法涉及通過使用本文所披露的多宿主動(dòng)物/植物病原體(例如，銅綠假單胞菌UCBPP-PA14)系統(tǒng)篩選任意數(shù)量的化合物，以便用作治療上的或農(nóng)業(yè)上的活性劑。根據(jù)我們的結(jié)論，即在植物、小鼠和線蟲上存在共同的致病毒力因子，容易理解的是，能影響這種毒力因子在線蟲中的功能的化合物同樣可以作為哺乳動(dòng)物(例如，人類患者)或植物的有效治療劑。盡管目前用于醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)上的大部分抗生素是殺菌的或抑菌的，因此有利于能抗這些抗生素的菌株或突變型，在本文所披露的篩選方法中(例如線蟲系統(tǒng))鑒定的化合物不能殺滅細(xì)菌，但能使其無(wú)致病性。而且，由于本發(fā)明的篩選方法是在體內(nèi)進(jìn)行的，所鑒定的化合物也不可能對(duì)真核宿主生物具有很高的毒性。
因此，本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化了諸如用于治療病原體疾病的藥物和植物保護(hù)劑的活性劑的評(píng)價(jià)、鑒定、和開發(fā)，所述病原體疾病包括由細(xì)菌、真菌、病毒、環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲、扁蟲動(dòng)物、和原蟲引起的疾病。一般，本發(fā)明的篩選方法提供了從大的群體中篩選感興趣的天然產(chǎn)物提取物或化合物的簡(jiǎn)便方法，還可對(duì)其作進(jìn)一步的評(píng)價(jià)并濃縮成活性較少的選擇性材料。然后對(duì)該材料來源的成分進(jìn)行純化，并在本發(fā)明的方法中進(jìn)行評(píng)價(jià)，以測(cè)定其抗致病活性。
下面我們將披露評(píng)價(jià)作為抗致病劑的化合物的效力的方法。這些實(shí)施例是用于說明目的的，而不是限定本發(fā)明的范圍。試驗(yàn)提取物和化合物一般，新型抗病原體藥物或植物保護(hù)劑是按照本領(lǐng)域公知的方法從天然產(chǎn)物或合成(或半合成)提取物的大型文庫(kù)或化學(xué)文庫(kù)中鑒定的。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，試驗(yàn)提取物或化合物的確切來源對(duì)于本發(fā)明的篩選方法來說不是至關(guān)重要的。因此，實(shí)際上可以用本文所披露的方法篩選任意數(shù)量的化學(xué)提取物或化合物。所述提取物或化合物的例子包括，但不限于植物、真菌、原核生物或動(dòng)物提取物，發(fā)酵液或合成化合物，以及現(xiàn)有化合物的修飾物。還存在多種用于任意數(shù)量化合物的隨機(jī)或定向合成的(例如，半合成或全合成的眾多方法，所述化合物包括，但不限于糖、脂、肽、和核酸基化合物。合成的化合物文庫(kù)可以從Brandon Associate(Merrimack，NH)和Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)購(gòu)買。另外，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的文庫(kù)可以從包括Biotics(Sussex，UK)，Xenova(Slough，UK)，Harbor BranchOceangraphics Institute(Ft.Pierc，F(xiàn)L)和PharmaMar，U.S.A.(劍橋，MA)在內(nèi)的多個(gè)來源購(gòu)買。另外，如果必要，用本領(lǐng)域已知方法，例如用標(biāo)準(zhǔn)提取和分離方法生產(chǎn)天然和合成產(chǎn)生的文庫(kù)。而且，如果需要，可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)、物理、或生物化學(xué)方法對(duì)任何文庫(kù)或化合物方便地進(jìn)行修飾。
另外，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解的是，如果可能的話應(yīng)當(dāng)使用對(duì)已知其抗病原體活性的材料進(jìn)行脫復(fù)制(例如，分類學(xué)脫復(fù)制、生物學(xué)脫復(fù)制、和化學(xué)脫復(fù)制，或其任意組合)或消除復(fù)制或重復(fù)的方法。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)一種粗制提取物具有抗致病活性時(shí)，有必要對(duì)正導(dǎo)向提取物作進(jìn)一步的分離，以便提取決定所觀察的作用的化學(xué)成分。因此，所述提取、分離和純化方法的目的是在具有抗病原體活性的粗制提取物中仔細(xì)鑒定并確認(rèn)一種化學(xué)實(shí)體。分離并純化所述異源提取物的方法在本領(lǐng)域中是公知的。如果必要，可以按照本領(lǐng)域公知方法化學(xué)修飾被證實(shí)為可用于治療致病性的試劑的化合物。
