鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針、以及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學領域，特別是指一種鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和 探針、W及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 非結核分枝桿菌廣泛存在于自然界的±壤，塵埃，水，魚類和家禽中，傳播途徑主 要從環(huán)境中獲得感染，例如污水，而人與人之間的傳染極少見。通常此類分枝桿菌對人類致 病性較結核分枝桿菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能發(fā)生障礙，則可 導致病變。非結核分枝桿菌其中W鳥胞內分枝桿菌復合群（Maviumcomplex)堪薩斯分枝 桿菌（M.Kartsasii)和贍餘分枝桿菌（M.xenopi)為引起肺部病變的最常見致病菌。
[0003] 鳥分枝桿菌病是由鳥-胞內分枝桿菌復合體（Mycobacteriumaviumcomplex或My cobacteriumavium-intracellularecomplex,MAIC)感染引起的人獸共患性傳染病。MAIC 感染后可侵害多種組織器官包括肺、骨髓和淋己結等。臨床病癥主要包括單一的結節(jié)、結節(jié) 狀的支氣管擴張、結節(jié)樣的浸潤和在免疫力低下患者中的擴散性浸潤四種類型。
[0004] 目前，實驗室里鑒定分枝桿菌采用的方法為涂片法和培養(yǎng)法。涂片法不能將結核 分枝桿菌和非結核分枝桿菌分開；培養(yǎng)法準確但需要培養(yǎng)2-3次才能確認，且耗時過長。近 些年來也出現(xiàn)了一些針對鳥胞內分枝桿菌復合群的分子生物學鑒定方法，但也均需4-6個 小時，如反向雜交，PCR-RFLP等，且容易出現(xiàn)實驗室污染。

【發(fā)明內容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探 針、W及其檢測方法。
[0006] 基于上述目的本發(fā)明提供的用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物，包括用于檢 測鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核巧酸序列分別為序列表中的SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2 ;W及用于檢測胞內分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核巧酸序列分別為序列表 中的沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4。
[0007] 由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ IDNO. 1和/或沈QIDNO. 2,W及沈QIDNO. 3和/或沈QIDNO. 4的基礎上經(jīng)過一至十 個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
[000引基于相同的發(fā)明構思，本發(fā)明還提供了用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的化qman探針，包括具有序列表中SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6的兩個化qman探針；兩個所述探針 的5'端標記有報告巧光基團，3'端標記有澤滅巧光基團。
[0009] 較佳的，所述具有序列表中SEQIDNO. 5的探針的5'端標記J0E，3'端標記B冊； 所述具有序列表中SEQIDNO. 6的探針的5'端標記FAM，3'端標記B冊。
[0010] 由上述化qman探針序列的衍生序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是 在SEQIDNO. 5和/或SEQIDNO. 6的基礎上，在序列的5'端和/或3'端添加一個或多 個堿基得到的序列。
[0011] 基于相同的發(fā)明構思，本發(fā)明還提供了鳥胞內分枝桿菌復合群檢測試劑盒，包括 用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物和化qman探針。
[0012] 基于相同的發(fā)明構思，本發(fā)明還提供了一種檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的方法， 采用上述用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物和上述用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群 的化qman探針，W待檢測樣本基因組DNA為模板，進行巧光定量PCR，其步驟如下：
[001引 1)提取待檢測樣本基因組DNA;
[0014]。配置巧光定量PCR反應體系：模板5y1，10Xhq酶buffer5y1，2.SmMdNTP4y1，用于檢測鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物各2y1，其濃度均為10iiM，用于檢測胞 內分枝桿菌的上游引物和下游引物各2yl，濃度為IOiiM,序列表中SEQIDNO. 5和SEQID NO. 6的兩個I'aqman探針各1y1，濃度均為10yM，Taq酶2. 5U，UNG酶0.Oly1，(1地2〇補至 SOiil；
