專利名稱：一種檢測h5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒。
背景技術(shù)：
H5亞型禽流感病毒為OIE規(guī)定的需申報的禽流感病毒，各國在進(jìn)出口動物檢疫和國內(nèi)疫情普查過程中非常重視。在各國的家禽及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易活動中對H5亞型禽流感有嚴(yán)格的監(jiān)管措施，在進(jìn)出口家禽、野鳥中一旦檢出，會造成惡劣的國際影響。另外，從2004年開始，日本、韓國、泰國、越南等亞洲國家和地區(qū)全面爆發(fā)H5亞型高致病性禽流感病毒。因此，立項進(jìn)行H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR定性檢測能力驗證， 確保監(jiān)測體系的核心一技術(shù)能力問題得到認(rèn)證保障，具有非常重要的現(xiàn)實意義。目前禽流感病毒熒光RT-PCR快速檢測技術(shù)已在國家質(zhì)檢總局系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)部屬的各地動物防疫站、全國所有禽肉出口集團公司的養(yǎng)殖場、禽肉加工場、各地的疾病預(yù)防控制中心，包括澳門民政總署化驗所等多個行業(yè)部門的實驗室推廣應(yīng)用，取得明顯的經(jīng)濟和社會效益。在美國、加拿大等國家也都紛紛采用了熒光RT-PCR方法檢測禽流感。對于H5亞型禽流感病毒核酸檢測，主要為普通RT-PCR、實時熒光RT-PCR和 NASBA，這些方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，已經(jīng)在實際的檢測工作中發(fā)揮了重要作用；另一方面，由于這些方法均為應(yīng)對當(dāng)前疫情而緊急開發(fā)出來，不同部門依據(jù)的方法不同，所用試劑也不盡相同，這樣很可能出現(xiàn)針對同樣的樣品出現(xiàn)不同的結(jié)果。目前我國已經(jīng)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)有GB/ T 19438. 2-2004《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》和GB/T19439-2004《H5亞型禽流感病毒NASBA檢測方法》。OIE推薦使用的檢測方法為普通RT-PCR、實時熒光RT-PCR 和 NASBA。H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR快速檢測的實驗?zāi)芰κ呛饬考仪輦魅静≡\斷實驗室檢測高致病性禽流感病毒結(jié)果準(zhǔn)確性的重要標(biāo)志。因此，建立檢測H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒能夠考察實驗室對H5亞型禽流感病毒的檢測能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒。該試劑盒主要在動物檢疫專業(yè)的測量審核領(lǐng)域使用，用于比對實驗室檢測H5亞型禽流感病毒能力的試劑盒，即該試劑盒能用于評價考核實驗室是否能正確檢測H5亞型禽流感病毒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種檢測H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒，保存于-20°C，該試劑盒是由以下樣品組成
A 含2 X 101°拷貝/mL目的核酸片段的溶液； B 含IO9拷貝/mL目的核酸片段的溶液； C 含IO8拷貝/mL目的核酸片段的溶液；D 含IO7拷貝/mL目的核酸片段的溶液； E 含IO6拷貝/mL目的核酸片段的溶液； F 含IO5拷貝/mL目的核酸片段的溶液； G 不含目的核酸片段的溶液；
其中，所述目的核酸片段為H5亞型禽流感病毒體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；所述溶液優(yōu)選為70%乙醇溶液。本發(fā)明所述測量審核用試劑盒的使用方法
1.各個參試實驗室可選擇國際、國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法或其他非標(biāo)方法，進(jìn)行H5亞型禽流感病毒核酸的檢測驗證；
2.試劑盒說明書
2. 1保存溫度-20°C ； 2.2有效期12個月；
2. 3使用方法使用前顛倒混勻管內(nèi)液體，然后再提取RNA進(jìn)行測試分析。2. 4循環(huán)條件設(shè)置
第一階段，反轉(zhuǎn)錄42 V 30 min； 第二階段，預(yù)變性92 0C 3 min；
第三階段，92 V 10 s ；45 V 30 s ；72 V 1 min ;5 個循環(huán)；
第四階段，92 V 10 s;60 V 30 s ;40個循環(huán)，在第四階段每次循環(huán)的退火延伸時收
