一種高通量快速檢測常見致病菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量快速檢測常見致病菌的方法，所述方法包括：采用針對多種致病菌標(biāo)志性DNA序列的通用引物對對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；使得所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與分別針對所述致病菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針接觸，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的雜交產(chǎn)物；檢測可檢測標(biāo)記物的信號以確定樣品中致病菌的存在或數(shù)量。本發(fā)明還提供了用于檢測致病菌的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可準(zhǔn)確快速、高通量地檢測致病菌，具有易操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】一種高通量快速檢測常見致病菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床檢測、食品檢測、公共衛(wèi)生和細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及 一種高通量、快速檢測致病菌（優(yōu)選臨床常見致病菌）的新方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌感染性疾?。ɡ缑谀蛳到y(tǒng)感染，如尿路感染）嚴(yán)重威脅人類健康且發(fā)病率 日益提高。常見的致病性細(xì)菌可導(dǎo)致多種疾病，例如：由大腸桿菌（E. coli)引起的腹瀉、 敗血癥；由金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus)引起的化膿感染、食物中毒、肺炎； 由肺炎克雷伯菌（K.peneumoniae)引起的上呼吸道、腸道感染；由糞腸球菌（E.faecalis) 引起的尿路感染、心內(nèi)膜炎、膽囊炎、腦膜炎及傷口感染等；由陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)引起的醫(yī)源性感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及敗血癥等；由銅綠假單胞菌 (P. Aeruginosa)引起的醫(yī)源性感染、術(shù)后傷口感染、化膿性中耳炎等；由普通變形桿菌 (P. vulgaris)引起的泌尿系統(tǒng)感染、創(chuàng)口感染、呼吸道感染、食物中毒及敗血癥等；由黏質(zhì) 沙雷菌（Serratia marcescens)引起的肺部感染、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、尿路感染、灼傷后敗血 癥等。
[0003] 針對細(xì)菌感染性疾病大量使用廣譜抗生素，雖然能夠抑制大部分致病菌，但會導(dǎo) 致耐藥菌株和變異菌株不斷出現(xiàn)，長期使用還會引發(fā)多種副作用，增加患者負(fù)擔(dān)和臨床治 療的復(fù)雜性。并且，某些疾病可能由多種致病菌共同導(dǎo)致，病因復(fù)雜。因此，檢測特定致病 菌并有針對性地抑制所測得的致病菌，有利于合理治療細(xì)菌感染性疾病。
[0004] 然而，以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)致病菌檢測方法存在耗時(shí)長、檢測敏感性受培養(yǎng)條件 限制等缺點(diǎn)，越來越不能滿足臨床的需要，因而開發(fā)快速、敏感、準(zhǔn)確地檢測病原菌的方法 一直是人們追求的目標(biāo)。近年來發(fā)展的生物芯片技術(shù)具有高通量、集成化、微型化及自動化 等特點(diǎn)，在檢測基因位點(diǎn)差異和分析基因表達(dá)水平等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，而在臨床致病 菌和耐藥性的檢測方面，則可為臨床抗生素的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。
[0005] 目前，臨床和食品檢驗(yàn)檢疫上細(xì)菌鑒定主要方法有：傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定 方法、PCR、Southern Blot雜交（即DNA印跡法）、ELISA等分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。但 是，傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，一般需要3-5天，ELISA方法雖然靈敏度高，但易受 污染，出現(xiàn)假陽性；采用多重PCR技術(shù)，雖然可以達(dá)到對單一菌的快速、準(zhǔn)確和方便的診斷 目的，但在病原菌未明時(shí)，需要采用多種不同引物進(jìn)行試驗(yàn)，這對病原菌的復(fù)雜性和PCR程 序的多樣性來說是不夠理想的。
[0006] 隨著生物芯片技術(shù)的日趨成熟，高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物芯片技術(shù)，被應(yīng)用到 越來越多的領(lǐng)域，其中就包括臨床致病菌快速診斷領(lǐng)域。液相芯片技術(shù)是新近開發(fā)出的新 一代分子診斷技術(shù)平臺，該平臺既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對高通量的檢測，其高通 量、高精確性以及耗時(shí)短的特點(diǎn)為臨床常見菌的檢測提供了思路，可有效防止抗生素藥物 的濫用。
[0007] 目前最先進(jìn)的技術(shù)是科學(xué)家韓健博士發(fā)明的Tem-PCR (target enriched multiplex PCR，祀序列富集多重PCR)技術(shù)與液相芯片檢測技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用，該技術(shù)能在一 次反應(yīng)中對多種靶序列進(jìn)行高度敏感和特異的擴(kuò)增和檢測，其主要原理是，針對待擴(kuò)增的 每一種靶序列，設(shè)計(jì)兩對巢式的特異性引物：FO，RO ;Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物帶有一個(gè) 能被通用的超級引物（Super Primer)識別的標(biāo)簽序列。巢式的祀序列特異性引物的濃度 極低，用于在PCR的最初幾個(gè)循環(huán)中富集目標(biāo)序列。只有超級引物的濃度足以進(jìn)行指數(shù)擴(kuò) 增，而且只有反向超級引物進(jìn)行了生物素的標(biāo)記。最后通過液相芯片檢測平臺輸出信號，達(dá) 到檢測目的。該技術(shù)與普通PCR技術(shù)相比具有兼容性好、特異性強(qiáng)、效率超高、可半定量等 優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)存在對所需DNA模板要求高、PCR反應(yīng)時(shí)間長、敏感性不夠強(qiáng)等缺點(diǎn)。