以下是用于評(píng)價(jià)一種分子或化合物改善對(duì)病原體的抗性或抑制病原體的效力的高流通量系統(tǒng)的實(shí)施例。這些實(shí)施例是用于說明目的的，而不是限定本發(fā)明。線蟲生物試驗(yàn)系統(tǒng)為了能夠以有效和系統(tǒng)的方式大規(guī)模篩選大量的天然產(chǎn)物、提取物、或化合物，在微量滴定板的孔中培養(yǎng)秀麗新桿線蟲L4兩性幼蟲，進(jìn)行半自動(dòng)化控制和全自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集。如上文所述，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能感染并殺滅秀麗新桿線蟲，而銅綠假單胞菌UCBPP-PA14所攜帶的誘變過的毒力基因是非致病性的。如果一種病原體具有較小的致病性，則L4蠕蟲可以存活，發(fā)育成成體兩性幼蟲，并產(chǎn)生數(shù)以千計(jì)的活的后代。因此，如果秀麗新桿線蟲與所述病原體一起培養(yǎng)，所述蠕蟲將會(huì)死亡，除非存在一種能減弱銅綠假單胞菌的致病性的化合物。這種活的后代的存在便于用多種方法監(jiān)測(cè)，包括用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡進(jìn)行目測(cè)篩選。
為了評(píng)價(jià)一種試驗(yàn)化合物或提取物改善宿主對(duì)一種病原體的抗性或者抑制一種病原體的致病性的能力，以合適劑量將試驗(yàn)化合物或提取物接種到接種有合適數(shù)量的諸如銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的病原體的過夜培養(yǎng)物的NGM瓊脂上。如果必要，可以接種各種濃度的試驗(yàn)化合物或提取物，以測(cè)定作用于宿主和病原體上的劑量效應(yīng)。對(duì)照孔接種非致病性細(xì)菌(負(fù)對(duì)照)或在缺少試驗(yàn)化合物或提取物的條件下接種病原體(正對(duì)照)，然后在37℃下將平板培養(yǎng)24小時(shí)，以便于所述病原體生長(zhǎng)。然后將微量滴定板冷卻到25℃，并將兩個(gè)秀麗新桿線蟲L4兩性幼蟲添加到所述平板上，并在25℃下培養(yǎng)，該溫度是秀麗新桿線蟲的正常生理完整性的上限。以合適的時(shí)間間隔，例如4-5天，檢查孔中的存活后代，例如通過用活動(dòng)監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)蠕蟲的活動(dòng)。
利用處理和對(duì)照幼蟲之間的比較研究測(cè)定試驗(yàn)分子或化合物在改善宿主對(duì)所述病原體的抗性或抑制該病原體的毒力方面的相對(duì)效力。能夠有效刺激、加強(qiáng)、提高、增強(qiáng)、或改善宿主對(duì)所述病原體的抗性或抑制、滅活、阻止、遏制、或控制所述病原體的致病性、并且不會(huì)對(duì)所述蠕蟲的正常生理、生殖、或發(fā)育造成不利影響的試驗(yàn)化合物被視為可用于本發(fā)明。植物生物試驗(yàn)系統(tǒng)為了能夠以有效和系統(tǒng)的方式大規(guī)模篩選大量的天然產(chǎn)物、提取物、或化合物，在微量滴定板的孔中或任何其它合適容器中培養(yǎng)宿主植物(例如，種子、幼苗、小植株、胚胎、成熟植株、或葉片)，進(jìn)行半自動(dòng)化操作和全自動(dòng)數(shù)據(jù)采集。用于該生物試驗(yàn)的合適植物宿主的具體例子包括，但不限于矮牽牛、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥屬、大豆、玉米、小麥、黑麥、稻、大麥或任何其它在商業(yè)上或農(nóng)業(yè)上重要的植物。培養(yǎng)植物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，參見Vasil，I.K.，植物細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué)，第I、II、III卷，試驗(yàn)室方法及其應(yīng)用，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1984；DixonR.A.