集熒光。試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。2. 5相對參考Ct值以2. 4中的循環(huán)參數(shù)為準(zhǔn)，含2 X 101°拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考Ct值約為7. 63，含IO9拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考Ct值約為 12. 73，含IO8拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考Ct值約為15. 23，含IO7拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考Ct值約為19. 58，含IO6拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考 Ct值約為21. 84，含IO5拷貝/mL目的核酸片段溶液的相對參考Ct值約為27. 76，不含目的核酸片段溶液的相對參考Ct值為>40。3.結(jié)果評價
如果未檢測到本試劑盒中的特定RNA序列，則說明該參試實驗室檢測技術(shù)有問題；如果能檢測到本試劑盒中的特定目的核酸片段，并且檢測的Ct值與標(biāo)定的Ct值采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗一 t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析無顯著差異，則證明該參試實驗室檢測技術(shù)水平優(yōu)良；如果能檢測到本試劑盒中的特定目的核酸片段，但是檢測的Ct值與標(biāo)定的Ct值采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗一 t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析有顯著差異，則證明該參試實驗室檢測技術(shù)水平不夠規(guī)范和穩(wěn)定，需要改進(jìn)。本發(fā)明創(chuàng)新性本試劑盒為H5亞型禽流感病毒核酸的檢測提供一組通過隨機組合的測量審核樣品，用定性評價的方式對參試機構(gòu)的測試該病毒核酸檢測的敏感性、特異性及檢測方法的準(zhǔn)確性提供一個測評基準(zhǔn)工具。此試劑盒對于評價參試機構(gòu)對H5亞型禽流感病毒核酸的檢測能力具有很好參考價值，對提升相關(guān)機構(gòu)的檢測能力有很強的促進(jìn)作用。本試劑盒中的H5亞型禽流感病毒核酸按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求進(jìn)行制備，采用了協(xié)作標(biāo)定、均勻性和穩(wěn)定性檢驗等，調(diào)制了適用于測量審核的最佳樣品濃度，通過實驗證明采用了 70%乙醇溶液作為性價比最高，又能有效保護(hù)和分散RNA核酸的分散保護(hù)劑。制備了動物檢疫病毒核酸測量審核樣品，并將其定量。下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實施例方式北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心動物實驗室制備樣品，使用的禽流感病毒株為A/Duck/HB/ (H5N1)，該病毒對禽類具有高致病性，由本實驗室分離保存。實施例1 樣品的制備
1禽流感病毒A/Duck/HB/ (H5N1) HA基因的擴增與克隆
在序列比對的基礎(chǔ)上，設(shè)計以下3條引物
AIH5F:5' -AAA ATG GAG AGA ATA GTG CTT-3' (SEQ ID No. 2)
AIH5R1:5' -CTA CAA TCT GAA CTC AAY AAA T_3，(SEQ ID No. 3)
AIH5R2:5' -TTT AAC TAC AAT CTG AAC TCA CA-3' (SEQ ID No. 4)
這3對引物可擴增含有禽流感病毒HA基因完整的閱讀框，約1. 7KB。將禽流感病毒A/Duck/HB/ (H5N1)雞胚尿囊液純化后，應(yīng)用TRIZOL提取試劑進(jìn)行RNA的提取。然后應(yīng)用安發(fā)瑪西亞公司的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads (Cat. No. 27-9259-01)按表1配方配成RT-PCR反應(yīng)液，加入提取的RNA，用ABI9700PCR擴增儀進(jìn)行 RT-PCR 擴增。表1 RT-PCR反應(yīng)體系
組分?jǐn)?shù)量無RNA酶的滅菌純化水37 μ LRT-PCRbeads1粒AIH5F (25 μ M)IuLAIH5R1 (25 μ Μ)IuLAIH5R2 (25 μ Μ)IuL模板10 μ L