[0008] 細(xì)菌rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細(xì)菌染 色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)包 含保守區(qū)及可變區(qū)。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因，其長 度約為1500pb，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的"分子鐘"。
[0009] 在核糖體RNA(rRNA)特征序列中，經(jīng)研究認(rèn)為16S rRNA及其類似的rRNA基因序列 作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適，其主要依據(jù)是：它們?yōu)榧?xì)胞所共有；其功能同源且最為 古老；既含有保守序列又含可變序列；分子大小適合操作；它的序列變化與進(jìn)化距離相適 應(yīng)。依據(jù)16S rRNA序列繪制的生命進(jìn)化樹，卡爾?沃斯（Carl Woese)將地球上的所有細(xì)胞 生物劃分為3個(gè)域（domain)，即古生菌（Archaea，也稱Archaebacteria)、細(xì)菌（Bacteria， 也稱Eubacteria)和真核生物（Eukarya)。16S rRNA序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要 依據(jù)也得到了廣泛認(rèn)同，隨著微生物核糖體數(shù)據(jù)庫的日益完善，該技術(shù)成為細(xì)菌分類和鑒 定的一個(gè)有力工具。
[0010] 關(guān)于16S rDNA的數(shù)據(jù)庫信息及分析軟件較其它分類鑒定用的基因豐富得多，如 RDP (http: //rdp. cme. msu. edu/html/) > ARB (http: //www. ard-home. de/) > ORS (http: // soul, mikro. biologie. tu-muenchen. de/0RS/)> OPD (http://www. com. msu. eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL-X、PRMER PREMIER、DNA START等，各分析軟件因采用的算法不同而各 有所長。
[0011] 然而，本領(lǐng)域中尚未提供同時(shí)檢測樣品中多種致病菌的方法。本領(lǐng)域中仍然迫切 需要開發(fā)出能夠克服目前致病菌檢測中的不足，且能高通量、快速檢測多種致病菌的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種高通量、快速檢測常見致病菌的方法，該方法具 有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測時(shí)間短、交叉反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用 于本發(fā)明方法的試劑盒，以及本發(fā)明的方法和試劑盒在臨床常見菌檢測中的應(yīng)用。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的 方法，所述致病菌為選自下組菌中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌 (K. peneumoniae，即 KPN)、奠腸球菌（E. faecal is，即 EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,即 ECL)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris, 即 PV)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，即 SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,即SA);所述方法包括：
[0014] ⑴獲得針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物 和針對SEQIDN0:11所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG或SEQIDN0:12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物；
[0015] (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得 所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包 含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
[0016] 在一些優(yōu)選例中，通過以上所述的PCR擴(kuò)增方法獲得的分別是SEQ ID N0:21-28 所示的各菌標(biāo)志性DNA序列。
[0017] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物的序列針對SEQ ID N0:12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 〇
[0018] 在一些優(yōu)選例中，所述通用上游引物的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示； 所述通用下游引物的序列如 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 或 SEQ ID NO:7 所示。
[0019] 在另一些優(yōu)選例中，所述致病菌為選自上組菌中的至少兩種。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所示序列的15?17個(gè) 連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或或SEQ ID NO: 12的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
[0021] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO: 12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA或的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