，植物細(xì)胞培養(yǎng)-實(shí)踐方法，IRL出版社，牛津大學(xué)，1985)。如上文所述，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌UCBPP-PA14能感染并殺滅擬南芥，而攜帶誘變過的毒力基因的銅綠假單胞菌UCBPP-PA14是非致病性的。因此，如果一種病原體具有減弱的致病性，所述植物將不會(huì)出現(xiàn)癥狀，或者會(huì)出現(xiàn)比對(duì)照植株輕的癥狀。如果擬南芥植物與所述病原體一起培養(yǎng)，該植物將會(huì)死亡或者具有多種疾病癥狀(例如，缺氯或軟腐)，除非添加一種化合物以降低銅綠假單胞菌的致病性。用多種方法，包括目測(cè)篩選可以方便地測(cè)定活的幼苗及其相關(guān)疾病癥狀的存在。
為了評(píng)價(jià)一種試驗(yàn)化合物或提取物改善宿主(例如，擬南芥)對(duì)一種病原體的抗性或抑制一種病原體的致病性的能力，以合適的劑量將一種試驗(yàn)化合物或提取物接種到組織培養(yǎng)基中(例如，固化瓊脂基培養(yǎng)基)。另外，如果必要，可以通過任何常規(guī)方法用所述候選植物保護(hù)劑或抗病原體化合物對(duì)所述宿主植物進(jìn)行預(yù)處理，例如，用含有所述試驗(yàn)化合物的溶液噴灑幼苗或小植株。用任何標(biāo)準(zhǔn)致病篩選系統(tǒng)試驗(yàn)宿主植物，例如，上文所述的擬南芥屬和萵苣葉滲透試驗(yàn)，或通過標(biāo)準(zhǔn)真空滲透技術(shù)。例如，按照標(biāo)準(zhǔn)方法用所述病原體對(duì)宿主幼苗進(jìn)行真空滲透。在真空滲透之后按照本領(lǐng)域已知方法培養(yǎng)幼苗(例如，培養(yǎng)擬南芥屬的方法可以參見擬南芥屬研究方法，Koncz，C.，Chua，N.-H.，Schell，J.，著，世界科學(xué)出版公司Pte.Ltd.，新加坡，1992)。如果必要，可以接種各種濃度的試驗(yàn)化合物或提取物，以便評(píng)價(jià)劑量對(duì)所述宿主和所述病原體的影響。對(duì)照幼苗用非致病性細(xì)菌滲透(負(fù)對(duì)照)或在沒有試驗(yàn)化合物或提取物的條件下用病原體滲透(正對(duì)照)。以合適的時(shí)間間隔，例如3-5天，檢查幼苗的發(fā)病癥狀。將處理和對(duì)照幼苗之間的比較研究用于測(cè)定所述試驗(yàn)分子或化合物在改善宿主對(duì)所述病原體的抗性或抑制所述病原體的毒力方面的相對(duì)效力。能夠有效刺激、加強(qiáng)、提高、增強(qiáng)、或改善宿主對(duì)所述病原體的抗性或抑制、滅活、阻止、遏制、或控制所述病原體的致病性、并且不會(huì)對(duì)所述幼苗的正常生理、生殖、或發(fā)育造成不利影響的試驗(yàn)化合物被視為可用于本發(fā)明。用途本發(fā)明的方法提供了一種用于鑒定微生物毒力因子和能夠抑制致病性或加強(qiáng)一種生物對(duì)一種病原體的抗性能力的化合物的簡(jiǎn)單方法。因此，用本文所述方法發(fā)現(xiàn)的具有醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)價(jià)值的化合物可用作藥物、植物保護(hù)劑或作為對(duì)現(xiàn)有的抗病原體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的信息，例如，通過合理化藥物設(shè)計(jì)。所述方法可用于篩選對(duì)多種病原體具有作用的化合物，所述病原體包括，但不限于細(xì)菌、病毒、真菌、環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲、扁蟲動(dòng)物和原蟲。病原體細(xì)菌的例子包括，但不限于氣桿菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、土壤桿菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、巴爾通氏體屬、Bortella、布魯氏菌屬、鞘桿菌屬、彎曲桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、弗朗西絲斯菌屬、嗜血菌屬、哈夫尼菌屬、螺桿菌屬、克雷伯氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特氏菌屬、莫根氏菌屬、穆爾氏菌屬、變形菌屬、普羅成登斯菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬、黃單胞菌屬、弧菌屬、耶爾森氏菌屬。
