專利名稱：用于篩選與rad9選擇性相互作用的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上屬于以抗癌化合物及其篩選方法為靶的領(lǐng)域。相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考本申請(qǐng)案主張大衛(wèi)·特瑞羅(David Terrero)于2008年10月M日申請(qǐng)的U. S. S. N. 61/108，224，“與RAD9選擇性相互作用的化合物的篩選方法(Method for Screening for Compounds Selectively Interacting with RAD9)，，的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
已知許多化合物可治療癌癥。一般來說，大部分化合物都是通過抑制DNA復(fù)制或細(xì)胞增殖起作用，而對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞不具特異性。盡管已經(jīng)通過使用靶配體以及結(jié)合特異性受體來賦予腫瘤細(xì)胞特異性，但大部分抗腫瘤化合物一般因殺死與復(fù)制較慢的正常細(xì)胞相比更多增殖較快的腫瘤細(xì)胞來起效。亟需對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性但對(duì)正常細(xì)胞無毒的選擇性較強(qiáng)的化合物。因此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種鑒別展現(xiàn)選擇性抗腫瘤活性的化合物的方法。本發(fā)明另一目的是提供一類新穎化合物，其通過靶向人類內(nèi)的hRad9來展現(xiàn)抗腫瘤活性。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)確定，具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的式Ia-Ie的天然和合成化合物，或其代謝物，尤其是塞克羅德(Securolide)是特別有效的抗腫瘤化合物，其靶向hrad9基因和/或由hrad9基因編碼的蛋白質(zhì)或含有所述蛋白質(zhì)的復(fù)合物，和/或P53基因和/或由p53基因編碼的蛋白質(zhì)。 根據(jù)在Rad9突變酵母菌株中進(jìn)行的研究，塞克羅德對(duì)hRad9突變體具有細(xì)胞選擇性。塞克羅德似乎與癌細(xì)胞中的突變hRad9相互作用，產(chǎn)生DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)， 塞克羅德可用于治療增生性病癥，例如黑色素瘤、白血病、乳癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝癌和淋巴癌，并減輕與所述癌癥相關(guān)的疼痛。也可以使用與證實(shí)塞克羅德的作用機(jī)制所用相同的分析法，例如通過在使用Rad9缺陷型突變酵母的分析法中針對(duì)功效進(jìn)行篩選， 來鑒別有效治療癌癥和任選的癌癥相關(guān)性疼痛的其它化合物。
具體實(shí)施例方式定義本文中使用的“烷基”是指飽和或不飽和脂肪族基團(tuán)，包括直鏈烷基、烯基或炔基； 支鏈烷基、烯基或炔基；環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)炔基(脂環(huán)族基團(tuán))；烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)炔基；以及環(huán)烷基取代的烷基、烯基或炔基。除非另作指示，否則直鏈或支鏈烷基的主鏈具有30個(gè)或更少碳原子(例如，對(duì)于直鏈，C1-C30 ；對(duì)于支鏈，C3-C30)，優(yōu)選20個(gè)或更少，優(yōu)選10個(gè)或更少，更優(yōu)選6個(gè)或更少，最優(yōu)選5個(gè)或更少碳原子。如果烷基未經(jīng)取代，那么烷基鏈的鏈中一般具有2到30個(gè)碳，優(yōu)選在鏈中具有2到20個(gè)碳，優(yōu)選在鏈中具有2到10個(gè)碳，更優(yōu)選具有2到6個(gè)碳，最優(yōu)選具有2到5個(gè)碳。同樣，優(yōu)選環(huán)烷基的環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3到20個(gè)碳原子，優(yōu)選在其環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3到10個(gè)碳原子，最優(yōu)選在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5、6 或7個(gè)碳。飽和烴基的實(shí)例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、 異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)物。不飽和烷基的實(shí)例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-( 丁二烯基)、2，4_戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和 3-丙炔基，和3- 丁炔基。術(shù)語“烷基”包括在烴基一個(gè)或一個(gè)以上碳原子處的一個(gè)或一個(gè)以上取代，以及雜烷基。