[001 引 3)進行PCR反應：反應條件為：50°C2min;94°CSmin;94°C30s，60°C40s，共 40 個 循環(huán)；在巧光定量PCR儀上進行擴增，收集信號。
[0016] 從上面所述可W看出，本發(fā)明提供的鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針、 W及其檢測方法。利用鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌與其他分枝桿菌之間的基因組差異，設 計2對引物和2條探針，根據(jù)擴增的祀片段分別設計化qman探針，并對兩條探針進行不同 的巧光標記，實現(xiàn)了在同一反應管中同時檢測鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌，并通過不同的 巧光通道加W鑒別，擴增的同時可W直接在軟件上判讀結果，而不用跑電泳，避免了氣溶膠 污染。具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特 點。與傳統(tǒng)的鑒別方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的實施例中使用鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針，W鳥分 枝桿菌基因組DNA為模板，進行巧光定量PCR擴增曲線圖；
[001引圖2為本發(fā)明實施例中使用鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針，W胞內分 枝桿菌基因組DNA為模板，進行巧光定量PCR擴增曲線圖；
[0019] 圖3為本發(fā)明實施例中使用鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針，W鳥分枝 桿菌和胞內分枝桿菌基因組DNA為模板，進行巧光定量PCR擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0020] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，W下結合具體實施例，并參照 附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。
[0021] 實施例1 :鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針的設計與合成
[002引根據(jù)Pub-Med中基因庫中所提供的各種分枝桿菌基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)各種 分枝桿菌在在16SrRNA序列上有差異，分枝桿菌在16SrRNA的不保守區(qū)域，根據(jù)運些差別 來進行設計引物和探針，從而將鳥胞內分支桿菌復合群從中區(qū)分出來，具體序列如下： [0023] 針對鳥分枝桿菌的引物、探針為：
[0024]上游引物AF:5' -GGAAAGGCCTCTTCGGAGGT-3'（序列表中沈QIDNO.I);
[00巧]下游引物AR:5' -CGCAAAAGCTTTCCACCAGA-3'（序列表中沈QIDNO. 2)，
[0026] 探針AP序列為：5' -CGGATAGGACCTCAAGACGCATGTC-3'（序列表中沈QIDNO. 5)。
[0027] 針對胞內分枝桿菌的引物、探針為：
[0028] 上游引物JF:5' -CCCCTTCGGGGGTACTCG-3'（序列表中沈QIDNO. 3)，
[0029] 下游引物IR:5' -CCGCAAAAGCTTTCCACCTAA-3'（序列表中沈QIDNO. 4)，
[0030]探針I(yè)P序列為：5' -ACCGGATAGGACCTTTAGGCGCATG-3'（序列表中沈QIDNO. 6)。
[0031] 其中，兩條化qman探針分別針對鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌，鳥分枝桿菌的探針 AP的5'端標記J0E，3'端標記B冊，胞內分枝桿菌的探針I(yè)P的5'端標記FAM，3'端標記 B冊。當待測樣品中只存在胞內分枝桿菌DNA時，反應體系中的胞內分枝桿菌體系會進行擴 增，在FAM通道有巧光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當樣品中只存在鳥分枝桿菌DNA時，反 應體系中鳥分枝桿菌體系會進行擴增，在JOE通道有巧光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當 同時存在兩種菌的DNA時，兩個體系會同時工作（注：濃度比在1:103?內），在兩個通道都 會出現(xiàn)實時擴增曲線，從而實現(xiàn)對兩者的鑒別。通過在不同通道的巧光信號觀察到的巧光 曲線來判斷模板中是鳥分枝桿菌和胞內分枝桿菌。
[0032] 所有引物和探針的合成和標記都由上海生工來完成。
[0033] 實施例2 :應用本發(fā)明提供的引物和探針對鳥胞內分枝桿菌復合群檢測
[0034] 1.提取待檢測樣本基因組DNA:
[0035] 1)取臨床疲樣本進行篩選并編號記錄涂片結果；
[0036]2)配制8%化OH溶液；
[0037] 3)在生物安全柜內向疲液中加入等體積上述氨氧化鋼溶液；
[0038] 4)劇烈震蕩混勻后37°C液化1小時；
[003引 W取Iml液化后的樣本至1. 5ml無菌離屯、管內；
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