對(duì)于治療用途來說，用本文所披露的方法鑒定的組合物或制劑可以全身給藥。例如配制在可以藥用的緩沖液，如生理鹽水中。例如優(yōu)選的給藥途徑包括皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、或皮內(nèi)注射，它可以在患者體內(nèi)提供連續(xù)的、可持續(xù)水平的藥物。人類患者或其它動(dòng)物的治療可以用包含在生理上可以接受的載體中的治療有效量的抗病原體劑進(jìn)行。例如，合適的載體及其配制由E.W.Martin披露于Remington’s藥物科學(xué)中。給予的抗病原體劑的量根據(jù)給藥方式、患者的年齡和體重以及疾病的類型和疾病的嚴(yán)重程度而改變。一般，其用量落在用于治療其它微生物疾病的其它制劑的用量范圍之內(nèi)，不過，在某些場(chǎng)合下，因?yàn)樵摶衔镙^高的專一性而需要較低的用量。以能抑制微生物繁殖的劑量給予化合物。例如，對(duì)于全身給藥來說，一種化合物的給藥量通常為0.1ng-10g/kg體重。
對(duì)于農(nóng)業(yè)用途來說，用本文所披露的方法鑒定的組合物或制劑可以作為農(nóng)藥以噴霧或噴粉的形式施加在植物的葉面上。通常，在所述病原體出現(xiàn)之前將所述制劑使用在植物表面上，以避免感染。還可以處理種子、鱗莖、根、塊莖、和球莖，以便在種植之后控制由其所攜帶的或存在于種植位點(diǎn)的土壤中的病原體預(yù)防病原體侵襲。還可以用化合熏蒸劑處理待種植蔬菜、觀賞植物、灌木、或樹木的土壤。處理優(yōu)選在種植之前數(shù)日或數(shù)周進(jìn)行。所述化合物可以通過機(jī)械途徑，例如拖拉機(jī)或用手動(dòng)裝置使用。另外，用該試驗(yàn)方法鑒定的化合物可以用作消毒劑。
本說明書中所提及的所有出版物和專利均被以相同的程度收作參考文獻(xiàn)，如同每一件出版物或?qū)＠粚ｉT和單獨(dú)指明為收作參考文獻(xiàn)一樣。
通過以上說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)特征，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，其它實(shí)施方案也屬于本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍。
保藏業(yè)已將銅綠假單胞菌UBCPP-PA14于1995年3月22日交由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為ATCC No.55664.申請(qǐng)人明白，在該授權(quán)專利終止之前若該菌株失去活力，其負(fù)有更換該菌株的責(zé)任，并在該專利授權(quán)時(shí)負(fù)有通知美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的責(zé)任，此后公眾可以獲得以上保藏物。在此之前，根據(jù)CFR§1.14和35 USC§112的規(guī)定專利局局長(zhǎng)可以獲得所述保藏物。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人The General Hospital Corporation等(ii)發(fā)明名稱篩選用于預(yù)防感染或致病性的化合物的方法(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)收件人Clark &amp; Elbing，LLP(B)街道176 Federal Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編02110-2214(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)Windows 95(D)軟件FastSeq for Windows version2.0(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/852,927(B)申請(qǐng)日1997年5月8日(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/962,750(B)申請(qǐng)日1997年11月3日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Elbing，Karen L.