適合的取代基包括(但不限于)鹵素，例如氟、氯、溴或碘；羥基；-NR1R2，其中 R1和&獨(dú)立地為氫、烷基或芳基，且其中氮原子任選季銨化；-SR，其中R為氫、烷基或芳基；-CN ；-NO2 ；-COOH ；羧酸酯基；-COR、-COOR或-COM2，其中R為氫、烷基或芳基；疊氮基、 芳烷基、烷氧基、亞氨基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、硅烷基、醚、磺酰基、磺酰胺基、雜環(huán)基、芳香族或雜芳香族部分、一CF3 ；-CN ；-NC0C0CH2CH2 ；-NC0C0CHCH ；-NCS ；和其組合。本文中使用的“芳基”是指C5-Cltl元芳香族、雜環(huán)、稠合芳香族、稠合雜環(huán)、聯(lián)芳香族或聯(lián)雜環(huán)系統(tǒng)。從廣義上看，本文中使用的“芳基”包括5、6、7、8、9和10元單環(huán)芳香族基團(tuán)，其可包括0到4個(gè)雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、批唑、吡啶、 吡嗪、噠嗪和嘧啶等。這些環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基也可稱為“芳基雜環(huán)”或“雜芳香族基”。芳香族環(huán)中的一個(gè)或一個(gè)以上環(huán)位置可經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上取代基取代，所述取代基包括(但不限于)鹵素、疊氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基(或季氨基)、硝基、硫氫基、亞氨基、酰胺基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳香族部分、一CF3、-CN ；和其組合。術(shù)語“芳基”還包括具有兩個(gè)或兩個(gè)以上環(huán)的多環(huán)系統(tǒng)，其中兩個(gè)或兩個(gè)以上碳為兩個(gè)鄰接環(huán)(即“稠環(huán)”)所共有，其中至少一個(gè)環(huán)是芳香族環(huán)，例如其它環(huán)可為環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)。雜環(huán)的實(shí)例包括(但不限于)苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并異噁唑基、苯并異噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、色滿基、色烯基、噌啉基、十氫喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氫呋喃并[2，3b]四氫呋喃、呋喃基、呋咱基(furaz any 1)、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1 H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、吲哚啉基、B引哚嗪基、B引哚基、3H-吲哚基、靛紅?；?isatinoyl)、異苯并呋喃基、異色滿基、異吲唑基、異吲哚啉基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、異噁唑基、亞甲基二氧基苯基、嗎啉基、萘啶基、八氫異喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4_噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羥吲哚基、嘧啶基、菲啶基、 菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基(phenoxathinyl)、吩噁嗪基 (phenoxaz i ny 1)、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基(p i ρ erony 1)、 蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎寧環(huán)基(quinuclidinyl)、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、四唑基、6H-1，2，5_噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基(thianthrenyl)、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和咕噸基(xanthenyl)。一個(gè)或一個(gè)以上環(huán)可如上文關(guān)于“芳基”所定義經(jīng)取代。術(shù)語“烯基”和“炔基”是指長度和可能的取代與上述烷基類似，但分別含有至少一個(gè)雙鍵或三鍵的不飽和脂肪族基團(tuán)。本文中使用的術(shù)語“雜烷基”是指含有至少一個(gè)雜原子的直鏈或支鏈或者環(huán)狀含碳基團(tuán)，或其組合。適合的雜原子包括(但不限于)0、N、Si、P和S，其中所述氮、磷和硫原子任選經(jīng)氧化，并且所述氮雜原子任選季銨化。雜烷基可如上文關(guān)于烷基所述經(jīng)取代?！巴檠趸?、“烷基氨基”和“烷硫基”用來指分別經(jīng)由氧原子、氨基或硫原子與分子其余部分連接的烷基。本文中使用的“烷基芳基”是指經(jīng)芳基(例如芳香族或雜芳香族基團(tuán))取代的烷基。