040] 6) 12000;rpm，離屯、IOmin后棄上清；
[0041] 7)在該離屯、管內(nèi)加入無(wú)菌生理鹽水Iml后震蕩混勻；
[0042] 8) 12000;rpm，離屯、IOmin后棄上清；
[004引 9)加入無(wú)菌水105y1后混勻；
[0044] 10)將管內(nèi)全部?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌1. 5ml離屯、管內(nèi)；
[0045] 11) 95°C水浴加熱IOmin后取出冷卻；
[0046] 12) 12000巧m，離屯、2min;
[0047] 13)轉(zhuǎn)入凍存盒，一20°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br>[0048] 2.配置巧光定量PCR反應(yīng)體系：
[0049] 實(shí)驗(yàn)材料：鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌H37Rv，BCG株，其它分枝桿 菌，呼吸道常見(jiàn)菌，Taq酶套裝燈akara)，引物AF和AR,IF和IR,探針AP和IP，(1地2〇。
[0050] 實(shí)驗(yàn)儀器：AB口500巧光定量PCR儀。
[0051]

[005引 3.進(jìn)行PCR反應(yīng)：
[0053] 按照上述體系進(jìn)行配置，在AB口500巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件 如下：50°C，2min，94°C5min;94°C30s，60°C40s，共40個(gè)循環(huán)；在巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò) 增，對(duì)FAM和JOE通道進(jìn)行信號(hào)收集。
[0054] 分別W鳥分枝桿菌純培養(yǎng)物滅活后提取的核酸、胞內(nèi)分枝桿菌純培養(yǎng)物滅活后提 取的核酸、和兩者混合物為模板，進(jìn)行檢測(cè)。圖1-3分別為本發(fā)明實(shí)施例中使用鳥胞內(nèi)分枝 桿菌復(fù)合群檢測(cè)用引物和探針，W上述基因組DNA為模板，進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增曲線圖。 [00巧]如圖1 -3所示，在模板中只含有鳥分枝桿菌基因組DNA時(shí)，只在對(duì)應(yīng)鳥分枝桿菌的 通道有擴(kuò)增曲線，而針對(duì)胞內(nèi)分枝桿菌的通道沒(méi)有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)；在模板中只含有胞內(nèi)分 枝桿菌基因組DNA時(shí)，只在對(duì)應(yīng)胞內(nèi)分枝桿菌的通道有擴(kuò)增曲線，而針對(duì)鳥分枝桿菌的通 道沒(méi)有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)；在模板中同時(shí)含有鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌基因組DNA時(shí)，在兩 個(gè)通道都可W檢測(cè)到巧光信號(hào)。
[0056] 從上面所述可W看出，兩種體系在同一反應(yīng)管中可W很好的進(jìn)行工作，沒(méi)有交叉 反應(yīng)。
[0057] 實(shí)施例3:與其他分支桿菌和呼吸道病原體的交叉反應(yīng)性
[0058] 通過(guò)實(shí)施例2中的檢測(cè)方法，分別W常見(jiàn)分支桿菌和呼吸道病原體為樣本，進(jìn)行 檢測(cè)。
[0059] 針對(duì)其它常見(jiàn)分枝桿菌（具體名稱如下表），制備了相應(yīng)的DNA模板，用該體系進(jìn) 行檢測(cè)，W達(dá)到闊值所需要擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)表示。結(jié)果如下：
[0060] 表I其它常見(jiàn)分支桿菌檢測(cè)結(jié)果
[0062] 從結(jié)果可W看出，此體系能夠鑒別出鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌（即鳥胞內(nèi)分支 桿菌復(fù)合群），對(duì)其它分枝桿菌沒(méi)有交叉。
[0063] 呼吸道常見(jiàn)病原體檢測(cè)結(jié)果如下表：
[0064] 表2與常見(jiàn)呼吸道病原體檢測(cè)結(jié)果

[0067] 從結(jié)果中可W看出，此體系能夠鑒別出鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌（即鳥胞內(nèi)分 支桿菌復(fù)合群），對(duì)其它呼吸道常見(jiàn)菌沒(méi)有交叉。
[0068] 綜上所述，本發(fā)明根據(jù)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群和其它分枝桿菌基因組的差異，設(shè) 計(jì)2對(duì)引物，兩條化qman探針?lè)謩e針對(duì)鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，鳥分枝桿菌的探針5' 端標(biāo)記J0E，3'端標(biāo)記B冊(cè)，胞內(nèi)分枝桿菌的探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記B冊(cè)。當(dāng)待測(cè)樣 品中只存在胞內(nèi)分枝桿菌DNA時(shí)，反應(yīng)體系中的胞內(nèi)分枝桿菌體系會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增，在FAM通道 有巧光信號(hào)出現(xiàn)，并有實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線；當(dāng)樣品中只存在鳥分枝桿菌DNA時(shí)，反應(yīng)體系中鳥分 枝桿菌體系會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增，在JOE通道有巧光信號(hào)出現(xiàn)，并有實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線；當(dāng)同時(shí)存在兩種 菌的DNA時(shí)，兩個(gè)體系會(huì)同時(shí)工作（注：濃度比在1:103?內(nèi)），在兩個(gè)通道都會(huì)出現(xiàn)實(shí)時(shí) 擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)兩者的鑒別。在擴(kuò)增的同時(shí)可W直接在軟件上判讀結(jié)果，而不用跑電 泳，避免了氣溶膠污染。