(B)注冊(cè)號(hào)35,238(C)文件/擋案號(hào)00786/263WO3(ix)通信資料
(A)電話(617)428-0200(B)傳真(617)428-7045(C)電傳(2)序列1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列1GCTAGTAGTC GATGACC(2)序列2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列2GCTGGCATCA ACCATGC
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓至少兩種不同的真核宿主生物接觸一種病原體，所述生物中至少一種是線蟲，其中，所述線蟲與所述病原體和候選化合物在快速殺滅條件下接觸；和(b)鑒定能在所述每一種真核宿主生物中抑制所述病原體的化合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述真核生物包括(a)線蟲和植物；(b)線蟲和脊椎動(dòng)物；(c)線蟲和無(wú)脊椎動(dòng)物；或(d)線蟲和昆蟲。
3.一種用于鑒定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種線蟲接觸一種病原體，其中，所述線蟲與所述病原體和候選化合物在快速殺滅條件下接觸；和(b)鑒定能抑制所述病原體的化合物，其中，所述化合物的鑒定是以能在一種真核生物中抑制所述病原體為指標(biāo)。
4.如權(quán)利要求1或3的方法，其中，所述病原體是細(xì)菌。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述細(xì)菌是銅綠假單胞菌UCBPP-PA14。
6.如權(quán)利要求1或3的方法，其中，所述線蟲是秀麗新桿線蟲。
7.如權(quán)利要求1或3的方法，其中，所述兩種真核生物中的第二種是植物或哺乳動(dòng)物。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中，所述植物是擬南芥屬。
9.一種用于鑒定致病性毒力因子的方法，該方法包括(a)鑒定一種能夠感染至少兩種不同真核宿主生物的病原體，所述生物中至少一種是線蟲；(b)制備所述病原體的突變型；(c)讓所述真核生物和所述線蟲的每一種接觸所述突變型病原體，其中，所述線蟲是在快速殺滅條件下接觸所述病原體；(d)確定所述突變型病原體是否能在所述每一種生物中導(dǎo)致發(fā)病，在以上兩種生物中的疾病相對(duì)由野生型病原體引起的疾病減輕表明在病原性毒力因子上發(fā)生了突變；和(e)將所述突變用作鑒定所述病原性毒力因子的標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求1、3、或9的方法，其中，所述快速殺滅條件使用具有P-糖蛋白突變的線蟲。
11.一種用于鑒定致病性毒力因子的方法，該方法包括(a)選擇一種能夠感染昆蟲的病原體；(b)制備一種病原體的突變型；(c)讓所述昆蟲接觸所述突變的病原體；和(d)確定所述突變型病原體是否能在所述昆蟲上導(dǎo)致發(fā)病，在所述昆蟲上的疾病相對(duì)由野生型病原體引起的疾病減輕表明在所述病原性毒力因子上發(fā)生了突變。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，鑒定的所述突變被用作鑒定所述致病性毒力因子的標(biāo)記。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述昆蟲是蛾或蠅。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中，所述蛾是蠟螟或菜蛾，或者所述蠅是黑尾果蠅。
15.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述病原體是細(xì)菌或真菌。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述細(xì)菌是假單胞菌屬的一員，或者所述真菌是鐮孢屬的一員。
17.如權(quán)利要求11的方法，其中，步驟(d)還包括計(jì)算病原體的LD50。
18.如權(quán)利要求11的方法，還包括在小鼠殺滅試驗(yàn)中試驗(yàn)所述突變的病原體。
19.一種用于鑒定能在真核生物中抑制病原體的化合物的方法，該方法包括(a)在有至少一種候選化合物的條件下，讓一種昆蟲接觸一種病原體；和(b)鑒定能抑制所述病原體的化合物，其中，所述化合物的鑒定是以能在一種真核生物中抑制所述病原體為指標(biāo)。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述昆蟲是蛾或蠅。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述蛾是蠟螟或菜蛾，或者所述蠅是黑尾果蠅。
22.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述病原體是細(xì)菌或真菌。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述細(xì)菌是假單胞菌屬的一員，或者所述真菌是鐮孢屬的一員。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于鑒定可用于抑制感染或致病性的化合物的篩選方法。還公開了用于鑒定致病性毒力因子的方法。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1261810SQ98806928
公開日2000年8月2日 申請(qǐng)日期1998年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月8日
發(fā)明者F·M·奧蘇貝爾, L·G·拉梅, M－W·譚, G·B·魯夫昆, S·馬哈楊－米克洛斯, A·布勒克斯, R·H·A·普拉斯特克, G·楊德, J·赫爾德 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司, 荷蘭癌癥協(xié)會(huì)