本文中使用的“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”是指經(jīng)由單環(huán)或雙環(huán)的環(huán)碳或氮連接的含有3 到10個(gè)環(huán)原子，優(yōu)選含有5到6個(gè)環(huán)原子的環(huán)狀基團(tuán)，其由碳和1到4個(gè)雜原子組成，所述雜原子各選自由非過氧基氧、硫和N(Y)組成的群組，其中Y不存在，或?yàn)镠、0、(C1-10) 烷基、苯基或苯甲基，并任選含有1到3個(gè)雙鍵且任選經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上取代基取代。雜環(huán)的實(shí)例包括(但不限于)苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并異噁唑基、苯并異噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色滿基、色烯基、噌啉基、十氫喹啉基、2H， 6H-1，5，2-二噻嗪基、二氫呋喃并[2，3-b]四氫呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、 咪唑基、IH-吲唑基、B引哚烯基、B引哚啉基、B引哚嗪基、B引哚基、3H-吲哚基、靛紅?；惐讲⑦秽?、異色滿基、異吲唑基、異吲哚啉基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、異噁唑基、亞甲基二氧基苯基、嗎啉基、萘啶基、八氫異喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、氧雜環(huán)庚烷基(ox印anyl)、氧雜環(huán)丁烷基(oxetanyl)、羥吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基、 吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、批唑烷基、批唑啉基、批唑基、噠嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、批啶并噻唑、批啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎寧環(huán)基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫喹啉基、四唑基、 6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和咕噸基。雜環(huán)基可任選經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上如上文關(guān)于烷基和芳基所定義的取代基取代。本文中使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘。作用機(jī)制細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期事件的精確次序，由此確保基因組的全部拷貝都分配到子細(xì)胞中(哈特威爾L. (Hartwel 1, L.)和維納特T. (ffeinert, T.)，科學(xué) (Science) 246，6四-634，1989)。檢查點(diǎn)出現(xiàn)缺陷會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，這是癌癥發(fā)生的一個(gè)主要影響因素，因?yàn)闄z查點(diǎn)有錯(cuò)誤的細(xì)胞進(jìn)行到有絲分裂過程時(shí)會(huì)出現(xiàn)受損或不完全復(fù)制的DNA(哈特威爾L. H. (Hartwel 1，L. H.)和卡斯坦M. B. (Kastan, M. B.)，科學(xué) (Science) 266，1821-18 ，1995 ；野島 H. (Nojima，H.)人類細(xì)胞(Hum. Cell) 10，221-230，1997)。利用酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)進(jìn)行的分子和遺傳研究已經(jīng)鑒別出S-G2/M檢查點(diǎn)所需的復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)，這一網(wǎng)絡(luò)將確保響應(yīng)DNA損傷和/或不完全DNA復(fù)制而使細(xì)胞周期停滯(維納特 T. (ffeinert, T·)，遺傳學(xué)與發(fā)育新見(Curr. Opin. Genet. Dev. )8,185-193,
1998)。在裂殖酵母中，一組6個(gè)非必需檢查點(diǎn)rad蛋白Husl、RadURad3, Rad9, Rad 17 和Rad26，構(gòu)成了裂殖酵母檢查點(diǎn)級(jí)聯(lián)的傳感機(jī)器(哈姆普雷T. (Humphrey, Τ.)，突變研究(Mutat. Res. )451,211-226,2000)。這些蛋白質(zhì)是響應(yīng)如羥基脲等化合物所引起的DNA 合成抑制或由紫外輻射和Y輻射引起的DNA損傷而使細(xì)胞周期停滯所必需的(哈姆普雷 T. (Humphrey, Τ.)，突變研究(Mutat. Res.) 451，211-226，2000)。這些蛋白質(zhì)在進(jìn)化期間高度保守，并且已經(jīng)在包括人類在內(nèi)的許多其它真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)蛋白質(zhì)(范克瓦斯 C. (Venclovas, C.)和塞倫 Μ·Ρ· (Thel en, Μ. P.)，核酸研究(Nucleic Acids Res. )28, 2481-2493,2000)。這些檢查點(diǎn)rad蛋白的人類類似物稱為hHusl、hRadl、hRad3、hRad9和 hRadl7。