專利名稱：一種草分枝桿菌Sq-1及復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學生物工程和發(fā)酵工程及微生物分子生態(tài)領(lǐng)域，更具體涉及一種滅活的草分枝桿菌Sq-I，還涉及一種枯草芽孢桿菌AS-1. 892活菌培養(yǎng)物，同時還涉及一種滅活的草分枝桿菌Sq-I與活的枯草芽孢桿菌ASl. 892復(fù)合制劑的制備方法。通過不同的菌株多種活性因子的協(xié)同作用調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，強化機體的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化、抗輻射能力，用于人和動物長期保健和一些慢性疾病的治療。
背景技術(shù)：
草分枝桿菌是一類非致病的桿菌，其制劑是一種免疫增強劑，20世紀末期，人們發(fā)現(xiàn)了分枝桿菌多糖(MPS)，胞壁酰二肽(MDP)，具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，同時促進造血系統(tǒng)、抑制病毒復(fù)制、修復(fù)受損細胞等等。近年來人們對它的去甲基化胞嘧啶，以及鳥嘌呤為核心的寡聚脫氧核苷酸序列(CPG)強佐劑作用引起了廣泛的關(guān)注，以生物調(diào)節(jié)劑治療由生理性病變引起的多種疑難雜癥，取得了很好的效果。成為21世紀初免疫治療極為關(guān)注的熱點。國內(nèi)外代表產(chǎn)品是德國sanum-kahlbeck公司在中國成都生產(chǎn)的烏體林斯，對它的臨床應(yīng)用作了大量的報導。它是以滅活的菌體作為非特異性免疫制劑(針劑)。中國專利“草分枝桿菌免疫液，ZL03118887. 7”以菌體及其培養(yǎng)物包括了 MPS、MDP、CPG等組分，優(yōu)以含胡蘿卜素、黃酮和多種維生素酶多種微量元素，更經(jīng)濟、更有效地發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗輻射等功能。枯草芽孢桿菌作為活菌微生態(tài)制劑，早在上世紀晚期以口服液形式進入市場，在免疫調(diào)節(jié)、消化道感染和氣管炎的治療上發(fā)揮了重要作用。地衣芽孢桿菌也以膠囊形式 (商品名整腸生)用于調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡。這類芽孢桿菌通常產(chǎn)生蛋白酶淀粉酶和纖維素酶幫助消化。增加機體對食物吸收利用率。近年來，kimio suetsima發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛋白酶消化的對蝦多肽和寡肽，具有很強的清除自由基的活性。任偉等人對于卵蛋白肽、骨原肽、大豆肽、玉米肽等食源性低聚肽，進行了抗氧化研究，結(jié)果表明，在清除DPPH自由基中大豆肽、卵蛋白肽活性最高，在抑制亞油酸自氧化體系中，大豆肽和海洋膠原肽，對于亞油酸自氧化抑制率分別為75%和58. 69%。因此生物活性肽(bioactive peptide)是一類具有分子量小， 生理活性強的特殊營養(yǎng)物質(zhì)，成為營養(yǎng)學界和醫(yī)學界研究的熱點領(lǐng)域，2008年李勇等人對海洋生物蛋白肽與靈芝多糖配伍作了防輻射的研究，結(jié)果表明，不僅增強了經(jīng)Cor照射的小鼠的存活時間，還大大的促進了外周血白細胞和DNA的修復(fù)，提高了 SOD酶活性，大大提高了小鼠細胞和體液的免疫功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種滅活的草分枝桿菌Sq-I，該菌在蔗糖無機鹽培養(yǎng)液內(nèi)首先產(chǎn)生MDP、MPS、CGP等構(gòu)形物；其次是黃酮、胡蘿卜素、維生素酶多種微量元素。后者以微量和超微量形式存在大大加強了各自生理活性，而且無任何毒副作用。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種復(fù)合微生態(tài)制劑，活著的枯草芽孢桿菌ASl. 