[0022] 在另一些實(shí)施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所示序列的15?17 個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或SEQ ID NO: 12 的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0023] 在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO: 12所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0024] 在一些優(yōu)選例中，所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列分別如下：a)SEQ ID N0:21所示 的大腸桿菌的標(biāo)志性DNA序列；b)SEQ ID NO:22所示的肺炎克雷伯菌的標(biāo)志性DNA序列；c) SEQ ID N0:23所示的糞腸球菌的標(biāo)志性DNA序列；d)SEQ ID N0:24所示的陰溝腸桿菌的標(biāo) 志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 25所示的銅綠假單胞菌的標(biāo)志性DNA序列；f) SEQ ID NO: 26 所示的普通變形桿菌的標(biāo)志性DNA序列；g) SEQ ID NO: 27所示的黏質(zhì)沙雷菌的標(biāo)志性DNA 序列；h) SEQ ID NO: 28所示的金黃色葡萄球菌的標(biāo)志性DNA序列。
[0025] 在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選 自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae，即KPN)、糞 腸球菌（E.faecalis，即EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，即ECL)、銅綠假單胞 菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris,即 PV)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，即SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，即SA);所述方法包括：
[0026] (A)采用本發(fā)明所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；
[0027] (B)提供分別針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針；
[0028] (C)在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸， 并且在所述接觸之前、之時(shí)或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述 致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記 物的雜交產(chǎn)物；
[0029] (D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測 致病菌的存在或數(shù)量。
[0030] 在另一些優(yōu)選例中，所述方法用于同時(shí)檢測出樣品中選自上組菌中的至少兩種。
[0031] 在一些實(shí)施方式中，所述方法用于臨床樣品檢測、食品檢驗(yàn)、食品加工過程檢測或 化妝品檢測，優(yōu)選用于臨床樣品檢測。
[0032] 在另一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物選自：編碼微球、或其它載體（如熒光標(biāo)記 物、發(fā)光蛋白等）。
[0033] 在另一些實(shí)施例中，所述方法還包括在步驟（A)之后，分離和/或純化所述所述致 病菌的標(biāo)志性DNA序列、和/或?qū)⑺鏊鲋虏【臉?biāo)志性DNA序列與可檢測標(biāo)記物連接。 在一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物是生物素、抗生物素、抗體、標(biāo)記細(xì)胞或發(fā)光蛋白。
[0034] 在一些實(shí)施方式中，所述樣品來源于：生物組織、體液、血液、尿液或食品。
[0035] 在另一些實(shí)施例中，所述樣品是DNA樣品或菌液。
[0036] 在另一些實(shí)施例中，所述樣品中可包含所述菌組內(nèi)致病菌中的一種或多種。
[0037] 在另一些實(shí)施方式中，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自：
[0038] a)針對SEQ ID NO: 21所示的大腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；b)針 對SEQ ID NO: 22所示的肺炎克雷伯菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；c)針對SEQ ID N0:23所示的糞腸球菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；d)針對SEQ ID N0:24所示的陰 溝腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；e)針對SEQ ID N0:25所示的銅綠假單胞菌 標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；f)針對SEQ ID N0:26所示的普通變形桿菌標(biāo)志性DNA 序列的特異性捕獲探針；g)針對SEQ ID NO: 27所不的黏質(zhì)沙雷菌標(biāo)志性DNA序列的特異 性捕獲探針；和h)針對SEQ ID NO:28所示的金黃色葡萄球菌的特異性捕獲探針。
[0039] 在另一些優(yōu)選例中，所述特異性捕獲探針的G/C為45?60%，優(yōu)選50?55%。
[0040] 在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的長度為20-25bp，更優(yōu)選22bp。
[0041] 在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的Tm值為40-60°C，優(yōu)選52°C。
[0042] 在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的5'端將修飾或封閉，以便于與編碼微 球偶聯(lián)。
[0043] 在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針選自下組：
[0044] a) SEQ ID NO: 13所示的大腸桿菌的特異性捕獲探針；
[0045] b) SEQ ID NO: 14所示的肺炎克雷伯菌的特異性捕獲探針；
[0046] c) SEQ ID NO: 15所示的糞腸球菌的特異性捕獲探針；
[0047] d) SEQ ID NO: 16所示的陰溝腸桿菌的特異性捕獲探針；
[0048] e) SEQ ID NO: 17所示的銅綠假單胞菌的特異性捕獲探針；
[0049] f) SEQ ID NO: 18所示的普通變形桿菌的特異性捕獲探針；