具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、 實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的鑒別方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0069] 所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：W上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非 旨在暗示本公開(kāi)的范圍（包括權(quán)利要求）被限于運(yùn)些例子；在本發(fā)明的思路下，W上實(shí)施例 或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可W進(jìn)行組合，步驟可WW任意順序?qū)崿F(xiàn)，并存在如 上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒(méi)有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在 本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的引物，其特征在于，包括用于檢測(cè)鳥分枝桿菌的 上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2;以 及用于檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQID NO. 3 和SEQIDNO. 4。2. 權(quán)利要求1所述引物的衍生序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的衍生序列，其特征在于：所述衍生序列是在SEQIDNO. 1和 /或SEQIDNO. 2,以及SEQIDNO. 3和/或SEQIDNO. 4的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一至十個(gè)堿基的取 代、缺失或添加得到的引物序列。4. 用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的Taqman探針，其特征在于，包括具有序列表中 SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6的兩個(gè)Taqman探針；兩個(gè)所述探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的Taqman探針，其特征在 于，所述具有序列表中SEQIDNO. 5的探針的5'端標(biāo)記J0E，3'端標(biāo)記BHQ;所述具有序列 表中SEQIDNO. 6的探針的5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記BHQ。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述Taqman探針的衍生序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的，其特征在于，所述衍生序列是在SEQIDNO. 5和/或SEQID NO. 6的基礎(chǔ)上，在序列的5'端和/或3'端添加一個(gè)或多個(gè)堿基得到的序列。8. -種鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的用于 檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的引物和權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群 的Taqman探針。9. 一種檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的用于 檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的引物和權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群 的Taqman探針，以待檢測(cè)樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，其步驟如下： 1) 提取待檢測(cè)樣本基因組DNA; 2) 配置熒光定量PCR反應(yīng)體系：模板5yl，10XTaq酶buffer5yl，2.5mMdNTP 4y1，用于檢測(cè)鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物各2y1，其濃度均為10yM，用于檢測(cè)胞 內(nèi)分枝桿菌的上游引物和下游引物各2yl，濃度為IOyM，序列表中SEQIDNO. 5和SEQID NO. 6 的兩個(gè)Taqman探針各Iy1，濃度均為 10yM，Taq酶 2. 5U，UNG酶 0. 01y1，ddH20 補(bǔ) 至 50y1 ; 3) 進(jìn)行PCR反應(yīng)：反應(yīng)條件為：50°C2min;94°C5min;94°C30s，60°C40s，共 40 個(gè)循 環(huán)；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，收集信號(hào)。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群的引物和探針以及其檢測(cè)方法，該引物包括用于檢測(cè)鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2；以及用于檢測(cè)胞內(nèi)分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4。該Taqman探針包括具有序列表中SEQ？ID？NO.5和SEQ？ID？NO.6的兩個(gè)Taqman探針；兩個(gè)所述探針的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。該方法包括提取待檢測(cè)樣本基因組DNA，配置熒光定量PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)等步驟。本發(fā)明提供的引物、探針、方法可用于臨床及科研中鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)、鑒別鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/325, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105219882
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510801925
【發(fā)明人】李光, 馬志遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】北京利德曼生化股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年11月19日