892在腸道中迅速繁殖，造成厭氧環(huán)境，抑制了處于劣勢的腸道其它好氧細菌的增殖， 同時有利于腸壁厭氧的乳酸菌雙歧桿菌的生長，調(diào)節(jié)了腸道微生態(tài)平衡?？莶菥a(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶，幫助消化，提高食物利用率，同時也提高了機體免疫水平，而兩株復(fù)合制劑強強聯(lián)合，強化了各自的生理活性功能。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，方法易行， 操作簡便，成本低，無污染。尤其提供了一種新型的植物油和泡敵乳化的消泡劑，效果好。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種草分枝桿菌Sq-I復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其步驟是首先是對草分枝桿菌Sq-I (Mycobacterium plei Sq-I)保藏號CGMCC N00916 和枯草芽孢桿菌AS1.892(l3acilluS subtilis ASl. 892)，此株菌在中國高等學校菌種目錄中編號為CCTCC AB93177，分級培養(yǎng)，制作復(fù)合微生態(tài)制劑。生物材料樣品的保藏信息為分類命名草分枝桿菌MyccAacterium phlei，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號中國科學院微生物研究所，保藏日期 2003年4月1日，保藏編號CGMCC NO. 0916。A、培養(yǎng)基配制由下述原料按重量份制做培養(yǎng)基(1■量份)g/L
原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發(fā)Sm菌體g/L
蔗糖10.0-15. 013. 0-15. 015. 0-20.0
葡萄糖2. 0-5. 05. 0-8. 0B. 0-10.0
K2HPO40. 15-0. 51. 0-1. 5 10-2.0
MgSO4 ·7H200. 1-0. 150. 15-0. 200. 15-0. 20
(NH4) Cl0. 5-1. 00. 5-1. 51. 0-2. 0
蛋白胨0. 5-1. 01. 0-1. 51. 0-1. 5
瓊脂17. 0-20.0
水余量余量余量
PH7. 2-7. 5，115°C 滅菌 35-45 分鐘。
B、將Sq-I種子無菌接入茄子瓶斜面在條件下培養(yǎng)2-4天，無菌操作轉(zhuǎn)入C、將接種瓶的種子接入種子罐，培養(yǎng)溫度為^_32°C，通氣量1 0. 8，自動流加消泡劑(任何一種食用植物油泡敵水按6-8 2-3 30-50混合乳化)。培養(yǎng)36-40小時種子抽樣鏡檢；菌體生長均勻，停止發(fā)酵；所述的消泡劑為食用植物油(任何一種)、泡敵、水。食用植物油、泡敵、水的比例為6-8 2-3 30-50。D、將種子罐的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，溫度為28_32°C，通氣量1 0. 8，自動流加消泡劑，培養(yǎng)50-60小時，抽樣鏡檢，菌體老化成球桿狀，停止培養(yǎng)；E、發(fā)酵液離心收集菌體，在108_112°C烘干，收干菌體。得到了-Sq-I的菌體。一種復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其步驟是A、一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌劑優(yōu)化的培養(yǎng)基(重量份)原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發(fā)酵罐菌體g/L
-種草分枝桿菌
牛肉膏2. 0-3. 0
蛋白胨4. 0-5. 0
NaCl4. 5-5. 0
瓊脂17. 0-20.0
大豆粕8. 0-10. 010.0-15