[0050] h) SEQ ID NO: 19所示的黏質(zhì)沙雷菌的特異性捕獲探針；和
[0051] i) SEQ ID NO: 20所示的金黃色葡萄球菌的特異性捕獲探針。
[0052] 在另一些實(shí)施方式中，步驟（C)中的所述可檢測標(biāo)記物為編碼微球，所述編碼微 球采用可產(chǎn)生不同可信號的標(biāo)記物編碼。
[0053] 在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記物選自：不同顏色的標(biāo)記物或其不同比例的組合。在另 一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記物選自：不同顏色的熒光標(biāo)記物，或不同比例的兩種或兩種以上的 突光標(biāo)記物的組合。
[0054] 在一些實(shí)施例中，所述編碼微球與捕獲探針偶聯(lián)。在一些實(shí)施例中，所述偶聯(lián)通過 EDC法進(jìn)行。在另一些實(shí)施例中，所述偶聯(lián)是通過NHS偶聯(lián)劑進(jìn)行的。在另一些實(shí)施例中， 所述微球是聚苯乙烯微球，并根據(jù)其表面帶有的分子殘基的不同，可以結(jié)合不同的探針分 子。
[0055] 在另一些實(shí)施方式中，步驟（D)中的所述檢測采用選自下組的一種或多種系統(tǒng)或 儀器：液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片。
[0056] 在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染 的試劑盒，所述致病菌為選自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌 (K. peneumoniae，即 KPN)、奠腸球菌（E. faecal is，即 EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,即 ECL)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa,即 PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris, 即 PV)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，即 SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,即SA);所述試劑盒包含：
[0057] (i'）針對SEQIDN0:10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC的通用上游引物和針 對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于 所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0058] (ii'）針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo) 記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0059] (iii'）一個(gè)或多個(gè)容器和/或包裝物；
[0060] (iv'）任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0061] (ν'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0062] (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0063] (vii'）任選的，使用說明書；
[0064] (viii'）任選的，致病菌治療劑。
[0065] 在一些優(yōu)選例中，所述試劑盒用于同時(shí)檢測出樣品中至少兩種選自上組的菌。
[0066] 在本發(fā)明的第四方面中，提供了下述物質(zhì)在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感 染的試劑盒中的用途：
[0067] ⑴針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針 對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于 所述致病菌的16SrDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0068] (ii)針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記 物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0069] (iii) 一個(gè)或多個(gè)容器和/或包裝物；
[0070] (iv)任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0071] (V)任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0072] (Vi)任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0073] (Vii)任選的，使用說明書；
[0074] (Viii)任選的，致病菌治療劑。
[0075] 在一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物是微球。
[0076] 在本發(fā)明的其它方面中，還提供了本發(fā)明上述方法和試劑盒在檢測致病菌和/或 治療致病菌感染中的用途。
[0077] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0078] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中這些顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實(shí) 施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。
[0079] 圖1 :針對菌A-菌F的16S rDNA基因的通用引物和特異性捕獲探針的設(shè)計(jì)示意 圖。
[0080] 圖2 :采用通用引物對（SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0081] 圖3 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0082] 圖4 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0083] 圖5 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0084] 圖6 :采用通用引物對（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:7)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。