Rad26在人類中不具有同系物。hRad9與hRadl和hHusl相互作用形成穩(wěn)定復(fù)合物，稱為9_1_1復(fù)合物(波特羅(Burtelow)等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.)，276，25903-25909，2001)。9-1-1 復(fù)合物中各成員與復(fù)制持續(xù)因子增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)之間的結(jié)構(gòu)同源性產(chǎn)生了一個(gè)假說，即，9-1-1復(fù)合物在DNA修復(fù)期間代替了復(fù)制相關(guān)性PCNA依賴性功能(卡斯帕雷(Caspari)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell. Biol.), 20, 1254-1262,2000)。在DNA復(fù)制期間，PCNA的同源三聚體在DNA上方形成一個(gè)環(huán)狀的滑動(dòng)壓板(sliding clamp)，并起到增加DNA聚合酶延續(xù)性(processivity)的作用。9-1-1/PCNA 模型得到了以下觀察的支持hRad9、hRadl和hHusl各自與hRadl7相互作用，而hRadl7 與復(fù)制因子C的亞單位共有廣泛的同源性，所述復(fù)制因子C是將PCNA1裝載到DNA上所需的一種蛋白質(zhì)(莫斯R(Mossi，R)和胡布斯切U. (HubScher，U.)，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur. J. Biochem.)，254，209-216，1998)。其它研究顯示，DNA 損傷不僅會(huì)誘導(dǎo) hRad9 和 hRadl 過磷酸化，而且還誘導(dǎo)9-1-1復(fù)合物與染色質(zhì)締合。據(jù)此，出現(xiàn)一個(gè)模型，其中將9-1-1以 hRadl7依賴性方式裝載到DNA的損傷位點(diǎn)可協(xié)調(diào)多層面的檢查點(diǎn)反應(yīng)(圣翁奇(St. Onge) 等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.)，276，41898-41905，2001)。體外生物分子研究和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻鳎?，5- 二氫-3-亞甲基_2[3H]呋喃酮，即“塞克羅德”結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，以觸發(fā)固有的免疫調(diào)節(jié)物，由此防止異常細(xì)胞生長。塞克羅德會(huì)導(dǎo)致Rad9突變酵母菌株的細(xì)胞死亡。根據(jù)這一資料，相信塞克羅德與癌細(xì)胞中的突變 hRad9相互作用，由此產(chǎn)生DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。涉及釀酒酵母突變菌株的生物分析顯示，細(xì)胞毒性只針對(duì)突變菌株，更具體點(diǎn)說，針對(duì)rad9基因。這表明，塞克羅德對(duì)不穩(wěn)定基因組具有選擇性細(xì)胞毒性。人類臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，體外分析法可預(yù)測(cè)癌癥和其它疾病 (包括用常規(guī)化療和放射療法經(jīng)歷失敗的乳癌和前列腺癌患者)的治療功效。釀酒酵母中受損的DNA活化基因rad9(稱為細(xì)胞周期修復(fù)檢查點(diǎn)蛋白)，以在發(fā)生損傷后使細(xì)胞周期停滯。Rad9還可促進(jìn)促細(xì)胞凋亡作用(細(xì)胞自殺)并抑制細(xì)胞分裂。 生物分析法顯示，塞克羅德通過rad9來損害損傷的DNA。Hrad9是rad9在人腫瘤細(xì)胞中的同系物。由于塞克羅德對(duì)其它類型酵母中的rad9突變體具有細(xì)胞毒性，故預(yù)期塞克羅德靶向人類中的hrad9，使惡性細(xì)胞中的基因組不穩(wěn)定。p53基因是一種腫瘤抑制基因，即，其活性停止腫瘤的形成。如果一個(gè)人從父母那里只繼承到P53基因的一個(gè)功能性拷貝，那么其易患上癌癥，并且多種組織常常會(huì)在早期成年期出現(xiàn)數(shù)種獨(dú)立的腫瘤。這一情況很罕見，并且稱為李-佛美尼綜合癥(Li-Fraumeni syndrome)。然而，在大部分腫瘤類型中都發(fā)現(xiàn)了 p53的突變，由此引起復(fù)雜的分子事件網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致腫瘤形成。p53基因已經(jīng)被定位在染色體17上。在細(xì)胞中，p53蛋白結(jié)合DNA，這一結(jié)合物又刺激另一基因產(chǎn)生一種稱為P21的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與細(xì)胞分裂刺激蛋白(cell division-stimulating protein, cdk2)相互作用。當(dāng)p21與cdk2形成復(fù)合物時(shí)，細(xì)胞無法通過下一細(xì)胞分裂階段。突變P53不再有效結(jié)合DNA，并由此使得p21蛋白不可用于充當(dāng)細(xì)胞分裂的“停止信號(hào)”。因此，細(xì)胞不受控制地分裂，并形成腫瘤。p53響應(yīng)無數(shù)壓力類型而活化，這些壓力類型包括(但不限于)DNA損傷(由紫外線、紅外線，或例如過氧化氫等化學(xué)試劑所誘導(dǎo))、氧化壓力、滲壓休克(osmotic shock)、核糖核苷酸耗盡(ribonucleotide depletion)和失調(diào)的致癌基因表達(dá)。