玉米粉15. 0-20. 020.0-25
玉米漿粉0. 5-1. 01. 5-2. 0
K2HPO41. 0-1. 51. 5-2. 0
KH2PO40. 5-1. 00. 5-1. 0
水余量余量余量
PH7. 2-7. ^l，121°C 滅菌35-45分鐘。B、將ASl. 892種子接種到茄子瓶斜面，在33_37°C條件下培養(yǎng)34_38小時，用無菌水將菌體洗下，轉(zhuǎn)入接種瓶；C、種子罐接入種子后，通氣量1 1，自動流加消泡劑，35_37°C培養(yǎng)18-22小時后鏡檢菌體，生長健壯均勻，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐接入種子罐種子，35_37°C通氣量1 1自動流加消泡劑，培養(yǎng)38_42小時， 鏡檢時，菌體變短，菌數(shù)達到IO9個/ml時停止發(fā)酵；所述的消泡劑為食用植物油(任何一種)、泡敵、水。食用植物油、泡敵、水的比例為為6-8 2-3 30-50。D、將發(fā)酵液離心，收集菌體，真空減壓63-67°C烘干，收集干菌體。得到了一種 ASl. 892枯草芽孢桿菌菌體。Sq-I干菌體與ASl. 892干菌體按1 3比例混均勻，得到了一種復(fù)合微生態(tài)制劑(膠囊)。綜上所述，為了保持菌株的優(yōu)良遺傳特性，在生產(chǎn)過程中，對原種大量增殖后用甘油-70°C和牛奶凍干保藏，開啟后其子代選典型生長快的菌落，并在生產(chǎn)中傳代不超過三次。該制劑很好地調(diào)節(jié)腸胃的微生態(tài)平衡，提高機體免疫力，具有較強的抗氧化、抗輻射的功能?？梢杂糜谌撕蛣游锏拈L期保健和一些慢性病的治療。發(fā)明的優(yōu)點和效果一、本發(fā)明是由滅活的草分枝桿菌的菌體和活著的枯草芽孢桿菌組配的新型微生態(tài)制品，二者混合后，滅活的菌體及代謝產(chǎn)物作為益生元增加腸道中有益菌的生長繁殖以及定植能力，活的菌體增加了新的益生菌群，大大增強了腸道益生菌的種群和數(shù)量。維持腸道良好的微生態(tài)平衡。二、兩種菌作為免疫增強劑，混合使用的多因子協(xié)同作用效應(yīng)遠遠大于單獨使用的效果。例如；枯草芽孢桿菌利用大豆蛋白作為氮源經(jīng)過它自身產(chǎn)生的蛋白酶消化以后， 產(chǎn)生多種2-4個氨基酸組成的短肽，具有很強的抗氧化活性，而彌補了草分枝桿菌蛋白酶活性不高的缺點。三、這種微生態(tài)制劑的使用將大大減少環(huán)境污染和抗生素的大量使用對人和動物造成的嚴重危害，是營養(yǎng)學向預(yù)防醫(yī)學轉(zhuǎn)變的重要里程碑。
四、微生態(tài)制劑經(jīng)過配伍，延長了制劑的活菌保質(zhì)期。五、本發(fā)明采用消泡劑是泡敵植物油和水乳化成的，效果好，發(fā)酵成本大大減小。六、此制劑工藝簡單，操作方便，成本低?？傊摼鷦┚哂忻黠@的抗氧化抗輻射和提高機體免疫力等功能。附表說明使用效果。表1三種不同制劑體外抗氧化比較
權(quán)利要求
1.一種草分枝桿菌，其特征在于草分枝桿菌Mycobacterium phci Sq-I CGMCC N00916。
2.權(quán)利要求1所述的一種滅活的草分枝桿菌Sq-I的制備方法，其步驟是A、培養(yǎng)基配制原料斜面種子g/L種子罐種子g/L發(fā)酵罐菌體g/L蔗糖10. 0-15. 013. 0-15. 015. 0-20. 0葡萄糖2. 0-5. 05. 0-8. 08. 0-10. 0K2HPO40. 15-0. 51. 0-1. 51.0-2. 0MgSO4 ·7Η200. 1-0. 150. 15-0. 200.15-0. 20(NH4)Cl0. 5-1. 00. 5-1. 51.0-2. 0蛋白胨0. 5-1. 01. 0-1. 51. 0-1. 5瓊脂17. 0-20. 0水余量余量余量ΡΗ7. 2-7. 5，115°C滅菌 35-45分鐘；B、將Sq-I種子無菌接入茄子瓶斜面在條件下培養(yǎng)2-4天，無菌操作轉(zhuǎn)入接種瓶，鏡檢種子無雜菌生長均勻；C、將接種瓶的種子接入種子罐，培養(yǎng)溫度為^_32°C，通氣量1:0. 8，自動流加消泡劑， 培養(yǎng)36-40小時種子抽樣鏡檢；菌體生長均勻，停止發(fā)酵；D、將種子罐的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，溫度為28-32°C，通氣量1:0.8，自動流加消泡劑， 50-60小時，抽樣鏡檢，菌體老化成球桿狀，菌數(shù)達IO9個/ml，停止培養(yǎng)；E、發(fā)酵液離心收集菌體，在108_112°C烘干，收干菌體，得到了一種草分枝桿菌Sq-I菌體。