[0085] 圖7 :采用通用引物對（SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0086] 本發(fā)明主要是為了克服目前致病菌（尤其是臨床常見致病菌）檢測中的不足，提 供一種高通量快速檢測致病菌的方法，采用一對通用引物及特異性捕獲探針設(shè)計(jì)，通過液 相芯片實(shí)現(xiàn)信號輸出的方法，可同時(shí)、快速檢測多種致病菌。該方法高效、靈敏、特異性強(qiáng)、 交叉反應(yīng)少，克服多重PCR及熒光檢測系統(tǒng)中存在的PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)繁瑣及產(chǎn)生交叉反 應(yīng)等缺點(diǎn)。
[0087] 本發(fā)明人開發(fā)的以16S rDNA PCR技術(shù)為核心的新型致病菌快速檢測技術(shù)，只需 采用一對通用引物就可以對多種不同細(xì)菌的16S rRNA特征信息進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的為包含 多重性的16S rDNA信息的PCR產(chǎn)物。這種常規(guī)的PCR方法，可以在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成擴(kuò) 增反應(yīng)。所獲得的PCR產(chǎn)物，采用與特異性引物偶聯(lián)的編碼微球，用液相芯片檢測系統(tǒng)（如 Luminex200)，可以實(shí)現(xiàn)多重性和高通量的檢測目標(biāo)。
[0088] 獲得致病菌標(biāo)志件DNA序列的方法
[0089] 本發(fā)明中提供了一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的方法，所述致病菌為 選自下組中的一種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae，即KPN)、 奠腸球菌（E.faecalis，即EF)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae，即ECL)、銅綠假單 胞菌（P. Aeruginosa,即PAE)、普通變形桿菌（P. vulgaris,即PV)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，即SM)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，即SA)，所述方法包括：
[0090] ⑴獲得針對SEQ ID NO :10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物；
[0091] (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得 所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包 含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
[0092] 如本文所用，術(shù)語"標(biāo)志性DNA序列"是指位于各種致病菌16S rDNA中、且可由本 發(fā)明的通用引物對擴(kuò)增獲得的特定序列，所述序列的兩端包含各菌共有的保守序列，而在 該序列內(nèi)部具有各種致病菌獨(dú)有的特異性序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述致病菌 的標(biāo)志性DNA序列分別如下：a) SEQ ID NO: 21所示的大腸桿菌的標(biāo)志性DNA序列；b) SEQ ID NO: 22所示的肺炎克雷伯菌標(biāo)志性DNA序列；c) SEQ ID NO: 23所示的糞腸球菌標(biāo)志性DNA 序列；d) SEQ ID NO: 24所示的陰溝腸桿菌標(biāo)志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 25所示的銅綠假 單胞菌標(biāo)志性DNA序列；f) SEQ ID NO: 26所示的普通變形桿菌標(biāo)志性DNA序列；g) SEQ ID NO: 27所示的黏質(zhì)沙雷菌標(biāo)志性DNA序列；和h) SEQ ID NO: 28所示的金黃色葡萄球菌標(biāo)志 性DNA序列。
[0093] 如本文所用，術(shù)語"特異性序列"或"可變區(qū)"可互換使用，均是指位于各種待測致 病菌16S rDNA基因內(nèi)部、各種待測致病菌獨(dú)有的一段區(qū)域。通過分析和比較各種待測致病 菌的16S rDNA序列可確定該特異性序列的存在和具體位置。通常，該特異性序列兩端具有 各種致病菌共有的保守序列。所述的特異性序列可用于區(qū)分致病菌的種類。
[0094] 可采用序列比對、參考文獻(xiàn)（液體芯片技術(shù)定量測定人體血清CEA、AFP、 NSE 和 tPSA，粱惠儀等，J Mol Diagn Ther，2010 年 7 月，VoL 2, No. 4 ;王嘉莉等； High-Throughput, Sensitive,and Accurate Multiplex PCR-Microsphere Flow Cytometry System for Large-Scale Comprehensive Detection of Respiratory Viruses (以新技術(shù)平臺Luminex快速檢測具二甲氧基苯青霉素抗藥性的金黃色葡萄球 菌）2007 年 5 月 30 日提前公開· 10. 1128/JCM. 02501-06. 2007, 45(8) :2626. D0I:J. Clin. Microbiol. James R. Prudent等）、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)確定適用于本發(fā)明方法 的各待測致病菌的特異性序列或包含該序列的標(biāo)志性DNA序列。關(guān)于16S rDNA的數(shù)據(jù) 庫信息及分析軟件在本領(lǐng)域中是已知的，例如RDP(http ://rdp. cme. msu. edu/html/)、 ARB (http: //www. ard-home. de/) > ORS (http: //soul, mikro. biologie. tu-muenchen. de/ ORS/)、OPD(http://www. com. msu. eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL-X、PRMER PREMIER、DNA START等，各分析軟件因采用的算法不同而各有所長，這些數(shù)據(jù)庫和軟件均可用于本發(fā)明 中。
[0095] 如本文所用，術(shù)語"保守序列"或"共有序列"可互換使用，均是指各種致病菌的16S rRNA基因（16S rDNA)的標(biāo)志性DNA序列中的一致序列。針對"保守序列"設(shè)計(jì)出的本發(fā)明 的通用引物可用于擴(kuò)增出各種待測致病菌的標(biāo)志性DNA序列。為了實(shí)現(xiàn)通用擴(kuò)增的目的， 通常該保守序列位于可變區(qū)的兩端。