這一活化是以兩個(gè)主要事件為標(biāo)志。第一，P53蛋白的半衰期急劇增加，導(dǎo)致受到壓力的細(xì)胞中p53迅速積累。 第二，構(gòu)象變化迫使P53在這些細(xì)胞中呈現(xiàn)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的積極作用。導(dǎo)致p53活化的關(guān)鍵事件是其N末端結(jié)構(gòu)域磷酸化。所述N末端轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域含有大量磷酸化位點(diǎn)，并且可視為蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)壓力信號(hào)的主要靶。已知靶向p53的這一轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶可大致分為兩組。第一組蛋白激酶屬于MAPK家族(JNKl-3、ERKl-2、p38MAPK)，已知其可響應(yīng)數(shù)類壓力，例如膜損傷、氧化壓力、滲壓休克、熱休克等。第二組蛋白激酶(ATR、ATM、CHK1*CHK2、DNA-PK、CAK)涉及基因組完整性檢查點(diǎn)，這一檢查點(diǎn)是檢測(cè)和響應(yīng)由基因毒性壓力引起的數(shù)種DNA損傷形式的分子級(jí)聯(lián)。致癌基因也刺激由P14ARF蛋白介導(dǎo)的p53活化。在未受壓力的細(xì)胞中，通過p53的持續(xù)降解，P53保持在較低水平。一種稱為 Mdm2 (在人類中也稱為HDM2)的蛋白質(zhì)結(jié)合于p53，防止其起作用，并將其從核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞液中。Mdm2還充當(dāng)泛素連接酶(ubiquitin ligase)，并將泛素與p53共價(jià)連接，由此標(biāo)記p53 以供蛋白酶體降解。然而，P53的泛素化是可逆的。泛素特異性蛋白酶USP7(或HAUSP)可將泛素從P53裂解下來，由此保護(hù)其免于經(jīng)歷蛋白酶體依賴性降解。這是響應(yīng)致癌傷害而使P53保持穩(wěn)定的一種方式。上述蛋白激酶磷酸化p53的N末端將破壞Mdm2的結(jié)合。隨后，其它蛋白質(zhì)(例如 Pinl)被募集到P53，并誘導(dǎo)p53的構(gòu)象發(fā)生變化，從而進(jìn)一步防止Mdm2的結(jié)合。磷酸化還使得如P300或PCAF等轉(zhuǎn)錄共活化因子結(jié)合，隨后將p53的羧基末端乙酰化，暴露出p53的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其活化或阻遏特異基因。脫乙?；?，諸如Sirtl和Sirt7，可使 P53脫乙酰基，從而抑制細(xì)胞凋亡。一些致癌基因還會(huì)刺激結(jié)合MDM2并抑制其活性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄。分析系統(tǒng)有關(guān)塞克羅德在Rad9和/或p53突變酵母細(xì)胞系中誘導(dǎo)選擇性細(xì)胞死亡的功效的研究證實(shí)，與野生型細(xì)胞系或動(dòng)物模型相比較，使用這些細(xì)胞系來篩選選擇性誘導(dǎo)Rad9 和/或p53突變系中細(xì)胞死亡的其它化合物是可行的。適合的細(xì)胞系和動(dòng)物模型在市面
7上有售，或者可根據(jù)常規(guī)方法制備。舉例來說，美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection ；位于弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，VA) 20108)列出了數(shù)種I ad9突變酵母菌株(目錄號(hào)90731 ；90730 ；74154,4003576,4023576和4033576)。含有同源克隆 RAD9的斑馬魚是從ATCC獲得，目錄號(hào)10169289。還存在很多有關(guān)具有不僅涉及RAD9和/ 或p53，而且還涉及含RAD9和/或p53復(fù)合物的其它方面的各種缺陷的酵母菌株的科技出版物，其也可用來篩選與正常細(xì)胞相比較誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的化合物。正常細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也可經(jīng)工程改造以誘導(dǎo)hRAD9和/或p53基因中發(fā)生突變，以供分析用。人類同系物以及小鼠和大鼠的基因都列于NCBI資料庫中。(位點(diǎn)號(hào)(LocuSID)5883)。優(yōu)選借助定點(diǎn)誘變法引入突變。定點(diǎn)誘變法是一種在DNA分子中指定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的分子生物學(xué)技術(shù)。一般說來，定點(diǎn)誘變法需要已知野生型序列?？梢曰瘜W(xué)方式合成序列含有所需突變的寡核苷酸。這一寡核苷酸是通過堿基對(duì)氫鍵連接到互補(bǔ)的野生型基因序列。合成寡核苷酸可用作引物，在體外合成與原始(模板)鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。DNA合成是通過將DNA聚合酶添加到DNA模板進(jìn)行。新合成的DNA鏈具有引物，而且其中并入了所需突變。