3.權(quán)利要求1所述的一種復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其步驟是 A、一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌劑的培養(yǎng)基原料斜面種子g/L種子罐種子g/L 發(fā)酵罐菌體g/L牛肉膏2. 0-3. 0蛋白胨4. 0-5. 0NaCl4. 5-5. 0瓊脂17. 0-20. 0大豆粕8. 0-10. 010. 0-15. 0玉米粉15. 0-20. 020. 0-25. 0玉米漿粉0. 5-1. 01. 5-2. 0K2HPO41. 0-1. 51. 5-2. 0KH2PO40. 5-1. 00. 5-1. 0水余量余量余量PH7. 2-7. ^1，121 °C 滅菌 35-45 分鐘；B JfASl. 892種子接種到茄子瓶斜面，在35-37°C條件下培養(yǎng)34-38小時，用無菌水將菌體洗下，轉(zhuǎn)入接種瓶；種子罐接入種子后，35-37°C培養(yǎng)，通氣量1 :1，自動流加消泡劑，18-22小時后鏡檢菌體，生長健壯均勻，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐接入種子，35-37°C培養(yǎng)，通氣量1 :1，自動流加消泡劑，38-42小時，鏡檢時，菌體變短，菌數(shù)達到IO9個/ml時停止發(fā)酵；將發(fā)酵液離心，收集菌體，真空減壓63-67°C烘干，收集干菌體，得到了一種ASl. 892枯草芽孢桿菌菌體；將Sq-I干菌體與ASl. 892干菌體按1 :3比例混均勻，得到了一種復(fù)合微生態(tài)制劑。
4.按權(quán)利要求2或3所述的一種復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于所述的消泡劑為食用植物油、泡敵、水，食用植物油、泡敵、水的比例為6-8 2-3 :30-50。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種草分枝桿菌Sq-1及復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，步驟是A、培養(yǎng)基配制；B、將Sq-1種子無菌接入茄子瓶斜面下培養(yǎng)；C、將接種瓶的種子接入種子罐；D、將種子罐的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；E、發(fā)酵液離心干燥，收集菌體，得到草分枝桿菌Sq-1。制備一種復(fù)合微生態(tài)制劑的方法，步驟是A、配制枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基B、將AS1.892種子接種到茄子瓶斜面培養(yǎng)；c、種子罐培養(yǎng)；d、發(fā)酵罐培養(yǎng)；e、將發(fā)酵液離心干燥，得到枯草芽孢桿菌菌體。F、將Sq-1干菌體與AS1.892干菌體按比例混均，制成膠囊。方法易行，操作簡便，成本低，無污染。該制劑很好地調(diào)節(jié)腸胃的微生態(tài)平衡，提高機體免疫力，具有較強的抗氧化、抗輻射的功能。用于人和動物的長期保健和慢性病治療。
文檔編號C12N1/20GK102206590SQ201010572928
公開日2011年10月5日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者張世敏, 張素琴 申請人:張素琴