[0096] 如本文所用，術(shù)語"通用引物對"是指針對致病菌標(biāo)志性DNA序列中的保守區(qū)域、 可用于擴(kuò)增出包含各種致病菌的特異性序列的致病菌標(biāo)志性DNA序列的一對通用引物。通 用上游引物（或稱"正向通用引物"）通常針對標(biāo)志性DNA序列的上游；通用上游引物（或 稱"反向通用引物"）通常針對標(biāo)志性DNA序列的下游。
[0097] 通用引物對的設(shè)計(jì)可根據(jù)本領(lǐng)域中常規(guī)的引物設(shè)計(jì)規(guī)則進(jìn)行、采用已知的引物設(shè) 計(jì)軟件和/或由提供引物設(shè)計(jì)的公司提供專門的服務(wù)。本發(fā)明的通用上游引物和通用下游 引物分別針對SEQ ID N0:10所示序列ACGCGAAGAACCTTACC和針對SEQ ID N0:11所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO :12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。例如 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可采用SEQ ID N0:1或3的通用上游引物與SEQ ID N0:2、4、5、 6或7的通用下游引物組合形成通用引物對。
[0098] 在本發(fā)明的方法中，可采用本領(lǐng)域中已知的PCR方法和常規(guī)條件、采用本發(fā)明的 通用引物對，對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。也可對已知類型的菌種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行測序，并將測序信息用于后續(xù)的特異性捕獲探針設(shè)計(jì)。
[0099] 致病菌檢測方法
[0100] 本發(fā)明中提供了一種檢測致病菌的方法，所述方法包括：
[0101] (A)采用如上所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；
[0102] (B)提供分別針對所述致病菌（一種或多種，優(yōu)選至少兩種）的標(biāo)志性DNA序列的 相應(yīng)特異性捕獲探針；
[0103] (C)在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸， 并且在所述接觸之前、之時(shí)或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述 致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記 物的雜交產(chǎn)物；
[0104] (D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測 致病菌的存在或數(shù)量。
[0105] 如本文所用，術(shù)語"特異性捕獲探針"或"捕獲探針"可互換使用，均是指針對可能 存在的某種致病菌在16S rDNA標(biāo)志性DNA序列中的特異性序列設(shè)計(jì)的，從而可特異性捕獲 該種致病菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。根據(jù)需要，本發(fā)明的捕獲探針可帶有或不帶有標(biāo) 記物（如放射性、生物素、熒光標(biāo)記物等）?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中常規(guī)的探針設(shè)計(jì)規(guī)則設(shè)計(jì)探針， 并人工合成探針。
[0106] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO : 13?20的捕獲探針序列分別特異性地 針對并可分別捕獲大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變 形桿菌、黏質(zhì)沙雷菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)志性DNA序列，更具體而言是標(biāo)志性DNA序列中 的特異性序列。
[0107] 可用各種可檢測標(biāo)記物與捕獲探針連接，以使得被特定捕獲探針捕獲的序列上帶 有特定的標(biāo)記，從而將特定可檢測標(biāo)記與特定菌的序列對應(yīng)起來，便于區(qū)分不同的細(xì)菌。所 述可檢測標(biāo)記物包括但不限于：編碼微球、載體（例如熒光標(biāo)記物、發(fā)光蛋白）等，優(yōu)選編碼 微球。連接標(biāo)記物和捕獲探針的方法是本領(lǐng)域中所熟知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)所 選的標(biāo)記物對捕獲探針或標(biāo)記物進(jìn)行修飾或改造，以得到兩者可相互連接（例如可參見許 艷軍，廈門大學(xué)2008年碩士學(xué)位論文：液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制備、表征 及其在生物檢測中的應(yīng)用、及其所引用的參考文獻(xiàn)等文獻(xiàn)）。
[0108] 如本文所用，術(shù)語"編碼微球"是指具有不同可檢測區(qū)分的特征（例如大小和/ 或顏色）、能與捕獲探針偶聯(lián)、并可被檢測設(shè)備區(qū)分的各種微球。微球的材料可為：聚苯 乙烯，如MultiAnalyte微球或SeroMap微球等。微球的直徑可為20nm_200 μ m，優(yōu)選5? 10 μ m，更優(yōu)選5.6 μ m。微球可用不同配比的染料（優(yōu)選熒光染料）染成不同的顏色（如 熒光色），從而獲得可多達(dá)數(shù)種、十?dāng)?shù)種、數(shù)十種、甚至百余種不同的編碼微球?？赏ㄟ^市售 途徑獲得編碼微球，例如購自凱杰生物、BIO-RAD或根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)和制備編碼微球（例 如可參考陳瑋，液相芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用進(jìn)展，成都醫(yī)學(xué)院病理教研室，成都醫(yī)院學(xué)報(bào)， 2008 (3) : 225-231，該文獻(xiàn)以其全文納入本文作為參考）。
[0109] 本發(fā)明的捕獲探針可經(jīng)過修飾或改造具有適于與編碼微球偶聯(lián)的接頭或基團(tuán)，例 如可在捕獲探針的5'端連接AMB以用于進(jìn)一步與編碼微球連接。捕獲探針與編碼微球的 偶聯(lián)，可采用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行（例如可參考韓衛(wèi)寧等，液相芯片技術(shù)在核酸檢測 中的應(yīng)用研究進(jìn)展，現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008 (10) : 1911-1915,該文獻(xiàn)以其全文納入本文作為參 考）。例如在適合捕獲探針上的接頭或基團(tuán)與編碼微球上的相應(yīng)結(jié)構(gòu)連接或反應(yīng)的條件下， 混合和孵化捕獲探針和編碼微球。