RT-PCR 循環(huán)參數(shù)為 42°C /lh ；94°C /3min ；94°C /40 sec, 53°C /40 sec, 72°C /2min，30 個循環(huán)，最后72°C/8 min0 RT-PCR完畢，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測擴增產(chǎn)物。上述引物擴增出約1.7KB的片段。采用 Promega 公司的 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Cat#A7170 、Lot#11356102)試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物中的目的核酸片段。再用1.0%瓊脂糖凝膠電泳的方法對純化的擴增產(chǎn)物進(jìn)行粗略定量。用!Iomega公司的PGEM — T Easy Vertor System II (Cat# A1380、Lot#8689;3)試劑盒按照試劑盒說明將目的片段與T載體相連接后，連接反應(yīng)體系見表2。表2連接反應(yīng)體系
組分體積2X buffer5μ LΤ—vectorIuLPCRproductΧμ LT4DNALigaseIuL補加去離子水至10 μ L連接反應(yīng)的條件為4°C過夜，如不立即進(jìn)行后續(xù)步驟，連接產(chǎn)物保存在4°C。2轉(zhuǎn)化與鑒定。按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的說明書要求，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于含有X-Gal和IPTG的瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12-16小時。從平板上長出的藍(lán)色、白色菌落中隨機挑取3-4個白色菌落，提取質(zhì)粒，用H5亞型 RT-PCR反應(yīng)液檢測，擴增陽性的為合格的克隆菌落。將挑取經(jīng)鑒定為陽性的菌落，用IOOml 液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C搖床振蕩培養(yǎng)12-16小時。3質(zhì)粒純化及序列分析
用 Promega 公司的 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Cat#A7100 、Lot#10454011)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提純，用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳的方法對提純的質(zhì)粒進(jìn)行純度檢測。將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。獲得序列后進(jìn)行拼接，得到的序列為序列表中的SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。4質(zhì)粒線性化和體外轉(zhuǎn)錄
對質(zhì)粒的序列進(jìn)行分析后，結(jié)果表明目的片段中不含有PvuII位點，而載體含有2個 PvuII位點，因此完全酶切后，可以切出含T7啟動子和全長目的片段的DNA片段。因此選用該酶對質(zhì)粒進(jìn)行線性化。用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7 (Cat# P1300、Lot#125575)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；體外轉(zhuǎn)錄體系見表3。反應(yīng)條件為37°C溫浴5小時。表3 T7體外轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.一種檢測H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒，其特征在于，該試劑盒是由以下樣品組成A 含2 X 101°拷貝/mL目的核酸片段的溶液； B 含IO9拷貝/mL目的核酸片段的溶液； C 含IO8拷貝/mL目的核酸片段的溶液； D 含IO7拷貝/mL目的核酸片段的溶液； E 含IO6拷貝/mL目的核酸片段的溶液； F 含IO5拷貝/mL目的核酸片段的溶液； G 不含目的核酸片段的溶液；其中，所述目的核酸片段為H5亞型禽流感病毒體外轉(zhuǎn)錄的RNA片段，其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述溶液為70%乙醇溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測H5亞型禽流感病毒的測量審核用試劑盒。該試劑盒含有H5亞型禽流感病毒的特定核酸樣品，為H5亞型禽流感病毒核酸的檢測提供一組通過隨機組合的測量審核樣品，用定性評價的方式對參試機構(gòu)的測試該病毒核酸檢測的敏感性、特異性及檢測方法的準(zhǔn)確性提供一個測評基準(zhǔn)工具。
文檔編號G01N21/64GK102230033SQ201110178719
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者劉來福, 張偉, 張利峰, 段向英, 谷強, 高志強 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局