通過使用一對(duì)引物和聚合酶鏈反應(yīng)，有可能擴(kuò)增新產(chǎn)生的DNA分子并產(chǎn)生足夠的拷貝，從而可能操作新的DNA。通常，接著借助限制性酶和DNA連接酶將突變DNA插入表達(dá)載體中。隨后常將表達(dá)載體插入細(xì)胞中，在這里，表達(dá)載體可用作遺傳模板以合成突變蛋白質(zhì)。然后，可將突變蛋白質(zhì)的生物活性與野生型蛋白質(zhì)相比較。分析法在優(yōu)選實(shí)施例中，將活性待篩選的化合物添加到正常(即，包括Rad9的檢查點(diǎn)蛋白復(fù)合物中不具有缺陷，和/或P53基因中不具有突變)和異常細(xì)胞(即，在包括Rad9的檢查點(diǎn)蛋白復(fù)合物中和/或在P53中的一種或一種以上蛋白質(zhì)或者編碼蛋白質(zhì)的基因中具有突變或失活)中。隨后，在其它分析法中篩選與正常細(xì)胞相比較引起異常細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的化合物，以評(píng)估針對(duì)例如腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和感染病毒的細(xì)胞等特定細(xì)胞類型的一般細(xì)胞毒性和活性。化合物可通過選擇性靶向人類中的hRad9和/或p53基因來展現(xiàn)抗腫瘤活性的適合化合物包括
權(quán)利要求
1.一種篩選藥學(xué)活性化合物的方法，其包含提供在包括I ad9的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白復(fù)合物或編碼所述復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的基因中具有一個(gè)或一個(gè)以上突變的細(xì)胞，將待篩選的化合物添加到所述細(xì)胞中，和確定所述化合物是否殺死一部分或全部所述細(xì)胞或誘導(dǎo)一部分或全部所述細(xì)胞凋亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是在動(dòng)物體內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含將所述化合物添加到在所述包括Rad9的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白復(fù)合物中不具有突變的正常細(xì)胞中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞在所述Rad9基因中具有突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞具有無活性或活性較低的Rad9蛋白。
9.一種藥學(xué)上可接受的化合物，其是通過根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法鑒別。
10.一種篩選藥學(xué)活性化合物的方法，其包含提供在蛋白質(zhì)P53或編碼所述蛋白質(zhì)的基因中具有一個(gè)或一個(gè)以上突變的細(xì)胞， 將待篩選的化合物添加到所述細(xì)胞中，和確定所述化合物是否殺死一部分或全部所述細(xì)胞或誘導(dǎo)一部分或全部所述細(xì)胞凋亡。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞是在動(dòng)物體內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包含將所述化合物添加到在所述p53蛋白中不具有突變的正常細(xì)胞中。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞在所述p53基因中具有突變。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞具有無活性或活性較低的p53蛋白。
18.—種藥學(xué)上可接受的化合物，其是通過根據(jù)權(quán)利要求10或15所述的方法鑒別。
全文摘要
經(jīng)確定，具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的式Ia-Ie的天然和合成化合物，尤其是塞克羅德(Securolide)是有效的抗腫瘤化合物，其靶向hrad9基因和/或由hrad9基因編碼的蛋白質(zhì)或含有所述蛋白質(zhì)的復(fù)合物，和/或p53基因和/或蛋白質(zhì)。根據(jù)在Rad9突變酵母菌株中進(jìn)行的研究，塞克羅德對(duì)hRad9突變體具有細(xì)胞選擇性。塞克羅德似乎與癌細(xì)胞中的突變hRad9相互作用，產(chǎn)生DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，塞克羅德可用于治療增生性病癥，例如黑色素瘤、白血病、乳癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、食道癌、肝癌和淋巴癌，并減輕與所述癌癥相關(guān)的疼痛。也可以使用相同分析法，例如通過在使用Rad9和/或p53缺陷型突變酵母的分析法中針對(duì)功效進(jìn)行篩選，來鑒別有效治療癌癥和任選的癌癥相關(guān)性疼痛的其它化合物。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102265154SQ200980152620
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者C·費(fèi)德里科·戈麥斯·加西亞-戈多伊, 大衛(wèi)·特雷羅, 費(fèi)德里科·M·戈麥斯 申請(qǐng)人:馬格納化學(xué)國際實(shí)驗(yàn)室公司