[0110] 在適當(dāng)條件下，使采用通用引物對擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與不同的捕獲探針-編碼 微球偶聯(lián)物雜交，以使得PCR產(chǎn)物帶有來自編碼微球的可檢測信號。雜交條件可參照廠商 提供的操作規(guī)程（例如Iuminex偶聯(lián)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行）或本領(lǐng)域中的常規(guī)條件 進(jìn)行。
[0111] 可采用本領(lǐng)域中已知的方法檢測連接到所述PCR產(chǎn)物上的編碼微球的信號，以測 定致病菌的存在或數(shù)量。例如可采用熒光微球檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片等。當(dāng)檢 測到與特定致病菌的捕獲探針偶聯(lián)的特定編碼微球信號時(shí)，表明被檢測的樣品中帶有此種 特定的致病菌。如需要的話，可通過編碼微球信號的強(qiáng)弱測定樣品中致病菌的數(shù)量。
[0112] 試劑盒及試劑的應(yīng)用
[0113] 本發(fā)明中還提供了一種用于檢測致病菌的試劑盒，其包含：
[0114] (i'）針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO :11 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQID NO :12 所示序列 TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物 對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于 所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0115] (ii'）針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo) 記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0116] (iii'）一個(gè)或多個(gè)容器和/或包裝物；
[0117] (iv'）任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0118] (ν'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0119] (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0120] (vii'）任選的，使用說明書；
[0121] (viii'）任選的，致病菌治療劑。
[0122] 本發(fā)明中進(jìn)一步提供了采用本發(fā)明的方法或試劑盒檢測致病菌和/或治療致病 菌感染中的用途。
[0123] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0124] 利用本發(fā)明的技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)（4小時(shí)內(nèi)，如2-3小時(shí)）對多種臨床常見致病 菌及其混合物進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測；與傳統(tǒng)的檢測方法（細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等） 以及醫(yī)院現(xiàn)用其它儀器檢測（例如西門子walkaway96微生物鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)原理還是傳 統(tǒng)檢測方法的原理）相比，新技術(shù)的特色和創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：可以直接用菌液或待檢樣 品作為PCR模板進(jìn)行快速多重PCR擴(kuò)增，可同時(shí)對多種常見致病菌進(jìn)行高通量并行檢測，一 次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果，操作簡便快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高。
[0125] 序列表說明
[0126] 本發(fā)明序列表中序列號與具體序列之間的對應(yīng)關(guān)系如下表1所示：
[0127] 表1.序列表說明
[0128]

【權(quán)利要求】
1. 一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的方法，所述致病菌為選自下組菌中的一 種或多種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌（E. faecalis)、 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、普通變形桿菌 (P. vulgaris)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus);所述方法包括： (i) 獲得針對SEQ ID NO : 10所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和 針對 SEQ ID NO : 11 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 或 SEQ ID NO : 12 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGA 的通用下游引物； (ii) 采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述 致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所 述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所 示序列的15?17個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或12的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQ ID NO :10所 示序列的15?17個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO :11或12的15?23個(gè)連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
4. 一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選自下組菌中的一種或多種：大腸 桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌（E. faecalis)、陰溝腸桿菌 (Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、普通變形桿菌（P. vulgaris)、黏 質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus);所述方法 包括： (A) 采用權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序 列； (B) 提供分別針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針； (C) 在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸，并且 在所述接觸之前、之時(shí)或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述致病 菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的 雜交產(chǎn)物； (D) 檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測致病 菌的存在或數(shù)量。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于臨床樣品檢測、食品檢驗(yàn)、食 品加工過程檢測或化妝品檢測，優(yōu)選用于臨床樣品檢測或食品檢疫。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自： a) 針對SEQ ID NO: 21所示大腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； b) 針對SEQ ID NO: 22所示肺炎克雷伯菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； c) 針對SEQ ID NO: 23所示糞腸球菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； d) 針對SEQ ID NO: 24所示陰溝腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； e) 針對SEQ ID NO: 25所示銅綠假單胞菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； f) 針對SEQ ID NO:26所示普通變形桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； g) 針對SEQ ID NO: 27所示黏質(zhì)沙雷菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；和 h) 針對SEQ ID NO: 28所示金黃色葡萄球菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（C)中的所述可檢測標(biāo)記物為編碼微 球，所述編碼微球采用可產(chǎn)生不同可信號的標(biāo)記物編碼。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（D)中的所述檢測采用選自下組的一種 或多種系統(tǒng)或儀器：液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片。
9. 一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒，所述致病菌為選自下組 菌中的一種或多兩種：大腸桿菌（E. coli)、肺炎克雷伯菌（K. peneumoniae)、糞腸球菌 (E.faecalis)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)、銅綠假單胞菌（P. Aeruginosa)、 普通變形桿菌（P. vulgaris)、黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens)、金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus);所述試劑盒包含： (i'）針對SEQ ID N0:10所示序列的通用上游引物和針對SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌 的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列； (ii'）針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、 或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物； (iii'）一個(gè)或多個(gè)容器和/或包裝物； (iv'）任選的，PCR擴(kuò)增用試劑； (v'）任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑； (vi'）任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器； (vii'）任選的，使用說明書； (viii'）任選的，致病菌治療劑。
10. 下述物質(zhì)在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒中的用途： ⑴針對SEQ ID N0:10所示序列的通用上游引物和針對SEQ ID N0:11所示序列或 SEQ ID NO :12所示序列的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所 述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述 致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列； (ii) 針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、 或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物； (iii) 一個(gè)或多個(gè)容器和/或包裝物； (iv) 任選的，PCR擴(kuò)增用試劑； (v) 任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑； (vi) 任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器； (vii) 任選的，使用說明書； (viii) 任選的，致病菌治療劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419703SQ201310412753
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】王慧, 周賢, 李井泉, 韓雪松, 儲瑞藹 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院